（应用化学专业论文）荧光相关光谱系统及其荧光纳米材料表征新方法研究.pdf

上海交通大学博士学位论文摘要 荧光相关光谱系统及其荧光纳米材料表征新方法研究 摘要 对单个分子的空间分布和对阃轨道进行直接观测，并对其进行识别、分类和 定量描述，一直是分析t 作者的梦想。上世纪七十年代由于研究生物大分子的化 学动力学的需要，出现了荧光相关光谱技术。随着九十年代显微共焦技术，计算 机技术和光学检测技术的发展进步，荧光相关光谱逐渐发展为一种溶液中单分子 检测技术，被广泛用于d n a 与蛋白质之间的相互作用研究，细胞膜上和细胞内部 的粒子的扩散研究和药物的高通量筛选等方面。荧光相关光谱通过测定溶液中微 区内( 通常 1 0 1 5 l ) 发光粒子由于布朗运动或化学反应而产生的荧光涨落( 荧光 强度的明暗变化) ，并对荧光强度随时间变化的函数进行相关分析，从而获得粒 子浓度、化学动力学参数等有关信息。 本论文工作以减少检测体积，提高荧光收集效率，增加信背比为理念，在 总结前人工作的基础上，经过艰苦实验摸索，自主构建了一套性能优良的荧光相 关光谱单分子检测系统，建立了一系列荧光纳米材料表征的新方法，用于荧光纳 米材料中一些重要的基础问题研究。主要研究内容包括如下几方面： 1 荧光相关光谱系统的研制。以激光共焦构理! 为其主体光学结构，选用水浸物 镜作为光学收集元件，针孔作为空间滤波元件，自组装了一套检测体积小于l f l ， 信背比达到4 0 0 的荧光相关光谱单分子检测系统。系统测试和基因的点突变分 析结果表明，该系统具有高灵敏和高稳定性的特点，可以用于生物大分子的扩散 动力学，生物大分子间的相互作用研究和基因点突变分析等领域。 2 采用荧光相关光谱技术建立了一种水溶液中荧光粒子的动力学半径测定的新 方法。同时将荧光相关光谱技术与其它光谱技术相结合，对水相合成的碲化镉量 子点的分子量和摩尔消光系数等参数进行了系统研究。并在传统的f c s 测定发光 量子点浓度方法的基础上，提出了一种快速测定量子点样品中发光量子点比例的 新方法，并对一系列量子点样品的发光量子点比例进行了测定。实验结果发现， 水相合成的量子点的量子产率与发光量子点比例成正比，而发光量子点的量子产 率可以认为接近1 0 0 。同时，将荧光相关光谱用于量子点标记辣根过氧化物酶 的产物的表征，发现在一个辣根过氧化物酶分子可以结合大约一个量子点。 上海交通大学博士学位论文摘要 3 将荧光相关光谱系统与微流控芯片电泳联用，建立了一种溶液中荧光粒子的荷 电或表面电荷的测定方法，并对荧光素的荷电和c d t e 量子点的表面电荷进行了 测定。我们发现，荧光素在p h 7 4 和p h 8 4 的缓冲溶液中的带电荷分别为 1 i o 5 和1 5 0 4 。巯基丙酸( m p a ) 为稳定剂的c d t e 量子点在不同p h 的 t b e 缓冲溶液中的表面电荷分别为6 2 ：t = 0 4 ( p h8 4 ) ，6 3 0 8 ( p h9 3 ) 和 7 6 0 7 ( p h l o o ) 。此外，还发现量子点的表面电荷不仅与量子点所在的缓冲 溶液的p h 有关，而且还跟表面配体的种类等其它因素有关。巯基丙酸( m p a ) 为 稳定剂的c d t e 量子点在高浓度的谷胱甘肽( g s h ) 溶液中充分交换后，表面电荷变 为1 1 8 0 5 。 4 采用荧光相关光谱和其它光谱技术，对重金属离子( a g + 离子) 对碲化镉量子 点的淬灭过程和机理进行了研究。研究发现，在a g + 离子淬灭量子点的过程中， a g + 离子进入量子点表面未配位完全的t e 原子位置，形成的a g t e 结构而产生新的 表面缺陷，导致量子点荧光淬灭。尤为重要的是，发现a g + 离子在量子点表面结 合后，直接将发光量子点变成不发光的量子点，从而导致量子点的荧光淬灭。因 此，认为a g + 离子淬灭量子点过程是量子点逐个淬灭过程，而不是单个量子点荧 光逐步衰减的过程。同时，我们还系统地研究了透析过程对荧光量子点的荧光增 强作用。实验发现，透析过程可以j 锦郭分不发光量子点转变成发光量子点，从而 显著提高量子点的荧光量子产率。其原因可能是由于透析过程消除了溶液中过量 的c d - m p a 复合物，并导致量子点表面结构发生重组和调整的缘故。 5 采用荧光相关光谱技术对激光照射下量子点发生团聚和光活化的过程进行了 系统的研究。实验结果表明，量子点在激光照射下发生的光活化过程与量子点的 团聚直接相关。量子点的光活化是由于激光照射下量子点发生团聚后，量子点表 面发生重组优化的结果。而量子点的粒径对量子点在光照下能否发生团聚具有决 定性作用。粒径越小的量子点在光照下其表面越容易发生光化学反应，从而导致 量子点相互团聚的发生。溶液中盐类分子可以降低量子点表面能，从而抑制量子 点问的团聚发生，从而抑制量子点光活化。同时还发现，光活化过程与量子点的 浓度有关。只有量子点浓度超过活化临界浓度后，量子点才能在光照下发生团聚 和光活化。 关键词：荧光相关光谱，碲化镉量子点，动力学半径，分子量，摩尔消光系数。 发光量子点比例，表面电荷，荧光淬灭和荧光增强 h 上海交通大学博士学位论文 f l u o r e s c e n c ec o r r e l a n o ns p e c t r o s c o p ys y s t e m a n di t sn e wa p p l i c a t i o n si nt h ec h a r a c t e r i z a t l 0 no f f l u o r e s c e n tn a n o m a t e r i a i ，s a b s t r a c t t od i r e c t l yo b s e r v ed i s 忙m u t i o a n dt i m e 缸a j e c t o r i e so fs i n g l em o l e c u l e so r s i n g l ep a r t i c l e sa n dt h e nt oa n