（药理学专业论文）salusinβ对ldlr小鼠动脉粥样硬化发展的影响及机制的初步探讨.pdf

论文图片3 9 参考文献4 4 综述4 7 攻读硕士学位期间发表学术论文题目5 6 致谢5 7 论文声明5 8 论文审阅认定书5 9 徐州医学院硕士学位论文 缩略词 缩略词表 a b b r e v i a t i o n 英文全称 a sa t h e r o s c l e r o s i s 中文全称 动脉粥样硬化 a c a t - 1 a c y l c o e n z y m e a ：c h o l e s t e r o l酰基辅酶a - 胆固醇酰基转 a c y l t r a n s f e r a s e 一1 a p o ea p o l i p o p r o t e i ne 移酶一1 载脂蛋白e d m e md u l b e c c o sm o d i f i e de a g l em e d i u m细胞培养液 d a b e r k f h f b s h & e h d l i d l l d l l d l r m a p k m t t p k c t g d i m e t h y l a m i n o a z o b e n z e n e二甲氨基偶氮苯 e x t r a c e l l u l a rs i g n a lr e g u l a t e dk i n a s e细胞外信号调节激酶 f a m i l i a lh y p e r c h o l e s t e r o l e m i a家族性高胆固醇血症 f e t a lb o v i n es e r u m h e m a t o x y l i n e o s i n e h i g h d e n s i t yl i p o p r o t e i n 胎牛血清 苏木素伊红染色 高密度脂蛋白 m i d d l ed e n s i t yl i p o p r o t e i n中间密度脂蛋白 l o w d e n s i t yl i p o p r o t e i n低密度脂蛋白 l o w - d e n s i t yl i p o p r o t e i nr e c e p t o r 低密度脂蛋白受体 m i t o g e n a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e s促分裂素原活化蛋白激酶 3 一( 4 ，5 ) - d i m e t h y l t h i a h i a z o ( z y 1 ) - 3 ，5 一d i 一四氮唑蓝 p h e n y t e t r a z o l i u m r o m i d e p r o t e i nk i n a s ec t r i g l y c e r i d e 蛋白激酶c 甘油三酯 徐州医学院硕十学位论文 t c v l d l v s m c s t o t a lc h o l e s t e r o l总胆固醇 v e r yl o w - d e n s i t yl i p o p r o t e i n 极低密度脂蛋白 v a s c u l a rs m o o t hm u s l ec e l l s血管平滑肌细胞 2 徐州医学院硕士学位论文 s a l u s i n p 对l d l r 小鼠动脉粥样硬化发展的影响 及机制的初步探讨 中文摘要 第一部分s a l u s i n p 在l d l r - - 动脉粥样硬化模型小鼠主动脉的表达 目的探讨心血管活性肽s a l u s i n p 在l d l r 动脉粥样硬化( a s ) 模型小鼠 主动脉内表达情况。 方法6 只雄性l d l r - - 小鼠给予高脂肪饮食造模1 2 周以促成动脉粥样斑块 的形成，6 只c 5 7 b l 6 j 小鼠为正常对照组，予以普通饲料。1 2 周后处死各实验组 小鼠，采用半定量逆转录一聚合酶链反应( r t - p c r ) 、w e s t e r nb l o t 及免疫组化方 法分别检测各组小鼠主动脉组织中的p r e p r o s a l u s i nm r n a 及蛋白水平的表达情况。 结果( 1 ) r t - p c r 结果显示：p r e p r o s a l u s i nm r n a 的表达在模型组较正常对 照组明显增加( 尸 0 0 1 ) ，有统计学意义。 ( 2 ) w e s t e r nb l o t 结果显示：与正常对照组相比，模型组小鼠主动脉内 p r e p r o s a l u s i n 蛋白含量明显增加( p o 0 1 ) ，差异具有统计学意义。 ( 3 ) 免疫组织化学分析显示：各组小鼠在内皮细胞和v s m c s 中均有s a l u s i n 1 3 阳性染色，正常对照组、模型组的s a l u s i n b 积分光密度值分别为：6 5 2 0 1 9 - - + 1 6 6 6 9 3 、 1 9 4 4 6 3 3 5 0 9 1 5 9 5 ，组间存在显著性差异( p o 0 1 ) 。 结论l d l r - a s 小鼠主动脉s a l u s i n d 的表达上调。 徐州医学院硕_ j ：学位论文 第二部分s a l u s i n p 对l d l r - 一小鼠动脉粥样硬化发展的影响 目的探讨心血管活性肽s a l u s i n p 对l d l r 小鼠a s 发展的影响。 方法( 1 ) 将1 2 只雄性l d l r - 小鼠随机分为两组：模型组和s a l u s i n p 组， 给予高脂肪饮食，另取6 只c 5 7 b l 6 j 小鼠作为正常对照组，予以普通饲料喂养。 s a l u s i n p 组小鼠每天皮下注射1 p g k g 的s a l u s i n p ，模型组小鼠皮下注射同体积的 p b s 。1 2 周后处死各组小鼠，分别检测血清中总胆固醇( t c ) 、甘油三酯( t g ) 、 低密度脂蛋白( l d l ) 及高密度脂蛋白( h d l ) 含量；h e 、油红o 染色分析各组 小鼠主动脉a s 斑块病变情况。 结果( 1 ) 模型组小鼠血清中t g 、t c 、l d l 和h d l 的浓度分别为( 8 3 9 + 2 5 1 ) m m o l l ，( 2 4 0 5 + 1 3 8 6 ) m m o l l ，( 2 4 0 5 + 1 3 8 6 ) m m o l l 和( 7 2 8 + 4 4 6 ) m m o l l ， 与正常对照组相比，除h d l p - ，其余血脂水平均显著升高( 尸 0 0 1 ) ；而s a l u s i n p 组小鼠血清中t g 、t c 、l d l 和h d l 的浓度分别为( 9 4 9 士4 8 0 ) m m o l l ，( 2 8 6 6 + 1 5 3 7 ) m m o k l ，( 2 1 0 8 + 1 5 0 3 ) m m o l l 并i ( 1 0 4 5 + 7 7 2 ) m m o l l ，与模型组相比虽然有所 增加，但是变化无统计学意义( 胗o 0 5 ) 。模型组和s a l u s i n p 组小鼠的体重与正常对 照组相比虽然有所增加，但亦无统计学意义( 胗o 0 5 ) 。 ( 2 ) 油红o 染色结果表明，模型组和s a l u s i n p 组的斑块面积内膜面积明显 大于正常对照组( p 0 0 1 ) ，而且s a l u s i n d 组斑块面积内膜面积大于模型组，差 异有统计学意义( p o 0 5 ) ； 模型组和s a l u s i n d 组的内膜厚度与对照组比较明显增厚( 尸 o 0 1 ) ；s a l u s i n - 1 3 组内膜 厚度明显大于模型组( p 0 0 1 ) ；模型组和s a l u s i n b 组的i m 值明显高于对照组 ( p 0 0 5 ) ，s a l u s i n d 组与模型组的i m 值比较也有增大，差异有统计学意义 ( p 0 0 5 ) 。 4 徐州医学院硕上学位论文 结论皮下注射s a l u s i n d 可增加l d l r 一- d , 鼠的a s 斑块面积，增加主动脉内 膜厚度。 第三部分s a l u s i n p 对血管平滑肌细胞增殖的影响 目的探讨心血管活性肽s a l u s i n p 对血管平滑肌细胞( v m s c s ) 增殖的影响。 方法体外组织贴块法培养大鼠中膜v m s c s ，细胞生长至近融合状态时用 0 2 5 胰蛋白酶消化传代，第3 代细胞用于本实验，实验共分为4 组：空白对照 组：给予p b s ；1 0 j o m o l ls a l u s i n p 组；1 0 一m o l ls a l u s i n p 组；1 0 。8 m o l l s a l u s i n p 组。实验方法包括：( 1 ) m t t 比色法检测v s m c s 的增殖状况；( 2 ) w e s t e r n b l o t 法检测p e r k l 2 1 拘表达；( 3 ) r t - p c r 法检测c l o s 、c m y cm r n a 表达。 结果( 1 ) 与对照组相比，s a l u s i n b 具有明显的促进v s m c s 增殖的作用， 而且在同州间点随着8 a l u 8 i n - 嘴趴1 0 。