（化学工程专业论文）中空纤维酶膜反应器制备l蛋氨酸的研究.pdf

中文摘要 本文采用分体式中空纤维酶膜反应器，利用游离氨基酰化酶对n 乙酰d l 蛋氨酸进行了拆分，并对拆分液进行了分离。包括以下内容： 游离氨基酰化酶动力学理论分析。考察了底物浓度、产物浓度对拆分反应的 影响，并用非线性法和l b 法对实验数据进行了拟合。结果表明：在实验所用底 物浓度范围0 0 2 4 m o l l ，拆分反应符合米氏方程，米氏常数k 。= o 9 8 5 m m o l l ， 没有出现底物抑制。两种产物均对拆分反应有抑制作用，l 蛋氨酸为竞争性抑制， 抑制常数墨：- - 5 0 1 m m o l l ，乙酸为非竞争性抑制，抑制常数k 。= 1 3 2 2 8 m m o l l 。 非线性法拟合出的参数值更优。 游离氨基酰化酶热失活动力学研究。推导了该酶热失活过程的三态模型，并 对模型作了简化，通过测定不同温度下，酶的比活随时间的变化，对实验数据进 行了拟合。结果表明：氨基酰化酶的热失活符合简化模型，即一级衰减模型。得 到失活速率常数k = 5 7 1 0 1 6e x p ( 1 2 9 0 3 2 n 。 用分体式中空纤维酶膜反应器对底物进行了拆分研究。考察了不同底物浓 度、底物停留时间对稳态时转化率以及产物产率的影响，并对该反应体系进行了 数学模拟。结果表明：在实验条件下，底物浓度为0 0 5 m o l l ，停留时间为5 小 时，结果较好。在低底物浓度下，修正的米氏方程能够较好的描述反应行为，而 在高底物浓度下，出现了较大的偏差，需对方程作进一步的修正。 对拆分后的溶液进行了分离研究。结果表明：在v 为5 0 - - 3 5 0 m l 之间的收 集液用于浓缩结晶获得n 乙酰d 蛋氨酸；在v 为3 5 0 - - 1 0 0 0 m l 之间的收集 液用于浓缩结晶获得l 蛋氨酸。在上柱过程中，6 0 。c 左右的热水即可将l 蛋氨 酸洗出，成本低廉且不造成化学污染，而简单的酸洗即可使n a + 树脂柱再生，因 此较低的成本有利于l 蛋氨酸的制备。 关键词：游离氨基酰化酶，动力学，热失活，酶膜反应器，拆分液 a b s t r a c t t h er e c i r c u l a t e dh o l l o wf i b e re n z y m a t i cm e m b r a n er e a c t o rw a su s e dw i t h f r e ea m i n o a c y l a s ef o rt h eo p t i c a lr e s o l u t i o no fn a c e t y l - d l m e t h i o n i n ea n d r e s o l v e ds o l u t i o nw a ss e p a r a t e d t h e o r i e so ff r e ea m i n o a c y l a s ed y n a m i c sw e r ea n a l y z e d t od e t e r m i n et h e e f f e c t so fs u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o na n dp r o d u c tc o n c e n t r a t i o no nt h eo p t i c a l r e s o l u t i o n ，e x p e r i m e n t sw e r ec a r r i e do u t b o t hn o n 1 i n e a ra n dl bm e t h o d s w e r eu s e dt of i tw i t ht h ee x p e r i m e n t a ld a t a t h er e s u l t ss h o w e dt h a ti nt h e e x p e r i m e n t a ls u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o nu s e di nt h es c o p eo f0 - 0 2 4 m o l l ，t h e r e s o l u t i o nw a sc o n s i s t e n tw i t ht h em i c h a e l i s m e n t e ne q u a t i o n ；t h ec o n s t a n to f m i c h a e l i s - m e n t e nw a s0 9 8 5 m m o l la n dt h e r ew a sn os u b s t r a t ei n h i b i t i o n t h et w op r o d u c t sb o t h 。