（化学工艺专业论文）超临界流体色谱提纯冬凌草甲素实验研究.pdf

超临界流体色谱提纯冬凌草甲素实验研究 e x p e r i m e n t a ls t u d y o nt h ep u r i f i c a t i o no f o r i d o n i nb y s u p e r c r i t i c a lf l u i d c h r o m a t o g r a p h y 学科专业：化学工艺 研究生：张艳稳 指导教师：吕惠生副教授 天津大学化工学院 二零零八年六月 摘要 冬凌草甲素是冬凌草中的萜类药用有效成分，具有清热解毒、消炎止痛、 健胃活血及抗肿瘤之功效。传统制备工艺以冬凌草为原料，采用有机溶剂进行提 取，然后采用层析、重结晶等方法进一步精制。工艺流程冗长，操作繁杂费时， 使用丙酮、氯仿等有机溶剂，不能适应日趋严格的环保要求。 本课题针对传统工艺提取冬凌草甲素存在的问题，采用超临界流体技术对冬 凌草甲素的提取和分离过程开展了实验研究。 首先对冬凌草甲素的超临界流体萃取( s f e ) 过程的工艺条件进行了研究。通 过分析不同夹带剂对s f e 过程中冬凌草甲素提取率的影响，选择水含量为1 0 的 乙醇水混合溶液作为夹带剂；通过正交实验得到以下s f e 冬凌草甲素适宜的工艺 条件：压力3 5m p a ，温度3 2 8 1 5k ，夹带剂流量4m l m i n ，c 0 2 流量2 5g m i r a 各因素对提取率的影响程度为：夹带剂流量 萃取压力 萃取温度 c 0 2 流量；冬 凌草甲素的提取率达到0 4 0 2 。 采用石油醚和乙酸乙酯萃取的方法对s f e 提取液进行了预处理，解决了超 临界流体色谱( s f c ) 过程色谱峰分离度差、拖尾严重等问题，冬凌草甲素含量( 溶 液脱除溶剂后在固相物中的含量) 由8 0 6 提高到1 9 9 4 。 首次采用了s f c 技术对冬凌草提取液进行了分离纯化。通过s f c 分离冬凌草 甲素的实验研究，确定了冬凌草提取液样品进行s f c 分离操作较适宜的工艺条 件：色谱柱为极性氰基柱( 2 5 0m m 9 4m m ，5 岬) ，改性剂为甲醇( 加入量8 ) ， c 0 2 流量1 8g m i n ，温度3 1 3 1 5k ，压力1 2m p a ，紫外检测器波长2 3 8n m 。在 此实验条件下，冬凌草甲素的容量因子为7 2 3 ，冬凌草甲素峰与相邻组分峰a 的 分离度为1 4 5 ，冬凌草甲素产品纯度达到8 4 4 。 在实验研究的基础上，利用分子模拟的m d 方法完成了s c c 0 2 c h 3 0 h m - - 元混 合流体密度的预测；采用五参数平均晶格场模型，对冬凌草甲素容量因子的实验 值与密度和温度进行了关联，得到r 2 = 0 9 0 3 0 9 ，f c = 7 2 3 凡o l ，说明采用五 参数平均晶格场模型，能够对s c c 0 2 甲醇为流动相的s f c 分离冬凌草甲素过程的 容量因子变化规律进行较好的描述；得n s f c 分离冬凌草甲素容量因子与温度和 密度关联的模型方程： 1 n 后厶：1 5 5 8 一下4 5 1 0 7 3 1 8 0 6 p + 7 3 2 6 0 4 1 p 一1 7 2 8 5 6 41 关键词：冬凌草甲素超临界流体萃取超临界流体色谱容量因子分离度 a b s t r a c t o r i d o n i n w h i c hi se x t r a c t e df r o mr a b d o s i ar u b e s c e n s ( h e m s l ) h a r a ，l sa n e n t k a u r e n ed i t e r p e n o i dc o m p o u n dw i t hm e d i c a lu s e s o r i d o n i nh a sm e d i c a lv a l u e s s u c ha st or e m o v eh e a t i n e s sa n dt o x i n ，a n da c ta sap a i n k i l l e r sa n da n t i s e p t i c t h e m a j o ru s eo fo r i d o n i ni st op r e v e n tc a n c e r p l e n t yo fo r g a n i cs o l v e n t si sn e e d e di n e x t r a c t i n go r i d o n i nt h r o u g ht h et r a d i t i o n a lt e c h n o l o g y , w h i c hi sf o l l o w e db yc o l u m n c h r o m a t o g r a p h ya n dr e c r y s t a l l i z a t i o nt or e f i n ei t t h et e c h n o l o g ya b o v e ，w h i c hc a u s e s e n v i r o n m e n t a lc o n t a m i n a t i o n ，c o n s u m eal a r g eq u a n t i t yo fo r g a n i cs o l v e n t sa n di s t i m ec o n s u m i n gb e s i d e sc o m p l e xo p e r a t i o n t h i sp a p e rf o c u s e so nt h ee x t r a c t i o na n dp u r i f i c a t i o no fo r i d o n i nb yu s i n g s u p e r c r i t i c a lf l u i dt e c h n o l o g y , w h i c hc a na v o i dt h ea f o r e m e n t i o n e dd r a w b a c k s f i r s t l y , r e s e a r c h w o r kw a sd o n et oo b t a i nt h eo p t i m u mc o n d i t i o n s f o r s u p e r c r i t i c a lf l u i de x t r a c t i o n as t u d yo nt h ee f f e c t so ft h ey i e l do fo r i d o n i ns h o w s t h a tt h eu s eo fa9 c i e t h a n o l w a t e rm i x t u r ea sc o s o l v e n ti se f f i c i e n c y o nt h eb a s i so f as e r i e so fo r t h o g o n a le x p e r i m e n t s ，s u i t a b l ee x t r a c t i o nc o n d i t i o n sw e r eo b t a i n e d ： p r e s s u r e3 5m p a ，t e m p e r a t u r e3 2 8 15k ，f l o w r a t eo fc o s o l v e n t4m l m i n ，f l o wr a t eo f c 0 22 5g m i n a c c o r d i n gt ot h ee x p e r i m e n t sr e s u l t s ，t h e e x t e n to fe f f e c t i o nt h e e f f i c i e n c yo fe x t r a c t i o n ：f l o wr a t eo fc o s o l v e n t p r e s s u r e t e m p e r a t u r e f l o w r a t eo f c 0 2 u n d e rt h eo p t i m u mc o n d i t i o n s ，t h ey i e l do f o r i d o n i ni s0 4 0 2 p r e p r o c e s s i n gp r e p a r a t i o n s ，f o rt h es u p e r c r i t i c a lf l i u dc h r o m a t o g r a p h y ( s f c ) p r o c e s s ，w e r eu s e do nt h ee x t r a c t i o nw i t hp e t r o l e u me t h e ra n de t h y la c e t a t e t h e s e p a r a t e ds t a t u s ，t r a i l i n gp e a k a n do t h e rd i s c r e p a n c yw h i c hm a yo c c u ri nt h e c h r o m a t o g r a mh a sb e e na m e l i o r a t e d t h ec o n t e n to ft h ec o l l e c t e do r i d o n i ni n c r e a s e d f r o m8 0 6 t ol9 9 4 s u p e r c r i t i c a lf l u i dc h r o m a t o g r a p h yi su s e df o rt h ef i r s tt i m ei n t h i st h e s i s t o p u r i f yt h ee x t r a c t e do r i d o n i n b a s e do ne x p e r i m e n t so fs f c t op u r i f yo r i d o n i n ，t h e o p t i m u mc o n d i t i o n sa r ea sf o l l o w s ：p o l a rc y a n oc o l o u m n ( 2 5 0m m 9 4m m i d5 l a i n ) 。