（应用化学专业论文）生物标识荧光染料及游离基氯化反应的研究.pdf

生物标识荧光染料及游离基氯化反应的研究 捅矍 本论文的主要工作是合成了四个用于生物标识的荧光染料，以及对游离基氯取代苯 环上硝基和游离基氯取代苯环上甲基氢的的相对反应速度进行了研究。 第一：采用了一种实用的路线合成提纯6 一羧基荧光素化合物。本文采用间苯二酚或 4 一氯间苯二酚和偏苯三甲酸酐缩合得到5 一位和6 一位羧基荧光素异构体。荧光素类衍生 物由于在普通溶剂中的溶解性很差，并且存在内酯环和游离羧基两种状态，增加了分离 提纯的难度。上面介绍的两个缺点能够通过在毗啶溶液中和特戊酰氯反应得到特戊酰氯 的羧基荧光素而解决，特戊酰氯的羧基荧光索重新溶解在乙醇中，加入二异丙胺，特戊 酰基的6 一羧基荧光素二异丙胺盐( 特戊酰基的2 ，77 6 一羧基荧光素二异丙胺盐) 在 乙醇中析出来。在稀盐酸中水解，和n ，n 一二琥珀酰亚胺碳酸酯反应得到相应的n h s 酯，能够直接用于蛋白质标记。 第二：合成了两个新的b o d i p y 染料。对羧基苯甲醛或对羟基苯甲醛和2 ，4 一二甲基 吡咯缩合得到二毗咯的甲基化合物，在四氯苯醌的条件下脱氢得n - - p h ：咯的亚甲基化合 物。再与三氟化硼和三乙胺反应后得到总收率为9 6 羧基b o d i p y 染料和总收率为3 5 7 的羟基b o d i p y 染料。羧基b o d i p y 能够直接用来标识蛋白而羟基b o d i p y 能够用于标识 核酸。 第三：对两类游离基氯化反应的相对反应速度进行了研究。实验结果表明游离基氯 取代苯环上硝基的速度比游离基氯单取代苯环上甲基氢的速度慢，但是比游离基氯二取 代苯环上甲基氢的速度快。 关键词：荧光染料；游离基氯化：羧基荧光素；特戊酰氯；n 。n7 一二琥珀酰亚胺碳 酸酯；四氯苯醌：蛋白标识；寡核苷酸标识；游离基氯化 生物标识荧光染料及游离基氯化反应的研究 a b s t r a c t i nt h i st h e s i s ，f o u rd i f f e r e n tf l u o r e s c e n td y e sf o r l a b e l i n gb i o t o g i c a l m o l e c u l e sh a v eb e e ns y n t h e s i z e da n dt h em e c h a n i s mo ff r e er e d i c a lc h l o r i n a t i o n o fn it r o t o l u e n e sh a v eb e e ni n v e s t i g a t e d f i r s t l y ：ap r a t t i c a la n dr e l i a b l em e t h o df o rt h ep r o d u c t i o no fm u l t f g r a m q u a n t i t i e s o f c a r b o x y f l u o r e s c e i ni sd e s c r i b e d t h e p o o r s o l u b i l i c y o f f l u o r e s c e i nd e r i v a t i v e sa n dt h e i re x i s t e n c ea sl a e t o n eo rf r e ea c i dt a u t o m e r s c o m p l i c a t e5 一a n d6 一i s o m e r i cs e p a r a t i o n b o t ho ft h ep r o b l e m sa r ec i r c u m v e n t e d b yt h er e a c t i o no fp i v a l o y lc h l o r i d ea n dc a r b o x y f l u o r e s c e i ni np y r i d i n et og i v e ac r u d em i x t u r eo fd i p i v a l a t e s a f t e rr e s o l v e di ne t h a n o la n dt r e a t e dw it h d i i s o p r o p y l a m i n e p u r e6 一c a r b o x yf l u o r e s c e i nd i p i r e l a t e sd i i s o p r o p y l a m i n es a l t i so b t a i n e d a f t e rt r e a t e dw i t hd i l u t eh y d r o c h l o r i ca c i da n dn ，n d i s u c c i n i m i d y l c a r b o n a t e ，t h ec o r r e s p o n d i n g6 一e a r b o x y f l u o r e s c e i nd i p i v a