i n h i b i t e dt h er e s o l u t i o ni nw h i c hl m e t h i o n i n ew a s c o m p e t i t i v ei n h i b i t o ra n di n h i b i t i o nc o n s t a n tw a s5 0 l m m o l lw h i l ea c e t i c a c i dw a sn o n - c o m p e t i t i v ei n h i b i t o ra n di n h i b i t i o nc o n s t a n tw a s13 2 2 8 m m o l l p a r a m e t e r so b t a i n e df r o mn o n 1 i n e a rm e t h o dw e r eb e t t e r t h e r m a ld e a c t i v a t i o nk i n e t i c so ff r e ea m i n o a c y l a s ew a ss t u d i e d t h et h r e e s t a t e m o d e lo ft h ep r o c e s so ft h i se n z y m e sh e a td e a c t i v a t i o nw a sd e r i v e da n dt h em o d e l w a sf u r t h e rs i m p l i f i e d b ym e a s u r i n gt h ee n z y m er e l a t i v ea c t i v i t yc h a n g i n ga g a i n s t t i m ea td i f f e r e n tt e m p e r a t u r e s ，e x p e r i m e n t a ld a t ao b t a i n e dw e r ef i t 1 h er e s u l t s s h o w e dt h a th e a td e a c t i v a t i o no fa m i n o a c y l a s ew a sc o n s i s t e n tw i t ht h es i m p l i f i e d m o d e l ，t h a ti s ，o n e - l e v e la t t e n u a t i o nm o d e l t h ee x p r e s s i o no fd e a c t i v a t i o nc o n s t a n t w a sa sf o l l o w s ：k d = 5 7 x 1 0 1 6 e x p ( 1 2 9 0 3 2 r ) t h er e s o l u t i o no fs u b s t r a t eu s i n gr e c i r c u l a t e dh o l l o wf i b e re n z y m a t i cm e m b r a n e r e a c t o rw a ss t u d i e d t od e t e r m i n ee f f e c t so fs u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o na n dr e s i d e n c e t i m eo fs u b s t r a t eo nt h ep r o d u c t i o no ns t e a d ys t a t e e x p e r i m e n t sw e r ec a r r i e do u t t h e m a t h e m a t i c a ls i m u l a t i o no ft h er e a c t i o ns y s t e mw a sa l s of o u n d e d t h er e s u l t ss h o w e d t h a tu n d e re x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n ss a t i s f a c t o r yp r o d u c t i o nw a sd e r i v e dw i t hs u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n0 0 5 m o l la n dr e s i d e n c et i m e5h o u r s a tl o ws u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n m o d i f i e dm i c h a e l i s - m e n t e ne q u a t i o nc o u l db e t t e rd e s c r i b et h er e a c t i o nb e h a v i o rw h i l e a th i g hs u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o nal a r