（生物化学与分子生物学专业论文）灵芝多糖的分离纯化及理化性质研究.pdf

灵芝多糖的分离纯化及理化性质研究 摘要 通过测定样品中的多糖含量，我们比较了灵芝发酵菌丝体和所购 灵芝子实体，确定了赤灵芝g l 2 深层发酵菌丝体原粉做为研究的材 料。对菌丝体原粉进行分离纯化，经过脱脂、脱低聚糖，加水抽提， 乙醇沉淀等步骤得到粗多糖。粗多糖再经蛋白酶和s e v a g 法联合脱蛋 白，乙醇分级沉淀得到g l 5 0 、g l 6 6 、g l 7 5 ，其中g l 5 0 经离子交换 ， ， 柱层析得到g l p l 、g l p 2 、g l p 3 。对g l p l 进行了免疫活性实验。f 实 、 验结果从b 淋巴细胞的转化能力、抗体产生能力和抗体水平三个方面 证实g l p l 具有提高体液免疫的作用。g l p l 经凝胶柱层析等步骤得到 精制多糖g l p 4 。经高效液相验证，g l p 4 为均一多糖。j 对g l p 4 进行了理化性质研究。测得g l p 4 比旋度为+ 1 2 5 2 。，分 子量为1 3 ，8 0 0 。完全酸水解和纸层析结果显示g l p 4 为葡聚糖。红外 光谱提示g l p 4 为b 一型葡聚糖。高碘酸氧化和s m i t h 降解说明g l p 4 含有( 卜3 ) ，( 卜4 ) 及( 卜6 ) 糖苷键。 关键词：灵芝多糖，分离纯化，免疫活性，结构分析 i s o l a t i o n ，p u r i f i c a t i o n a n d p h y s i c o c h e m i c a l c h a r a c t e r i z a t i o no f p o l y s a c c h a r i d e f r o mg a n o d e r m al u c i d u m a b s t r a c t a f t e rm e a s u r i n gt h ec o n t e n to fp o l y s a c c h a r i d e ，w ec h o s ec u l t u r e dm y c e l i ao f g a n o d e r m al u c i d u ma s 0 1 2 1 - e x p e r i m e n t a l m a t e r i a l t h ec r u d ep o l y s a c c h a r i d ew a s o b t a i n e dt h r o u g hd e g r e a s e ，r e m o v a lo fo l i g o s a c c h a r i d ea n de t h a n o lp r e c i p i t a t i o no f c u l t u r e dm y c e l i a t h r o u g hr e m o v a lo fp r o t e i n ，f r a c t i o n a l p r e c i p i t a t i o nb ye t h a n o l ， d e a e c e l l u l o s ec o l u m n c h r o m a t o g r a p h y ,s e p h a d e x g 一1 0 0 g e l c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y ，w eg o tg l p 4 g l p 4w a s t e s t i f i e da sp u r e p o l y s a c c h a r i d eb y h p l c d u r i n gt h ep u r i f i c a t i o n ，t h ei m m u n o l o g i c a lf u n c t i o no fg l p 1w a ss t u d i e d t h e r e s u l t si n d i c a t e dt h a tg l p lw a sa b l et oe n h a n c e i m m u n o l o g i c a la b i l i t y t h ep h y s i c o - c h e m i c a lc h a r a c t e r i z a t i o no fg l p 4w a ss t u d i e d t h e s p e c i f i c r o t a t i o ni s1 2 5 2 。