（水生生物学专业论文）南方鲇dmrt1及其亚型cdna的克隆和表达的研究.pdf

独创性声明 x9 0 2 0 3 7 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得西南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我 一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的 说明并表示谢意。 学位论文作者：未1 1 智b 彦 签字日期：一，矽年月，日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院可以将学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：曰不保密， 口保密期限至年月止) 。 学位论文作者签名：剀智准 签字日期：邪多年占月，日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 导师签名：刁河彩 签字日期：声卵莎年石月j - - 日 电话 邮编 南方鲇1 ) m r t l 及其亚型全长e d n a 的克隆和 表达的研究 专业硕士研究生刘智皓 指导教师：王德寿 内容摘要 本研究采圳r t - p c r 与s m a r tr a c e 相结合的方法从南方鲇( s i l u r u sm e r i d i o n a l i s ) 克 隆得至j j d m r t l 及其亚型全长c d n a 。南方自d i d m r t l ( s o u t h e r nc a t f i s hd m r t l ，s c d m r t l ) c d n a 全k = 1 3 4 7 b p ，包括一个编i - b 2 9 5 个氨基酸的开放阅读框、一个加尾信号( a a t a a a ) 和一个 p o l y ( a ) 尾巴。s c d m ，f ，亚型c d n a 全长1 5 1 3 b p ，包括一个编码2 7 1 个氨基酸的开放阅读框 和一个p o l y ( a ) 尾巴。s c d m r t l 7 及其型含有所有d m 基因具有的典型特征d m d o m a i n 。 序列对比发现s c d m r t l 及其型与革胡子鲜i d m r t l 最相似，它们同属d ，h r ，卜一类群区别于 d m r t 2 8 。 在对s c d m r t l 及其弧型的序列分析中发现，它们只有3 末端有区别而在5 端则完全相 同。冈此我们推；坝t j s c d m r t l 弧型是由于其前体m r n a 在3 末端通过选择性剪切产生的。同时， 通过扩增s c d m r t l 基因第4 、5 个内含子的片段萃“对其它脊椎动物d m r t l 基网结构的分析，我 们推剃u s c d m r t l 基因可能禽有6 个外显子，区别于其它脊椎动物的5 个外显子。测序结果表明 扩增片段中包含了属丁第4 和第5 个外显子部分和内含子的供体位点( g t ) 和受体位点( a g ) 。 冈此我们推测s c d m r t l 的剪接模式不同于s c d m r t l 型，其产生是由于将s c d m r t l 前体m r n a 剪切掉了第5 个外显子，并拼接上最后一个外显子形成，而其亚型则由其前5 个外显子拼接而 成。 另外，我 门对s c d m r t l 及其亚型在南方鲇备组织中的表达进行了研究。研究表明s c d m r t l 及其弧型在精巢和卵巢均有表达，表达量都是精巢高于卵巢。尤其是s c d m r t l 亚型在精巢的 表达远远高于卵巢。s c d m r t l 为雌雄性腺特异表达，而其弧裂高表达于性腺，同时在雄鱼微 弱表达丁肠和肾脏。 用雌激素e 2 、芳化酶抑制剂f a d r o z o l e 和雌激素受体拮抗剂t a m o x i f e n 对孵化后( d a y s a f t e rh a t c h i n g ，d a b ) 5 天的南方鲇仔鱼进行浸浴处理2 0 天。6 5 d a h 时的检测表明在f a d r o z o l e 处理组和t a m o x i f e n 处理组，s c d m r t l 及其弧型的表达上调，而e 2 组荆i 对照组没有s c d m r t l 2 及其弧刑的表达。研究同时发现f a d r o z o l e 牙jt a m o x i f e n 同对处理组s c d n c r t i 及其厢刑冉勺表 达没有明显上调。在对芳化酶表达的研究中，我们发现f a d r o z o l e 、t a m o x i f e n 处理编和 f a d r o z o l e 和t a m o x i f e n 同时处理组卵巢型芳化酶的表达均铍下凋，而脑刑芳化酶的表达没 有明显变化。 组织学观察表明，f a d r o z o l e 处理组的卵巢出现了一定程度卵母细胞的退化和生殖上皮 的增生t 并发现存在有丝分裂中的性母细胞。研究表明f 组个体的卵巢可能正处于从向精 巢转变的过样中。