m o d i f i e rm e t h a n o la n dc o n t e n t8 ( w t ) ，f l o wr a t eo fc 0 2 18g m i n ， t e m p e r a t u r e3 13 15k ，p r e s s u r e12m p a ，u v - s p e c t r o m e t e rw a v e l e n g t h2 38n m u n d e r t h ea b o v ec o n d i t i o n s 。t h ec a p a c i t yf a c t o ro fo r i d o n i ni s7 2 3 ，t h er e s o l u t i o no f o r i d o n i na n dt h ea d j a c e n tp e a kai s1 4 5a n dt h ep u r i t yo ft h ec o l l e c t e do r i d o n i n r e a c h8 4 4 o nt h eb a s i so fe x p e r i m e n t a lr e s e a r c h ，m dm e t h o do fm o l e c u l a rs i m u l a t i o nw a s u s e dt op r e d i c tt h ed e n s i t yo fs c c 0 2 c h 3 0 hm i x t u r e f i v e p a r a m e t e rm e a n f i e l d l a t t i c em o d e lw a su s e dt or e l a t et h ec a p a c i t yf a c t o ro ft h eo r i d o n i nw i t ht e m p e r a t u r e a n dd e n s i t y , r e s u l t e di nr 2 = 0 9 0 3 0 9 ，f c 7 2 3 f o o l ，w h i c h , i m p l e st h a tt h em o d e l c a np r e c i s e l yd e s c r i b es f c p r o c e s sw i t hs c c 0 2 c h 3 0 ha sm o b i l ep h a s e t h er e l a t i o n s h i po fs f cc a p a c i t yf a c t o ro ft h eo r i d o n i nw i t ht e m p e r a t u r ea n dd e n s i t yi sg i v e na s f o l l o w s ： - n k 一8 一一4 5 1 0 7 3 18 0 6 p + 7 3 2 6 0 4 ( p ) 川2 s s 6 k e yw o r d s ：o r i d o n i n ，s u p e r c r i t i c a lf l u i de x t r a c t i o n ，s u p e r c r i t i c a lf l u i d c h r o m a t o g r a p h y , c a p a c i t yf a c t o r , r e s o l u t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得鑫垄盘堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：彳i 辛它狺签字日期：) 心年石月6 同 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解墨鲞盘堂有关保留、使用学位论文的规定。特授 权苤鲞盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家 有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名：细色晚 导师签名： 签字日期：砷年多月6 日 l卜 鼍囊无 签字日期：少矿辟月么日 第一章文献综述 1 1 冬凌草甲素 第一章文献综述 冬凌草 r a b d o s i ar u b e s c e n s ( h e m s l ) h a r a 】，又名碎米桠，冰凌草，系唇型科 香茶菜属多年生草本植物，药用茎和叶，因冬天全株结满薄如蝉翼的银白色冰凌 片而得名，广泛分布于黄河流域以南省区，主产地在河南济源太行山一带。