a l y z e , s o r t , a n dd e s c r i b et h e m , a l es t i l lo n eo fa n a l y s t s d r e a m s i n1 9 7 0 s ，i no r d e rt om s o r em o l e c u l a rd i f f u s i o na n dr e a c t i o nk i n e t i c so f b i o m a c r o m o l e c u l e si nt h eh i 【g h l y d i l u t e d s o l u t i o n ，f l u o r e s c e n c e c o r r e l a t i o n s p e c t r o s c o p y 伊c s ) t e c h n i q u ew a s i n t r o d u c e d a n dw i t ht h ed e v e l o p m e n to f c o n f o c a l m i c r o s c o p et e c h n i q u e ，o p t i c a ld e t e c t i o nt e c h n i q u ea n dc o m p u t e rs c i e n c ei n1 9 9 0 s ， f c sg r a d u a yb e c o m ea nm v a n c e ds i n g l em o l e c u l ed e t e c t i o nt e c h n i q u ei nt h e , s o l u t i o n n o wi th a sr e c e n t l ye x p e r i e n c e dg r o w i n gp o p u l a r i t yi nt h el i f es o i e n c e ，s u c h a ss t u d yo nt h ei n t e r a c t i o no fd n aa n dp r o t e i n ，d i f f u s i o no f p a r t i c l e si nt h ei n n e ro f c e l la n do nt h ec e l lm e m b r a n ea n dh i 曲t h r o u g h p u ts c r e e n i n go fn e wd r u g ( h t s ) f c si sa l lu l t r a s e n s i t i v ea n dn o n i n v a s i v ed e t e c t i o nt e c h n i q u et h a tu s e ss t a t i s t i c a l a n a l y s i s o ft h ef l u c t u a t i o n so ff l u o r e s c e n c ee m i t t e df r o mas m a l l , o p t i c a l l y w e l l d e f i n e do p e nv o l u m ee l e m e n t t h ea u t o c o r r e l a t i o nf u n c t i o nc a np r o v i d eu ss o m e i m p o r t a n ti n f o r m a t i o n , s u c ha st h ea v e r a g en u m b e ro fl u m i n e s c e n tp a r t i c l e si nt h e v o l u m ea n dt h ec f f i c i e n to fd i f f u s i o ne t c a san e ws i n g l em o l e c u l ed e t e c t i o n t e c h n i q u e 咖d y0 1 1f c s i n s t r u m e n ta n da p p l i c a t i o ni ss c a r c e i nt h i sw o r k ，b a s e do nt h ep r i n c i p l e st oc o n s t r u c to n es i n g l em o l e c u l ed e t e c t i o n s y s t e m ：( 1 ) as m a l le x c i t a t i o nv o l u m e ，t or e d u c et h eb a c k g r o u n d ；( 2 ) h i g h - e f f i c i e n c y c o l l e c t i o no p t i c s ；( 3 ) t h eu s eo fd e t e c t o r sw i t hh i g hq u a n t u me f f i c i e n c ya n dl o wd a r k n o i s e ；( 4 ) c m e f i l l e l i m i n a t i o no fb a c k g r o u n df l u o r e s c e n c eb yv a r i o u sm e a n s ，a s e n s i t i v ea n ds t a b l ef l u o r e s c e n c ec o r r e l a t i o ns p e c t r o s c o p y ( f c s ) s e t u pw a sd e v e l o p e d a n du s e df o rs t a d yo ns o m ek e yp r o b l e m so ff l u o r e s c e n tn a