本研究在6 5 d a h 没有得到雄鱼。 关键词：南方鲇o m r t l 亚型选择性剪切诱导性逆转芳化酶表达 m o l e c u l a r c l o n i n ga n de x p r e s s i o no f t h e d m r t la n di s o f o r mc d n a si ns i l u r u s m e r i d i o n a l i s l i uz h i h a o s u p e r v i s e db yp r o f iw a n gd e s h o u a b s t r a c t r t - p c ra n ds m a r tr a c ew e r ep e r f o r m e dt oo b t a i n d m r t l ( s o u t h e r nc a t f i s hd m r t l ， s c d ，l l + ，) a n di t si s o f o r m ( i s oi ns i l u r u sm e r i d i o n a l i s f u l ll e n g t hc d n ao fs c d m r t lc o n s i s t so f 1 3 4 7 b a s e p a i r s ( b p ) ，c o n t a i n i n ga no p e nr e a d i n gf r a m e ( o r f ) w h i c he n c o d e sap o l y p e p t i d ew i t h 2 9 5a m l n o d a c i d s ，ap o l y a d n e n y l a t i o ns i g n a l ( a a t a a a ) a n dap o l y ( a ) t a i l p u l ll e n g t hc d n ao f s c d m r t li s fc o n s i s t so fi51 3 b p ，c o n t a i n i n ga no r fw h i c he n c o d e sap o l y p e p t i d ew i t h2 71a m i n o a c i d sa n dap o l 九a ) t a i ls c d m r t la n di t si s o f o r mc o n t a i nat y p i c a lc h a r a c t e rs h a r e d b yo t h e rd m g e n e s - - d m d o m a i na l i g n m e n ts h o w ss c d m r t la l o n gw i t hi t si s o f o r ma r em o s ts i m i l a rt ot h a to f n o r t h e r nc a t f i s hd m r t l a l lo f t h e mb e l o n gt ot h ed m r t lg r o u p ，d i f f e r e n tf r o md m t 。t 2 8g r o u p s s c d m r t li s fw a sf o u n dd i f f e r e n tf r o ms c d m r t o n l ya tt h e3 e n db ys e q u e n c ea n a l y s i s ，w i t h t h ei d e n t i c a ls e q u e n c e sa tt h e5 1e n d t h u sw ec o n j e c t u r el h a lt h ef o r m a t i o no fs c d m r t li s f i sd u e t o t h ea l t e r n a t i v es p l i c i n g o f p r e c u r s o r m r n ao fs c d m r t l w i t h i n t h e3 e n d t h ec l o n i n go f t h e4 t h a n d5 t hi n t r o n so fs e d m r t la n dt h eg e n es t r u c t u r ea n a l y s i so fo t h e rv e r t e b r a t ed m r t ls h o w e dt h a t s c d m r t lg e n ep r o b a b l yc o n t a i n s6e x o n s ，d i f f e r e n tf r o mt h o s eo fo t h e rv e r t e b r a t e sw h i c hc o n t a i n5 e x o n st h u sw ei n f e rt h a tt h e5 t he x o no fs c d m r t lp r e c u r s e