1 。“嚎1 0 培m o v d 坳，v s s 的吸光度值( a ) 增大( 尸 o 0 1 ) 。 t ( 2 ) w e s t e r n b l o t 结果显示，与对照组相比，v m s c s 经浓度为1 0 母和1 0 。8 m o l l 的s a l u s i n p 作用4 8h 后p - e r k l 2 表达均明显增加( 尸 o 0 1 ) ，而且s a l u s i n p 的浓 度越大，p e r k l 2 表达增加越明显。 ( 3 ) 增殖相关基因c m y c 表达的光密度值随着s a l u s i n d 浓度的增加( 1 0 。1 0 、1 0 一、 1 0 培m o l l ) 依次为：o 6 7 + 0 1 4 、0 9 6 + 0 0 1 、1 4 5 + 0 0 2 ，与对照组的0 4 9 士0 0 5 相比， 明显上调( p o 0 5 ) ；c f o s 基因表达的光密度值分别为：o 6 6 + 0 0 6 、0 8 4 + 0 0 1 、 1 2 4 士0 0 1 ，与对照组0 2 4 士0 0 1 相比，亦明显上调，差异具有统计学意义( 氏o 0 1 ) 。 结论s a l u s i n d 可能通过活化e r k l 2 ，诱导c m y c 、c f o s 基因表达，从而促 进v s m c s 增殖。 关键词s a l u s i n - p ；动脉粥样硬化；斑块；低密度脂蛋白；基因敲除小鼠；血 l _|： 徐州医学院硕+ 学位论文 管平滑肌细胞；增殖；e r k l 2 ；原癌基因 e f f e c to fs a l u s i n po nt h ep r o g r e s s i o no fa t h e r o s c l e r o s i si n l d l r - - m i c ea n dt h eu n d e r l y i n gm e c h a n i s m s a b s t r a c t p a r to n e ：t h ee x p r e s s i o no fs a l u s i n bi na o r t ao fl d l r - - a t h e r o s c l e r o t i cm i c e o b j e c t i v e t oo b s e r v et h ee x p r e s s i o no fs a l u s i n 一1 3 ，an e wv a s o a c t i v ep e p t i d e ，i n a o r t i co fl d l r m i c e m e t h o d ss i xm a l ec 5 7 b l 6 jm i c ew e r eu s e da sc o n t r o lg r o u pa n df e ds t a n d a r d m o u s ec h o wd i e t s s i xm a l el d u 己一- m i c ew e r eu s e da sm o d e lg r o u pa n df e dw e s t e r n d i e t sc o n t a i n i n g2 1 f a ta n do 1 5 c h o l e s t e r 0 1 a f t e r1 2w e e k s ，t h ee x p r e s s i o no f s a l u s i n pi nt h ea o r t aw a sd e t e c t e db yr t p c r ，w e s t e r nb l o ta n di m m u n o h i s t o c h e m i s t r y ， r e s p e c t i v e l y r e s u l t s c o m p a r e dw i t hc o n t r o lg r o u p ，t h ee x p r e s s i o no fp r e p r o s a l u s i nm r n a ， p r e p r o s a l u s i na n ds a l u s i n pi nm o d e lg r o u pi n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y ( p 0 0 5 ) ( 2 ) o i lr e dos t a i n i n gs h o w e dt h a tt h em i c ei nl d l r - 一g r o u pd e v e l o p e ds e v e r e a t h e r o s c l e r o t i cl e s i o n s ( p o 0 1 ) ， w h i c hw a s s i g n i f i c a n t l ya g g r a v a t e d b y s u p p l e m e n t a t i o nw i t hs a l u s i n p 衅0 0 5 ) ( 3 ) h & es t a i n i n gs h o w e dt h a tc o m p a r e dw i t ht h ec o n t r o lg r o u p ，t h e i n t i m a l t h i c k n e s so fm o d e lg r o u pa n ds a l u s i n - dg r o u pw a s i n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y ( p o 01 ) m o r e o v e r , t h ei n t i m a lt h i c k n e s so fs a l u s i n pg r o u pi st h i c k e rt h a nt h em o d e lg r o u p ( p o 0 1 ) c o m p a r e dw i t hc o n t r o lg r o u p ，t h e i mr a t i o so fm o d e lg r o u pa n ds a l u s i n - 1 3 g r o u pw e r es i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e d 衅o 0 5 ) c o m p a r e d w i t ht h em o d e lg r o u p ，t h ei m r a t i oo fs a l u s i n pg r o u pw a sa l s os i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e d ( 尸 o 0 5 ) c o n c l u s i o ns a l u s i n 6c a ni n c r e a s et h ea t h e r o s c l e r o t i cl e s i o n sa n dt h et h i c k n e s so f a o r t i ci n t i m ai nl d l r - m i c e p a r tt h r e e ：e f f e c to fs a l u s i n do nt h ep r o l i f e r a t i o no f v a s c u l a rs m o o t hm u s c l ec e l l s o b j e c t i v e t oo b s e r v et h ee f f e c to fs a l u s i n po nt h ep r o l i f e r a t i o no fv a s c u l a rs m o o t h m u s c l ec e l l s ( v s m c s ) a n di t su n d e r l y i n gm e c h a n i s m s m e t h o d s p r i m a r yv s m c s w e r ec u l t u r e db yt h et i s s u ee x p l a n t sm e t h o d t h ee f f e c t 7 o fs a l u s i n p ( 1 0 1 0 、1 0 。9 、1 0 8 m o l l ) o nv s m c sp r o l i f e r a t i o nw a sd e t e r m i n e db ym t t a s s a y t h ee x p r e s s i o no fp h o s p h o e r k1 2w a sd e t e c t e db yw e s t e r nb l o ta n a l v s i s t h e m r n a e x p r e s s i o n so f c m y ca n dc 1 0 sw e r em e a s u r e db vr t p c r r e s u l t s c o m p a r e dw i t h c o