g e rd e v i a t i o na p p e a r e ds ot h a tt h ee q u a t i o nn e e d e d f u r t h e rm o d i f i c a t i o n t h es e p a r a t i o no fr e s o l v e ds o l u t i o nw a ss t u d i e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a ts o l u t i o n c o l l e c t e db e t w e e n5 0 m la n d3 5 0 m lw a sc o n c e n t r a t e da n dc r y s t a l l i z e dt oo b t a i n n a c e t y l d m e t h i o n i n ew h i l es o l u t i o nc o l l e c t e db e t w e e n35 0 m la n d10 0 0 m lt oo b t a i n l m e t h i o n i n e w a t e ra b o u t6 0 c o u l db eu s e dt ow a s ho u tl - m e t h i o n i n e w h i c hc o s t l e ea n dc a u s e dn oc h e m i c a lp o l l u t i o n n a + r e s i nc o l u m nc o u l db er e r e g e n e r a t e db y s i m p l ea c i dp i c k l i n g t h e r e f o r eal o w e rc o s tw a sb e n e f i c i a lt ot h ep r e p a r a t i o no f l m e t h i o n i n ep r o d u c t i o n k e yw o r d s ：f r e ea m i n o a c y l a s e ，k e n e t i c s ，h e a td e a c t i v a t i o n ，e n z y m a t i c m e m b r a n er e a c t o r , r e s o l v e ds o l u t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得叁盗盘堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：王魁 签字日期： 2 0 0 c j 年6 月孑日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解墨盗盘堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权墨鲞盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名： 勉 导师签名： 扔咎一 签字日期：2 0 d 1 年6 月弓e t签字日期：2 删年毛月? 日 第一章文献综述 1 1 引言 第一章文献综述 随着生命科学，特别是基因工程的迅猛发展，人们对组成生命的基本分子氨 基酸的研究也不断深入，对氨基酸及其衍生物的生物学功能了解不断深入，氨基 酸的应用范围也在日益扩展。目前在自然界中已经发现以及人工合成的氨基酸近 4 0 0 种，它们主要用于食品、日用化工、农药、保健品和新药的合成制备以及生 命科学的研究。 1 2 蛋氨酸的性质及市场分析 蛋氨酸，即2 氨基- 4 甲硫基丁酸( d l c h 3 s c h 2 c h 2 c h ( n h 2 ) c o o h ) 是旋 光性化合物，又名甲硫氨酸，是八种必需氨基酸中唯一含有硫的氨基酸，相对分 子量为1 4 9 2 0 7 ，白色晶体或粉末，熔点2 8 1 ( 分解) ，相对密度为1 3 4 0 ，易 溶于水、稀碱和稀酸，微溶于乙醇，不溶于乙醚。从立体结构讲，它有左旋体( l 型蛋氨酸) 和右旋体( d 型蛋氨酸) l l j 。 l 型蛋氨酸为极微小的六角形薄片结晶体，熔点为2 8 2 - - 2 8 3 ( 分解) 。 溶于水和热稀醇，不溶于无水乙醇、醚、苯、丙酮和石油醚。【口】2 。5 ：6 7 8 0 ( 水) ， 【口】苫：+ 2 2 5 0 ( 1 m o l l 盐酸) 。d 型蛋氨酸为白色结晶，溶于水、稀酸及碱，极 微溶于醇，不溶于醚1 2 j 。 全球每年蛋氨酸的需求量大约为3 5 0 ，0 0 0 吨，主要是化学合成的d l 蛋氨 酸。目前全球蛋氨酸市场由少数几家公司控制，其中n o v u s 、d e g u s s a 、a d i e s s o 公司分别占有3 4 、3 0 和2 8 的市场份额。蛋氨酸最初的商业价值是作为家畜 饲料中的营养成分【3 矧。