rm r n ai ss p l i c e di np r o d u c i n g s c d i n r t l w h e r e a ss e d ，n r t li s f c o n s i s to f t h ef o r m e r5e x o n s s e m i - q u a n t i t a t i v ea n a l y s i sw a sp e r f o r m e dt oe x a m i nt h ee x p r e s s i o np a t t e r no fs c d m r t la n d i si s o f o r mi nb o t hs e x e so fs o u t h e r nc a t f i s hi no r d e rt of i g u r eo u tt h e i rf u n c t i o nt h er e s u l t s s h o w e dt h a tb o t hs c d m r t la n di t si s o f o r me x p r e s s e di nt h eg o n a do fb o t hs e x e s ，h i g h e ri nt e s t e s t h a ni no v a r i e s f u r t h e r m o r e t h ee x p r e s s i o no fs c d m r t li s o f o r mi nt e s t e sw a sm u c hh i g h e rt h a ni n o v a r i e sb e s i d e s ，s c d m r t li s o f o r me x p r e s s i o n sw e r ef o u n di nn o n - g o n a dt i s s u e s ，o nt h eo t h e rh a n d ， s c d m r t lw a sf o u n dt ob ee x p r e s s e de x c l u s i v e l yi ng o n a d so f b o t hs e x e s d r u gt r e a t m e n t sw i t he 2 ，f a d r o z o l ea n dt a m o x i f e no nt h ef r i e so fs o u t h e r nc a t f i s h w e r e p e r f o r m e d5d a y sa f t e rh a t c h i n g ( d a b ) i no r d e rt of i g u r eo u tt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e ns c d m r t l a l o n gw i t hi t si s o f o r ma n da r o m a t a s e r e s u l t ss h o w e dt h a ti nt h eg r o u p st r e a t e dw i t hf a d r o z o l ea n d t a m o x i f e n ，r e s p e c t i v e l y , t h ee x p r e s s i o n so fs c d m r t a n di t si s o f o r mw e r eu p r e g u l a t e de v i d e n t l y w h e r e a st h ee x p r e s s i o n so fs c d m r t la n di t si s o f o r mf a i l e dt ob ed e t e c t e di nt h ec o n t r o lg r o u pa n d t h eg l n a pt r e a t e dw i t he 2 h o w e v e rt h ee x p 一 e s s i o no f s c d m r t la n di t si s o f o r mi nt h eg r o u pt r e a t e d w i t hb o t hf a d r o z o l ea n dt a m o x i f e nd i d n ts h o wa n yt r a c eo fu p r e g u l a t i o n a tt h es a m et i m e ，t h e e x p r e s s i o n so f o v a r i a nt y p ea r o m a t a s ei ng r o u p st r e a t e dw i t hf a d r o z o l e ，t a m o x i f e n ，f a d r o z o l ea n d t a m o x i f e nr e s p e c t i v e l yw e r ed o w n r e g u