n t r o l g r o u p ，s a l u s i n ps i g n i f i c a n t l ys t i m u l a t e dt h e p r o l i f e r a t i o n o fv s m c s ，i n c r e a s e dt h ep r o t e i n e x p r e s s i o no fp h o s p h o e r k l 2 ，a n d p r o m o t e dt h em r n ae x p r e s s i o n so f c m y ca n dc f o s c o n c l u s i o ne r k l 2p a t h w a ym a yb ei n v o l v e di nt h ee f f e c to fs a l u s i n b o nt h e p r o l i f e r a t i o no fv s m c s k e y w o r d s ：s a l u s i n _ 1 3 ；a t h e r o s c l e r o s i s ；p l a q u e ；l o wd e n s i t yl i p o p r o t e i n ；g e n e k n o c k o u tm i c e ；v a s c u l a rs m o o t hm u s c l ec e l l s ；p r o l i f e r a t i o n ；e r k l 2 ；p r o o n c o g e n e 8 徐州医学院硕士学位论文 1 厶乓 h 青 动脉粥样硬化( a t h e r o s c l e r o s i s ，a s ) 导致的心、脑血管疾病严重危害着人类 的生命健康。在欧美国家和一些地区由冠状动脉粥样硬化引起的心脏病已成为人 群中首位的死亡原因。在我国，a s 的发病率正日益上升，而且呈现发病年龄逐渐 年轻化，发病程度更加严重的趋势。进一步探讨a s 的发病机制，寻找能够预防、 延缓a s 发生发展和逆转其病变的药物作用新靶点已成为当今医学科学家高度重 视的问题。a s 的发病过程漫长，病因和发病机制仍不十分清楚。近年来，随着细 胞生物学、分子生物学、免疫学、遗传学等学科的飞速发展和相互渗透，对a s 的 病因学有了新的认识和发展，从而为其防治指明了研究方向。a s 的发生过程是多 因素参与的，涉及动脉壁细胞、细胞外基质、血液成分、血流动力学、环境及遗 传等诸多方面。 s a l u s i n s 是由同本学者s h i c h i r i 等【1 】于2 0 0 3 年发现的一种新的内源性的心血管 活性肽，包括2 8 个氨基酸的s a l u s i n 一0 【$ 1 2 0 个氨基酸的s a l u s i n p 两种，是编码人类扭 转应力障碍基因( t o r s i o nd y s t o n i a ) 一t o r 2 a 的选择性剪接产物。s a l u s i n s 在血浆、 尿液及人体的大多数组织内均可合成和表达【1 ，2 1 。研究显示，s a l u s i n s 具有降低血压、 减慢心率、促进细胞增殖肥大、促进垂体精氨酸加压素释放、抑制心肌细胞凋亡 等多种心血管效应【1 ，3 ，4 1 ，提示s a l u s i n s 可能通过自分泌旁分泌方式参与了多种心血 管活动的调节，具有重要的病理和生理意义。 w a t a n a b e 等【5 6 1 研究显示，冠状动脉粥样硬化患者血清s a l u s i n a 水平明显低于 轻度高血压患者以及正常人群，而且s a l u s i n 0 【可能通过降低酰基辅酶a 胆固醇酰基 转移酶1 ( a c a t - 1 ) 表达及活性从而抑制泡沫细胞的形成，而s a l u s i n p 则可以通 过增强a c a b l 的表达及活性从而促进泡沫细胞的形成，这一结果提示s a l u s i n s 与 a s 之间具有相关性，s a l u s i n 0 【可能抑制a s 的发生发展，而s a l u s i n d 则可能促进a s 9 的s a l u s i n b 对a s 发展的影响，并初步探讨了其作用机制。 1 0 徐州医学院硕十学位论文 第一部分s a l u s i n p 在l d l r - 一动脉粥样硬化模型小鼠主动脉的表达 研究提示，s a l u s i n p 可能促进了a s 的发生发展，为了证实s a l u s i n p 与a s 的 关系，我们首先观察了s a l u s i n 。