（应用化学专业论文）新型配合物合成表征及与DNA蛋白的相互作用研究.pdf

海南大学硕上学位论文吴姗姗 摘要 无机化学领域中金属配合物的结构和它们的生物活性是一个比较热门的研究领域。 d n a 结合的研究对新发展的治疗试剂寻找d n a 探针的有非常重要的作用。此外，血清 白蛋白( s a ) 是血浆中最丰富的蛋白，并具有非常重要的生理功能，如运输，缓冲，营养 等。这引起了科学家研究金属配合物生物化学特性的兴趣，包括配合物与主要目标分子 d n a 和血清白蛋白的相互作用。 论文共分为四部分： 第一章：介绍了d n a 、蛋白的结构、功能和性质，综述了金属配合物与d n a 、蛋 白的作用机制与应用研究进展。 第二章：合成了四种含硫氨基葡萄糖金属配合物( m g l u s ，m = c o ，c u ，n i ，z n ) ， 利用元素分析，摩尔电导，核磁共振氢谱进行了结构表征，结果表明含硫配体与这四种 二价金属离子均形成了2 ：1 型非电解质配合物。在p h = 7 0 8 嘣s 缓冲液中，采用紫外吸 收光谱和荧光光谱研究了金属配合物与小牛胸腺d n a 的作用机制，发现随着金属配合 物量的逐渐增加，d n a 电子吸收光谱的最大吸收峰呈增色效应，对配合物d n a e b 体 系也能产生荧光猝灭作用，说明四种金属配合物均可与d n a 发生相互作用，结合方式 为部分插入；进而在近似生理酸度条件下，利用荧光光谱，对金属配合物与h s 加s a 的结合特性进行了初步分析，发现配合物均能猝灭h s 加s a 的荧光强度，利用s c a t c t 砌 方程计算了四种金属配合物与h s 加s a 的结合常数和结合位点数，结果表明金属配合 物与血清白蛋白有较强的结合且只有l 类键合位，其中c o g l u s 与蛋白的结合力最强。 第三章：合成了n ，n 联苄基一1 ，2 二胺( l ) 及四种过渡金属配合物，m l 2 ( o a c ) 2 2 h 2 0 ( m = c u ，n i ，z n ，c o ，并利用元素分析，质谱，摩尔电导，n m r 及i r 进行结构表征。另 外，利用单晶x 射线衍射仪测定c u ( i i ) 和n i ( i i ) 金属配合物的晶体结构，表明配合物有 相似的分子结构。n i ( i i ) 配合物为一个规则的正八面体配位环境，但受典型j a h nt e l l e r 效应影响，c u ( i i ) 处于一个拉长的八面体环境。利用u v 和荧光光谱法分析配合物与小 牛胸腺d n a 的作用机制，结果表明，配合物与d n a 之间的结合方式为插入。在近似 生理酸度条件下，研究c u ( o a c ) 2 l 2 2 h 2 0 和n i ( 0 a c ) 2 l 2 2 h 2 0 与蛋白相互作用的情况。 应用荧光分析法对其与h s a 的结合特征以及热力学作用进行分析。结果表明，主要作 用力为疏水作用。根据s c a t c h a r d s 方程计算， c u ( o a c ) 2 l 2 2 h 2 0 、n i ( o a c ) 2 l 2 2 h 2 0 的 焓变和熵变分别为一1 1 5 3 3l ( j 仰o l 叫和4 6 3 3 9j m o l k - 1 ，一1 1 0 2 6k j m o l - 1 和4 6 3 9 6 j m o r 1 k - 1 。 第四章：苯甲醛与二乙烯三胺浓缩反应得到的s c l l i f r 碱，经k b h 4 还原得到一个新 配体，n 苯甲基_ n _ 【2 ( 苄氨基) 乙基】乙烷1 ，2 二胺，其与过渡金属氯酸盐合成金属配合 物，通式为m 2 l 2 c 1 3 ( m = c 屿n i ，z n ，c o ) 。利用摩尔电导，元素分析，i r 光谱对其进行表 新型配合物合成表征及与d n a 蛋白的相互作用研究 征，通过x 射线单晶衍射仪确定n i ( i i ) 配合物的晶体结构，氯原子为桥联原子。应用紫 外和荧光光谱法，研究小牛胸腺d n a 与配合物的相互作用，表明配合物与d n a 的结 合模式为静电作用，结合力为c u ( i i ) 配合物 z n ( i i ) 配合物 n i ( i i ) 配合物 c o ( i i ) 配合 物。通过s c a t c h 莉方程分析金属配合物与人血白蛋白的结合常数与结合位点，结果表 明配合物与h s a 有很强的相互作用。热力学作用分析，主要作用力为疏水作用。 关键词：过渡金属配合物光谱法小牛胸腺d n a 血清白蛋白 海南大学硕士学位论文吴姗姗 a b s t r a c t m a n ys t u d i e so nm em o l e c u l a rs 协j c t u r eo fm e t a lc o m p l e x e sa 1 1 dm e i rb i o l o g i c a la c t i v 时 c a u s e dm u c hi m e r e s ti 1 1t h ef i e l do fi n or g ：猫cc h e m i s 町d n ab i n d i n gm l d i e sa r ev e 巧 i m p o r t a l l tf o rt h ed e v e l o p m e n to fn e wm e r 印e u t i cr e a g e m sa i l dd n ap r o b e s f u n h e 肌o r c ， h h n a ns e r u ma l b 啪i n ( h s a ) i sm em o s ta _ b u n d a n tp r o t e i ni nm eb l o o dp l a s m 孔a n dh a sv e 巧 抽1 p o r t a n tp h y s i o l o g i c a