t h em o l e c u l a rw e i g h ti sa b o u t1 3 ，8 0 0 t h er e s u l t so f h y d r o l y s i s a n dp a p e rc h r o m a t o g r a p h ys h o w e dt h a tg l p 4w a sc o n s i s t e do f 出u c o s e i rp r o v e d t h a tg l p 4w a s 1 3 一g l y c o s i d i c b o n d p e f i o d a t eo x i d a t i o na n d s m i t h d e g r a d a t i o n s h o w e d ( 1 - 3 ) ，( 1 - 4 ) a n d ( 1 - 6 ) l i n k a g e s k e yw o r d s ：g a n o d e r m al u c i d u m p o l y s a c c h a r i d e ( g l p ) ，p u r i f i c a t i o n i m m u n o l o g i c a la b i l i t y ，s t r u c t u r ea n a l y s i s 2 第一章综述 灵芝，又名瑞草，芝草，是我国传统的药食两用的珍贵保健药。 祖国医学对灵芝的药效研究源远流长，自古以来被认为有起死回生的功效，是 名贵药材中的极品，远在周朝列子一书中就有“朽壤之上，有南芝者”。东汉时 期的神农本草经中载有：“益心气”、“安精魂”、“补肝益气”、“坚筋骨”、“好 颜色等功能忆明代李时珍的本草纲目对灵芝做如下描述：“苦、平、无毒a 主治心中结，益心气。补中、增智慧、不忘。久食轻身不老”口1 。 灵芝是担子菌纲，多孔菌科，灵芝属真菌【3 】。一般供药用的主要是赤芝 f g a n o d e r m al u c i d u m ) 和紫芝( g a n o d e r m a j a p o n i m ) 。研究表明，灵芝的组成成分复 杂，具有多种有效成分和广泛的生物学作用，能治疗多种疾病。本文就灵芝的有 效成分和生物活性特别是灵芝多糖的生物活性以及灵芝多糖的结构与生物活性 之间的关系作一综述。 1 1 灵芝的有效成分和生物活性 研究证明，灵芝含有多糖、氨基酸、蛋白质、多肽、甾类、萜类、有机酸、 挥发油、油脂、生物碱、长链烷烃以及多种酶和无机离子1 4 j 。经研究不同品种灵 芝，同一品种的不同生长阶段，野生与人工培养灵芝，所含的化学成分不同。 r 1 ) 灵芝多糖 灵芝多糖( g l p ) 是灵芝的主要活性成分，其种类很多，主要有葡聚糖、杂 聚糖、半乳糖、甘露糖、甘露岩藻半乳聚糖、阿拉伯糖、阿拉伯木质葡聚糖等【”。 灵芝中多糖的含量因灵芝品种、提取方法与多糖的纯度等不同而有较大差异。 灵芝多糖目前己分离到的有2 0 0 多种，其中大部分为1 3 型的葡聚糖，少数为 a 型的葡聚糖，多糖链由三股单糖链构成，是一种螺旋状立体构形物，其立体 构形和d n a 、r n a 相似，螺旋层之间主要以氢键固定定位，分子量从数百到数 十万，除一小部分小分子多糖外，大多不溶于高浓度的酒精中，在热水中溶解， 大多存在于灵芝细胞壁内壁。液体培养的发酵液和固体培养的培养基中有灵芝菌 丝分泌的胞外多糖。胞内多糖胞外多糖都是有效多糖。灵芝多糖大多为异多糖， 即除含有葡萄糖外，大多还含有少量阿拉伯糖、木糖、岩藻糖、鼠李糖、半乳糖、 甘露糖等其他单糖。单糖间糖苷键连接有( 1 3 ) ，( 1 4 ) ，( 1 6 ) 数种。多数 有分枝，部分多糖含有肽链，多糖分枝密度高或含有肽链的其药理活性一般也比 较高。灵芝多糖结构中含有较多的糖苷键可能是使其具有强烈药理活性的原因 f 6 1 。 灵芝多糖是灵芝中最有效的成分之一，因此，也特别受到医药科技工作者的 重视，研究报导也最多。现知灵芝多糖有广泛的药理活性，能提高机体免疫力， 能提高机体耐缺氧能力，消除自由基，抑制肿瘤，抗放射，提高肝脏、骨髓、血 液合成d n a 、r n a 、蛋白质能力，延长寿命等。灵芝的多种药理活性大多和灵 芝多糖有关【6 1 。 f 2 ) 灵芝酸 灵芝酸( g a n o d e n i ca c i d ) 是灵芝的另一主要活性成分。灵芝酸是一种三萜类 物质，基本构造为数个异戊烯首尾相连构成，大部分为3 0 个碳原子、部分为2 7 个碳原子。灵芝酸有四环三萜和五环三萜二类。各种灵芝中已分离到的灵芝酸已 达1 0 0 多种。灵芝酸是灵芝的苦味成的主要来源，其含氧功能团对苦味的产生起 重要作用。各种赤灵芝中的三萜类具有品种特异性，可以作为鉴定灵芝品种的依 据之一。灵芝酸在不同种的灵芝中或同一品种不同培养基培养的及不同生长阶段 的子实体中，其含量是不同的，所以其苦味程度也有所不同，一般味苦的灵芝其 灵芝酸含量往往较高。日本对灵芝商品及灵芝制成品的灵芝酸含量十分重视，认 为灵芝酸含量高，灵芝产品质量就好。 灵芝酸有强烈的药理活性，有止痛、镇静、抑制组织胺释放、解毒、保肝、 毒杀肿瘤细胞等功能，是灵芝的主要有效成分之一。灵芝酸能抑制大鼠巨细胞释 放组织胺，抑制血管紧张肽转化酶的活性，降低血压，灵芝酸还能抑制大鼠肝细 胞从2 4 ，2 5 二氢羊毛甾醇合成胆固醇，可以用来防治动脉粥样硬化和心脏病。 j o r g e l 等从赤芝提取的几种灵芝酸具有细胞毒性，能杀伤体外培养的肝癌细胞【7 1 。 ( 3 ) 各种元素 灵芝中含有多种元素。不同品种灵芝中元素的种类和含量略有差异，人工培 养的灵芝与野生灵活子中的元素种类和含量也不一致。