亚洲地区蛋氨酸供应紧张，中国作为世界第二大饲料生 产国，对蛋氨酸的需求更高，目前我国主要依靠进口解决需求问题，国内蛋氨酸 生产装置与国外相比存在很大的差距【7 1 。近年来，我国的饲料工业发展迅速，市 场对蛋氨酸的需求量也迅速增加，预计2 0 1 0 - - - 2 0 2 0 年将达到9 0 千吨年。 蛋氨酸的另一个需求是l 蛋氨酸的药用价值。近些年医药级l 蛋氨酸的需 求量呈逐年增加趋判引。目前l 蛋氨酸国内年需4 0 0 - 5 0 0 吨，价格2 7 2 8 万元 吨( 医药级) ，而国内年生产不足1 0 0 吨，且有的成本已接近市场价格，因此， 第一章文献综述 目前的问题是必须改变落后的生产工艺，而采用世界上较为先进的生产工艺和技 术，将各项收率提高，减少试剂消耗，降低生产成本以提高竞争力。 1 3l 蛋氨酸的临床应用 1 9 2 2 年m u e l l e r 首次从蛋白质中分离出蛋氨酸，1 9 2 8 年b a r f e r 和c o y n e 分 析了其结果为仅氨基n 丁酸的丫甲基硫醇衍生物。1 9 3 9 年v i g n e a u d 等人从动物 营养学角度研究发现蛋氨酸具有转甲基作用。1 9 5 3 年，c a n t o n i 通过实验证实了 蛋氨酸的转甲基作用是通过s 腺苷蛋氨酸( s - a d e n o s y l l m e t h i o n i n e ，简称s a m ) 甲基化试剂实现的。在蛋白质合成中，蛋氨酸是信息核糖核酸“翻译”成蛋白质 过程中的第一步。无蛋氨酸的存在，蛋白质的生物合成就无法开始【9 ，1 0 1 。 l 蛋氨酸是人类和其他哺乳动物体内生长和代谢过程所必需的微量元素。人 类的一些遗传疾病，如：胱硫醚尿、高胱氨酸尿都是由于蛋氨酸得不到正常代谢 造成的。胱硫醚尿、高胱氨酸尿通过染色体隐性遗传基因表达。这种遗传病人都 有以下中的一些症状，如：智障、血小板较少、畸形足、骨骼变形、关节脱臼和 听力等问题。14 1 。饮食中缺少蛋氨酸常见的疾病有：血毒症、幼儿风湿、肌肉麻 痹、脱发、沮丧、精神分裂、帕金森症、肝功能衰退等。蛋氨酸在生物体中的作 用主要是通过s 腺苷蛋氨酸( s a m ) 来实现，s a m 能够促使活化甲基和硫基， 从而在体内完成1 0 0 多个反应。有些反应是合成细胞和生物体所必需的化合物的 重要步骤。蛋氨酸是抗脂肪肝药物，通过卵磷脂的生成，减少脂肪的积累【1 5 , 1 6 。 蛋氮酸对生物体吸收、运送和硒和锌元素利用起着重要的作用。蛋氨酸是重要的 螯合试剂，因此有利于生物体的铬和汞的排泄。对于人类，蛋氨酸可以生成大脑 所需的肌氨酸酐，a i d s 病人一般都缺少蛋氨酸。专家认为a i d s 病人在神经系 统的退化如：痴呆症，可能就是由于蛋氨酸的缺乏造成的。同样，初步试验发现 蛋氨酸可以治疗帕金森症i l7 | 。蛋氨酸在人体叶酸代谢中起着重要的作用，当体内 缺乏蛋氨酸时，叶酸就会在肝内积聚，形成5 甲基叶酸，造成短期叶酸缺乏症。 维生素b 1 2 缺乏症与叶酸缺乏症原因相同，从而使得病人出现过敏和贫血症【1 8 】。 l 蛋氨酸是人类具有广泛应用价值的药物，包括调节体内p h 和电解质平衡、 其他药物的辅助药物、营养药物等其他的应用。它是人类常用的8 0 0 种药物之一， 而d 蛋氨酸和d l 蛋氨酸不可以在人类体内应用，可能会出现过敏症状。动物 体内，d 型蛋氨酸要经酶转化成l 型蛋氨酸后才能参与蛋白质的合成 i s 】。 2 第一章文献综述 1 4l 蛋氨酸的生产方法 目前，l 蛋氨酸的生产方法主要有化学合成法、微生物发酵法和生物拆分法 三大类。 1 4 1 化学合成法 化学合成法合成的蛋氨酸均是混旋的蛋氨酸，需要进行手性拆分。蛋氨酸化 学合成法有丙烯醛法、氨基内酯法、丙二酸酯法以及固液相转移催化法。丙烯 醛法具有原材料价格低廉、生产工艺路线短、工艺能耗少及收率高等特点，被广 大生产厂家所采用。世界上蛋氨酸的两大生产商法国的罗纳普朗克公司和美国的 孟山都公司的生产工艺都是以丙烯醛法为基础，稍加改进。 1 4 2 微生物发酵法 谷氨酸的微生物发酵法生产促使入们研究蛋氨酸的发酵法生产，通过发酵法 生产的蛋氨酸为具有生物活性的l 蛋氨酸。目前，赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸 和组氨酸均实现发酵法工业化生产。通过微生物发酵生产氨基酸时，最大的问题 是严重的反馈抑制现象，通常野生型微生物不可能产生大量的l 蛋氨酸【1 9 翔】。 虽然发酵法生产l 蛋氨酸有一些研列2 1 】，但至今仍没有能够实现l 蛋氨酸的高 浓度生产。 1 4 3 生物拆分法 近年来，利用酶( 或菌体酶) 的高度立体选择性进行外消旋体的拆分，已成 为制备手性化合物的重要途径。在l 蛋氨酸的生物拆分法中，通常先将外消旋 的d l 一蛋氨酸衍生化，之后使用脂肪酶、酯酶、氨基酰化酶或海因酶等( 或者含 有这些酶的菌体) 对该衍生物进行选择性水解。一般来说酶和微生物的立体选择 性是l 型的，所以生产的氨基酸是l 型。由于酶法具有拆分效率高、立体选择 性高、反应条件温和、专性强、操作简单和有利于环保等优点，从而使得它在 工业中具有很好的应用前景。 