l a t e d ，w h i l et h ee x p r e s s i o n so fb r a i nt y p ea r o m a t a s ei na l g r o u p sr e m a i nn oe v i d e n td i f f e r e n c e h i s t o l o g i c a l o b s e r v a t i o n sr e v e a l e dt h a to o c y t ed e g e n e r a t i o n ，t h e h y p e r p l a s i ao fg e n i t a e p i t h e l i u ma n dt h ee x i s t a n c eo fg e r mc e l li nm i t o s i sp h a g eo c c u r r e di ni n d i v i d u a l st r e a t e dw i t h f a d r o z o l e ，i n d i c a t i n gt h a tg o n a d so f t h e s et r e a t e df i s hw e r eu n d e r g o i n gt r a n s f o r m a t i o nf r o t ho v a r y t ot e s t i s n oc o m p l e t es e xr e v e r s e dm a l ei n d i v i d u a l sw e r eo b t a i n e du pt o6 5 d a hi no u rr e s e a r c h k e yw o r d ：s i l u r u sm e r i d i o n a l i s ；d m r t i ；i s o f a r m ；a l t e r n a t i v es p l i c i n g ：i n d u c e ds e x r e v e r s a l ；a r o m a t a s e ；e x p r e s s i o np a t t e r n 4 1 前言 性别是生物最基本的生命特征之一，但是不同生物的性别决定机制又大相径 庭，表现为极端的多样性。脊椎动物大致存在两种不同的性别决定机制：遗传依 赖性性别决定( g e n e t i cs e xd e t e r m i n a t i o n ，g s d ) 和环境依赖性性别决定 ( e n v i r o n m e n ts e xd e t e r m i n a t i o n ，e s d ) 。在高等脊椎动物，如哺乳类和鸟类的性 别主要由性染色体上的遗传基因决定；而在低等脊椎动物，由于进化的原始性， 很多种类两性性染色体无差异，有的甚至完全缺乏性染色体，因此外界环境如： 温度，类固醇激素，种问和种内关系等因素在性别决定和分化过程中有重要作用， 甚至胚胎发育过程中外界环境因素的变化可以完全掩盖遗传因素的作用，从而成 为性别发育的决定因素。伴随着脊椎动物从低等到高等进化，性别决定和分化机 制在不同种类呈现明显的变化：遗传因素的作用逐渐增强，而环境因素的影响在 削弱，直到哺乳类和鸟类，环境因素的作用最终完全被遗传因素取代( 王德寿等， 2 0 0 0 ) 。 1 1 脊椎动物的性别决定 1 1 1 哺乳类的性别决定 哺乳类的性别决定类型为x y 型，是典型的遗传依赖性性别决定的动物， s r y ( s e xd e t e r m i n a t i o nr e g i o no nyc h r o m o s o m e ) 被发现后，经过各地学者十几 年的努力，其性别决定基因级联已仞具雏形。其中曲y 被认为是整个性别决定级 联的最上游总丌关，在s r y 的下游，有转录因子w t l ( w i l m s t u m o rg e n e1 ) 、s o x 9 ( s r yr e l a t e dh m gb o xg e n e9 ) 、a d 4 b p s f l ( s t e r o i d o g e n i cf a c t o r1 ) ，d a x l ( d s s a h co nxc h r o m o s o m e1 ) 、d m r t l ( d m r e l a t e dt r a n s c r i p t i o nf a c t o r1 ) 等 和生长因子b m p t g f 、f g f 、阡w r 等共同作用完成哺乳类的性别决定通路( 周 林燕等，2 0 0 4 ) 。 研究表明，小鼠( m u sm u s c u l u s ) w t l 等位基因灭活( i n a c t i v eo fb o t hw t l a l l e l e s ) 后的胚胎性腺和肾脏不能正常发育，且w t l 等位基因灭活对小鼠是致死 的( k r e i d b e r ge t a l ，1 9 9 4 ) 。