等离子体发射光谱分析 4 ( i p c ) 结果表明：灵芝浸膏粉中含有2 5 种元素，其中c a ，m g ，p ，f e ，z n ， c u ，n i ，c o ，c r ，m o ，l i ，b ，v ，s n ，g e ，s r ，t i ，s e 等1 9 种为人体必需或 有益的常量或微量元素。原子吸收光谱分析( a a s ) 结果表明：灵芝浸膏粉中含 有丰富的钙( 2 3 3 0 p p m ) 、镁( 2 4 4 0 p p m ) 、磷( 4 5 0 0 0 p p r n ) 及铁( 3 9 0 p p m ) 、锰 ( 1 5 6 p p m ) 、锌( 5 5 3 p p m ) 、锗( 2 5 0 p p m ) 等，这些元素为人体正常生长发育 所必需或在人体内起重要的保健作用。己知，f e ，c a ，z n ，m n 等有养血益肝、 补肾之功效；z n ，c u ，m n ，l i 等微量元素与活血化淤、益气安神等功效有关； 微量元素t i 对预防心血管系统疾病起重要作用；此外，g e ，s e ，m n ，c u ，m o ， c r ，n i 等微量元素与人体抗衰老、抗癌等密切相关口】。在灵芝的菌丝体和发酵液 中，磷的含量相当丰富，磷具有镇静安神的作用，灵芝对神经衰弱和顽固失眠的 疗效与磷的作用有着密切关系。 文献报道，担子菌纲多孔菌中有机锗的含量高达8 0 0 2 0 0 0 m g k g ，它有抑 制多种肿瘤的生长，调节免疫功能等作用，因此有人认为灵芝中的有机锗有某种 生理活性【9 】o 但文献报道灵芝中的有机锗含量差异很大，不同产地的野生灵芝， 人工培养与野生灵芝的有机锗含量均不相同。野生灵芝中有机锗的含量一般都很 低，有的甚至不能检出。有一日本作者报道，不同地区和不同生长阶段的灵芝， 有机锗含量为1 3 7 8ug 瓜g ，而水提物中未检出f l 。这证明，灵芝水提物的生物 学作用与锗无关。中国医学科学院药物研究所有人将有机锗加入深层发酵培养菌 丝体的培养液中，可使菌丝体中有机锗的含量显著增高。由此可见，对于人工培 养的灵芝，无论是子实体还是菌丝体，都可以根据人们的需要认为的在培养基中 加入某种成分，而使灵芝中该成分的含量显著提高。 ( 4 ) 生物碱 灵芝腺苷是一种活性很强的物质，是灵芝的主要有效成分之一。灵芝含有腺 嘌呤和腺嘌呤核苷，尿嘧啶和尿嘧啶核苷 “1 。灵芝有多种腺苷衍生物，都有较强 的药理活性，能降低血液黏度，抑制体内血小板聚集，能提高血红蛋白2 、3 二 磷酸甘油的含量，能提高血液供氧能力和加速血液微循环，提高血液供氧能力和 加速血液微循环，提高血液对心、脑的供氧能力。a k i r as h i m i z u 等报道，腺嘌 呤核苷是赤芝水提取物抑制血小板凝集的有效成分。动物实验表明，尿嘧啶和尿 嘧啶核苷对实验性肌强直症小鼠血清醛缩酶有降低作用1 2 1 。紫芝中含有五种生 物碱，一种为y 三甲胺基丁酸，在窒息性缺氧模型中，有提高存活时间的作 用，并能使离体豚鼠心脏冠状动脉流量增加。 ( 5 ) 其它 灵芝中含有少量蛋白质、多肽、氨基酸。赤芝孢子内脂a 有降胆固醇的作用。 赤芝孢子酸a 有降转氨酶作用。灵芝、紫兰、薄树芝中的薄醇醚，灵芝孢子中 的孢醚，可使部分切除肝脏的小鼠的肝脏再生能力增强。灵芝纤维素能降胆固醇， 预防动脉粥样硬化、便秘、糖尿病、高血压、脑血栓等【6 】。余竟光等从薄盖灵芝 深层发酵菌丝体中分离到4 种呋喃衍生物。药理实验表明其中5 - 羟甲基呋喃甲醛 有抑制血小板聚集的作用【1 4 】。曾惜春等从当归分离得5 - 羟甲基呋喃甲醛，认为 可能是扩张冠状动脉、提高小鼠心肌摄取铷的有效物质。 此外，灵芝还含有多种长链脂肪酸、长链烷烃、甾类及多种酶类等，这些成 分是否参与某种生理活性尚不清楚1 1 ”。 1 2 灵芝多糖的生物活性 f 1 ) 调节免疫 灵芝对免疫系统的影响是双向的：对抗病的特异性和非特异性免疫能力，灵 芝有促进作用，而对致病的过敏反应，则有抑制作用。从两个不同角度加强了机 体保持稳态、抵抗疾病的能力。此种双向作用的详细机制尚待阐明。但已可认为， 调整免疫功能，抑制过敏反应也是扶正培本作用的重要内容。灵芝对支气管哮喘 等与过敏有关的疾病有效，提示它可能有抑制过敏反应的作用。 雷林生等探讨了g l p 对免疫抑制剂和抗肿瘤药引起的免疫抑制作用的拮抗 作用。结果表明，g l p 的拮抗作用的强度取决于这些药物的免疫抑致作用的程 度，只有这些药物轻度抑致免疫反应时，g l p 才具有完全拮抗作用1 6 】。 a 灵芝多糖对t 细胞的影响 灵芝多糖在体外直接活化脾淋巴细胞，但活化水平较低，远不如c o n a 或p h a 的作用强，使活性e 玫瑰花结形成率增高。灵芝多糖体外协助c o n a 诱导的脾淋 巴细胞转化，促进活化t 细胞的增殖，其程度远远高于单用c o n a 和灵芝多糖t 6 细胞增殖的和。但超过一定剂量时，这种促进作用消失，甚至显示出抑制作用。 灵芝多糖对n n g n 4 、鼠脾细胞的活化与增殖作用相似，对c 3 h 、c 5 7 b l 6 j 、 l a c a 、s w i s s 等品系的小鼠脾细胞，均有显著的协同c o n a 诱导其转化的作用。 体内给药，同样能明显促进c o n a 对小鼠脾淋巴细胞的活化增殖。灵芝多糖在体 外能显著促进c o n a 诱导t h 细胞产生淋巴因子i l 一2 和y i f n ，但单独刺激小鼠 脾细胞，只有微弱的活化作用。