冬凌 草味甘苦，性微寒，具有清热解毒、消炎止痛、健胃活血及抗肿瘤之功效。1 9 7 2 年从河南林县民间草药中发掘而出，以往历代本草均无记载，于1 9 7 7 年收载于 中国药典。该地民间将其用于食道癌、贲门癌的治疗，治愈率很高，从而引 起了医学工作者的高度重视。 冬凌草中含有二萜、单萜、倍半萜、三萜等一系列萜类，以及挥发油、甙类、 多糖、黄酮及甾体等化学成分【l - 4 ，研究表明：其中主要药用有效成分为贝壳杉 烷类二萜，现已从不同产地的冬凌草中分离出2 0 多种此类化合物；二萜类中主 要有效成分为冬凌草甲素o r i d o n i n ( - 4 ) 5 8 ) 和冬凌草乙素p o n i c i d i n ( - - 4 ) 1 2 ) p j ； 三萜类也具有一定的药理作用，主要有效成分为齐墩果酸o l e a n o l i ca c i d ( - 0 5 2 ) 和熊果酸u r s o l i ca c i d ( - - 4 ) 2 4 ) 【6 | 。目前研究较多、药理作用明确的为冬凌草甲素。 1 1 1 结构和性质 冬凌草甲素的分子式为c 2 0 h 2 8 0 6 ，分子量3 6 4 4 2 ，无色棱柱状结晶，2 4 8 2 5 0 熔解并分解，味苦，不溶于水，苯，醚和氯仿，易溶于甲醇和丙酮。冬凌草甲 素是一种具有一定极性的四环二萜类化合物，分子结构如图l - l 所示，分子中的 四个羟基形成氢键，分子之间靠氢键结合成晶体【7 】o 分子中含有的a 亚甲基环戊 酮，是一种抗癌活性集团，分子裂环或亚甲基饱和则活性消失。 图1 1 冬凌草甲素的结构式 f i g 1 1m o l e c u l a rs t r u c t u r eo f o r i d o n i n 第一章文献综述 1 1 2 药理作用 冬凌草甲素是冬凌草的主要药用有效成分，具有清热解毒、消炎止痛、健胃 活血及抗肿瘤之功效，该成分的药理活性一直备受关注。 抗菌消炎作用【8 】。冬凌草甲素对金黄色葡萄球菌、肺炎双球菌乙型链球菌均 有小剂量抑菌，大剂量杀菌的作用，其中肺炎双球菌对之最为敏感。 冬凌草甲素具有广谱的抗肿瘤作用 9 1 1 】。冬凌草甲素能够通过对癌细胞的直 接杀灭作用，抑制癌细胞得以摄取营养物质的钠泵活性，癌细胞d n a 、r n a 和 蛋白质的合成，诱导癌细胞凋亡和抵抗正常细胞突变等多种方式起到抗肿瘤的作 用。 冬凌草甲素作为一种抗癌药物应用于临床时应考虑到对心血管血流动力学 的影响。李琦掣1 2 】在研究过程中发现冬凌草甲素可以阻断心肌的p 受体，具有明 显的降压作用，可能还阻断外周血管平滑肌突触前膜p 受体，减少去甲肾上腺素 的释放，从而舒张血管平滑肌，降低外周血管阻力。 河南省医学科学研究所等单位【l3 】还研究了冬凌草甲素对机体免疫功能的影 响。研究表明：冬凌草甲素对体液免疫有轻度抑制作用，同时对细胞免疫无明显 的抑制作用。 1 1 3 制备工艺 冬凌草甲素的传统制备工艺：以冬凌草为原料，采用有机溶剂进行提取，然 后采用层析、重结晶等方法进行分离和精制。基本工艺步骤为：干燥、破碎、浸 泡提取、提取液预处理、柱层析、粗品重结晶精制等。根据采用的提取溶剂的不 同，冬凌草甲素的制备又分为乙醚提取层析精制和乙醇提取层析精制两种工 艺。 1 1 3 1 乙醚提取一层析精制 乙醚提取层析精制法为冬凌草甲素的早期提取分离工艺【1 4 15 1 。首先将干燥 粉碎后的冬凌草叶用乙醚浸泡，然后将乙醚浸泡提取液浓缩至膏状；再用甲醇溶 剂溶解，活性炭脱色；脱色滤液浓缩后放置一段时间，进行过滤再浓缩，后装入 氧化铝柱，采用氯仿丙酮进行层析分离，分离后的粗品经丙酮重结晶得到冬凌 草甲素，具体流程如图1 2 所示： 2 第一章文献综述 兰垦望羔可砰醚犀捷畈p 塑卿乙r 系蓊i _ | 曼罩啊醇溶裤 上酏- + 网甄藤堡生再百p t 寸面砰旅蚓 j 型塑坠臣至亟蕈函，景- 星堑 骂壹亟董氢卜冬凌草甲素 图1 - 2 乙醚提取层析精制法流程图 f i g 1 2f l o w s h e e to f e t h y le t h e re x t r a c t i n g - c o l u m nc h r o m a t o g r a p hr e f i n i n g 该工艺中使用的乙醚、氯仿等有机溶剂均有毒，易挥发，洗脱时溶剂用量大， 而且价格较高，流程冗长，操作费时麻烦，产品生产成本较高，对环境污染较大， 目前已很少采用。 1 1 3 2 乙醇提取一层析精制 为了改善有机溶剂残留及对环境的污染问题，袁珂等l l6 j 对冬凌草甲素的乙醇 提取法进行了研究，在提取过程中采用乙醇溶剂替代了乙醚溶剂，并专门考察了 冷浸、渗漉、回流、破碎这四种溶剂提取工艺。研究表明：按冬凌草甲素的提取 率由高到低排列为回流法 冷浸法 破碎法 渗漉法，其中回流提取工艺使用溶剂 量最大( 3 0 倍量) ，且加热时间长达数小时，提出杂质多且活性炭脱色困难；冷 浸提取和渗漉提取需要时间较长，冷浸法为2 周，渗漉法为数天，且使用溶剂量 较大( 2 0 倍量) ；破碎提取需要时间很短，操作时间为2 分钟，但原料由于破碎 成浆，给提取液后续分离造成了一定的困难。