l a t es u c c i n i m i d y l e s t e rw h i c hi ss u i t a b l ef o rl a b e l i n gp r o t e i ni ss y n t h e s i z e d s e c o n d l y ：t w o n o v e lb o d i p y d y e s a r e d e s i g n e d a n d s y n t h e s i z e d t h e p - s u b s t i t u t e db e n z a l d e h y d e c o n d e n s ew i t ht w oe q u i v a l e n t2 ，4 - d i m e t h y i p y r r o l e g iv ed i p y r r o m e t h a n e s u b s e q u e n t t r e a t m e n to fd i p y r r o m e t h a n ew i t hp c h l o r a n i l a f f o r d sab l a c kr e a c t i o n m i x t u r e 。t r e a t m e n to ft h eb l a c km i x t u r ew i t h t r i e t h y l a m i n ea n db f ：r e t h e r a t ea f f o r d st h ee a r b o x yb o d i p yd y e sa n dt h eh y d r o x y b o d i p yd y ei n9 6 a n d3 5 7 y i e l dr e s p e c t i r e l y t h en h se s t e ro f t h ef o r m e r c a nb eu s e df o rl a b e l i n gp r o t e i n ，a n dt h e l a t t e ri ss u i t a b l ef o rl a b e li n g o i g o n u c l e t i d e s t h i r d l y ：t h er e l a t i r er e a c t i v i t i e so ft w ok i n d so fr a d i c a lc h l o r i n a t i o nh a v e b e e ni n v e s t i g a t e d t h er e s u l ts h o w st h a tt h er e a c t i v i t yo f d e n i t r o c h l o r i n a t i o n i sm u c hl e s st h a nt h ef i r s t q c h l o r i n a t i o no fm e t h y lg r o u pb u tm o r et h a nt h e s e c o n da - c h l o r i n a t i o n k e yw o r d s ：f i u o r e s c e n td y e s ：r a d i c a i c h i o r i n a t i o n ：o a r b o x yf 1u o r e s c e i n ： p i v a l o y lc h i o r i d e ；n ，n - d i s u c c i n i m i d y lc a r b o n a t e ；p - c h l o r a n il ：l a b e ii n gp r o t e i n l a b e li n go ii g o n u o i e t i d e s ；d e n i t r o t h l o r i n a t i o n 2 生物标识荧光染料厦游离基氯化反应的研究 月u 吾 生命科学的更深层次的研究是2 l 世纪的重点，科学工作者力图从分子结构水平详 尽的研究和准确的了解生命从产生到死亡的全过程以及解释各种生理现象和防治疾病， 大量的种类繁多的生物物质的存在和变化，表明了生命过程的复杂，研究生物大分子结 构及功能以及生物分子的转化是一个重要的步骤。生物体由为数不多的象氨基酸、核苷 酸、脂肪酸、单糖和维生素等小分子有机分子和一些无机离子以及由这些小分子构成的 大量功能大分子所组成，表达生命所具有的信息与特征。 由于对检测技术的要求越来越高，传统的检测技术已经不能满足时代的需要。例如 传统的同位素生物标识技术的同位素污染，现在生物分析的荧光标识技术的应用得到了 迅速的发展。尤其是近十几年来，激光、微处理机和电子学等一些新的科学技术的引入 和飞速发展，极大的推动了荧光分析法的广泛应用，并且加速了各式各样新型分析仪器 的问世，使荧光分析法不断朝着高效、准确、痕量、微观和自动化的方向发展。八十年 代中期发展起来的d n a 自动测序技术，利用4 种荧光染料标识，自动获得c 、g 、a 、 t 四类碱基的序列。成为现在分子生物分析技术法发展的重要里程碑。