灵芝多糖超过一定浓度时，可t h 细胞产生i l 一2 ， 其浓度比引起脾细胞增殖抑制的浓度更低。灵芝多糖对荷s 1 8 0 肿瘤的小鼠i l 一2 活性亦有促进作用。 1 7 1 赤芝和树舌多糖在体外能明显对抗氢化可的松和环磷酰 胺对c o n a 诱导脾淋巴细胞转化增殖的抑制。体内给药能荷s 1 8 0 肿瘤小鼠的i l 2 和i f n 活性降低。灵芝多糖对正常成年鼠和免疫功能衰退的老龄鼠显示出相同 的活性。从赤芝提取的三种灵芝多糖能显著促进正常c o n a 诱导正常成年鼠和免 疫功能衰退的老龄鼠的脾淋巴细胞增殖，使老龄鼠的脾淋巴细胞增殖接近正常成 年鼠，显示出抗衰老的作用 1 8 】。 平盖灵芝( 树舌) 多糖能显著增强甲基化的细菌a 一淀粉酶和不完全的福氏 佐剂( m g a a i f a ) 引起的迟发性过敏反映，这一作用是由于此药能激活非特异 性的具有扩大细胞免疫效应的t 细胞所致。灵芝多糖或分b n ，c 与c o n a 合用，可 显著提高小鼠脾脏t 细胞增殖，并部分对抗环磷酰胺对脾细胞增殖的抑制作用 【t o 灵芝多糖( g l p ) 是从灵芝菌培养物的菌丝体中提取的多糖。向小鼠腹腔连 续注射大剂量的g l p ( 4 m g 只，2 m g 只) 5 天，对t 细胞增殖、细胞表型的表 达、t 细胞诱生i l 2 及b 细胞产生溶血素抗体均有抑制作用；当适量的g l p ( o 1 m g 只，o 0 5m e , 只) 连续向小鼠腹腔注射5 天，可明显增强上述免疫指标。表 明g l p 是一种生物反应调节剂，适量可增强机体的细胞及体液免疫功能，为临 床应用g l p 治疗免疫功能紊乱提供了理论依据【2 0 】。 b 灵芝多糖对b 细胞的影响 赤芝多糖对抗s r b c 空斑形成细胞的产生有促进作用，但对正常成年鼠作用 不明显，而对免疫功能衰退的老龄鼠则有明显的促进作用。体外单独用赤芝多糖， 对b 细胞有轻度活化作用。高斌等报道，树舌多糖能提高荷瘤鼠的n k 细胞活 性，并认为与抗肿瘤作用有关【1 7 i 。 c 灵芝促进巨噬细胞的吞噬功能 腹腔注射灵芝提取物，能促进腹膜渗出细胞、巨噬细胞和多型核白细胞的积 聚。灵芝与氯喹合用，可以改善氯喹所引起的免疫抑制现象，显著增强腹腔巨噬 细胞系统的吞噬功能。灵芝腹腔注射给药可使巨噬细胞的吞噬能力和巨噬细胞溶 酶体酶的活性明显增强，并呈剂量反应关系。高斌等报道，树舌多糖有体外诱导 小鼠腹腔巨噬细胞分泌i l i 样物质，较对照组增加约2 倍。l l 7 】灵芝液及灵芝多 糖连续给药，能提高小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红血球的活力。吞噬百分率和吞噬 指数均有提高【2 l 】。 ( 2 ) 抑制肿瘤 从不同品种或同一品种灵芝中提取的多糖，其抗肿瘤活性因提取方法、多糖 的种类和纯度等不同而有很大差异，其有效剂量( 相当于生药) 也有很大差异。 口服多糖的有效剂量要比腹腔注射大得多，同等剂量时，口服一般不显示任何活 性，因此各作者均采用腹腔注射给药。不同灵芝的不同多糖，其抑瘤率差异很大， 与生药的有效剂量相差几十至几百倍1 2 ”。 日本学者从灵芝中提取的多糖对s 1 8 0 肉瘤有抗肿瘤作用，能抑制瘤细胞增 殖。关洪昌等发现，灵芝多糖d 6 对小鼠艾氏腹水癌也有一定抑制作用【2 3 1 。 f 3 ) 对核酸、蛋白质合成的影响 核酸，蛋白质是生命的物质基础，体内一切重要的生命过程都与核酸，蛋白质 发生联系有的灵芝多糖能促进核酸、蛋白质的生物合成这对机体细胞物质代谢 和能量代谢的调节可能产生积极的影响，从而增强机体抗病能力，促进病人康复 这可能是灵芝扶正固本作用的机制之一。 灵芝多糖仇、银耳多糖及银耳孢子多糖均能促进。h 一亮氨酸( 3 i - t l e u ) 掺入小 鼠血清蛋白更新率，进一步研究证实，灵芝多糖d 。、银耳多糖还能促进3 h - l e u 掺入小鼠肝脏蛋白质，这些都反映肝脏合成蛋白质的能力增强。由于此二多糖均 能促进m 一尿嘧啶核苷( 3 h u r ) 掺入小鼠肝脏r n a ，但不能促进3 h 一胸腺嘧啶核苷 ( 3 h t d r ) 掺入小鼠肝脏d n a ，似表明它们能促进转录过程，加速r n a 合成，但 对d n a 合成无影响。灵芝多糖d 。还分别能促进3 h - l e u 、3 h u r 和3 h t d r 掺入 小鼠骨髓蛋白质、r n a 和d n a ，但对3 h t d r 掺入艾氏腹水癌细胞d n a 无影响 i 1 9 】。 灵芝多糖可引起体外培养的小鼠脾细胞核d n a 、r n a 含量的显著增加，细 胞内超微核结构改变，细胞质和细胞核的平均截面积增加，核质比下降，促进细 胞的增殖。灵芝多糖可明显促进混合淋巴细胞培养中脾细胞对 3 h t d r 的摄取， 增加脾细胞中d n a 多聚酶q 的活性。表明灵芝多糖可通过诱导d n a 多聚酶的产生， 促进免疫细胞中d n a 的合成和细胞增殖，加速免疫应答过程和同种异型抗原刺激 的淋巴细胞转化。