乙醇提取层析精制的操作过程： 首先将干燥粉碎后的冬凌草叶用乙醇溶剂提取，分离出的乙醇提取液进行活性炭 脱色；将脱色滤液浓缩至浸膏，用乙酸乙酯溶剂溶解后再用5 n a 2 c 0 3 溶液萃取， 得到的乙酸乙酯萃取相浓缩后与适量硅胶拌匀晾干，装入敞口玻璃柱中用丙酮一 石油醚进行梯度洗脱，分离后的粗品用甲醇重结晶得到冬凌草甲素。工艺流程见 图1 3 ： 兰望塑啦塑壁，至翌一茎亘囹一提取液t 垂蓟鱼等鎏固 j 重重，五丽堕塑! 黑嘉裴鎏鎏型酸圣斗鎏堕j 孽矍，l 硅胶柱菥袒鱼曼，百磊匪亘夏i 卜冬凌草甲素 教仕一 一。 图l 一3 乙醇提取一层析精制法流程图 f i g 1 - 3f l o w s h e e to fe t h a n o le x t r a c t i n g - c o l u m nc h r o m a t o g r a p hr e f i n i n g 3 第一章文献综述 为了进一步降低生产成本，冯长伟掣1 7 】采用9 5 乙醇替代无水乙醇对冬凌 草甲素进行提取，并采用热水混悬和石油醚萃取对浸膏进行脱杂处理。在冬凌草 原料中加入1 0 倍量9 5 乙醇，加热提取，浓缩后得到绿褐色黏稠浸膏；再用无 水乙醇溶解绿色浸膏，同时加入粉状活性炭脱色，将滤液浓缩得到浸膏；将浸膏 用热水混悬，混悬液用等量石油醚萃取4 次，将水相浓缩得到浸膏，完成了冬凌 草甲素的提取操作；将得到的浸膏用适量乙醇溶解，并加入等量的柱层析硅胶， 充分拌匀，在水浴上加热脱掉溶剂。将相当浸膏2 倍重量的柱层析硅胶装柱，加 样后上层覆盖适量硅胶，再加少量脱脂棉，分别以9 ：1 、8 ：2 比例的石油醚丙酮 为洗脱液，以1 0 1 5m l m i n 的流速进行洗脱，得到冬凌草甲素粗品。 邵锡宸等【l8 】为了进一步优化冬凌草甲素的乙醇提取工艺，通过正交试验考察 了冬凌草提取工艺条件及各因素的影响程度。实验采用罐组式逆流提取流程，将 一组浸取罐串联，乙醇顺次通过并与冬凌草互成逆流，乙醇在流动中浓度逐渐增 高，但它分别与平行浓度更高的冬凌草接触，确保传质过程获得较高的浸取率。 实验表明：冬凌草浸取因素以乙醇浓度对各项指标起决定性作用，浸取压力影响 次之，浸取时间影响较小，冬凌草原料长度影响甚微；得到冬凌草提取工艺优化 条件为：采用9 0 9 5 乙醇溶剂进行提取，浸取压力0 1 4 7m p a ，浸取时间4 - 6h 。 晁金华等i l9 】针对提取液的预处理工艺进行了改进。先将冬凌草干叶用工业酒 精连续回流提取，提取液用活性炭脱色，脱色滤液浓缩近干后溶于乙酸乙酯溶剂， 并加入5 n a 2 c 0 3 溶液洗除酸性杂质，含有冬凌草甲素的酯层经水洗至中性后加 无水n a 2 s 0 4 干燥，回收乙酸乙酯溶剂得到糖浆状物，然后将糖浆状物进行硅胶柱 层析，以8 ：2 的氯仿丙酮的混合溶剂洗脱，重结晶后得到冬凌草甲素。 采用乙醇提取柱层析进行分离精制，流程冗长，同时大量使用丙酮、氯仿 等有机溶剂，产品生产成本较高，对环境影响较大。在层析精制过程中，拌硅胶 及装柱工序操作劳动强度大，操作繁杂费时。 1 1 3 3 超临界流体萃取工艺研究 超临界流体萃取技术( s u p e r c r i t i c a if l u i de x t r a c t i o n ，s f e ) 是兴起于2 0 世纪6 0 年代的一种新型的提取分离技术，c 0 2 以其独有的优势成为首选的超临界萃取 剂，该溶剂安全、无毒，萃取产品中不存在溶剂残留问题，超临界c 0 2 ( s c c 0 2 ) 萃取过程中易挥发组分或生理活性物质极少损失或破坏，特别适于天然活性物质 成分的萃取分离。采用s c c 0 2 萃取技术可以改善冬凌草甲素传统提取工艺中存在 的流程冗长，大量使用有毒有害溶剂，影响环境等问题。 超临界流体( s u p e r c r i t i c a lf l u i d ，s c f ) 密度接近于液体，而黏度和扩散系数接 近于气体，因此不仅具有与液体溶剂相当的溶解能力，而且还具有良好的传质功 4 第一章文献综述 能。利用s c f 的这一特性，通过调节系统的操作压力和温度，选择性的萃取出 所需要的物质。 冬凌草甲素为四环二萜类化合物，其活性中心为a 亚甲基环戊酮结构，高温 受热后裂环或亚甲基饱和则活性消失1 7 。s c c 0 2 萃取可实现低温操作，从而有效 避免高温提取过程中一些不必要的不良反应对该活性中心所可能造成的破坏，保 证萃取的冬凌草甲素的品质。 田宏现等【2 0 j 以冬凌草叶为原料，冬凌草甲素含量约为0 5 8 ，采用对比分析、 正交实验和数理统计等方法，对s c c 0 2 萃取冬凌草甲素过程的萃取压力、萃取温 度、分离釜温度以及萃取时间对萃取冬凌草甲素产率的影响进行了分析，得到了 萃取操作的最佳工艺条件：萃取压力2 4m p a ，萃取温度3 2 8 1 5k ，萃取时间2 5 h ， c 0 2 流量2 9l m ，分离釜温度3 1 3 1 5k ，冬凌草甲素的提取率最高可达到0 5 1 5 。 