b 在l d l r a s 模型小鼠主动脉内的表达情况，并 与c 5 7 b l 6 j 正常对照小鼠进行比较，进而为第二、三部分实验提供基础。 材料和方法 l 材料 i i 实验动物 6 只六周龄雄性、c 5 7 b l 6 j 背景的l d l r o 小鼠和6 只c 5 7 b l 6 j 小鼠均购自 南京大学模式动物研究所。 1 2 主要试剂及药品 s a l u s i n - p p h o e n i x p h a r m a c e u t i c a l s 公司 a n t i - h u m a ns a l u s i n pa n t i b o d yp h o e n i x p h a r m a c e u t i c a l s 公司 s d s p a g e 蛋白上样缓冲液碧云天生物技术研究所 b c a 蛋白浓度测定试剂盒碧云天生物技术研究所 s d s p a g e 凝胶配置试剂盒碧云天生物技术研究所 w e s t e r n 封闭液碧云天生物技术研究所 n b t b c i p 显色试剂盒碧云天生物技术研究所 w e s t e r n 一抗稀释液碧云天生物技术研究所 w e s t e r n 二抗稀释液碧云天生物技术研究所 硝酸纤维素膜 a m e r s h a mb i o s c i e n c e s 公司 d a b 试剂盒武汉博士德生物公司 徐州医学院硕士学位论文 s a b c 法免疫组化染色试剂盒武汉博士德生物公司 a p 标记山羊抗兔i g g 北京中杉公司 总r n a 提取及聚合酶链反应试剂盒天根生化科技( 北京) 有限公司 p r e p r o s a l u s i n 引物 上海生工生物工程技术有限公司 1 3 主要仪器设备 5 4 1 7 r 台式高速冷冻离心机德国e p p e n d o r f 公司 z f p 型紫外手提式分析仪上海长明光学电子仪器厂 3 7 c 恒温水浴箱浙江美晨公司 j a 2 0 0 3 上皿电子天平上海精科天平公司 低温冰箱美国f o r m a 公司 p h 3 t c 精密数显酸度计上海第二分析仪器厂 j a 3 0 0 3 电子天平上海第二天平仪器厂 倒置相差显微镜日本o l y m p u s 公司 t s 1 型脱色摇床海门市麒麟医用仪器厂 1 2 8 c e 酶标仪奥地利c l i n i b i o 公司 d y y - i i l 2 型稳压稳流电泳仪北京六一仪器厂 l e i c a 冰冻切片机 德国 1 4 主要试剂的配制 1 2 分离胶和5 浓缩胶的配制 1 2 分离胶( 1 5m l )5 浓缩胶( 8m l ) 超纯水 3 0m l5 5m l 3 0 a c r b i c ( 2 9 ：1 ) 6 0m l1 3m l 1 5m o l lt r i s h c l ( p h 8 8 )5 7m l o 5m o l lt r i s h c l ( p h 6 8 ) 一 1 0m l 1 0 s d s 1 5 0l x l 8 0 “l 1 2 徐州医学院硕士学位论文 1 0 a p 1 5 0l , t l 8 0r t l t e m e d6i t l8i t l 2 方法 2 1 动物分组及饲养 6 只c 5 7 b l 6 j d 、鼠作为正常对照组，予以普通饲料喂养，6 只l d l r - 小鼠 作为模型组，给予高脂肪饲料( 其中含2 1 的脂肪和o 1 5 胆固醇) 喂养1 2 周以 促成动脉粥样斑块的形成。 2 2 胸主动脉p r e p r o s a l u s i nm r n a 的l 玎- p c r 测定 2 2 1 胸主动脉总r n a 的提取步骤 ( 1 ) 各组胸主动脉包于锡箔纸中放于液氮中冻存约1m i n 后，取出砸细充分破坏 组织。分别放于离心管中。 ( 2 ) 每组加入1m l 裂解液。 ( 3 ) 吹打后室温放置5m i n ，使核酸蛋白复合物完全分离。 ( 4 ) 加入2 0 01 t l 氯仿，剧烈震摇1 5s ，室温放置3m i n 。 ( 5 ) 4 c ，1 2 0 0 0r p m ，离心1 0m i n ，将上层水相移至新管中。 ( 6 ) 缓慢加入o 5 倍体积无水乙醇，混匀。将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱 中，4 c ，1 2 0 0 0r p m ，离心3 0s 。弃掉收集管中的废液。 ( 7 ) 向吸附柱中加入5 0 0 此去蛋白液( 用前按说明加入无水乙醇) ，4 c ，1 2 0 0 0 r p m ，离心3 0s ，弃废液。 ( 8 ) 向吸附柱中加入7 0 0 此漂洗液，室温静置2m i n ，4 c ，1 2 0 0 0r p m ，离心3 0 s ，去除残余液体。 ( 9 ) 向吸附柱中加入5 0 0t x l 漂洗液，室温静置2r a i n ，4 c ，1 2 0 0 0r p m ，离心3 0 s ，去除残余液体。 ( 1 0 ) 将吸附柱放入2m l 收集管中，4 c ，1 2 0 0 0 r p m ，离心2r a i n ，去除残液。 ( 1 1 ) 吸附柱充分晾干后，转入新离心管中，加5 0 “l 无核酶水，室温放置2r a i n ， 徐州医学院硕十学位论文 4 c ，1 2 0 0 0r p m ，离心2m i n 。将洗脱的溶液一7 0 。c 保存备用。 2 2 2 p r e p r o s a l u s i n 的r t - p c r 扩增 每组取5 “g 总r n a 逆转录成为c d n a 后，取5 “1c d n a 进行p c r 扩增。 p r e p l o s a l u s i n 上下游引物序列如下：上游：5 c a ct t cc c c c a c c c ca g c c a c a 3 ，下游：5 - c c ga c ac t cc g t t c at c tc a ct 一3 ，扩增长度为5 6 5b p 。 g a p d h 上下游引物序列如下：上游：5 a t gg a a g a a g a a a t gc c gc 3 ， 下游：5 一a c ac g ca g ct c gt t gc a ga a 3 ，扩增长度为2 8 7b p 。反应条件： 9 4 。c 变性3 0s ，6 5 c j l 萎火1m i n ，7 2 延伸1m i n ，3 0 个循环【1 1 。 2 2 3 电泳 称取0 4 5g 琼脂糖，倒a 3 0m l 1x t b e 缓冲液中配制成1 5 的琼脂糖凝胶， 微波加热，冷却至6 0 c 左右加入4 “l 溴化乙锭( e b ) ，倒入模具中，室温静置3 0 r a i n 。电泳条件为1 0 0v 、3 0m i n 。将p r e p r o s a l u s i n 与g a p d h 的p c r 产物在1 5 的 琼脂糖凝胶中进行电泳。置于凝胶图象分析软件q u a n t i t yo n e ( 美国伯乐公司) 进 行光密度分析，用p r e p r o s a l u s i n 的光密度值与g a p d h 光密度值的比值表示目的基因 p r e p r o s a l u s i nm r n a 的相对表达量。 2 3 主动脉中p r e p r o s a l u s i n 蛋白含量测定 2 3 1蛋白质样品的制备 ( 1 ) 以上各组主动脉充分剪碎，破坏组织，加入4 0 0g l 含p m s f 的裂解 液匀浆。 ( 2 ) 匀浆后于冰上裂解3 0m i n ，期间不断摇动使充分裂解。 ( 3 ) 裂解完后4 1 2 0 0 0r p m 离心5m i n 。 ( 4 ) 将离心后的上清分装转移到0 5m l 的离心管中，2 0 保存。 2 3 2 按b c a 蛋白浓度测定试剂盒所示方法测定样品蛋白浓度。 2 3 3 s d s p a g e 电泳 ( 1 ) 玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上准备灌胶。 1 4 待浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子竖直向上轻轻将其拔出。 ( 4 ) 用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中，加入足量电泳液。 ( 5 ) 将样品按3 ：1 比例加入溴酚蓝，并于沸水中煮5m i n ，计算1 0 0 “g 蛋 白的溶液体积即为上样量。用微量进样器贴壁吸取样品，缓缓加入加 样孔中，在最左侧孔中加入5h lm a r k e r 。 ( 6 ) 恒压1 0 0v ，待溴酚蓝刚好跑出浓缩胶后，电泳至溴酚蓝刚跑出分离 胶即可。 2 3 4 转膜 ( 1 ) 在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、海绵、玻棒、滤纸和硝 酸纤维素膜。 ( 2 ) 将夹子打开使黑面向下，在上面垫一张海绵，用玻棒赶走气泡，在海 绵挚上垫3 层滤纸。 ( 3 ) 撬开玻璃板，将浓缩胶轻轻刮去，p r e p r o o s a l u s i n 蛋白分子量为2 6k d a ， 1 3 - a c t i n 分子量为4 3k d a ，根据m a r k e r 显示，在所需分子量上下o 5c m 裁胶。