荧光标识方法与 激光技术，计算机处理技术等新技术的最新结合，为复杂的生物体系的分析研究提供了 更广阔的应用空间。 而要提高荧光检测技术的灵敏度的关键是要找到摩尔吸光系数高和荧光量子产率 高的荧光染料，研究和发掘新的灵敏度的大共扼体系的紫外可见染料、荧光染料等有机 分子探针是重要途径之一。 本文的主要工作是合成能够用于生物标识的荧光染料。 大连理工大学硕士学位论文 第一章：文献综述 1 1 概述 生物大分子是生物体内最重要的组成部分。约占生物体质量的三分之一以h 。生物 大分子主要包括四类化合物：蛋白质，核酸，糖，脂。他们是构成生物体和维持生命现 象的最基本的物质基础和功能基础。因此要研究生命运动的规律，就必须对这些化合物 的结构进行准确的检测。随着科学技术的发展，对检测灵敏度的要求越来越高，荧光分 析法及荧光检溯成为生物分析( 生物金属离子检测、蛋白质检测、核酸检测) 中类非 常重要的方法。 1 2 生物标识荧光染料的介绍 1 2 1 荧光产生的理论基础 分子中具有不同的能级，电子处于不同的能级中，当光照射到分子上，电子被激发， 从低能级跃迁到高能级。含有处于较高能级的电子的分子为激发态分子，不稳定。电子 通过辐射跃迁和非辐射跃迁失去能量返回基态，荧光就是处在激发态的分子和原子返回 基态过程中伴随着放射出来的一种光能。荧光产生过程如图卜l 所示： e 图1 - 1 荧光的产生过程 fig 卜1fiu o r e s c e n c ef o r m a t io no fs u b s t a n c e e 能量；f 荧光；p 磷光；is c 体系间跨越；i c 内转换 t 2 t 一般讲，荧光试剂分子处于基态，吸收光后，试剂分子处于电子激发态，基态和激 发态都有单重态和三重态，多重态用2 s + i 表示。s 为电子自旋量子数的代数和，其数值 为0 或l 。s 为0 时，分子内的轨道中的所有电子自旋配对，自旋方向相反，此时分子 生物标识荧光染料及游离基氯化反应的研究 处于单重态，大多数有机物分子的基态处于单重态。分子吸收光能后，电子跃迁到高能 级，电子自旋方向不变，此时分子处于激发单重态。s 。，s ，s ! ，表示分子的基态和 第一，第二，激发单重态，篚量由低到高。如果处于基态单重态的有机物分子的电 子在跃迁的过程中伴随着电子自旋方向的变化，在激发态分子轨道上就有两个自旋不配 对的电子，此时s = i ，表明分子处于激发态的三重态，用t 表示，t ，l 分别表示三重态 的第一，第二激发态。分子中的电子从基态( 单重态) s 。跃迁至激发态单重态s ，s ? ， 比较容易发生，进行很快( 约1 0 “s ) ，而从基态单重态到激发态三重态不易发生。高能 量的单重态激发态分子( 如s ：) 可以与其他同类分子或溶剂分子碰撞通过内部转换( 无 辐射跃迁) 回到激发态的最低能级，这一过程为1 0 “2 s ，处于激发态最低能级的分子寿 命一般为1 0 - - t m l 0 s ，它们会放出光子返回基态，这时产生的光就是荧光。 1 2 2 物质荧光受到的影响 物质产生荧光的首要条件是该物质的分子中必须具有吸收特征频率光能的基团军分子中应 具有与照射光能量相同的电子能级跃迁：其次是该物质应具有一定的量子产率和适宣的环境，如 温度、p h 值、所用溶液伏态等。目前，已知的大量有机物和无帆物中，仅有小部分会发生强荧光， 它们的激发光谱、发射光谱和荧光强度都与它们的结构有密切关系。m 物质的结构出发，强荧光 物质应有如下特征： 1 ) 大的n 键共轭结构 共轭体系分子能产生荧光。分子体系中电子的共轭程度越大，非定域n 电子越易被激发， 荧光就越容易产生，因此能产生荧光的物质大多数含有芳香环或杂环a 2 ) 刚性平面结构 具有强烈荧光的有机物质，大多数分子为刚性平面结构，刚性及共平面性越大，其有效的n 电子离域性越高，则茺光越强。立体异构现象也影响着有机他台物的荧， 陛质，顺式和反式同分 异构体常具有不同的荧光性质。 3 ) 取代基团为给电子取代基 取 谨的性质( 尤默燃团) 蹦粉啡的茺惴眭和强蔓埔强烈的影响。缭台各个方面 的因素，取代基大致分为三类：1 ) 使荧光增强的基l i h 如0 h 、一n 托、一n r 、- n 、吒n 、1 0 c h l 等；i i ) 使荧光减弱的基团，如：- - c o f f l 、- c = o 、_ n q 、硼、一f 、c l 、吨r 、一i 等；i i d 影响不 明显的基团，如：一趼、一n h j 等。 物质的结构影响着物质的荧光特性，但荧光的发射需要个外部环境，影响荧光产生的环境 因素主要有以下几个方面： 1 ) 温度的影响 温度对于溶液的荧光强度有显著的影响，般荧光物质的溶液随着温度的刚氐而荧光效率升 高，荧光强度增大。而当温度e 升时荧光强度下降，其主要原因是分子内部能量的转换作异j l 遽温 大连理工大学硕士学位论文 度升高而加快，同时激发分子和溶剂分子之间发生某些可i 煎的光化学反应，这也是荧光强度下降 的原因之一。当溶液中有淬灭剂存在时，温度对于荧光强度的影响将更为复杂。 2 ) 溶剂的影响 不同的溶剂会使物质的荧光谱带位置( 有时还有强度) 发生改变。随着溶剂极性的增 加，向波长较短方向( 或向蓝) 位移，通常称为负向溶剂化显色。