冬凌草甲素具有一定的极性，s c c 0 2 对分子量较大或极性较强的溶质分子溶 解能力较差，为了有效提取那些有极性的成分，常常需要在s c c 0 2 中加入一定量 的极性溶剂作为夹带剂，以调节其极性，提高待萃物在其中的溶解度。邢洁等【2 l 】 对萃取过程中加入夹带剂的情况进行了考察。通过正交实验得到了s c c 0 2 萃取冬 凌草甲素的最佳工艺条件：压力3 8 5m p a ，温度3 1 3 1 5k ，夹带剂1 5m l g 。文 献中对所采用的夹带剂未进行具体说明，得到冬凌草甲素的提取率为0 3 9 。实 验以一定比例的石油醚丙酮为洗脱液，对s c c 0 2 萃取所得的产物用硅胶柱色谱进 行梯度洗脱，制得高纯度的冬凌草甲素。 本文拟采用s f e 制备s f c 分离冬凌草甲素的原料液，但由于冬凌草原料产 地，萃取实验设备，以及冬凌草甲素精制工艺等因素的影响，利用现有萃取实验 装置和参考文献中提供的最佳工艺条件，没能重复文献报道的提取效果。故本文 在冬凌草提取液的制备及预处理实验部分对s f e 冬凌草甲素的实验条件进行了 优化研究，并对提取液进行预处理，为s f c 分离冬凌草甲素实验提供原料。 1 1 4 分析检测方法 1 1 4 1 紫外分光光度法 紫外分光光度法是利用物质在紫外光区的分子吸收光谱，对物质进行定性、 定量及结构分析的方法。赵清治等【2 2 】采用外分光光度法测定注射剂“癌得宁”中 冬凌草甲素的含量。分析检测步骤：精密称取一定量“癌得宁”制剂，加8 0 乙醇溶剂溶解，并以8 0 乙醇溶剂作为空白，在2 3 8n m 波长处测量吸收度，由 测得的吸收度在标准曲线上查得冬凌草甲素含量。 紫外分光光度法的吸收光谱比较简单，特征性不强，并且大多数简单官能团 第一章文献综述 在近紫外光区只有微弱吸收或无吸收，所以应用有一定局限性。 1 1 4 2 薄层扫描法 薄层扫描法指用一定波长的光照射在经薄层层析后的层析板上，对具有吸收 或能产生荧光的层析斑点进行扫描，用反射法或透射法测定吸收的强度，以检测 层析谱的方法。袁珂等【2 3 1 采用薄层扫描法对冬凌草中冬凌草甲素的含量进行了测 定。 薄层层析条件：冬凌草甲素用甲醇溶解后，在硅胶g 薄层板上点样，以8 ：2 氯仿一丙酮展开，上行展开，展距1 6c m 。将样板取出晾干后，喷以5 0 硫酸显 色，1 0 0 - 1 0 5 烘烤至斑点清晰，呈现亮黄绿色斑点。于紫外灯( 3 6 5n m ) 下定位， 母值为0 5 5 左右。 薄层扫描条件：采用反射法双波长锯齿扫描法，光束狭缝0 4m m 0 4m m ， 线性参数s x = 3 ，灵敏度中等，冬凌草甲素的测定波长觚= 2 4 6n m ，参比波长l r = 3 0 0 n m o 薄层扫描法设备简单，应用较广泛，但灵敏度不太高，样板上经常出现斑点 模糊等问题，且采用目测法测定，误差较大。 1 1 4 3 高效液相色谱法 高效液相色谱法是通过溶质在固定相和流动相之间进行连续多次交换而实 现分离的技术。根据各组分分配系数的不同，离开色谱柱的顺序不同，通过检测 器得到不同的峰信号，最后通过分析比对这些信号来判断待测物所含有的物质。 高效液相色谱作为一种重要的分析方法，广泛的应用于化学分析中。其特点是采 用了高压输液泵、高灵敏度检测器和高效微粒固定相，适于分析高沸点不易挥发、 分子量大、不同极性的有机化合物。 邢洁等【2 l 】采用a g i l e n t l l 0 0 高效液相色谱仪，对冬凌草甲素的定量分析进行 了实验研究，得到冬凌草甲素色谱分析条件：s h i m p a c kc 1 8 柱( 1 5 0m m 4 6m m i d ，5p , m ) ；流动相甲醇水( 4 5 ：5 5 ) ；流速1 0m l m i n ；检测波长2 3 9n m ；进样 量2 0 l ；外标法定量。在选定色谱条件下，冬凌草甲素的保留时间为1 3m i n 左 右，其它成分不干扰冬凌草甲素的测定。 李志平等 2 4 1 也对采用高效液相色谱法，建立测定冬凌草甲素含量的方法进行 了研究。得到色谱分析条件：色谱柱w a t e r ss y m m e t r yc 1 8o d s 柱( 15 0m m x4 6 m mi d ，5 l m a ) ；检测波长2 3 8n m 温度3 0 8 1 5k ；流动相甲醇水( 6 0 ：4 0 ) ，流速 1 0m l m i m 进样量l ou l 。 采用高效液相色谱法对冬凌草甲素的含量进行分析，样品处理简单( 只需用 o 4 5 岬微孔滤膜过滤) 、分离度高、重现性好、线性范围宽、结果准确、精密度 6 第一章文献综述 高。 本研究课题拟采用高效液相色谱法，以甲醇水为流动相，对冬凌草甲素产 品进行分析检测。 1 2 超i 临界流体制备色谱技术 1 2 1 超临界流体色谱技术 s f c 是以超临界流体为流动相，以固体吸附剂( 如硅胶) 或键合到载体( 或毛 细管壁) 上的高聚物为固定相的一种新型色谱分离技术。混合物在s f c 上的分离 机理与气相色谱( g c ) 及液相色谱( l c ) 一样，即基于各化合物在两相间的分配系 数不同而得到分离。 