t o s a 冽等人实现了用固定化氨基酰化酶菌体实现d l 蛋氨酸的连续拆分工 业化生产。s o d a 2 3 1 选用b a c i l l u ss p 2 6 6 和v i b r i os p 2 5 6 ，由n 氨基甲酰蛋氨酸 生产l 蛋氨酸，产率分别为3 4 4 和2 5 5 。y a m a s h i r o t 2 4 】等人选用b a c i l l u sb r e v i s 和它的突变育种，进而由d l 5 乙内酰脲生产出l 蛋氨酸。v o e i k e la n dw a g n e r l 2 5 1 等人选用a r t h r o b a c t o rs p d s m7 3 3 0 和a s p e r g i l l u ss p ，通过d l 5 甲基硫基乙基 3 第一章文献综述 乙内酰脲生物转化得到l 蛋氨酸。w a g n e r l 2 6 】等人选用d s m 9 7 7 1 突变菌株，生 物转化d l 5 ( 2 甲基硫基乙基) 乙内酰脲得到l 蛋氨酸，转化率为9 0 ，最佳的 生物转化条件为p h 为7 5 ，温度3 7 ，尽量增大d l 5 ( 2 甲基硫基乙基) 乙内酰 脲( 3 0 9 l 1 ) 浓度，酶系统中没有出现抑制现象。选用胱硫醚丫合成酶生产a 氨基酸也已有报道1 27 | 。 在众多的研究中最重要的也是唯一工业化的是以乙酰d l 蛋氨酸为底物，采 用氨基酰化酶或含氨基酰化酶的菌体拆分生产l 蛋氨酸的方法。利用氨基酰化 酶( 主要来自曲霉、青霉、假单胞杆菌、酵母以及动物肾脏等) 只作用于乙酰d l 蛋氨酸的l 型而对d 型无作用的原理，先将氨基酸用醋酸酐乙酰化为乙酰d l 蛋氨酸，然后用酶水解，经分离结晶而将l 蛋氨酸同乙酰d 蛋氨酸分开，余下 的乙酰d 蛋氨酸可用化学或酶法消旋化后，继续拆分，直到几乎全部的d l 蛋 氨酸转变成l 型。 由化学合成的混旋蛋氨酸生产l 一蛋氨酸的工艺过程见图1 - 2 1 2 8 】： 工艺介绍：蛋氨酸经过酰化后得到乙酰d l 蛋氨酸，用氨基酰化酶拆分，用 强酸性离子交换柱分离出拆分液中的l 蛋氨酸产品，在溶液中剩余的主要是n 乙酰d 蛋氨酸和少量未反应的n 乙酰l 蛋氨酸。选用醋酸酐消旋剩余的乙酰 d 蛋氨酸，得到乙酰d l 蛋氨酸，从而实现原料液的充分利用，过程的总收率 接近4 5 。如果没有这部分重新利用，l 蛋氨酸的收率最高只有3 0 。 蛋氨酸罟碱蛋氨酸矿乙酰一 消旋 图1 1 氨基酰化酶拆分乙酰d l 蛋氨酸生产工艺流程 f i g l - lp r o c e s se n g i n e e r i n go f n - a c e t y d l m e t h i o n i n er e s o l u t i o n 1 5 氨基酰化酶的性质和来源 1 5 1 氨基酰化酶的性质 氩酸 氨基酰化酶( e c3 5 1 1 4 ) ，n a c y l a m i n o - a c i da m i d o h y d r o l a s e 或a c y l a s e i ，具有较强光学特异性，立体特异性为l 型，它能够将化学合成的n 乙酰d l 氨基酸拆分( 水解) ，从而得到l ，氨基酸【2 9 】。 从米曲霉中提出的氨基酰化酶是个双亚基酰化酶，该酶的分子量为7 3 ，2 0 0 4 第一章文献综述 1 3 6 ，0 0 0 d a ，直径约为2 n m 。分子中有1 2 个半胱氨酸残基，其中有4 个游离的 s h 和2 个二硫键，亚基之间没有二硫键。该酶固着于细胞导管表面，每个亚基 含有4 0 6 个氨基酸，其氨端为乙酰丙氨酸。每个亚基含一个z n “，是一种含锌金 属酶。 1 5 1 1 金属离子催化和抑制作用 氨基酰化酶是金属酶，z n 2 + 位于酶的活性中心，并且为催化活性所必需。郑 学坊 3 0 l 等人通过顺磁共振法、可见光谱法及酶活性测量研究从猪肾中提纯氨基酰 化酶在p h 4 。0 条件下与外加的c u 2 + 离子存在直接相互作用。结果发现：外加的 c u ( i i ) 离子进入氨基酰化酶活性中心位点。取代了活性中心位点的z n ( i i ) ， 使酶活性下降，说明金属离子对金属酶活性有重要的影响。对酶有催化作用的金 属离子有z n 2 + 、c p 、m n 2 + 、f e 2 + ，对酶活有抑制作用的有c d 2 + 、c u 2 + 、m n 2 + 、 n i 2 + 和- - 7 , 基碳酸氢钠离子。 1 5 1 2p h 对酶活的影响 p h 对酶活的影响有两个方面1 3 l 】，首先是在涉及的p h 范围内，酶不可逆地 或缓慢可逆地变性，即p h 对酶的稳定性的影响；其次是在保持酶稳定的p h 范 围内，在酶不失活的情况下，p h 对反应速率的影响。适于氨基酰化酶拆分最佳 反应p h 为7 o 8 0 。 1 5 1 3 温度对酶活的影响 温度对酶促反应影响的原因是多方面的【3 2 】。概括地说主要有两个方面，一是 温度对酶蛋白稳定性的影响，即对酶热变性失活作用：二是温度对酶促反应本身 的影响，其中可能包括影响酶和底物的结合，v m 麒，酶和底物分子解离基团的p k ， 酶与抑制剂、激活剂或辅助剂的结合等。 