相应的向波长较长方向 ( 或向红移) 称为正向溶齐i 化显色，溶剂的极性改变对最大吸收位置产生的影响，主要是 由于当溶剂的极性改变时，基态和激发态溶质分子的溶剂化能产生差异。即溶剂对溶质 分子基态和激发态的稳定化作用不同引起的。有些特殊的极性化合物，受溶剂的影响很 大。对于不具有非键电子的共振“体系，同样具有极性激发态。因此在极性愈强的溶 剂中由偶极一偶极作用引起的溶剂化作用也会导致激发态的稳定化作用加强，从而降低 n 一+ 跃迁的能差，使红移增强。 溶剂所产生的拉曼光，其波长常和溶液中荧光体所产生的荧光的波长靠近，其强度 常不及荧光强度的千分之一，荧光谱带具有一定的波峰，而拉曼带的波长却随激发光的 波长而变，拉曼光对荧光分析的干扰应予以注意。 3 ) 氢键的影响 一 溶剂也常通过氢键来影响物质的荧光，不同溶剂形成氢键的能力为：水 甲醇 乙醇 氯仿 己烷。荧光物质与溶剂或其它溶质分子之间发生氢键有两种情况：一是在激发之 前，即荧光物质处在基态时与溶剂或其它溶质分子形成的氢键；二是在激发之后，即荧 光物质处在激发态时与溶剂或其它溶质分子形成的氢键。显然，第一种情况下产生的氢 键将对物质的吸收光谱和荧光光谱都产生影响，而后一种情况只对物质的荧光光谱产生 作用。溶剂的氢键供体或受体能力及溶剂的极性，都将影响到荧光物质的实际光谱移动。 4 ) p h 值的影响 未解离的( 弱酸或弱鳓分子和它们的离子常呈现出不同的荧，薛顺。若分子中的酸性和碱 性基团，属于生色团的部分，或直接连在生色团上，那么溶液中的p h 值的改变，会引 起绝大多数含有这些基团的化合物的基态和激发态的酸碱性或解离形态的变化，因此有着 不同的荧光光谱。 此外，溶液的浓度对荧光强度也有影响，在较低范围内，荧光强度随浓度的增大而增大，达 到一定值后，增加浓度，荧光强度反而降低了，直至荧光完全猝灭( 大约浓度为1g l ) 。溶液中 的表面活性剂，溶剂性质等因素，也对荧光有着不同程度的影响。 综匕所述，荧光与有机物质的分子结构及环境因素存在着非常复杂的关系，有很多现象和规 律要进步的探讨。 生物标识荧光染料厦游离基氯化反应的研究 1 2 3 荧光团( 荧光染料) 的介绍 1 。2 3 1 香豆素型高分子荧光染料 以香豆素为母体的荧光染料，如果染料中含有- n h ：、- c o o h 等基团，在一定条件下 也可与被标记物发生反应，而含有基团的荧光染料可选择性与蛋白质的一s 发生反 应。用聚合物上连有大量荧光团的高分子荧光染料进行标记，其灵敏性大大提高，它在 量子产率、s t o k e s 位移、光稳定性、分子均匀性、与蛋白质配对的产率等方面都适合生 物标识。香豆素染料母体的结构s c h e m e l 一l 所示”1 ： r r - 0 1 2 3 2 善染料 菁染料通常由两个杂环体系及中间的次甲川链组成，其核心结构s c h e m e l 2 所示= ： ，尸zr s r ，领卜刚胪c h s c h e m e l - 2 ：菁类染料的核心结构 其中x 可以为0 、s 、s e 或者n r 、c r ，k 、y 。为r 3 = r 4 ，j 1 1 、p 为( j 蛾f ，”【i r 为卜6 个碳原子的烷基，可为链状或者环状。l l ，为c i 、b r 、i 等负离子。管染牝，u 在其分子结构中含有较大的共轭平面型和季铵盐阳离子，因此与d n a 有很大的亲糟力， 并且结合后荧光大大增强，是近年来倍受亲睐的生物大分子标记荧光染料。菁染牟 鹩， 外一个优点是波长可调范围特别大，可以进入近红外区，能有效避开生物j ”“j0 光，提高探针的灵敏性。 但是菁染料也存在一个显著的缺点那就是光稳定性差，很容易分解，其应用受到一 定的制约。 大连理工大学硕士学位论文 1 2 3 3 萘酰亚胺荧光染料 t ，8 一萘二甲酰亚胺( s c h e m e l 3 所示) 是类良好的荧光发色体，其4 一位一洲。等 供电基团的衍生物大都具有强烈的荧光”1 。含酰肼和乙烯砜活性基团的萘酰亚胺染料， 在适当的p h 值和温度下，对微生物着色有专一选择性，由于其无毒，可用于细胞内染 色6 1 。但是其波长较短，可调范围较小。 r f s 0 3 一l n h 2 s c h e m e l 3 ：蓁酰亚胺类染料的母体结构 s c h e m e l 3s t r u c t u r e so fn a p h t h a ii m ；d ef i u o r o p h o r e s 1 2 3 4 咕吨类荧光团- 7 1 咕吨类染料的结构s c h e m e l - 4 所示，其中r ，、r ：、r s 、融、艮单独分别为氢原子，烷 基，芳香环，烷氧基，羟基，卤素原子，氰基，羧基，异氰基等等。至少其中有一个是 连接官能团，最好是能有一个是羧基官能团。 r i o x r 7 y r 1 1r 6 s c h e m e l - 4 ：咕吨类荧光团 s c h e m e l - 4 ：s t r u c t u r e so fx a n t h a n ef i u o r o p h o r e s r 。、r i r弛、r 。r 。最好是卤素原子，l l o 个碳原子的烷基，硫取代烷基等等。