n o m a t e r i a l s t h ep a p e r c o n t a i n st h ef o l l o w i n gp a r t s ： 1 o n ef l u o r e s c e n c ec o r r e l a t i o ns p e c t r o s c o p ys y s t e mw a sd e v e l o p e dw i t hl a s e r i n 上海交通大学博士学位论文 c o n f o c a l o p t i c s a sm a i n o p t i c a ls t r u c t u r e ，o n eh i - g h n u m c d c a l a p e r t u r e w a t e r - i m m e r s i o no b j e c t i v ea so p t i c a lc o l l e c t i n gd e v i c ea n dap i n h o l ea ss p a c ef i k e r t h em e a s u r e m e n to nt h ed i f f u s i o no fo r g a n i cd y e ss h o w st h a tt h el a s e rh i 曲l y i l l u m i n a t e dv o l u m ei sl e s st h a nl f la n dr a t i oo fs i g n a lt ob a c k g r o u n d ( s i n ) o f s i n g l e d y em o l e c u l ei sg r e a t e rt h a n4 0 0 t h eh i 【曲一s e n s i t i v ea n ds t a b l es y s t e mc a nb eu s e df o r c 6 7 7 t p o i n tm u t a t i o na n a l y s i so f m e t h y l e n e t e t r a h y d r o f o l a t er e d u c t a s eg e n e 2 c o m b i n e df c sw i t he n s e m b l em o l e c u l a rs p e c t r o m e t r y , an e wm e t h o dw a s d e v e l o p e dt oc h a r a c t e r i z em o l e c u l a rw e i g h t , m o l a re x t i n c t i o nc o e f f i c i e n ta n db r i g h t f r a c t i o no fc d t eq d ss y n t h e s i z e di na q u e o u ss o l u t i o n t h ep r i n c i p l ei sm a i n l yb a s e d o nt h em e a s u r e m e n t so fh y d r o d y n a m i cd i a m e t e r so fc d t eq d sa n dt h en u m b e ro f b r i g h tq d s i nas m a l li l l u m i n a t e dv o l u m ee l e m e n t u s i n g f c st e c h n i q u e h y d r o d y n a m i cd i a m e t e r so fas e r i e so fc d t eq d sw e r em e a s u r e d 、析t hf c sa n dt h e m o l e c u l a rw e i g h t sw e r ec a l c u l a t e da s s u m i n gt h em c a s u r g dh y d r o d y n a m i cd i a m e t e r s a st h ed i a m e t e r so fq d s t h em o l a re x t i n c t i o nc o e f f i c i e n t so fq d sa td i f f e r e n t e x c i t o n i ca b s o r p t i o np e a kp o s i t i o n sw e r ec a l c u l a t e dw i 血t h em o l e c u l a rw e i g h t s f u r t h e r m o r e ，t h ef i t t e de x c i t o n i ca b s o r p t i o np e a k d e p e n d e n c eo fe x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t sw a su s e dt os t u d yo s t w a l dr i p e n i n go rd e f o c u s i n go fq d si nf l q u e m l $ s y n t h e s i sp r o c e s s t h eb r i g h tf r a c t i o no fq d ss a m p l e sw c i c h a r a c t e r i z e db y m e a s u r i n gt h ec o n c e n t r a t i o no f t h eb r i g h tq d sa n dt h et o t a lc o n c e n t r a t i o no f q d s ，a n d i tw a so b s e r v e dt h a tt h eb r i g h tf r a c t i o u so fc d t eq d ss a m p l ew e r ep r o p o r t i o n a lt o q u a n t u my i e l d s ( q y s ) a n dt h er a t i oo ft h eb r i g h tf r a c t i o nt oq yw a sc l o s et o1 o u r m e t h o d sd e s c r i b e dh e r e i na r e s i m p l e a n d u n i v e r s a l ，a n d a r es u i t a b l ef o r c h a r a c t e r i z a t i o no fm o l e c u l a rw e i g h t ，m o l a re x t i n c t i o nc o e f f i c i e n ta n d b r i g h tf r a c t i o n o fq d ss y n t h e s i z e di na q u e o u sp h a s ea n do r g a n i cp h a s e m e a n w h i l e ，t h em e t h o d s w f y eu s e dt oc h a r a c t e r i z eh r pp r o t e i nt a g g e dw i t hq d s i tw a so b s e r v e dt h a tn e a r l y o n eq u a n t u md o tw a sc o n j u t a t e do nt h es u r f a c eo f e a c hh r p p r o t e i n 3 an e wm e t h o dw a sd e s c r i b e df o r t h em e a s u r e m e n to f s u r f a c ec h a r g eo f f l u o r e s c e n t p a r t i c l e s ，i n c l u d i n gq d s ，b yc o u p l i n gf c s w i t hm i c r o f l u i d i cc h i pe l e c t r o p h o r e s i s t h i sm e t h o dh a sb e e ns u c c e s s f u l l yu s e dt od e t e r m i n et h es u r f a c ec h a r g eo f f l u o r e s c e i n a n dc d t eq d s t h em e a s u r e dc h a r g e so ff l u o r e s c e i ni np h7 4a n dp h8 4b u f f e r sa r e t v 上海交道大学博士学位论文 a b g 兀认c t 1 1 ：t - 0 5a n d1 5 i - 0 4 ，r e s p e c t i v e l y t h es u r f a c ec h a r g eo f m p a - s t a b i l i z e dc d t eq d si n t h et bb u f f e ro f p h8 4 ，9 3a n d1 0 0w a s6 2 _ 4 - o 4 ，6 3 ：l 0 8 ，a n d7 任o 7 m e a n w h i l e ， i tw a sf o u n dt h a tt h es u r f a c ec h a r g eo f q d sw a sr c m a r k a b l ya s s o c i a t e dw i t ht h et y p e o f s t a b i l i z e r so nq d ss u r f a c e ，b u f f e rp ha n do t h e rf a c t o r s a f t e rm p a - s t a b i l i z e dc d t e q d sd r yp o w d e rw a sd i s s o l v e da n dd i s p l a c e db yr e d u c e dg l u t a t h i o n ei nt h e1 0m m b o r a t eb u f f e r ( p h1 0 o ) c o n t a i n i n g1 0m mr e d u c e dg l u t a t h i o n e ，s u r f a c ec h a r g eo f c d t e q d s c h a n g e d i n t o l l 8 ：t ：0 5 c o m p a r e d t o t h e c u r r e n t m e t h o d s , t h i s t e c h n i q u e i s c h a r a c t e r i z e db yn o n i n v a s i v e n e s s ，h i g hs e n s i t i v i t y , e f f e c t i v e n e s sa n d v e r s a t i l i t y 4 c o m b i n a t i o no f f c sw i t hs o m ee n s e m b l et e c h n i q u e sw a su s e dt oi n v e s t i g a t et h e q u e n c h i n gp r o c e s sa n dm e c h a n