灵芝多糖也可以完全拮抗环胞素a 、丝裂霉素c 、氟尿嘧啶和 阿糖胞苷对小鼠混合淋巴细胞反映( m l r ) 的轻度抑制作用，部分拮抗氢化可的 松对m l r 的严重抑制作用。“。 灵芝的一种小分子多糖，促进3 h 一尿嘧啶核苷掺入肝r n a ，其增加率为2 0 5 ， 促进3 h 胸腺核苷，3 h 尿嘧啶核苷掺入骨髓r n a 和d n a ，其增加率分别为4 8 7 和 4 3 3 。所以这些多糖对肝病恢复，骨髓造血均有促进作用。“。 ( 4 ) 其它 从赤芝提取的葡萄糖、杂多糖、肽聚糖等具有降血糖作用。赤芝葡聚糖能刺 激分泌胰岛素，并促进葡萄糖在外周组织的利用，对正常鼠和高血糖小鼠均有明 显的降血糖作用 z 6 1 。 抗放射与促进骨髓造血机能：灵芝液具有抗放射作用，可明显降低”c oy 射 线照射小鼠的死亡率，并使平均存活时间显著延长“。 灵芝多糖d 6 促进蛋白质合成、改善造血机能、诱导细胞色素p - 4 5 0 等作用均 有利于增强机体的防御功能，提高机体保持稳态的能力【2 3 】。 灵芝多糖能增强小鼠耐缺氧存活的能力灵芝制剂能降低机体及心肌的耗氧 量，增加缺氧状态下豚鼠的冠状动脉血流量、增加心肌a t p ，改善心肌缺血缺氧 状态；对由于缺氧引起的家兔缺血型心电图改变有显著的对抗作用。提高小鼠耐 缺氧的能力、延长缺氧小鼠平均存活时间。 1 3 灵芝多糖结构与生物活性的关系 多糖的生物活性和多糖的结构特别是高级结构有很大关系一般说来，灵芝多 糖的主链越长，侧链频率越高，分子量越大，生物学活性越高。有生物学活性的 9 灵芝多糖，其分子量一般大于1 0 4 道耳顿2 ”，小于此值则活性很低或完全没有。 灵芝多糖分为a 型和b 型两种，a 多糖没有活性，有活性的多糖均为b 型结构， 具有以b 一( 1 3 ) 糖苷键相连的主链。糖苷键连接吡喃葡萄糖残基，并在主链 的第0 - 6 ( 少数0 2 ) 碳原子处具有侧链。该结构为灵芝多糖抗肿瘤活性的最小 共同单位。侧链上相连的糖苷键可以是。从赤灵芝提取的几种多糖，其侧链频率 不同，抑瘤率差异很大。水不溶性葡聚糖，其侧链频率为l 3 1 时，抑瘤率为9 7 9 ， 侧链频率为1 1 6 8 和1 2 3 0 ，同等剂量的抑瘤率分别为5 9 6 和1 0 9 。一般多 糖越纯，抑瘤率越高，从平盖灵芝提取的多糖含有种糖蛋白，具有细胞毒性， 抑瘤率为7 8 1 ，去除该蛋白质后，同等剂量的抑瘤率为9 5 3 ，细胞毒性消 失【2 8 】。 据梁忠岩报导，灵芝多糖在水溶液中时多糖一般为三股单糖组成，树舌多糖 链在o 1 nn a o h 溶液中会解离成单股钳6 1 。多糖的药理活性与单糖间糖苷键的 结合形式有关。现认为单糖间以b 一( 卜3 ) ( 卜6 ) 连接或以b 一( 卜4 ) ( 1 - 6 ) 连 接的糖苷键是有活性的，以纯( 卜4 ) 糖苷键连接的则没有活性。此外，多糖的 药理活性还与其立体结构( - - 级结构) 有关。若螺旋形的立体构形被破坏，多糖 活性则大大下降。这里不妨比较一下灵芝多糖与淀粉、纤维素的区别。淀粉和纤 维素其单糖间的糖苷键都是( 卜4 ) 连接。淀粉分子的立体结构为a 一型的线状结 构，纤维素的立体结构为$ 型的带状结构，二者都没有立体形的构造，而纤维 素和淀粉( 包括糊精) 是没有药理活性的。 多数活性多糖有分枝，部分多糖含有肽链，多糖分枝密度高或含有肽链的其 药理活性一般也比较高。灵芝多糖结构中含有较多的糖苷键可能是使其具有强烈 药理活性的原因。 探讨多糖结构和生物活性是一项非常有意义的工作该领域的进展不但将为 人们筛选新的有显著药理活性的新药提供指导，更进一步的将为人工设计合成 出自然界没有的活性更强的化合物提供基础。 2 1 实验材料 第二章材料与方法 2 1 1 灵芝子实体原粉：购自浙江富阳医药保健品有限公司。 2 1 _ 2 灵芝菌丝体原粉：由赤灵芝g l 2 菌株液体深层发酵处理后获得。 ( 1 ) 菌种：赤灵芝g l 一2 菌株由上海交通大学生命科学技术学院提供。 ( 2 ) 培养基： 种子培养基：碎玉米粒在水中浸泡一夜，捞出用纱布包好，隔水蒸1 0 1 5 分钟后分装，1 5 k g c m 2 压力下灭菌2 0 分钟。 种子摇瓶培养基： 蔗糖3 5 蛋白胨o 5 酵母膏0 2 5 m g s 0 4 ，7 h 2 0 0 0 5 v b l o 0 0 5 k i - h p 0 4 0 1 p h 调至5 5 发酵摇瓶培养基： 葡萄糖1 蔗糖3 蛋白胨o 3 酵母膏o 2 k h 2 p 0 4 o 1 m g s 0 4 7 h 2 0 0 0 5 v b i o 0 0 5 p h 调至6 0 2 1 3 主要仪器设备： z x 9 1 旋转蒸发仪 g l 一2 0 型全自动高速离心机 w d p 型微生物多用培养箱 d t 系列电子天平 s a 、，a n t 冷冻干燥器 7 5 2 型紫外光栅分光光度计 电热恒温水浴锅 电热手提压力蒸汽消毒器 l k bb r o m m a2 1 1 1 部分收集器 l k bb r o m m a2 1 3 2 恒流泵 p h s 一3 型精密数显酸度计 f t i rp a p a g o n1 0 0 0 傅立叶变换红外光谱仪 w z z - 2 a 自动旋光仪 b i o - r a d1 3 3 型高效液相色谱仪 t s k 4 0 - t s k 5 0 串联h p l c 柱 s h o d e xr is e - 7 l 型示差折射仪 b a r n s o nb - 2 0 0 h 型超声波水浴槽 o l y i v l p u s 显微镜 2 1 4 主要生化试剂 环磷酰胺 牛血清白蛋白 d e a e 一纤维素 s e p h a d e x g 一1 0 0 单糖标准品 d e x t r a nt 系列 链霉蛋白酶 硅胶分离板 其他试剂均为分析纯或优级纯国产试剂 2 1 5 主要试剂和溶液的配制及处理 多糖测定试剂：6 ( w w ) 苯酚浓硫酸 d t 分离液：异丙醇：乙酸：环己烷= 7 ：1 3 ：l o ( v v ) 纸层析试剂 展层剂： 正丁醇：乙酸：水= 4 ：1 ：5 ( v v ) ， 硝酸银显色剂的配制： 华美生物工程公司 上海吉泰科技有限公司 w h a t m a n 公司 华美生物工程公司 m e r c k 公司 p h a r m a c i a 公司 上海吉泰科技有限公司 青岛海洋化工厂 a ：1 6 的硝酸银水溶液：丙酮= 1 ：9 ( v v ) b ：i n a o h 乙醇溶液( w ) c ：6 m o l l 氢氧化铵 脱脂试剂：氯仿：甲醇= 2 ：l ( v 厂v ) f o l i n 酚试剂 试剂甲：( a ) 1 0 9 碳酸钠、2 9 氢氧化钠和o 2 5 克酒石酸钾钠溶于5 0 0 m l 蒸 馏水；( b ) 0 5 9 硫酸铜( c u s 0 4 5 h 2 0 ) 溶解于1 0 0 m l 蒸馏水中。每次使用前将 ( a ) 5 0 份与( b ) 1 份混合，即为试剂甲。 试剂乙：在1 5 l 容积的磨口回流瓶中加入1 0 0 9 钨酸钠( n a 2 w 0 4 2 h 2 0 ) ， 2 5 9 钼酸钠( n a m 0 0 4 2 h 2 0 ) 及7 0 0 r a l 蒸馏水，再加5 0 m l 8 5 磷酸，1 0 0 m l 浓盐酸充分混合，接上回流冷凝管以小火回流1 0 小时。回流结束后，加入 1 5 0 9 硫酸锂，5 0 m l 蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾1 5 分钟，驱除过 量的溴，冷却后溶液呈黄色，微带绿色( 如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴 的步骤) 稀释至1l ，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准氢氧 化钠滴定，以酚酞为指示剂，然后适当稀释使最终浓度为1 n 酸。 2 2 实验方法 2 2 1灵芝菌丝体的发酵 g l 一2 菌种 2 8 。c ，1 2 0 h摇瓶 2 8 c ，4 8 h扩大培养2 86 c ，8 4 h发酵产物 叫卜 ( 玉米培养基)( 种子摇瓶) 2 2 2 灵芝菌丝体原粉的制备 发酵液过滤后用压榨机压榨菌丝体部分，然后烘干，粉碎得灵芝菌丝体原粉。 2 2 3 灵芝多糖的分离纯化 ( 1 ) 灵芝菌丝体原粉的脱脂 2 9 1 称取灵芝菌丝体原粉2 0 0 9 ，加入氯仿：甲醇( 体积比2 ：1 ) 混合液6 0 0 m l ， 装入1 0 0 0 m l 圆底烧瓶，置于4 5 c 恒温水浴，上接回流管，接通冷凝水，回 流6 小时。然后滤出溶剂，残渣中再加入氯仿：甲醇( 体积比 2 ：1 ) 混合液6 0 0 m l ，如是回流脱脂三次，滤出溶剂，滤渣置烘箱中4 0 烘 干。 ( 2 ) 灵芝原粉的脱低聚糖 滤渣中加入8 0 k 醇6 0 0 m l ，8 5 c 回流6 小时，如是脱低聚糖三次，滤出 溶剂，滤渣烘干。 ( 3 ) 灵芝粗多糖的提取 所得滤渣中加入蒸馏水1 0 0 0m l ，9 5 一1 0 0 c 提取6 小时，过滤出溶液， 浸提4 5 次，合并滤液，然后用旋转蒸发仪，于4 0 。c 将其浓缩至5 0 0 m l ， 5 0 0 0 r p m 离心2 0 分钟，收集上清液，接着在磁力搅拌器帮助下边搅拌边向上 清液中缓缓加入三倍体积的冷无水乙醇，放入4 冰箱沉淀过夜，然后 5 0 0 0 r p m 离心2 0 分钟，收集沉淀，沉淀再依次用无水乙醇和乙醚离心洗涤， 最后将沉淀置于装有p ：0 ；和n a o h 的真空干燥器中抽真空干燥，得到粗多糖 粉末1 。 ( 4 ) 粗多糖的脱蛋白 a 蛋白酶处理。“ 取粗多糖l o g 溶于5 0 0 m l 水中，用n a ：c o 。调p h 至7 8 ，加链霉蛋白 酶0 1 9 ，甲苯2 m l ，3 9 c 保温7 2 小时，接着再用自来水透析4 8 小时， 再对蒸馏水透析1 2 小时，然后用旋转蒸发仪在4 0 。c 将溶液浓缩至2 0 0 m l 。 b s e v a g 法脱蛋白。“ 取2 0 0 m l 的蛋白酶处理液，加入五分之一体积的氯仿4 0 m l ，随之再 加入五分之一氯仿体积的正丁醇8 m l ，置于2 5 0 m l 的分液漏斗中剧烈振 荡2 0 分钟，打开活塞，放出下层氯仿及中间层一变性蛋白，重复六次， 直至无变性蛋白出现为止。