当x 和y 为氮基或取代氨基是此化合物代表若丹明染料( r h o d a m i n ) ，当y 为氧原子，而x 为烷氧基或者保护的羟基此化合物代表荧光素染料。他们都是非常重要的荧光染料，荧 光量子产率高，在荧光探针方面应用很广泛。但是他们的缺点也很明显：s t o k e s 位移较 竺塑堡望茎垄鲞型墨塑曼萎篓些垦窒塑竺塞 小，对环境因素如p h 的依赖性很强，与生物大分子结合后荧光淬灭很严重，达到6 0 9 0 。 即使这样，由于尚未找到合适的替代品，他们仍然是生物医学上应用最广泛的荧光团。 1 2 3 5 b o d i p y 类染料” b o d o p y 类染料( 如s c h e m e l 一5 所示) 由于其开发较晚，现在应用不是很广泛，但是由 于其荧光量子产率高，其荧光范围随取代基的不同变化很大，并且其荧光不受其环境p h 的影响，它的性能受到普遍公认。 s c h e m e l 5 ：b o d i p y 荧光团 s c h e m e l 一5 ：s t r u c t u r e so fb o d i p yf i u o r o p h o r e s 1 2 4 荧光标识方法的种类 按荧光标识试剂与被测组分的结合方式可将荧光标识技术分为两大类：共价键合荧 光标识和非共价键合荧光标识“”“。 1 ) 非共价键合荧光标识( n o n c o v a l e n tf l u o r e s c e n tl a b e l i n g ) 非共价键合荧光渌识通常是指荧光标识试剂与被标识分子通过物理作用方式相结合的标识 方法，如核酸探针与d n a 的嵌入作用、某些蛋白质探针与蛋白质分子的择形镶嵌等。可用于在 双链d n a 片断的电泳显色和毛细管电泳点阵基因排布技术( c a p i l l a r y & f r a y e l e c t r o p h o r e s i sg e n o t y p i n g ) ，将d n a 嵌入染料直接与d n a 片断复合。由于嵌入只需 简单地将染液与d n a 样品混合，而得到稳定的多位点标记的产物，这是共价键合标记法 难以比拟的。但这类标识般只能用于定性检测或粗略定量，常用于核酸与蛋白质等大分子的 检测，免疫荧光分析等，较少应用于小分子的分析。 2 ) 共价键合荧光际识( c o v a l e n tf l u o r e s c e n tl a b e l i n g ) 共价键合荧光标识是指荧光标识试剂与被标识分子通过共价化学键的方式相结合 的标识方法。标识反应的发生是因为荧光标识试剂和被标识的生物物质中含有彼此可共 价反应的活性基团，常见的反应活性基团有一n h ：、一0 h 、一s h 、一c o o h 和一n c s 等。活性基 团也可在无活性基团分子中引入，如在核苷酸和寡聚核苷酸的合成中引入氨基一n 1 1 ：等， 根据所含的反应基团及基团所在的位置的不同，可有多种荧光标记反应方式。该法具有 很高的反应专一性，可重复，易于定量检测，特别适合予小分子如氨基酸、小分子肤的 分析，也可用于大分子检测。 一 ，。、0 ， r ， ，z矗， 一r f v | 。、 勺、声、丫、总。 一 大连理工大学硕士学位论文 1 3 荧光染料在生物标识中的应用 1 3 1 荧光染料在蛋白质检测中的应用 1 3 1 1 蛋白质的简单介绍 蛋白质是生物体内最重要的物质之一，是生命的物质基础，是生物化学研究的主要 对象。催化生物体内的( 几乎) 一切化学反应的酶，调节物质代谢的许多激素，以及人 和动物体内防御疾病、抵抗外界病原侵害的抗体都是蛋白质或者多肽。蛋白质分子都很 大，相对分子量一般都在1 万以上，最小的也有好几千。他们可以被酸、碱及各种水解 蛋白质的酶等催化分解为肽或者氨基酸。对蛋白质的结构、构像进行详细的研究有助于 精确研究蛋白质的作用方式和功能。 1 3 1 2 蛋白质检测技术的发展”觚 传统的考马斯亮染技术由于其较低的成本、使用方便和与下游的蛋白质鉴定技术的 良好相容性得到了非常广泛的应用。但其缺点在于胶与胶之间的重复性差且由于胶本身 的差异而难于控制。在改进的方法中，通过应用胶体染色克里，胶本身可不被显著着色。 其原理是通过在染色的过程中形成胶体颗粒和染料间的平衡，染料进入胶体与蛋白质电 结合，胶体颗粒则被阻挡与胶外，因此使得胶本身不着色。通常传统的考马亮蓝染色和 胶体考马斯亮蓝染色能检测到8 - 1 0 n g 和3 0 1 0 0 n g 的蛋白，局限在于它的检测灵敏度和 线性动态范围比较小。 银染技术比考染灵敏度高，通过将胶浸泡在含银离子的溶液中，从胶面上洗掉非紧 密结合的金属离子，加入某些试剂使与胶内蛋白结合的银离子形成金属银来显色。该方 法可检测到纳克级的蛋白质，其线性动态范围在4 0 倍范围内。但是银染步骤非常复杂， 胶与胶的重复性差，有报道差异达到2 0 。目前有些自动化的银染过程将有可能减少这 种差异。银染时加入醛类作为固定剂虽然可以提高检测灵敏度，但是这样将干扰e d m a n 测序和质谱分析。 放射性同位素标记方法常用3 h 、“c 、“s 、3 2 p 、”p 和“5 i 等来进行标记，该方法大量 用于体内的代谢实验。然而，近年来用放射性标记来检测蛋白质合成速率的方法也受到 了质疑。