而s f l s f l 是人类( h o m os a p i e n s ) 和小鼠性腺和肾 上腺发育必不可少的：s f ，异源灭活突变( h e t e r o z y g o u si n a c t i v a t i n gm u t a t i o n ) 的 病人出现性逆转，并且肾上腺不能形成；小鼠s f l 等位基因灭活导致肾上腺和性 腺- 7 e , 形成。s o x 9 是目前已知的s t y 仅有的直接调节目标基因，在s r y 表达后被 激活，并出现雄性特异上调( l o v e l l b a d g e ，2 0 0 2 ) ，在下游将与w t l 、怠，= 协同 作_ _ 激活a m h ( a n t i m u l l e r i a n h o r m o n e ) 的表达，进而抑制缪勒氏管的发育。d a x l 突变的雄性小鼠，s r y 的表达接近野生型，只是下游s o x 9 的表达大大减少，凶此 d a x l 可能是在s r y 下游和s o x 9 的上游起作用，它的突变会导致雄性发育紊乱 ( m e e k se ta l ，2 0 0 3 ：a r g e n t ee la l ，2 0 0 3 ) 。d m r t l 在哺乳类雄性发育中有重要 作用。小鼠胚胎两性未分化生殖嵴d m r t l 的表达水平相似，在分化阶段出现精 巢特异表达上调，在卵巢中的表达量减少( r a y m o n d ，1 9 9 9 a ) 。人类d m r t l 若处 于半合子状态，则导致精巢发育缺陷而产生x y 雌性( r a y m o n d ，1 9 9 9 b ) 。另一 方面，生长因子( b m p t g f 、f g f 、w n t 等) 在性腺分化中州1 ，转录r 的沂 动( s c h m a h la n dc a p e l ，2 0 0 3 ；m o r o h a s h i ，2 0 0 2 ) 。 1 1 2 鸟类的性别决定 鸟类( 平胸类除外) 的遗传性别决定方式不同于哺乳类，为雄性同配( z z ) ， 雌性异配( z w ) 。而且鸟类和哺乳类的性染色体没有明显的同源性，相反，鸟类 的z 染色体可能与人类第9 号染色体同源( n a n d ae la l ，1 9 9 9 ) 。迄今为止，在 鸟类中尚未发现类似哺乳类s r y 的性别决定总开关基因。关于鸟类性别决定有w 显性基因、z 染色体剂量和共同作用3 种假说( t i a n ，1 9 9 6 ) 。 长期以来，人们一直认为类似于哺乳类s r y 性别决定基因存在于异配染色体， 所以近年来一些鸟类雌性w 染色体上的特异基因相继被克隆，如：c h d ( c h r o m o d o m a i n h e l i c a s e d n a b i n d i n gp r o t e i n ) 、a s w ( a v i a ns e x - s p e c i f i c w - l i n k e d ) 和砑7 ，( f e m a l e e x p r e s s i o nt r a n s c r i p t ，n u m b e r1 ) 等。c h d w 基凶位 于w 染色体上，与小鼠的c h d i 高度同源，可以通过改变染色体结构调节转录， 但表达模式和功能尚未见报道( e l l e g r e n ，1 9 9 6 ) 。目前的研究表明，a s w 的m r n a 早在4 5 天胚胎尚未完全分化的卵巢髓质中就已经出现高表达，并在卵巢分化的 整个阶段和成体卵巢都有表达，而雄性则完全缺乏( o n e i l le ta l ，2 0 0 0 ) ；胛丌 也仅在将发育为雌性性腺的性分化时期表达，通过在z z 雄性过量表达e f 丌可 诱使雄性到雌性的性逆转，这表明该基因在鸟类雌性性别决定中可能有重要作用 ( s m i t he t a l ，2 0 0 3 ) 。 另一方面，较多的研究认为，位于z 染色体上的d m r t l 檄有可能是鸟类雄 性性别决定候选丛因。早在第4 5 天的鸡( g a l l u sg ( d l u s ) 胚胎泌尿生嫡嵴就出 现了雌雄差异性表达，雄性明显高于雌性。d m r t l 在z w 雌性中的过量表达可以 引起性逆转。此外，在用芳化酶抑制剂( f a d r o z o l e ) 处理雌性鸡胚产生性逆转时， 检测到性腺中d m r t l 的表达达到f 常雄性胚胎表达的水平，同时s o x 9 的表达也 被激活( 但s o x 9 的激活明显迟于d m r t l 的上调) ，因此作者认为d m r t l 表达水 平上调在本质上与精巢发育有关( s m i t he t a l ，2 0 0 3 ) 。鸟类是否存在类似哺乳类 的剂量补偿作用一直有争议。鸟类可能不存在z 染色体失活，d m r t l 的表达水平 可能与z 染色体的数量有关，因为雄性两个拷贝( z z ) 的表达高于雌性( z w ) ( s m i t he la l ，1 9 9 9 ) 。 1 1 3 爬行类的性别决定 爬行类足温度依赖性别决定( t e m p e r a t u r es e xd e t e r m i n a t i o n ，t s d ) 最典型的 代表。