1 5 1 4 同位素效应 同位素效应影响酶活的表现，j o h a n n e sh e n s e l i n g 等人【3 3 】研究了猪的氨基酰 化酶在拆分n 乙酰d l 蛋氨酸时受到溶剂中存在的同位素氘的影响。当p h = 6 时，k 倒d ) l 妇h ) = 0 7 ；中性溶液中不存在影响；当p h = 9 时，与酸性的情况相反 k 训d 邝钿h ) - 1 4 。这种作用主要与质子作用有关。在酶拆分反应中存在质子平衡， n 乙酰d l 蛋氨酸随着p h 值增加，质子化程度增加，为了平衡这种作用，氘质 子含量增大，因此在酸性情况下d 2 0 作用比h 2 0 利于催化反应，而在碱性n 乙酰d l ，蛋氨酸质子化程度增加，因此h 2 0 作用比d 2 0 利于催化反应。因此在 5 第一章文献综述 h 2 0 溶液中溶液酶的最佳p h 为7 0 。 1 5 1 5 常见变性剂 氨基酰化酶变性试剂有尿素、g d n h c i 、精氨酸、天门冬氨酸、有机溶剂、 清洁剂、去垢剂以及加热变性。精氨酸使得酶变形的原因是它分子结构中含有阳 离子状态的类似氯化胍( g d n h c i ) 的胍基团f 3 4 1 ，因此精氨酸也是一种研究酶分 子去折叠和再折叠过程的很好的可逆变性剂。 1 5 2 氨基酰化酶的来源 氨基酰化酶的来源广泛，存在于各种动物和植物器官、微生物体内及其发酵 液中。微生物中的氨基酰化酶是工业应用最直接和最便利的来源。迄今为止，已 经在米曲霉菌【” ( a s p e r g i l l u so r y z a e ) 、葡萄酒色青霉菌【3 6 ( p e n i c i l l i u mv i n a c e u m ) 、 产碱杆菌【3 7 1 ( a l c a l i g e n ss p ) 、芽孢杆菌 3 9 , 3 9 1 ( b a c i l l u ss p ) 、阿拉伯乳酸杆菌1 4 0 ( l a c t o b a c i l l u sa r a b i n o s u s ) 、分枝杆刮4 ( m y c o b a c t e r i u ms p ) 、嗜麦芽假单胞 菌f 4 2 】( p s e u d o m o n a sm a l t o p h i l a ) 等微生物中提取得到，其中以米曲霉固态发酵 产生的胞外酶最容易获得，也最适合工业应用。通过硫酸铵分级沉淀、s e p h a d e x g 5 0 凝胶层析和d e a e s e p h a r o s e 阴离子交换层析，从米曲霉3 0 4 2 中提取得到了 米曲霉氨基酰化酶，该酶的纯化倍数为5 4 2 9 ，比活为6 4 7 6 6 u m g ，总收率为 4 9 5 3 f 4 3 。 不同来源的氨基酰化酶其活力不同，c h i b a t a f 舭】对6 0 种氨基酰化酶活力进行 比较，米曲霉( a s p e r g i l l u so r y z a e ) n o 9 活力最高，葡酒色青霉菌( p e n v i n a c e u m ) 次之，酵母菌、大肠杆菌( e c o l ik - 1 2 ) 也较高。王淑豪、刘阳【4 5 ，4 6 1 等人对米曲 霉( a s p e r g i l l u so r y z a e ) 3 0 4 2 进行了紫外诱变，通过诱变培养基进行优化培养、 筛选，得到比出发菌株酶活高的菌株。王剩47 】采用这种菌株进行液体培养得到的 酶活最高。 1 6 氨基酰化酶和菌体的固定化 目前，固定化酶和固定化细胞在工业方面的应用研究报道越来越多。1 9 6 9 年，日本田边株式会社成功的利用固定化氨基酰化酶，由乙酰化d l 氨基酸连续 生产l 一氨基酸。相比之下，固定化细胞的研究比固定化酶的研究起步晚，但由 于固定化细胞可以免去酶的提取，因此固定化细胞研究阶段进入生产的速度大大 超过了固定化酶，而且在大规模的工业化生产中固定化细胞也较固定化酶的多。 但是由于酶的高拆分率，使得在拆分率要求高时，固定化酶优于固定化细胞。 6 第一章文献综述 酶和细胞的固定化方法主要有以下四种：吸附法、包埋法、共价键结合法和 交联、法【4 8 1 。 吸附法分为物理吸附和离子吸附法。用物理吸附制成的固定化酶，酶活力损 失少，但酶附着于载体上，易脱落，较小实际价值。离子吸附法是将酶与含有离 子交换基的水不溶性载体相结合，酶吸附于载体上较为牢固，在工业上的用途颇 广。离子结合法的载体主要是离子交换树脂。 包埋法是将酶包埋于格子内，格子的结构可以防止蛋白质渗出到周围培养基 中，而底物仍能渗入格子内与酶接触。此方法对大分子底物不适用。酶本身不参 与水不溶性格子的形成，酶分子仅仅是被包埋起来，而未受到化学反应，故可以 获得较高的酶活。但是这种方法存在酶的漏失，尤其是对于低分子蛋白质为甚。 常用的包埋剂为聚丙烯酰胺、琼脂、海藻酸、卡拉胶、二醋酸纤维、三醋酸纤维、 骨凝胶、明胶和戊二醛等。 共价键结合法是酶与聚合物载体通过共价键结合的固定化方法。与载体共价 键结合的酶的功能基包括：氨基、羧基、酚基、巯基、羟基、咪唑基以及吲哚基 等。这种方法酶与载体的结合较为牢固。酶不易脱落，但因反应条件较为剧烈， 酶活不免损失，而且制备过程比较复杂。 