如在代谢实验中，混入放射物如“s 一蛋氨酸，在标准剂量和作用时间下，可引 起d n a 的断裂，增加p 5 3 蛋白水平，改变细胞和细胞核的形态使细胞周期停止或引起调 亡。虽然该方法的灵敏度较高，但使用放射性物质不但很危险而且成本非常高。 还有很多文献报道了关于在s d s p a g e 胶上使用负染的方法，包括使用氯化钾、氯 化铜、氯化锌、乙酸钴等等。目前3 种最常用的负染方法是使用氯化锌、氯化钾和氯化 铜。其中氯化铜的染色灵敏度略高，氯化钾的灵敏度远低于考马亮蓝染色法。氯化锌法 是目前灵敏度最高的负染方法。 生物标识荧光染料及游离基氯化反应的研究 近年来发展起来的利用荧光染料标识蛋白质，h p l c 荧光检测技术在灵敏度、准确性 以及蛋白质识别和与现代下游技术的相容性等方面超越了传统的染色技术。荧光共振能 量转移( f r e t ) 荧光检测被广泛用于“测量”在1 0 一l o o a 范围内分子内或分子间的距离， 适于探索蛋白质的结构，现在已经成为检测蛋白质的一种很重要的方法。“。 1 3 1 3 荧光共振能量转移( f r e t ) 的介绍“5 ”3 在下面关于f r e t 的讨论中，我们只解释从一个供体荧光发色团到一个不同的受体 发色团的无辐射能量转移。这个受体发色团可能是荧光团也可能不是( 异体传递) 。f r e t 发生时不产生热量也不包括供体与受体间的碰撞。在蛋白质中，发色团既可以是与特定 氨基酸残基以共价键结合形成的外来探针，也可以是内有的探针如酩氨酸和色氨酸残 基。供体发色团与受体发色团间如能发生f r e t ，他们必须拥有强的电子跃迂。当以适当 波长的光( 在2 5 0 - - 5 0 0 n m 范围内) 激发荧光团时，光子从最低态( s 。) 跃迁到较高振动水平 ( s ，s ：，s 。等) 。在兆分之一秒内这些光子衰弱到这些掉过去水平中振动能级的最低状 态( s ，) ，然后慢一些( 十亿分之一秒) 衰弱到s 。的一个状态。发射光子的光波长比激发的 波长要长。这些过程用图卜2 说明。 a a 图1 - 2f r e t 能量转移过程 fig 卜2 ：p r o c e s so ff r e te n e r g yt r a n s f e r 0 = 基态给体，a = 受体，- k ：激发态 辐射跃迁，- 非辐射跃迁，- + 结合跃迁 f r e t 发生的条件：( 1 ) 供体有商量子产量( 中。) ；( 2 ) 供体的发射光谱与受体的吸收 光谱有实质的交迭；( 3 ) 有适当的吸收发射跃迁队列和它们的分离向量( 具体用参数k ! 表示) ；( 4 ) 供体一受体间的距离在1 5 0 xr o 范围内( 见下) 。 供体的量子产量( 中。) 定义为发射光子数目与吸收光子数目的比，这参数受探针周 围环境的影响。 供体发射光谱( j 。) 和受体吸收光谱( 波长用n m 表示，单位是c 一，j 的单位为c m ) 9 查堡翌= 三查兰堡主兰垡堡奎 的交迭部分的积分定义如下： 屯= j ( 五b ( z ) a 4 d 旯p 。( 五) d 丑 ( 1 ) f o r s t e r 距离( 啪最初被定义为供体与受体间能量转移效率为5 0 时的距离。这种关系给 出如下： 霹= ( 8 7 9 1 0 。i ) k 2 聍- 4 中d 厶 ( 2 ) 其中：8 7 9 x 1 0 1 5 来自：9 0 0 0 ( 1 n l o ) 1 2 8 j x a v o g a d r o 常数( 每摩尔6 0 2 x 1 0 ”) ：k 2 是f o r s t e r 的定位因素( 下面将详细讨论) 在数量上等于2 3 供给量，事实上探针是等方 性运动的；1 3 是供体与受体间媒介的折射指数，蛋白质的这一指数通常被认为是1 4 。 这些参数除p 以外均可通过实验来确定。 转移效率( e ) 与供体和受体间距离r 与r 。间关系定义为： e = 霹( e 2 一r 6 ) ( 3 ) 当供体与受体间距离约为5 0 r 时，f r e i r 效率几乎达最大值，一方面当距离更小时 检测不到它们之间的距离，另一方面当供体一受体间距离从5 0 r 开始增大，曲线的斜 面变得很浅，并且很难精确的确定出更长的距离来。 应用r 。的重要性在于它提供了一种估算f r e t 距离的方法，这种方法可应用于任意 给出的探针对。稳态f r e t 实验可以在5 0 r 值时得出。即，对于r 0 为4 0 a ，可以在2 0 - 6 0 a 范围内估算距离。超过这些距离限度时仍可以用荧光团寿命来估算r ，但是不确 定性也随之增加，并且无论何种情况，范围都不得超过8 5 一9 0 r 。 f r e t 效率可以通过测荧光强度和供体荧光团寿命两种方法得出，其中供体荧光团寿 命分别在受体存在和不存在时得出的。即： e = l 一氏= 1 - r d ( 4 ) 其中尼和矗分别是受体出现与不出现时的强度，相应的f 。和f 。分别是受体出现与不 出现时的荧光团寿命。 f r e t 光谱学比其它光谱提供的关键性的结构信息更多，举例来说，o r c u l o w d i c h r o i s m 只报道了蛋白质的二维结构。