小心剥下胶条置于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐。将膜盖于 胶上，并在膜上盖3 张滤纸和另一张海绵垫，将夹子夹起。整个操作在 转移液中进行，并不断擀去气泡。 ( 4 ) 将夹子放入转移槽中，并在夹子中加满转移液。在转移槽中加入冰水， 避免转移时大量产热。恒流3 5 0m a ，转移6 0m i n 。 2 3 5免疫反应 ( 1 ) 膜用t b s 浸润后移至含有封闭液的表面皿中，在脱色摇床上封闭1h 。 ( 2 ) 从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下放于一抗 徐州医学院硕：卜学位论文 液面上。4 c 孵育过夜。 ( 3 ) 将膜从一抗中取出，用t b s t 在脱色摇床上洗两次，每次1 0m i n ；再 用t b s 洗一次，1 0m i n 。将膜放于二抗液面上，室温下孵育2h 后，同 上方法用t b s t 和t b s 洗涤。 2 3 6 染色 ( 1 ) 将膜放在表面皿内，在膜上滴加b c i p n b t 显色液，避光在摇床上显色 1 5m i n 左右。 ( 2 ) 显色完成后将膜取出，用水冲洗，停止染色。 2 3 7 结果分析对所得蛋白质条带利用i m a g ej 分析软件进行灰度分析，以 p r e p r o s a l u s i n 与1 3 - a c t i n 灰度的比值表示目的蛋白的相对表达含量。 2 4 切片的制备 分离出各实验组小鼠胸主动脉到主动脉弓的动脉血管，并清除其周围粘附的 结缔组织，1 0 中性甲醛固定。o c t 包埋后制备动脉血管连续冰冻切片，每例样 本五张，每张切片厚度为1 0p m 。p b s 冲洗3 次，每次1 0m i n 。贴附于预处理的载 玻片上。 2 5 免疫组织化学( s a b c 法) 染色 ( 1 ) 于载玻片上滴! j n 3 h 2 0 2 封闭2 0m i n ； ( 2 ) p b s 冲洗5m i n x 3 次； ( 3 ) 5 血清封闭2 0m i n ( 甩掉载玻片上的血清，免洗) ； c 4 ) 滴加兔抗人s a l u s i n p 抗体，4 c 冰箱过夜； ( 5 ) p b s 冲洗1 0m i n x 3 次： ( 6 ) 滴加辣根过氧化酶标记的山羊抗兔二抗，室温孵育2h ； ( 7 ) p b s 冲洗1 0 m i n x 3 次； ( 8 ) 滴力h s a b c 复合物室温孵育2h ； ( 9 ) d a b 显色，光镜下观察； 1 6 徐州i 医学院硕士学位论文 ( 1 0 ) 自来水冲洗终止反应； ( 1 1 ) 脱水：依次为7 0 、8 0 、9 5 的酒精各3 0s ，1 0 0 酒精i 、1 0 0 酒精i i 各1m i r a ( 1 2 ) 透明：二甲苯i 、二甲苯i i 各1m i n ； ( 1 3 ) 封片：中性树胶常规封片，光镜下观察。 ( 1 4 ) 用i m a g e p r op l u s6 o 图像分析软件计算s a l u s i n p 的积分光密度。 2 6 统计学分析 所有计量资料以均数士标准差( m e a n 士s d ) 表示，用s p s s l 3 0 统计软件进行 分析，两样本比较采用t 检验，多组间比较先用单因素的方差分析( o n e w a y a n o v a ) 比较组间有差异的基础上，再用q 检验进行组间的两两比较，p 0 0 5 表示差别有统计学意义。 1 7 徐州医学院硕士学位论文 结果 1 p r e p r o s a l u s i nm r n a 的表达 r t - p c r 灰度分析结果表明：模型组的p r e p r o s a l u s i nm r n a 表达较正常对照组明 显增加( 尸 0 0 1 ) ( 图1 ) 。 2 p r e p r o s a l u s i n 蛋白含量的测定结果 w e s t e r nb l o t 结果显示，与正常对照组相比，模型组小鼠主动脉i 为p r e p r o s a l u s i n 蛋白含量明显增加( p o 0 1 ) ，差异具有统计学意义( 图2 ) 。 3 免疫组化分析结果 免疫组织化学分析染色光镜下发现，各组小鼠在内皮细胞和v s m c s 中都有 s a l u s i n d 阳性染色，并且其主要在胞浆部分表达。且在外膜的脂肪组织较多的部位 也有大量的阳性染色。与正常对照组相比模型组小鼠s a l u s i n b 在v s m c s 层及内膜 层表达较多( 图3 ) 。积分光密度分析结果显示，正常对照组、模型组的s a l u s i n d 积分光