l 如n c t i o n s ，s u c h 弱仃a n s p o r t a t i o n ，b u f r e r i n g ，n 嘶t i o n ，e t c t h e s e i n s p i l ec o n s i d e r a b l ei i l t e r e s ti i lt h es t u d yo ft 1 1 eb i o c h e n l i c a lb e h a “o ro ft l l e s ec o m p l e x e s i n c l u d i n gt h e i r 缸e r a c t i o n s 州t hd n a a i l ds e m mp r o t e i n s ，砌c ha r ep 面n a d rt a 唱e tm o l e c u l e s ， w i l e nm e t a lc o m p o u l l di s 枷i l i s t e r e d 访仃a v e n o u s l y 1 1 1 i sd i s s e 似i o nc o n s i s t so ff o u rc h a p t e r s ： c h a p t e rl ：t ks 仃u c t u r e ，缸1 c t i o na 1 1 dp r o p e n i e so fd n a a i l dp r o t e i i l 、e r ei n t r o d u c e d ， t 1 1 em 酬d sf o rt 1 1 ea n a l y s i so ft h ei i l t e r a c t i o no fd r u g s 、) v i t hd n a ，p r o t e i na i l dr e s e a r c h p r o g r e s si i lp r e p 删i o 玛b i o a c t i v i t i e sa n d 印p l i c a t i o no fc o m p l e x e sw e r es u i 】 u i l a r i z e d c h a p t e r2 ： f o u rs u l 如r - c o m a i r l i n gd ( + ) - g l u c o s 锄i r l cm e t a lc o m p l e x e si l a _ v eb e e n s y m h e s i z e d ( m g l u s ，m = c o ，c u ，n i ，z n ) a i l dc h a r a c t e r i z e db ye l e m e n t a d ，锄a l y s i s ，m o l a r c o n d u c t a 】n c e ，a r l dp r o t o nn u c l e a rm a g n e t i cr e s o n 锄c e t h ey i e l d so f 出lm e s ec o m p l e x e sw e r e a b o u t7 0 ，t h e yd i s s o l v e de 嬲i l y 证w a t e r t h el i g a n dc o o r d i n a t em e t a li o 璐m a i l l l yb e “v e e n s u l p h u ra n dm 削i o n s ，m ec o o r d i n a t i o nm o l a rr a t i oo f 1 el i g a i l dt 0m e t a l i o nw a s2 ：1 ，t l l e m o l a rc o n d u c t i v i t ) ri i l d i c a t e dt l l a ta l lm ec o m p l e x e sa r en o n e l e c t r o l y t e t h em e c h a n i s mo ft 1 1 e 硫e r a c t i o nb e t 、e e nm e t a lc o m p l e x e sa 1 1 dc a l fm y m u s ( c t ) d n ah 舔a l s ob e e ns t u d i e db y u l t r a v i o l e ta b s o r p t i o na n dn u o r e s c e n c es p e c 仃o s c o p yi n sb u 廊r ( p h = 7 0 8 ) t i l er e s u l t s f r o mv a r i e de x p e 血i l e n t ss h o wt h a tt h ei n t e n s i 够o ft l l em a x i m a la b s o 印t i o np e a l ( si n c r e a l s e d 州m 笋a d u a la d d i t i o no fm 洲c o m p l e x e s ，b u t l em e 锄i o n sc a j ld e c r e a l s et l l em a x i m a l a b s o 印t i o na i l dt h el i g a n dh a sn oe 虢c to ni t m e a i l w i l i l e ，m e t a lc o m p l e x e sc o u l dr e m 砌“l b l y q u e n c ht i l ee m i s s i o ni n t e n s i t yo ft h ed n a - e bs y s t e m ，t h em e t a lc