f r e t 更接近予实验中采用的e p r 光谱，e p r 光 谱得出比f r e t 方法更小距离范围( 5 - 2 0 h ) 内的结构及结构转变的信息，但是e p r 稍微不 如f r e t 灵敏。其次，e p r 光谱能用于解决结构的分布而f r e t 提供一些斜的平均数。 测量距离时f r e t 有许多方面都可以与n m r 相e e 。尽管n m r 得出了大量的数据，利用 这些数据可以构造出蛋白质的原子模型，而f r e t 不能。但是，n m r 暂时很少用，只用于 缩氨酸和小蛋白质上，它较耗费时间，同时发光计又很贵。当然f r e t 光谱学也能得到 蛋白质的原子结构图，但是那不是其本质的应用。电子显微镜( e m ) 近年来经改进后变得 兰塑堡堡茎垄鲞整垄塑塞苎墨些垦壁箜墅塞 便于操作并且可以重塑图象。e m 和f r e t 都能用于研究有意思的结构问题“。3 ，例如像 肌动蛋白单体是如何朝向本体肌动蛋白细丝并决定了肌动蛋白与肌肉分子之间的距离 的。 最后，我们介绍一些定位因素的摘要。计算r 假设供体与受体探针为等方性运动， 这样得出的结果接近于同x r d 反映的结果。我们能校正一些由于完全自由旋转需要而减 少的，用k 2 = 2 3 。距离的计算是在一个单一的吸收偶极和一个单一的发射偶极基础上得 出的，但是许多供体和受体都有一个以上的偶极。蛋白质表面的核苷酸链的低于十亿分 之一秒的运动也可能发生，并且即使在蛋白质晶体中也存在蛋白质部分的实在的运动。 例如近期由m c l a u g h l i n 共结晶g e l s o l i n 片段“，4 0 - - 5 0 个残基承受迅速的热运动， 脱氧糖核酸酶结合在单体上会有明显的淬灭这一方法解出的肌动蛋白的结构。此外，单 一探针“t e t h e r i n g ”由可一定程度自由旋转的链( 有时是柔性侧链) 连接在氨基酸侧链 上。总之，这些因素可得知f r e t 探针实际是自由旋转的。 1 3 2 荧光染料探针在核酸检测中的应用 1 3 2 1 核酸的简单介绍 核酸，也称多聚寡核苷酸，是构成生命的重要化学物质，其基本组成单位是核苷酸。 核苷酸是由磷酸基团、戊糖和碱基通过一定的结合方式而构成的。组成核营酸的戊糖有 核糖和脱氧核糖两种，因此将核酸分为核糖核酸( d n a ，d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d ) 和脱氧 核糖核酸( r n a ，r i b o n u c l e i ca c i d ) 两大类。构成核酸的碱基主要有5 种：腺嘌呤( a ) 、 鸟嘌呤( g ) 、胞嘧啶( c ) 、胸腺嘧啶( t ) 、尿嘧啶( u ) 。其中胸腺嘧啶只存在于脱氧核糖核 酸中，而尿嘧啶只出现在核糖核酸中。 脱氧核糖( 或核糖) 中c 。上的半缩醛羟基( b 一构型) 与嘌呤碱基的n 。一h 或嘧啶碱基 的nl - - h 脱水生成c n 糖苷键，形成相应的核苷( n u c l e o s i d e ) 。通过核苷酸的磷酸基与 另一分子核苷酸的核糖c 。上的羟基形成磷酸二酯桥相连而成的长链结构化合物 多聚核苷酸，即d n a 或r n a 。多聚核苷酸有如下特点： 多聚核苷酸是通过5 3 磷酸二酯键连接而成。链的一端一般含有一个游离5 一磷酸基，另端则有一个游离的37 一羟基。多聚核苷酸具有方向性，这一点必须 注明。 多聚核苷酸是由含有不同碱基的核苷酸所组成。因此具有一定的核苷酸顺序，即 核酸的碱基顺序。核酸的碱基顺序是核酸的一级结构。 d n a 存在a 、b 、z 等不同的构象，其中b 型d n a 构象最为常见。1 9 5 3 年，w a t s o n 和c r ic k 的d n a 双螺旋结构模型就是基于这种构象提出的。维持d n a 双螺旋结构的作用 有：氢键、碱基堆砌力以及离子键。d n a 双螺旋结构具有如下特点： 查堡墨三盔兰堡主兰垡丝塞 o d n a 分子由两条多聚核苷酸链组成。两条链沿着一个共同的轴平等盘绕，形成( 右 手) 双螺旋结构。螺旋中的两条链方向相反，即其中一条d n a 链方向为5 ，一3 ，而另 一条链方向为3 一5 。 嘌呤碱基和嘧啶碱基位于螺旋的内侧，磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环 平面与螺旋轴垂直，糖基环平面与碱基环平面成9 0 。角。 螺旋的横截面的直径约为2 0a 。每条链相邻两个碱基之间轴距为3 4a 。每1 0 个核苷酸形成一个螺旋。螺旋的螺距( 即螺旋旋转一圈) 高度为3 4a 。 两条多聚核苷酸链的盘绕力是链间的碱基对所形成的氢键，碱基形成有严格的配 对规律。因此，在d n a 分子中，嘌呤碱基的总数与嘧啶碱基的总数相等。 1 3 2 2 核酸检测技术的介绍 随着限制性内切酶的发现，导致了第一个物理图谱的完成，精确的物理图谱使得测 序变得常规化。而测序技术的快速发展，使s a n g e r 的末端终止法以其速度与准确性很 快取代了m a x a m 和g i i b e r t 的化学法。大规模测序的开始是以荧光自动分析仪的发明开 始的( h u n k a p i l l e re ta 1 ，1 9 9 1 ) 。