超临界流体被用作色谱流动相最早是由l o v e l o c k 于1 9 5 8 年提出的，当时没 能作为一种分析手段来应用，后来开发了空心毛细管柱式s f c ，才使超临界流体 应用于分析领域【2 5 1 。但当时正是g c 和高效液相色谱( h p l c ) 研究和发展非常迅速 的阶段，这成为了s f c 发展的最大障碍。直到8 0 年代中期，随着对超临界流体 特性的进一步认识和超临界流体实验技术新的突破，s f c 才重新引起研究人员的 注意，并且出现了商业化的色谱柱和设备，从而s f c 得到了不断的完善和发展。 超临界流体的性质介于气体与液体之间，兼有两者的特点。它像液体那样， 溶解能力强，能溶解大分子及非挥发性样品：又能如气体一样，具有较小的黏度， 较大的扩散系数。因此，与g c 和h p l c 相比，它具有一些显著的特点【2 6 】： ( 1 ) 与g c 相比，s f c 的流动相具有类似于液体的密度，为常压气体的 2 0 0 5 0 0 倍，具有较高的溶解能力，适于分离难挥发和热不稳定性物 质，而g c 需将样品气化后才能进行分离操作，不适合于热不稳定 物质的分离； ( 2 )与h p l c 相比，s f c 的流动相具有较小的黏度，可减小过程阻力， 在相同条件下，压力降比液相色谱的低；s c f 具有较高的扩散系数 和传质速率，s f c 分离操作的时间短，单位时间内分离效能高； ( 3 )s f c 与h p l c 和g c 相比，温度和压力的微小变化能引起s f c 流动 相的密度和溶解能力的较大差异，可通过调节温度、压力来实现对 不同物质的分离，且s f c 分离得到的产品与溶剂分离容易，产品后 处理工艺简单； ( 4 )s f c 可与大多数通用型h p l c 、g c 多种检测器匹配，还可与质谱 ( m s ) 、傅立叶变换红外光谱( f t i r ) 和核磁共振仪( n m r ) 等大型仪 第一章文献综述 器联用，使其在定性、定量检测中极为方便； ( 5 )s f c 通常采用无毒、价廉易得的c 0 2 作为流动相，对环境无污染，满 足绿色化工生产的要求。 基于s f c 的以上特性，使其可以有效的用于混合物的分离分析和制备，但 s f c 不能完全代替g c 和h p l c ，它是这两种技术的补充。s f c 作为一种对环境 友好、高效、新型的化工分离技术，在逐渐走向成熟，并愈来愈受到人们的关注。 1 2 1 1 分离原理 s f c 是通过溶质在固定相和流动相之间进行连续多次交换而达到分离的过 程，借助于溶质在两相间的分配系数的差别使不同溶质分离开来。在s f c 操作 过程中，样品加在柱头，随流动相一起进入色谱柱，在固定相和流动相间分配。 分配系数小的组分，不易被固定相滞留，流出色谱柱较早；分配系数大的组分， 在固定相上滞留时间长，流出色谱柱较晚。不同组分在色谱过程中的分离状况， 首先取决于各组分在两相间的分配情况，这是热力学平衡问题，是分离的首要条 件，其相关的热力学参数有容量因子等。此外，不同组分在色谱柱中运动时，谱 带随柱长展宽，展宽的程度与运动过程中的动力学因素( 如溶质在两相中的扩散 系数、固定相填料颗粒的大小和填充情况以及流动相流速等) 有关。分离的最终 结果是热力学和动力学的综合，常用分离度作为衡量色谱分离效能的总指标。 ( 1 ) 容量因子【2 7 ，2 8 】 容量因子也称为分配比，用k 表示，是指在一定压力和温度下，组分在两相 间达到分配平衡时，分配在固定相和流动相中绝对量之比，用公式表示为： 仃 k = 卫 ( 1 1 ) g m 式中，吼和g 埘分别为溶质分配在固定相和流动相中的绝对质量。 用保留时间来表示容量因子k 。，可得到： f 一， k = 塑 ( 1 2 ) 乞 式中，t 。为从开始进样到柱后出现组分浓度极大值时所需的时间，称为保留 时间：t 。为在色谱柱内不保留组分的流出时间，称为死时间。 容量因子k 是在色谱系统分配平衡过程中度量色谱柱对组分保留能力的重 要参数，某组分的k 值越大，色谱系统对该组分的保留时间就越长；当k 为零时， 表示该组分在色谱柱中不被保留。 第一章文献综述 ( 2 ) 选择性因子 一种组分与另一种组分的保留值之比为选择性因子口它是两个相邻组分 选择性分离的指标，是两种组分热力学平衡分配差值的一个度量，可表示为： 七! 2 舌 ( 1 - 3 ) 选择性因子口，随温度、固定相、组分的性质变化而变化，与色谱柱长度、 内径、流速以及固定相间空隙度无关。它表示固定相对相邻两组分的选择保留作 用，口，越大，两组分分离的越好，但它反映不出柱效能的高低。 ( 3 ) 分离度 分离度也称分辨率或分辨度，用尺。表示，是定量描述相邻两个色谱峰分离 程度的指标，它定义为相邻两色谱峰保留值之差与两峰底宽度总和一半的比值， 可表示为： 耻石a 丽t 2 希 ( 1 - 4 ) 式中，为两组分保留时间的差值，彬和形为两组分的色谱峰峰底宽度。 r 。值越大，相邻两组分分离的越好。一般来说，当尺。 甲醇乙醇 丙酮。采用丙酮为夹带剂时，冬凌草甲素的提 取率最低；采用甲醇和乙醇为夹带剂时，提取率差别不大，均高于用丙酮为萃取 剂的萃取效果；采用9 5 乙醇的含水溶液为夹带剂时，冬凌草甲素的提取率明显 高于其他夹带剂。 