交联法是使用双功能或多功用的试剂与酶分子之间进行分子间交联的固定 化方法。常用的交联剂是戊二醛。但用戊二醛所得的固定化酶活力较低，一般与 吸附法或包埋法联合使用可以达到加固的良好效果。 不同的固定化方法，其固定化机理不同，固定化难易程度和效果不同，影响 固定化效果的因素主要有：固定化方法和固定化载体。虽然固定化方法和固定化 载体很多，但是没有一种方法或者是载体具有普遍适用性。对于不同的酶，其载 体和方法的选择都更多的依赖于实验室结果。 固定化酶或固定化菌体虽然都能实现酶的回收利用，但却存在一些缺点，如 需要大量的惰性载体( 通常固定化酶中载体质量分数为9 0 - - 9 9 ) ；固定化过 程中酶活力损失严重( 酶活保留率低于6 0 ) ；固定化后传质阻力降低了表观酶 活力等。为了解决这个问题，酶膜反应器成为了近年来研究的热点。 1 7 酶膜反应器 酶膜反应器将酶催化反应的高效率与膜的选择透过性有机结合，可以强化过 程的速率。这类酶膜反应器不仅具有简化流程和节省装置投资等优点，而且对于 受热力学平衡限制或受产物抑制的生物催化反应，可以通过选择性地透过反应产 物，这样一方面可以减小产物抑制，另一方面可以使酶催化反应向有利于产物生 第一章文献综述 成的方向移动，可以提高转化率。近年来，酶膜反应器在生物、医药、食品、化 工、环境等领域得到了日益广泛的应用4 们。随着基因工程、材料科学特别是高分 子材料科学的发展，随着高效固定化技术的开发以及过程设计的不断优化，酶膜 反应器的应效率将会逐步提高，其应用领域也将会越来越广泛。 1 7 1 酶膜反应器的分类 酶膜反应器可以根据系统耦合方式、酶的存在状态、系统的相数、膜组件型 式、膜材料类型、传质推动力等的区别，分为不同的类型。 1 ) 根据反应与分离耦合方式的差别，可以将酶膜反应器分为一体式和循环 式酶膜反应器。分体式是将酶催化反应与膜分离分开进行，系统通常包含一个搅 拌槽式反应器加上一个膜分离单元，如图1 2 所示：一体式是将反应与分离耦合 在一起，在反应的同时实现分离，此时，膜既作为酶的载体，又构成分离单元， 如图1 3 所示。 透过液 图1 2 分体式酶膜反应器 f i g 1 2r e c r u i t e de i l 巧m a t i cm e m b 啪er e a c t o r 膜( 带有固定化酶) 图1 3 一体式酶膜反应器 f 远1 - 3a l l i i l - 0 n ee n z y m m i cm e m b r a n em a c t o r 2 ) 根据酶的存在状态，可将酶膜反应器分为游离态和固定化酶膜反应器。 第一章文献综述 前者酶均匀地分布于反应物相中，酶催化反应在接近本征动力学的状态下进行， 但酶易发生剪切失活或泡沫变性，装置性能受浓差极化和膜污染的显著影响。固 定化酶膜反应器中，酶通过吸附、交联、包埋、化学键合等方式被“束缚”在膜 上，酶装填密度高，反应器稳定性和生产能力高，产品纯度和质量好，废物量少。 但酶在固定化过程中活性会下降，而且往往分布不均，传质阻力也较大。 3 ) 根据系统相数的差别，可将酶膜反应器分为单液相( 超滤式) 和双液相 酶膜反应器。单液相酶膜反应器多用于底物分子量比产物大得多，产物和底物能 够溶于同一种溶剂的场合。双液相酶膜反应器多用于酶催化反应涉及两种或两种 以上的底物，而底物之间或底物与产物之间的溶解行为差别较大的场合。 4 ) 根据膜组件的型式的不同，可以将酶膜反应器分为板框式、螺旋卷式、 管式和中空纤维式四种。其差别在于结构复杂性、装填密度、膜的更换、抗污染 能力、清洗、料液要求、成本等方面有所不同。 5 ) 根据膜材料的不同，可将酶膜反应器分为高分子酶膜反应器和无机酶膜 反应器。高分子膜材料种类多，制作方便，成本低，因而应用较多。 6 ) 根据传质推动力的不同，可将酶膜反应器分为压差驱动、浓差驱动、电 位差驱动的酶膜反应器。 1 7 2 酶膜反应器的应用 目前，酶膜反应器主要用于有机相催化，手性拆分与手性合成，生物大分子 的分解等场合。有机相酶催化、手性合成与拆分方面。研究最多的是脂肪酶，涉 及的反应类型有酯的水解、酯的合成和酯交换等1 5 0 1 。t s a i 等人用三种疏水性的高 分子膜通过物理吸附法固定脂肪酶，在带有搅拌的扩散反应器中进行橄榄油水解 实验。考察了酶和底物浓度对水解速率的影响，发现酶活性在6d 左右的时间内 活性下降很大，判断是由于酶的失活、产物抑制以及产物在膜与有机相界面处的 吸附所致。m a t s o n 在多相酶膜反应器领域取得了不少领先性成果，如氨基酸异构 体拆分，手性药物中间体的合成等。李树本等【5 l 】在碱催化连续原位消旋条件下， 利用脂肪酶催化的萘普生甲酯立体选择性反应，动态拆分制备s 一萘普生。姜忠 义等p 2 j 以溶解于正辛醇中的n 一乙酰d ，l 苯丙氨酸乙酯消旋混合物为底物，以 磷酸盐缓冲溶液为萃取剂，将从a s p e r g i l l u sm e l l e u s 中提取的氨基酰化酶固定于 聚丙烯腈中空纤维膜上作为催化剂，通过膜反应萃取过程，实现了l 苯丙氨酸的 高效手性合成。生物大分子的分解方面，用于酶膜反应器的生物大分子包括蛋白 质、多糖等，主要工作集中在淀粉、纤维素、蛋白质等的水解。