然后用三倍体积冷无水乙醇醇析，所得沉淀 用水溶解后再醇析，重复三次。 ( 5 ) 分级沉淀。 在粗多糖溶液中边搅拌边滴加冷无水乙醇，至体积比为1 ：l ，即乙醇的 终浓度为5 0 ，置4 6 c 冰箱中沉淀过夜，5 0 0 0 r p m 离心2 0 分钟，分别收集沉 淀和上清液，然后将沉淀冷冻干燥得5 0 级份，在上清液中加入冷无水乙醇 至体积比为l ：2 ( 乙醇终浓度为6 6 ) 同上处理得到6 6 级份。上清液继续加 冷无水乙醇至l ：3 ( 乙醇终浓度为7 5 ) 得到7 5 级份。 ( 6 ) 离子交换柱层析提纯。2 1 a 装柱 柱规格为巾2 6 5 0 c m ，柱中先预留三分之一柱长的双蒸水，将处理 好的d e a e 一纤维素稀悬浊液沿壁缓缓倾入柱中，使其自然沉降，打开恒 流泵，调节流速为6 0 m l h ，装至距住柱顶端1 0 c m 左右，最终柱床体积 为2 0 0 m l 左右，以双蒸水为洗脱剂2 4 m l h 平衡2 4 小时。 b 上样和柱层析 取5 0 级份5 9 溶于蒸馏水中，配成2 0 m g m l 的溶液，取5 0 m l 准备上 样。将柱中胶面以上的液体放出以后，关闭恒流泵，将样品溶液沿管壁 均匀小心加入，接着打开恒流泵( 流速3 0 m l h ) ，待样品溶液完全没入 胶面后，加洗脱液洗二、三次。然后连接洗脱瓶开始洗脱先用双蒸水 充分洗脱，部分收集器收集洗脱液，直至洗脱液没有多糖为止( 苯酚一 硫酸法检测) ，合并糖峰洗脱液，旋转蒸发浓缩后，干燥得到g l p l 。然 后依次分别用0 3 nn a h c o 。，0 i nn a o h 洗脱。“，分别将洗脱峰合并后旋 转蒸发浓缩，浓缩液先对自来水透析4 8 小时，再对双蒸水透析2 4 小时， 浓缩后冷冻干燥，分别得g l p 2 ，g l p 3 。 ( 7 ) 分离型凝胶柱层析提纯。3 1 柱填料为葡聚糖凝胶s e p h a d e xg - 1 0 0 ，柱规格为由2 6 l o o c m 装柱后，先用0 0 5 m o l ln a c i 溶液平衡2 4 小时，洗脱速度2 0 m l h 配 i o m g m l g l p i 溶液，取i o m l 上样。洗脱液为0 0 5 m o l ln a c i 溶液，洗脱速 度2 4 m l h 用部分收集器收集洗脱液，1 5 m i n 管。用苯酚硫酸法检测各管多 糖含量，合并洗脱峰各管洗脱液，旋转蒸发浓缩后，透析，冷冻干燥得精制 多糖粉末g l p 4 。 脱脂 灵芝菌丝体原粉 滤渣 加厂 提取液滤渣 浓缩，乙醇沉淀i + 粗多糖 脱蛋白j 脱蛋白粗多糖 离 双蒸水 洗脱 5 0 滤液 ( 弃去) g l 5 0上清液 6 6 乙 g l 6 6上清液 g l p lg l p 2g l p 37 5 凝胶柱层析i g l p 4 ( 精制灵芝多糖) g l p 7 5 上清液 图2 一l ：灵芝多糖分离提纯流程示意图 6 h 2 2 4 灵芝多糖的生物活性测定 f 1 ) 实验小鼠喂养3 5 ，3 6 】 取体重1 6 l g 的昆明种雌性小鼠，随机分组，每组1 0 只，共4 组：分 别为对照组，阴性免疫抑制组，5 0 级份组，6 6 级份组。各组饲养方法如 下：阴性对照组，蒸馏水2 5 m g k g 体重( 灌喂) ；免疫抑制对照组，蒸馏水 2 5 m g k g ( 灌喂) + 环磷酰胺2 0 m g k g ( i p ，三天一次) ；5 0 级份组，5 0 级 份溶液2 5 m g k g ( 灌喂) + 环磷酰胺2 0 m g k g ( i p ，三天一次) ；6 6 级份组， 6 6 级份溶液2 5m g k g ( 灌喂) + 环磷酰胺2 0 m g k g ( i p ，三天一次) 。其他 饲养条件相同，连续喂养十天。 ( 2 ) 白细胞吞噬率与吞噬指数的测定 最后一次进食后，眼眶采血，取o 0 4 m l 加入己加0 0 2 m l 草酸钠溶液的 凹玻片的凹孔内，再加0 0 2 m l 白色葡萄球菌悬液，3 7 。c 培养3 0 m i n 后制片， 碱性美蓝染色，油镜下观察白细胞吞噬的状态m 1 。 主要指标是吞噬率及吞噬指数。 吞噬率( ) = 1 0 0 个多型核白细胞中吞噬细菌的细胞数 吞噬指数= 1 0 0 个多型核白细胞中吞噬的细菌总数1 0 0 f 1 ) 红细胞s o d 活力的测定 a 红细胞s o d 抽提液的制各【3 8 】 采用眼眶采血法，取小鼠新鲜血液2 0 0 p l ，于4 m l 生理盐水中混匀， 1 5 0 0 r p m 离心5 r a i n ，弃上清液，加入2 m l 双蒸水，搅拌，依次加入冷乙 醇l m l ，氯仿l m l ，4 0 0 0 r p m 离心1 5 m i n ，上清液即为红细胞s o d 抽提 液。 b 红细胞s o d 活力的测定【3 9 , 4 0 , 4 1 s o d 测活方法一般是根据s o d 具有抑制o z ? 的原理建立起来的，本 文采用邻苯三酚自氧化法。按表2 2 加样，在2 5 。c ，3 2 5 n m 测定邻苯三酚 自氧化速率及加样后的氧化速率。