它不仅效率高而且测序的质量也比手工操作高得多。 下面按其出现的时间顺序分别介绍几种主要的测序技术。 1 3 2 2 1m a x a m - g ii b e r t 化学修饰法 该方法的基本原理是使用化学试剂处理具有末端放射性标记的d n a 片段，造成碱基 的特异性切割。由此产生一组具有各种不同长度的d n a 链的混合物，经过凝胶电泳按大 小分离和放射自显影后，可以根据x 射线片上显现的谱带直接读出待测d n a 片段的核苷 酸顺序。该方法有如下优点：只需要简单的化学试剂，所测序列结果来源于原d n a 分子。 该方法还可以用来分析甲基化等d n a 修饰情况，可以通过化学保护及修饰干扰实验来研 究d n a 二级结构及蛋白质与d n a 的相互作用。 1 3 2 2 2s a n g e r 双脱氧链中止法 这种方法有时也被称为引物合成法或酶催引物合成法，该方法要求使用一种单链的 d n a 模板和一种适当的d n a 合成引物。使用d n a 聚合酶以单链d n a 作为模板，以2 7 ，3 一双脱氧核苷三磷酸( d n t p ) 为底物，使之掺入到核苷酸链的3 一末端，因为双脱氧核苷 三磷酸缺少3 一羟基，因此使d n a 链的延长终止。由于在双脱氧核苷三磷酸上标记有放 射性物质或荧光物质，通过变性凝胶的电泳可以得到终止于不同残基的d n a 片段的谱带， 经过分析即可得到相应的d n a 序列。由于该方法所测序列d n a 来源于酶促合成的d n a ， 因此可能有误差存在。但是由于高质量的酶制剂的获得，以及合成引物成本的降低，测 序反应的日臻完善，该方法已得到广泛的应用。 2 生物标识荧光染料及讲离基氯化反应的研究 1 3 2 2 3d n a 杂交测序法 如果一段较短的d n a 探针能同靶d n a 分子中的某一段杂交，并能形成完全的双链体 分子，就可以据此推断靶d n a 分子中存在与探针互补的序列。这一方法有以下两个步骤： 首先是将待测的靶d n a 分子同一组序列已知的寡核苷酸探针进行杂交；然后是对能够同 靶d n a 完全形成双链体的分子的寡核苷酸探针之间的碱基重叠关系进行分析，从而得出 靶d n a 的碱基序列。这是一种理想化的状态，实际上的杂交模式远比这复杂。但是，d 弧 杂交测序法操作简单快捷，不需要复杂的凝胶电泳，使用的仪器价格低廉，在几分钟甚 至几秒内就可以得到结果。 1 3 2 2 4 测序技术的自动化 测序技术的自动化主要是测序结果分析的自动化。在1 9 8 6 年，s m i t h 等报道了种 使用4 种不同的荧光染料分别标记4 种不同的碱基，反应后，在同一个电泳管中电泳， 通过激光作用诱发荧光，通过记录荧光达到检测目的。但由于不同的荧光染料有不同的 电泳迁移率，使得各种染料标记的碱基的吸收光谱出现重叠的现象，增加了d n a 序列分 析的复杂性。同年，a n s o r g e 报道一种使用四甲基罗丹明作为惟一的荧光染料，预先标 记于m 1 3 引物上。然后按照标准的双脱氧末端终止法进行反应，并用聚丙烯酰胺凝胶电 泳进行分离。所不同的是采用激光装置激发荧光，并有相应的荧光信号接收装置，可以 将荧光信号转换成电信号输入到数据处理系统中，这样就可以直接得到待测的序列数 据。随着应用的日益广泛，这类荧光标记的自动测序系统也日益完善。 1 3 2 2 5 基本p c r 法啪”1 多聚酶链式反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，p c r ) 是一种体外测定核酸序列扩增 技术。p c r 采用了两条分别互补于双链d n a 模板待扩增区域两端的引物。每一条引物分 别引发一条互补的d n a 链，一条引物引发的d n a 链又可作为另一条引物的模板合成另一 新的d n a 链，如此反复经若干次循环后最终导致两引物中间区域内d n a 的大量复制。p c r 反应的条件相当简单，只需在d n a 聚合酶、脱氧核糖核酸、模板、引物以及含镁离子的 缓冲液的存在下，经高温变性、低温退火、适温延伸三步简单的热循环即可达到对待定 d n a 模板的指数扩增。 原始的p c r 反应所用的酶是k l e n o wd n a 聚合酶，这种酶不耐高温，每次变性后都 要补充新的酶，大大限制了技术的推广应用。而耐高温酶( t a q ) 的发现解决了这一关键 问题，不仅简化了p c r 的操作，也增加了高温退火和延伸反应中的特异性。 1 3 2 2 6 实时荧光p e r 原理证2 侧 所谓实时荧光p c r ，就是在利用荧光信号检测整个p c r 扩增过程，获得在线描述p c r 过程动力学曲线。实时荧光p c r 的化学原理包括探针类和非探针类两种，探针类是利用 大连理工大学硕士学位论文 与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，非探针类则是利用荧光染料或者特殊 设计的引物来指示扩增的增加。前者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但后者 则简便易行。 非探针类的方法主要有：双链d n a 荧光染料型，利用荧光染料可