i s mo f h e a v y m e t a li o n s ( s u c ha sa g + ) o nc d t eq d s i ti sf o u n dt h a tw h e ns i l v e ri o n s ( a 曲q u e n c hq d s ，t h ef r e ea g + i o n se n t e rt h et r a p s i t e s ，b i n dw i t hb a r et ea t o m sa n df o r mt h ea g t es t r u c t u r ei nt h es u r f a c e ，w h i c h r e s u l t si nt h el u m i n e s c e n tq u e n c h i n go f q d s t h ef c se x p e r i m e n t a lr o s a i t ss h o wt h a t t h eq u e n c h i n gp r o c e s si sn o tt h eg r a d u a lr e d u c t i o no f f l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo f s i n g l e q d s ，b u tt h ed e c r e a s em t h en u m b e ro f b r i g h tq d sw i t ht h ea d d i t i o no f a g + i o n s f u r t h e r m o r e ，f c sw a su s e dt oi n v e s t i g a t et h ee f f e c to f d i a l y s i sp r o c e s so nc d t eq d s i ti so b s e r v e dt h a ts o m ed a r kq d sc o n v e r ti n t ot h eb r i g h tq d si nt h ed i a l y s i s e x p e r i m e n t sa n dt h ed i a l y s i sp r o c e s sc a ni m p r o v et h eb r i g h t n e s sp e rq d s a n dt h e r e s u l t so f f c sa n df l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p yi l l u s t r a t et h a tt h ei n c r e a s eo f t h e f l u o r e s c e n c eq u a n t u my i e l d ( q y ) i sm a i n l ya t t r i b u t e dt ot h er e m o v a lo f e x c e s s u n r e a c t e dc d m p ac o m p l e xa n dt h ep o s s i b l ec h e m i c a lc h a n g eo f t h eq d ss u r f a c ei n t h ed i a l y s i sp r o c e s s t h e s en e wr e s u l t sc a nh e l pi l st of n r t h e ru n d e r s t a n dt h ec o m p l e x s u r f a c es t r u c t u r eo f w a t e r - s o l u b l eq d s ，i m p r o v et h e i rs u r f a c ec h e m i c a lf e a t u r e s ，a n d e x p a n dt h e i ra p p l i c a t i o n si ns o m ef i e l d 5 t h ea g g r e g a t i o na n dt h es u b s e q u e n tp h o t o a c t i v a t i o np r o c e s so fm p a - e a p p i n g c d t eq d si n d u c e db yl a s e rw e r es y s t e m a t i c a f l ys t u d i e dw i t hf l u o r e s c e n c ec o r r e l a t i o n s p e c t r o s c o p y 俾c s ) i tw a so b s e r v e dt h a tt h ep h o t o a c t i v a t i o np r o c e s sw a sc l o s e l y r e l a t e dw i t ht h ea g g r e g a t i o no f q d si ns o l u t i o n t h eb r i g l l t e n i n go f q d ss a m p l e sw a s d u et ol a s e r - i n d u c e da g g r e g a t i o na n ds u b s e q u e n ts u r f a c er e c o n s t r u c t i o n t h e a g g r e g a t i o np r o c e s so fq d s w a sd e p e n d e n to ns i z e so fq d s t h es m a l l e rq d sw e r v 上海交通大学博士学位论文 a b g 兀u l c t