研究发现，t s d 在鳄日、龟鳖目和有鳞目广泛存在( 焦保卫等，2 0 0 2 ) 。 在胚胎孵化的温度敏感期，温度的变化可以完全掩盖遗传因子的作用从而影响胚 胎的性别分化。但用雌激素在雄性促进温度( m a l ep r o m o t i n gt e m p e r a t u r e ，m i t ) 处理9 睁化胚胎，可以诱导产生雌性个体，这表明雌激素在爬行类t s d 中有重要 作用。另有研究发现，芳化酶在未分化性腺和m p t 孵化胚胎的表达量很低，而 在雌性促进温度( f e m a l ep r o m o t i n gt e m p e r a t u r e ，f p t ) 孵化胚胎的表达水平明显 增加。因此f p t 可能通过诱导芳化酶的表达上调，进而与雌激素协同作用促进 胚胎雌性分化；相反，m p t 可能抑制芳化酶的表达从而诱导雄性发育( p i e a ue la l ， 1 9 9 9 ) 。 研究发现，红耳滑龟( t r c h e m y ss c r i p l ( , 1 ) 、北美短吻鳄( a l l i g a t o r m i s s i s s i p p i e n s i s ) 和橄榄龟( l e p i d o c h e 舾o l i v a c e a ) 等s o x 9 的表达具有雄性4 异 性特征( s p o t i l ae l a l ，1 9 9 8 ；w e s t e r ne l a l ，1 9 9 9 ；m e r e n o m e n d o z ae t a l ，1 9 9 9 ) 。 在刘橄榄龟的研究中发现，s o x 9 的表达受温度调控：其在m p t 和f p t 孵化肛胎 的温度敏感期( 2 1 - - 2 5 阶段) 都有表达，而到f p t 孵化胚胎发育的2 6 阶段，s o x 9 的表达下调。d m r l l 的表达也是温度依赖的：在m p t 和f p t 孵化胚胎的生殖嵴 中肾复合体都有表达，但到温度敏感期的2 3 - - 2 5 阶段，m p t 发育胚胎性腺的 d m r t i 表达水平均高于雌性。因此，s o x 9 的下调和d m r t l 的上调可能分别在雌 性和雄性温度性别决定中有重要作用( t o r r e sm a l d o n a d oe la l ，2 0 0 2 ) 。 另外，s f l 在北美短吻鳄f p t 胚胎的整个发育阶段( 2 0 - - 2 7 ) 的表达量不变， 而在m p t 的2 3 - - 2 5 阶段出现明显下调，同时雌性个体芳化酶的表达在这一阶段 出现明显上调( w e s t e r ne t a l ，2 0 0 0 ) 。另外，研究表明, 4 m h 在北美短吻鳄发育中 仅在精巢有表达，这种表达在雌性芳化酶上调之前就已经存在，所以a m h 在m p t 发育胚胎可能抑制芳化酶表达水平的增加。 1 1 4 两栖类的性别决定 两栖类性别决定中温度、类固醇激素、遗传因素的作用都不像其他种类那 样明显，染色体组型也极其复杂( 有x x x y 或z w z z ，某些种类甚至进化为极 不寻常的o w 雌o o 雄，或者是x x e k y 和z w z z 在同种内共存) ( s c h m i da n d s t e i n l e i n ，2 0 0 1 ) 。虽然在自然状态下，环境变化诱导性逆转的例子很少，但通过 改变实验胚胎孵化条件( 如温度、类固醇激素) ，很多种类可以改变其性别分化， 从而产生完全的性逆转。类固醇激素在蛙性别发育中也有重要作用，但外源类固 醇激素处理的作用则没有规律，即使在种内差别也很大，甚至完全相反。所以部 分两栖类属于e s d 的种类，遗传因素在性别决定中可能也有重要作用。 s h i b a t a 等( 2 0 0 2 ) 发现d m r t l 在蛙( r a n ar a g o s a ) 性腺中的表达是雄性特 异的，而在雌性卵巢无表达。另外，d m r t l 的表达在x x 性逆转性腺中大大提高， 表明d m p t l 可能在两栖类雄性性腺发育中有重要作用( s h i b a t ae l a l ，2 0 0 2 ) 。相 反，d a x l 在蛙卵巢发育中下调，而如果用睾酮处理诱导遗传雌性性逆转时，d a x 首先出现下调，随后又出现迅速上调。这表明d a x l 在两栖类可能与精巢的发育 有关( s u g i t ae l a l ，2 0 0 1 ) 。非洲爪蟾( x e n o p u s l a e v i s ) 为z w z z 性别决定。在 对爪蟾的研究中发现，d m r t l 仅在性腺表达，而且精巢的表达量远远高于卵巢。 研究同时发现，d m r t l 在性腺尚未丌始发生分化时，就已经在蝌蚪的性腺中肾 复合体开始表达( 第5 3 阶段) ，因此认为d m r t l 在爪蟾性别分化中有重要作用 ( o s a w ae ta l ，2 0 0 5 ) 。迄今为止，对两栖类性别分化分子机制的研究很少。 1 1 5 鱼类的性别决定 世界上现存鱼类多达2 0 ，0 0 0 余种，是脊椎动物中分布最广、种类最多的类 群。