利用膜的筛分作 用，可以将相对分子质量较大的生物大分子与相对分子质量较小的水解产物实 现原位分离，以部分甚至全部消除产物抑制，酶膜反应器还可以用来控制反应的 9 第一章文献综述 深度。p o u l i o t 等人在一个中空纤维酶膜反应器中，采用胰岛素或胰凝乳蛋白酶， 研究了酪蛋白的水解。在其研究中，膜可以在线地分离出不同的氨基酸产物。最 近c u r c i o 等人【5 3 】在通过凝乳酶合成p a r a - k 酪蛋白和甘油缩氨酸的过程中应用了 同样的系统。c e m p e l 等和b e l h o c i n e 等瞰】采用木瓜蛋白酶作为生物催化剂，在一 个酶膜反应器中研究了血色素的酶催化转化反应，血色素是一种重要的动物屠宰 场副产物。他们报道了微滤膜或超滤膜的成功应用，并且由于形成了动态的蛋白 质层，在实验过程中表现出和真实膜具有一样的作用，从而避免了酶的流失。 p a o l u c c i j e a n j e a n 掣5 5 j 最近报道了木薯淀粉通过伍淀粉酶的反应生产低分子量水 解产物。这时，超滤膜从反应产物中分离出酶和基质，并用于循环。他们得到了 较好的生产能力，而且没有明显的酶流失。h o u n g 等采用同样类型的酶膜反应器， 在麦芽糖的水解中得到了类似的结果【5 6 | 。 由上面的叙述可见，酶膜反应器已经有了比较广泛的应用领域。下面主要介 绍其中的一个类型分体式中空纤维酶膜反应器。 1 8 分体式中空纤维酶膜反应器 由上面的叙述可知，分体式中空纤维酶膜反应器主要有两个单元，反应器与 膜组件，其中膜组件形式为中空纤维式，酶以游离态存在于反应体系中。这样较 之固定化酶膜反应器的优点为： 1 ) 酶以均相分布于反应体系中，没有传递的限制； 2 ) 酶催化反应在接近本征动力学下进行，酶活力得到了最大程度的利用； 3 ) 不依赖特殊的固定化技术，而且也减少了固定化费用和时间； 4 ) 可以比较容易的补加新鲜酶溶液，保证酶的活力。 对于该反应体系，需要考虑的问题为中空纤维膜材料、反应体系中的酶动力 学、酶失活、操作条件等。 1 8 1 中空纤维膜材料 用于制造中空纤维膜的材料主要分为有机材料和无机材料。有机材料有醋酸 纤维素( c a ) 、聚砜( p s ) 、聚丙烯腈( p a n ) 、聚偏氟乙烯( p v d f ) 、聚醚 砜( p e s ) 、壳聚糖等；无机材料主要有高岭土、氧化铝( a 1 2 0 3 ) 、氧化锆( z r 0 2 ) 等。有机材料可塑性好、价格便宜、制备方法较无机材料简单，但它的应用范围 受不耐高温和高压及使用寿命短限制。无机材料以陶瓷为主。具有机械性强、耐 高温、耐腐蚀、耐化学试剂，但可塑性差、受冲击易破裂、成型性差及价格较贵。 l o 第章文献综述 1 8 2 反应体系中的酶动力学 由前面的叙述可知，酶是以游离形式存在于反应体系中，接近于自由酶的本 征动力学。因此可以通过研究游离氨基酰化酶拆分混旋蛋氨酸的动力学特征，根 据实际运行膜反应器的参数，对游离酶的动力学参数加以修正，模拟出中空纤维 膜反应器中的酶的表观动力学。 1 8 3 反应体系中的酶失活 在间歇式的反应器中酶的失活主要是热失活和搅拌，而在该反应体系中，由 于氨基酰化酶在流动过程以及通过中空纤维膜时会受到剪切力的作用，因此酶失 活还包含有剪切失活【5 7 1 。 1 8 4 反应器的优化操作条件 在间歇反应器中，与底物转化率有关的因素为底物浓度和酶浓度，而在该反 应体系中，由于反应料液的流动，影响底物转化率的因素还应包括料液流速，即 底物在反应器中的停留时间。停留时间短，底物的转化率小，停留时间长，底物 的转化率大。三者之间应存在一个适宜的数值范围，从而使单位时间、单位质量 酶的生产率较大。 1 9 本文研究内容和创新点 本文采用分体式中空纤维膜反应器，利用游离的氨基酰化酶对n 乙酰d l 蛋氨酸进行连续的手性拆分，并对拆分液进行了分离。主要的工作如下： 1 ) 对氨基酰化酶的催化动力学进行分析，求取各参数，比较了非线性法和 双倒数法； 2 ) 研究游离氨基酰化酶的热失活动力学，求取模型参数； 3 ) 优选反应器的操作条件，并对反应体系的反应行为进行了数学模拟； 4 ) 对拆分液进行了分离研究。 第二章酶催化反应动力学理论分析 2 1 引言 第二章酶催化反应动力学理论分析 从1 9 世纪末开始，各国研究者就致力于对酶催化机理的研究。1 8 9 4 年，德 国化学家e m i lf i s h e r 根据糖化酶的特点建立了锁钥理论。他确定了酶的功能由 底物分子的立体结构决定( 如原子间的位置关系) 。 基本的酶动力学可以追溯到1 9 0 3 年，v i c t o r h e n r i 在巴黎得出结论：酶与底 物结合成酶底物中间络合物是酶催化作用的基本步骤。在此基础上，德国的 l e o n o rm i c h a e l i s 和加拿大的m a u dl e n o r am e n t e n 在1 9 1 3 年数学化地表述了酶作 用的普遍理论，发表了著名的米氏方程即现在应用的m i c h a e l i s m e n t e n 方程，常 简称为m