a p tt ob ea g g r e g a t e dt o g e t h e ra n db ep h o t o - a c t i v a t e db yl a s e r a n dt h eh i g h e r c o n c e n t r a t i o no f s a l tc o u l dr e d u c ea n ds u p p r e s st h ea g g r e g a t i o ns i g n i f i c a n t l y , a n dt h e n a f f e c t e d p h o t o - a c t i v a t i o np r o c e s s o f q d s m e a n w h i l e ，i t w a sf o u n dt h a t p h o t o a c t i v a t i o np r o c e s sw a sa l s oa s s o c i a t e dw i t ht h ec o n c e n t r a t i o no fq d s o n l y w h e nt h ec o n c e n t r a t i o n so fq d sw e r eg r e a t e rt h a nt h ec e r t a i nc o n c e n t r a t i o n ( c a l l e d c r i t i c a lc o n c e n t r a t i o n ) ，t h ep h o t o a c t i v a t i o no f q d sh a p p e n e du n d e rl a s e ri r r a d i a t i o n k e yw o r d s ：f l u o r e s c e n c ec o r r e l a t i o ns p e c t r o s c o p y ，c d t eq o s , d y n a m i c d i a m e t e r , m o l e c u l a rw e i g h t , m o l a re x t i n c t i o nc o e f f i c i e n t ，b r i g h tf r a c f i o n ，s u r f a c e c h a r g e ，l u m i n e s c e n tq u e n c h i n ga n dl u m i n e s c e n te n h a n c e m e n t v i 上海交通大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得 的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写 过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明本 人完全意识到本声明的法律结果由本人承担 学位论文作者签名： 硇存 日期：夕印年午月譬e t 上海交通大学 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了_ 解学校有关保冒、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家 有关部门或机构送交论文的复印件和电子版允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大 学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密口，在- 年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密口。 ( 请在以上方框内打“4 ”) 学位论文作者签名：蓠身懦 指导教师签名： 日期：沪刁年甲月日 & 够彳t , 1 1 奄 蹴9 归俨 上海交通大学博士学位论文第一章绪论 第一章绪论 自从原子、分子的概念建立以来。人们就梦想能对单个原子、分子进行观察 和操纵。1 9 5 9 年，f e y n m a n 认为“人类可以用小的机器制作更小的机器最后 将变成根据人类意愿，逐个地排列原子，制造产品”i t 。然而直到二十世纪八十 年代，人们对微观世界的观测和研究仍是建立在系综平均的基础上的，提供的仍 然仅仅是物质的平均性质。这种系综平均约分橱方法，仅能了解一般物质的整体 属性，而对单个分子及单个分子之间的相互作用不能准确、有效地表达。到了二 十世纪八十年代初，扫描隧道显微术( s 1 m ) 的出现从根本上改变了人们对物质 世界的认识水平【2 】。它使人们第一次可以在三维空间下观察到单个原子在物质表 面的排列状态。继s t m 之后，科学家们又陆续发展了一些单分子( 原子) 研究方 法，如原子力显微术( a f m ) 、近场扫描光学显微术( n s o m ) 等o , 4 1 ，并诞生 了一门新的学科一单分子科学。而单分子科学作为人类认识物质世界的一次深 刻革命，迅速对自然科学的各个分支产生了深远的影响。 与系综平均的分析方法相比，单分子科学的分析方法，如单分子检测( s i n g l e m o l e c u l ed e t e c t i o n ，s i n ) 方法。可以直接观测非均匀聚集体中的单个分子的分 布和时间轨道，并对它们进行识别、分类和定量描述。单分子检测技术还能测定 一些在整体水平上不可能同步进行的化学反应的中间产物，从而对化学反应的途 径进行实时监测【5 l 。因此单分子检测技术的出现和迅速发展将对许多科学定律产 生深刻的影响，为分子生物学、化学、医学、固态物理学和材料科学的更深层次 上的研究提供一个新的分折手段。 