在脊椎动物中，鱼类的性别决定方式也是最为多样的一个类群：有雌雄异体、 雌雄同体( 先雌后雄、先雄后雌、雌雄同步) 以及发育过程中的性逆转类型，并 且鱼类的染色体组型在不同种类之问存在很大差异( x x x y 、z z z w 、z o 以及 一些未发现类型) ，因此鱼类性别决定的机制也呈现多样化( b a r o i l l e ra n d d c o t t a ，2 0 0 0 ) 。 与高等脊椎动物一样，鱼类性别决定的基础仍然是遗传基因，但不同的是 在许多鱼类，决定性别的基因并不明显集中于性染色体上，常染色体上的基因更 多地参与到性别决定中。另外，在发育早期，鱼类的性别更踱显表现为双向潜力： 某些外部环境因素能在不同程度上影响鱼类的性别分化，从而使鱼类性别决定机 制更加复杂( 王德寿等，2 0 0 0 ) 。 鱼类性别分化中的一个最显著的特点是：在性腺分化的早期，外源类固醇 处理能够改变其性别而产生完全的性逆转。一般来说，雌激素能使遗传雄性个体 雌性化，而雄激素能使遗传雌性个体雄性化。关于内源性类固醇激素在鱼类性别 分化中的作用存在两种假说，即平衡假说( b o g a r t ，1 9 8 7 ) 和缺失假说( n a g a h a m a ， 2 0 0 0 ) 。平衡假浼同时强调雌激素和雄激素在性分化中的作用，认为鱼类性腺分 化方向主要取决于哪一种性类固醇激素占优势。而缺失假晚只强调雌激素在性分 化中的作用，认为内源雌激素是卵巢发育的天然诱导物，一旦性腺中有雌激素合 成，无论其遗传性别如何，都将发育为卵巢。相反，若发育早期性腺缺乏类固醇 合成( 即雌、雄激素均缺失) ，则进入雄性通路发育为精巢( 周林燕等，2 0 0 4 ) 。 目前对鱼类性别决定和分化机制的认识已不仅仅停留在激素水平，许多与 哺乳类性别决定和分化同源的基因都已经在鱼类克隆得到。已克隆的基因包括： d m r t l ( g u a ne ta l ，2 0 0 0 ；m a r c h a n de la l ，2 0 0 0 ) 、d a x l ( w a n ge la l ，2 0 0 2 ) 、 聊( y o s h i u r ae la l ，2 0 0 3 ) 、s o x 9 ( y o k o ie ta l ，2 0 0 2 ：z h o ue la l ，2 0 0 3 ) 、d m y ( m a t s u d ae l a l ，2 0 0 2 ) 等。这些基因在性别决定和分化中的作用值得深入研究。 以上研究大都集中在雌雄异体鱼类，对于雌雄同体的研究较少。黄鳝 ( m o n o p t e r u sa l b u s ) 是典型具有天然性逆转的雌雄同体鱼类，且是雌性先熟型 雌雄同体( p r o t o g y n o u sh e r m a p h r o d i t e ) ，即从胚胎到性成熟期都是雌性。雌性 性成熟产卵后，卵巢丌始退化：同时分布于生殖嵴上的精原细胞丌始生长发育， 此时贱留的雌性生殖细胞与发育的原始雄性生殖细胞共同存在于生殖囊腔内，为 雌雄问性发育阶段，然后向雄性过渡。这一发育过程是单向的( 陈全震等，1 9 9 9 ； 刘修业等，1 9 9 0 ；肖亚梅等，1 9 9 5 ) 。这一过程中伴随着雌激素表达的减少和睾 酮表达的增加( 陶亚雄等，1 9 9 3 ，1 9 9 4 ) 。另外，h u a n g 等在黄鳍克隆得到4 个 不同的d m r t l 亚型，它们的区别仅在于m r j n a 的3 术端不同。其中d m r t l a 和b 在其性逆转过程中的表达变化为：卵巢 0 f 精巢i 卵精巢i i 精巢，且d m r t l a 高 于d m r t l b 。说明d m r t l 基因的不同亚型的表达变化在黄鳝性逆转的过程中起着 重要作用( h u a n ge t a l ，2 0 0 5 ) 。 1 2d m 基因的研究现状 动物的性别决定是一个重要的生物学问题，而且对于实现动物的性别控制 具有重大的实践意义。在哺乳类中，跏y 为雄性性别决定因子，s 砂的表达直接或 问接地激活下游一系列转录因子和生长因子以一定地时序表达，进而形成了初具 轮廓的级联调控通路。总的说来，若有曲y ，胚胎发育为雄性。曾经普遍认为没 有毋y 的表达，胚胎发育为雌性，但有研究表明雌性的性别决定可能比想象中的 复杂得多，或许存在另外一个雌性性别决定通路此通路丌启则发育为雌性( 周 林燕等，2 0 0 4 ：y a o ，2 0 0 5 ) 。 目前，在非哺乳类还没有发现s r y s r y 的同源基因。但研究表明在不同的物种 中其它一些基因同样起着与性别决定和分化相关的作用，l h l 2 n m a b 一3 、d s x h d m y 分别在线虫( c a e n o r h a b d i t i se l e g a n s ) 、果蝇( d r o s o p h i l am e l a n o g a s t e r ) 和青鲻 ( o r y z i a sl a t i p e s ) 中起着性别决定基因的作用，同g 寸d m r t l 在许多脊椎动物性别 决定和分化中都有重要作用。