酶活力单位的定义：在l m l 反应液中， 每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达5 0 时的酶量定义为一个活力单位。 4 2 1 样品的s o d 活力可由下式计算。 单位体积活力( u m l ) = ( 原自氧化速率_ 力口样后自氧化速率) 反 应液总体积( m l ) 样品稀释倍数原自氧化速率 0 5 加样量 表2 - 3 ：测定邻苯三酚自氧化速率及s o d 活力加样程序 p h 8 2t r i s - h c i h 2 0 s o d 抽提液 0 0 1 nh c il m m 邻苯三酚 总体积 缓冲液( m l ) ( m l ) ( m l ) ( m l ) ( m l )( m l ) 空白管 4 54 32 5 o02o9 0 自氧化测试管 454 32 0 m i n0o0 29 0 s o d 测试管 4 54 3 x00 2 9 0 注：x 为加入的s o d 抽提液的体积，随s o d 浓度而定。调整加样量使氧 化速率处于自氧化速率的o 3 5 0 6 5 倍范围内【“1 。 ( 4 ) 免疫活性实验：( 以下活性实验委托国家新药筛选中心进行) a 动物致敏( o d ) 动物：i c r 小鼠( 早) ，2 0 _ 2 9 ，随机分组 致敏：将新鲜羊红细胞用生理盐水( s r b c ) 洗涤三次，按5 l e 例 稀释s r b c 压积，每只小鼠腹腔注射o 2 m l b 给药( 2 - 4 d ) 配药：双蒸水溶解样品 给药途径：i p 给药次数：4 d 解剖( 5 d ) 小鼠称体重后摘眼球取血 ( 5 ) 脾脏、胸腺增重的测定 无菌操作下取脾脏，称重 取胸腺，称重 ( 6 ) 琼脂单扩散法测定血清i g g 水平 1 ：3 0 稀释兔抗小鼠i g g 血清与5 6 温育的1 5 琼脂糖溶液，浇板，打 孔，每孔分别加入标准血清( 混合正常小鼠血清) 与待测血清1 0 ul ，3 7 。c 2 4 小时后，测量扩散环直径，计算结果。 ( 7 ) 琼脂单扩散法测定血清c 。水平 l ：6 5 稀释兔抗小鼠岛血清，其余同上 ( 8 ) 溶血分光光度法q h s 测定脾细胞抗体生成 新鲜s r b c 经p h 7 2p b s 洗三次，i ：2 0 稀释 新鲜豚鼠血清l ：1 0 稀释 配置2 1 0 7 细胞m l 小鼠细胞悬液 以上三者分别取l m l 混合，3 7 l 小时，离心取上清液，5 2 0 n m 测0 d 值 ( 9 ) 3 h - t d r 渗入法测定c o n a 诱导脾脏t 淋巴细胞增殖实验 用含1 0 4 , 牛血清r p m l l 6 4 0 培养液2 1 0 6 细胞m l 脾细胞悬液，加入培 养板每7 l1 0 0ul 实验孔加c o n at 0 0ul ( 终浓度5 i jg m l ) ，对照孔加培养 液1 0 0 ul ，置5 c o ：培养箱3 7 。o 温育7 2 小时，培养终止前1 6 小时加 3 h t d r 9 2 5 k b q 孑l ，收获后用液闪测定d p m ，计算刺激指数( s i ) s i = 实验孔d p m 对照孔d p m ( 1 0 ) l p s 诱导脾脏b 淋巴细胞增殖实验( 3 h t d r 渗入法) l p s 终浓度1 0 ug m l ，其余同上 2 2 5灵芝多糖的结构分析 ( 1 ) 完全酸水解和纸层析法测定多糖的组成f 4 3 1 精确称取多糖1 0 r a g ，溶于1 0 m l 蒸馏水中，取l m l 溶液加入4 nh c ll m l ，充入安培管，充氮气封管，1 0 5 。c 水解8 小时。取新华滤纸，将水解液 与标准单糖溶液做纸层析，展层剂为：正丁醇：乙酸：水= 4 ：l ：5 ( v v ) ，显 色剂为硝酸银显色剂。 ( 2 ) 高碘酸氧化和s m i t h 降解测定多糖内糖苷键类型 a 高碘酸氧化“” 精确称取多糖样品，加一定量1 5 2 0 m m o l l 高碘酸溶液，置4 2 0 条件下于暗处放置，间或振摇。于4 ，2 4 ，4 8 小时间隔时间取样稀释 1 9 2 5 0 倍后，使用紫外分光光度仪在2 2 3 n m 处测定光密度。随着高碘酸被消 耗，光密度值逐渐下降，直至达稳定值。将测得样品溶液的光密度值 与原高碘酸钠溶液的吸收值相比较，o 0 1 5 m o l l 的高碘酸钠及碘酸钠溶 液光密度值约为0 6 和o 1 。由所测高碘酸的浓度下降的数值，即可推断 出平均每个糖基消耗的高碘酸量。 b s m i t h 降解“” 取高碘酸氧化完全的多糖溶液l o m l ，加入0 2 m l 乙二醇，对蒸馏水 透析4 8 小时后，用8 m g n a b h 于室温暗处还原1 2 小时，用0 1 m o l l c h 。c o o h 调节p h = 5 0 ，对蒸馏水透析2 4 小时后冷冻干燥，进行完全酸水解。纸 层析鉴定产物，展开系统为正丁酵：乙酸：水= 4 ：1 ：5 ( v v ) ，硝酸银显 色，判断甘油、赤藓糖、游离单糖等是否存在。 ( 3 ) 红外光谱法分析多糖内构型基团“ 取i m g 左右经干燥的糖样，与1 0 0