冬凌草甲素分子有一定极性，而丙酮溶剂极性较弱，因而采用丙酮为夹带剂 时，冬凌草甲素的提取率远远低于其他三种极性较大的夹带剂；甲醇和乙醇与冬 凌草甲素形成氢键的能力较强，且溶解度均较大，因而提取率较高：9 5 乙醇因 其水的存在使极性更强，考虑到萃取物为中草药有效成分，且9 5 乙醇价格较低， 是制药行业中常用的提取溶剂，因此应考虑将含水乙醇作为提取冬凌草甲素夹带 剂的首选。 乙醇溶剂中含水量的选择。由于水的极性很高，在母体中或母体附近存在的 少量水与溶质形成氢键等分子间作用力强。这些作用力促使溶质从原料基体中扩 散移出，提高溶质在s c c 0 2 中的溶解度。水除了给母体表面提供微水环境，还通 过膨胀基体使萃取剂更容易进入母体活性通道，因此在萃取体系中引入水将有利 于提高冬凌草甲素的提取率。 。 实验中选择含水量为o 、5 、lo 、l5 和2 0 的乙醇水混合物为夹带剂 进行冬凌草甲素的提取实验。夹带剂筛选实验的工艺条件、乙醇中水含量对冬凌 草甲素提取率的影响分别见表2 3 、图2 3 ： 第二章冬凌草提取液制备及预处理 图2 3 乙醇中水含量对冬凌草甲素提取率的影响 f i g 2 - 3e f f e c to f w a t e rc o n t e n to nt h ey i e l do fo r i d o n i n 实验结果表明：采用无水乙醇为夹带剂时，冬凌草甲素的提取率最低，为 0 2 0 5 。而采用含水乙醇为夹带剂时，冬凌草甲素的提取率有明显提高。随着夹 带剂中水的百分含量的增大，冬凌草甲素的提取率先上升后下降，当水的相对含 量为1 0 时提取率最高，达到0 3 8 1 ；当水含量高至2 0 时，实验结束后，萃 取釜底发现有少量液体残余，肖观秀【6 9 】对c 0 2 乙醇水三元体系的相行为的研究 表明，在一定实验条件下，水含量过大c 0 2 乙醇水三元体系有可能已经呈现分 相状态，造成萃取效果下降。因此，选择水含量为1 0 的乙醇水的混合溶液作 为s f e 冬凌草甲素实验的夹带剂。 2 4 2 萃取时间确定 图2 4 为以含水量1 0 的乙醇水混合溶液作为夹带剂时，时间对冬凌草甲 素提取率的影响图，萃取时间影响的实验工艺条件如表2 4 所示。 表2 - 4 萃取时间影响实验的工艺条件 1 a b l e2 4p r o c e s sc o n d i t i o n so fe x t a c t i o nt i m e 第二章冬凌草提取液制备及预处理 珊 图2 - 4 时间对冬凌草甲素提取率的影响 f i g 2 - 4e f f e c to fe x t r a c t i n gt i m eo nt h ey i e l do fo r i d o n i n 从图2 4 时间对冬凌草甲素提取率的影响变化趋势可以看出，在萃取初期， 即萃取时间到3h 之前，随着萃取时间的延长，冬凌草甲素的提取率增长很快： 随着萃取时间的延长，提取率增长逐渐缓慢。随着萃取时间延长至6h ，提取率 增长已十分缓慢，在萃取时间为3h 时，提取率增长存在一个明显的转折点。 在实际操作过程中，选择合适的操作时间，既要达到提高萃取收率的目的， 又要减少系统的操作时间和溶剂的用量，因此确定适宜的萃取时间为3h 。 2 4 3s f e 正交实验 s f e 正交实验的夹带剂为乙醇含量的9 0 的乙醇水溶液，萃取时间为3h ， 通过考察萃取压力、温度、夹带剂流量和c 0 2 流量对冬凌草甲素提取率的影响， 确定超临界c 0 2 萃取冬凌草甲素的最佳条件。本实验设计了以压力、温度、夹带 剂流量和c 0 2 流量为四因素的正交实验，每个因素取4 个水平，具体的实验范围 和条件详见表2 5 正交实验因素水平表。 表2 - 5 正交实验因素水平表 t a b l e2 - 5f a c t o r sa n dl e v e l so fo r t h o g o n a le x p e r i m e n t s 因素 压力) 温度( 力夹带剂流量c 0 2 流量( c ) 一 水平 m p a k m l m i n 1 g m i n 。 l2 03 0 8 1 5l1 5 23 0 3 1 8 1 5 2 2 0 3 3 53 2 3 1 532 5 4 4 03 2 8 1 543 0 2 4 第二章冬凌草提取液制备及预处理 表2 - 6 为s c c 0 2 萃取冬凌草甲素正交实验结果。 表2 6 正交实验结果表 t a b l e2 - 6t h er e s u l t so fo r t h o g o n a le x p e r i m e n t s 因素 压力白) 温度( 7 夹带剂流量c 0 2 流量提取率 实验号 m p a k ( f ) m l m i n 1 ( c ) g m i n 1 l2 03 0 8 1 5l1 5o 0 9 l 22 03 1 8 1 5 2 2 00 2 0 1 32 03 2 3 1 532 50 2 9 5 42 03 2 8 1 543 0o 3 7 1 53 0 3 0 8 1 52 2 50 2 9 3 6