o m p l e x e sc o u l db 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i n gf o r c ew a sc o g l u s z n g l u s u i 新型配合物合成表征及与d n 蛋白的相互作用研究 c u - g lus c u - g l u s ，a n dt h eb i n d i r 唱s i t ei so i l l y0 1 1 e c h a p t e r3 ：an e wi i g a l l d ，m ，d i b e n z y l e t h a n e - 1 ，2 d i 锄i n e ( l ) 锄di t sf o u r 仃a n s i t i o n m e t a l ( i i ) c o m p l e x e s ，m l 2 ( o a c ) 2 。2 h 2 0 ( m = c u ，n i ，z n ，c o ) ，l l a v eb e e ns y n t h e s i z e d 锄d c h a r a c t e r i z e db ye i e m e n t m 觚a l y s i s ，m 鹤ss p e c t r m o l a rc o n d u c t i v i t y ，n m ra r l di r m o r e o v e r ，t l l ec r y s “ss t m c t l 鹏o fc u ( i i ) a n dn i ( i i ) c o m p l e x e sc h a r a c t e r i z e db ys i n g l ec r y s t a l x - r a yd i m 秕t i o ns h o w e dt h a tt l l ec o m p l e x e sh a v eas i m i l a rm o l e c u l a rs 仃u c t u r e n i ( i i ) h 嬲趾 r e g u l 盯o c t a l l e d r a l c o o r d i n a t i o ne i i r o 姗e mc o m p l e x e s ，b u t 帅i c a lj 山1t e l l e re a e c t i n f l u e n c e dc u ( i i ) i n 锄e l o n g a t e do c 切h e d r a le n v i r o i m l e n t t i l ei m e r a c t i o nb e t 、e e nc o m p l e x e s a n dc a l ft h y r i l u sd n aw e r e 咖d i e db yu va n df l u o r e s c e n c es p e c 仃am e a s u r e ，砌c hs h o w e d t l l a tt h eb i n d i n gm o d eo fc o m p l e x e sw i t l ld n ai si i l t e r c a l a t i o n u n d e rp h y s i o l o g i c a jp h c o n d i t i o 玛t h ee f f e c t so fc u ( o a c ) 2 l 2 2 h 2 0a r l dn i ( o a c ) 2 l 2 。2 h 2 0o nh 啪a ns e n l ma l b 啪i n 、e r ee x 锄抽e db yn u o r e s c e n c e t h er e s u l t so f s p e c 仃o s c o p i cm e 雒u r e m e m ss u g g e s t e dt l l a tt l l e h y d r o p h o b i ci n t e r a c t i o ni st h ep r e d o m i n a n ti m 咖o l e c u l 孤f o r c e 1 1 1 ee n t h a j p yc h a n g ea 龇l dt t l ee n 仃o p yc h a n g e l o fc u ( o a c ) 2 l 2 2 h 2 0 孤l dn i ( o a c ) 2 l 2 2 h 2 0w e r ec a l c u l a t e dt 0 b e 一1 1 5 3 3l ( j m o l - 1 锄d4 6 3 3 9j m 0 1 1 k 。一l i 0 2 6k j m o l 一1 砒1 d4 6 3 9 6j m o l - 1 k 一1 r e s p e c t i 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巧s 切1x - r a y d i 伍乏屺t i o ns h o wt h a t 山e r ew 硒ac t l l o r i n ea 幻m 弱b r i d g e 7 i l l ei n t e r a c t i o no fc o m p l e x e s 州t l l c a l ft l l y m u sd n aw a si r e s t i g a t e db yu l t r a v i o l e ts p e c 由r o s c o p ea n df l u o r e s c e n ts p e c t r o s c o p y ， w l l i c hs h o w e dt h a tt 1 1 em o d eo fc o m p l e x e sb i n d i n gt od