1 1 单分子检测技术归纳 目前能用于单分子研究的技术很多，主要可以归纳为两大类：一是扫描探针 显微技术( s c a n n i n gp r o b em i c r o s c o p i e s ，s p m s ) ，一是光谱技术( o p t i c a l s p e e t r o s c o p i e s ) 。 上海交通大学博士学位论文第一章绪论 1 1 1 扫描探针显微技术 ( 1 ) 扫描隧道显微镜( s c a n n i n gt u n n e l l i n gm i c r o s c o p y , 8 t m ) 1 9 8 2 年i b m 公司瑞士苏黎世实验室的两位科学家b i m i g 和r 0 h 蝌研制出种 新型显微镜一扫描隧道显微镜，其原理是利用量子力学中的隧道效应，通过探测 固体表面原子中电子的隧道电流来分辨固体表面的形貌t 2 。即把非常细小的针尖 和被研究物质表面作为两个电极，当样品与针尖距离非常近( l 姗) 时在外加电 场的作用下，电子会穿过两电极问的绝缘层从一个电极流向另一个电极，而产生 隧道电流。隧道电流与针尖、样品间距，外加电压以及样品物理性质有密切关系， 所以通过观察电流、间距等物理量可以获得样品的各种物理性质。同时s t m 达到 了原子级的分辨，可以用来实现单分子研究。 s t m 现已在多个领域取得成就，譬如采用该技术人们可实现单分子观察、单 分子操纵旧、对晶体中的分子排列进行研究印以及构造新的功能分子和单分子器 件等【8 ，虮。s t m 的一个局限在于所分析的样品应该具有一定的导电性，这在某种 程度上限制了它的应用。 ( 2 ) 原子力显微镜( a t o m i cf o r c em i c r o s c o p e ，a f m ) 由于s t m 需要依靠隧道电流工作，因此仅适用于导电材料的分析。为了获取绝 缘材料的原子图像，在s t m 的基础上，b i n n i n g 、q u a t e 和g e r b e r 于1 9 8 6 年又发展 了原子力显微镜技术f 3 】。它的基本原理是：利用特制的微小探针接近样品表面，由 于原子间的相互作用力。使得装配探针的悬臂发生微弯曲，检测到微弯曲的情况， 从而知道表面与探针之间的原子力大小。在探针沿表面扫描时，保持尖端与表面 原子力恒定所需施加于压电材料两端的电压波形，就反映了表面形貌。由于原子 间的作用力极小( 约为l o 一1 0 牛顿量级) ，因此a f m 的分辨率可达原子尺寸。a f m 可以探测任何类型的力，由此派生出一系列的力显微镜，如磁力显微镜 ( m f m ) 1 0 1 、电力显微镜( e f m ) 、摩擦力显微镜( f f m ) 等。 a f m 具有广泛的用途，特别是最近几年a f m 被广泛应用到生命科学领域的 研究中。r i e f 等人对多糖的结构进行了研究】，w o n g 等测定了链酶亲和素一生 物素间的作用力f 1 2 】，l e e 等人测定了d 咐a 两条互补链间的作用力l ”】，而b o l a n d 和 r a m e r 对d n a 碱基对的氢键作用进行了研究f 1 4 】，并认为每个互补碱基对间的氢键 上海交通大学博士学位论文 第一章绪论 力为5 4 p n 。s 衄和y o k o t a 还对错配d n a 和m u t s 蛋白的相互作用进行了研究【1 5 1 i 1 2 光谱技术 ( 1 ) 荧光相关光谱技术( f l u o r e s c e n c ec o r r e l a t i o ns p e c t r o s c o p y , f c s ) 在生理条件下对生物大分子进行探测并提供分子结构和功能之间的信息，是 目前分析化学家在单分子检测研究中最感兴趣的课题。激光诱导荧光检测由于其 具有高灵敏度是目前溶液中单分子检测最常采用的手段。激光诱导荧光单分子检 测技术的关键在于如何从背景噪音中提取单分子荧光信号。在激光诱导荧光检测 中背景噪音主要来源于拉曼和瑞利散射、样品溶液和盖玻片本体荧光以及检测器 暗电流。w e i s s 认为f 5 l ，采用以下四个方法可以有效降低背景噪音，提高信噪比； 1 ) 尽量减小检测体积，因为单分子信号与激发体积无关，而背景噪音与激发体 积成正比；2 ) 采用高效光学收集元件；3 ) 采用低暗电流检测器；4 ) 采用其他 多种手段消除背景荧光。其中检测体积是影响单分子检测信噪比的关键因素。当 检测体积小到几时，其背景可忽略不计，将具有很高的信噪比。目前已发展了多 种溶液中的单分子检测技术，比如流体聚焦法，微滴流法等。 k e l l e r f f - 铂d o v i c h i 等采用流体聚焦的方法，将样品通道逐渐变窄，直至最窄处 只有一个分子通过，然后采用激光束垂直照射样品通道并将其恰好聚焦在通道最 窄处，从而将检测体积减少到1 0 4 2 l ，第一次实现了单个r e g 分子的检测【6 , 1 7 】。 利用p l 级微滴检测溶液中单分子具有溶剂背景低、激光照射时间长，信号 强度大等特点。b a r n e s 等采用微滴流法，实时观测到了微滴流中单个r 6 g 分子的 荧光 t s , 1 9 】。 二十世纪七十年代初。m a g d e 、e l s o n 和w e b b 在涨落光谱的基础上提出了荧 光相关光谱概念1 2 0 - 2 3 。但由于计算机技术、光学技术以及光学检测技术的局限性， 荧光相关光谱并未在单分子检测中得到应用。直到1 9 9 3 年r i g l e r 等在光学构型上 开始采用了共聚焦技术，将检测体积降到l 0 0 5 l 以下，f c s 技术才开始显示其在 溶液单分子检测方面的巨大优越性【2 4 】。它通过测定溶液中微区内( 通常 1 0 - 1 5 l ) 发光粒子由于布朗运动或化学反应而产生的荧光涨落( 荧光强度的明暗变化) ， 并对荧光强度随时间变化的函数进行分析，从而获得粒子浓度、化学动力学参数 等有关信息。其基本理论，实验技术，仪器设备将在下一节做具体介绍。 上海交通大学博士学位论文第一章绪论 ( 2 ) 荧光共振能量转移( f l u o r e s c e n c er e s o n a