它们都含有一个能与d n a 结合的蛋白结构域 d m d o m a i n ，此结构域在整个动物界都非常保守。含有d m d o m a i n 的基因被称为 d m 基因。d m 基因的种类丰富，形成了一个基因家族d m 基因家族。m a b j 、 d s x 、d m ) ，i d m t 。t l 都属于该基因家族，此外还有d m r t 2 - - 8 等。 1 2 1m a b - 3 基因和线虫性别决定通路 土坡线虫( c e l e g a n s ) 是一种十分重要的模式生物，其体细胞含有五对常染 色体和一对性染色体。x 染色体与常染色体套数的比例决定其性别：当比例为1 时发育为雌性，比例为o 5 时发育为雄性。土坡线虫的性别决定也是一个多基因 协同作用的复杂生物学调控过程，其最终性别形态取决于一系列基因共同作用的 结果( 见图1 1 ) 。m a b 3 基因是一种促雄性个体发育的基因，在雄性个体中是 必须的，可产生三种转录产物，但其中仅全长m r n a 是有功能的。分析发现在 雄体中此m r n a 的含量水平大大高于雌雄同体，并且在一种t r a 基因缺失的 x x 突变体中测得这种m r n a 水平与币常雄体内接近，这表明m a b 一3 受f r d 一的 x ：、i 饥x x 卜_ 盯。 限 j 二 x a05 ( x o r 4 “ ：j 哒 | r u 2 f n i - j 曲k 崞 n t l - 2 t r n 3 慑k 哒 剀ll ：示十坡线虫性别决定通路示意图。m a b 一3 为十坡线虫性别决定基冈。 f i gl 1s e xd e t e r m i n a t i o n p a t h w a y o fce l e g a n s m a b 3i st h es e xd e t e r m i n a t i o ng e n eo f ce l e g a n s 控制。在对m a b 一3 的序列分析中发现，它可以编码一个含两个拷贝的类锌指结构 与d n a 结合核心基序，此结构与果蝇d s x 基因编码产物d o u b l e s e x 很相似。此结 构域不完全等同于锌指结构，但对m a b ，3 的活性是必须的。在雄体体内，m a b 一3 基因不仅对其外周神经系统中的v 一射线成神经细胞的分化是必不可少的，而且 对抑制雄体肠组织中卵黄蛋白原基因的转录也是不可缺少的( 曾辉等，2 0 0 4 ) 。 1 2 2d s x 基因和果蝇性别决定通路 在果蝇( d m e l a n o g a s t e ，) 的性别调控过程( 图12 ) 中，存在四个关键基因： s x l 、i r a 、i r a 一2 和d s x 基因。其性别决定通路见图3 。当x ：常染色体为1 时，蹦， 早 2 蔓 串 ： 。上l h 搬1 ：、二 ，耳 l 、f 甲竹 口1 h 一 _ l ，几丁 口 卜口 h _ 圈_ 卜 2，4s 卟鹰p ? 口) ( 卜口一口 2 ib y 。1 ， 、l 幽1 2 ：示果蝇- 眭别决定通路。d s x 为果蝇的性别决定基冈。 f i g1 2s e xd e f e r m i n a t i o np a t h w a yo fd m e l a n o g a s t e r d s xi s t h es e xd e t e r m i n a t i o ng e n eo f dm e l a n o g a s t e r 被激活，产生雌性特异的剪接产物，而该产物又作用于i r a ，使之被剪接成雌性 特异的转录产物。而这些活化的基因又作用于决定雌性性别的最后一个基因d s x 。 一 。篡一“加舢舯旺 ” 一 曲 。裂 跳所_ 量脚舳 d s x 控制性别的表型，它的不同突变能产生x x 雄性和x y 雌性。在化蛹期，d s x 的转录产物选择性地剪接成两种形式：雌性特异的m r n a ( d s x d 和雄性特异的 m r n a ( d v x 一加( n a g o s h ie l a l ，1 9 8 8 ) 。d s x f 的蛋白产物抑制雄性分化基因的表 达，而d s x m 的蛋白产物抑制雌性分化基因的表达。在雌蝇和雄蝇中，其m r n a 的前三个外显子相同，但第四个外显子不同。雄性特异的m r n a 缺失了第四个 外显子的一大段前体r n a 。而d s xm r n a 前体性别特异的剪接涉及雌性特异的 3 剪接位置的活化，其活化过程是在转化子i r a 和l r a 一2 基因的产物参与下实现的。 与雌性3 剪接位置相比，d s x 基因的雄性3 剪接位置更易于被剪接( 刘辉等，2 0 0 5 ) 。 1 2 3 四足类和鸟类d m 基因研究现状 到目前为止，哺乳类已经发现了包括d m r t l d m l t 8 自，j8 种i ) m 基洲。j q d m r t l 参与哺乳类的性别分化，在人类和小鼠缺失包含d m r t l 的片段会发，上梢巢 发育障碍( r a y m o n de t a l ，1 9 9 9 a ，1 9 9 9 b ：d e g r a n d ie l a l ，2 0 0 0 ) ，而海f