n aw a se l e c 们s t a t i cb 砌i n g ，锄dm e b 洫d i n ga f j f i i l i t yw i md n a 、v a sc u ( i i ) c o r n p l e x z n ( i i ) c o m p l e x n i ( i i ) c o m p l e x c o ( i i ) c o m p l e x t h eb i n d i n gc o n s t a n t s 锄ds i t e so ft l l ei n t e r a c t i o n 、讥t l lh 啪a ns e r u ma l b 啪i nw e r e 趾a l y z e db ym es c a t c h a r d e q 删i o n ，t l l er e s u h si i l d i c a t e dt l l a tt l l e r ew 弱as 仃o n gi m e r a c t i o n b e “坨e nt l l em e t a lc o m p l e x e s 锄dh s a a si i l d i c a t i o nb y l e 肌o d y n a m i ca n a l y s e s ，t 1 1 e b i n d i n gw 硒m a j m yb a s e do nh y d r o p h o b i ci 1 1 t e m c t i o n k e yw o r d s ：i t i o nm e t a lc o m p l e x e s ；s p e c 臼d s c o p y ；c a l ft l l y m u sd n a ；m ma l b u r 】血l 海南大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导 下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个 人或集体已经发表或撰写过的作品或成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中 以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 论文储虢奚槲舛 日期： 伊扩年6 月阳 学位论文版权使用授权说明 本人完全了解海南大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有 关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权海南大学可以将本学 位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和 汇编本学位论文。本人在导师指导下完成的论文成果，知识产权归属海南大学。 保密论文在解密后遵守此规定。 论文作者签名：娶州导师签名：7 乙 日期：、略年6 月f z 日日期：1 钟月，明 本人已经认真阅读“a 让i s 高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人的学位论文提交 “c a l i s 高校学位论文全文数据库”中全文发布，并可按“章程”中规定享受相关权益。回壶j 佥室握銮 后进后：旦圭生i 旦= 生；旦三生蕉查。 论文作者签名津槲 日期： 芦苫年1 ) 月1 日 导师签名：7l 厶导师签名：fb 川 日期：了神舻年月l l 日 海南大学硕士学位论文吴姗姗 第一章绪论 1 1 核酸简介 核酸是重要的生物大分子，所有生物都含有核酸。核酸主要分为脱氧核糖核酸 ( d n a ) 和核糖核酸( r n a ) 。d n a 主要存在于细胞核的染色体中，i a 则存在于细 胞质中。核酸是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础。在生物的生长、发育和繁 殖等正常生命活动中，核酸都起着及其重要的作用。人们研究小分子与核酸相互作用时， 对双螺旋d n a 、r n a 、寡核苷酸、三螺旋d n a 和单链d n a 均有研究。其中d n a 靶 向化合物是很重要的药物选择对象，临床上使用的许多抗癌药物都以d n a 作为主要靶 点，通过与癌细胞d n a 发生相互作用破坏其结构，进而影响基因调控和表达功能，表 现出抗癌活性。一些抗病毒药物，如：治疗艾滋病的药物是以d n a 作为靶目标的分子， 此外一些致癌物也能与d n a 形成加合物，这种加合物也可能是癌变的预警标志物。核 酸是生物体重要的遗传物质、遗传信息的携带者和基因表达的物质基础，它在生物的生 长、发育和繁殖等活动中起着十分重要的作用。 许多小分子能与核酸发生相互作用，破坏其模板作用，使核酸链断裂，进而影响基 因调控和表达功能。小分子不仅可以作为生物探针，还可以把核酸为靶目标作为抗肿瘤 药物的母体，某些小分子与核酸的加合物还是癌变的预警标示物。测定小分子与核酸相 互作用的亲和力及键合选择性有利于阐明小分子与核酸的选择键合作用以及理解其键 合机理，进一步探讨小分子的结构与核酸作用模式及其生物活性之间的关系，能够使人 们从分子水平上理解某些疾病的发病机理，并通过分子设计来寻找有效的治疗药物，对 阐明抗肿瘤抗病毒药物的作用机理，药物体外筛选、致癌机理的研究都有非常重要的意 义。因此有些小分子与d n a 相互作用的研究，一直受到人们的关注【l 棚。 1 1 1d n a 双螺旋结构的发现 1 8 6 8 年，瑞士的一位年轻科学家f m i e s c h e r 从脓细胞和鲑鱼精子中提取出人类历 史上第一个核酸制品核素( n u c l e i n ) ，即今天所指的脱氧核糖核蛋白。r a 1 仃i l 锄【7 】 提取了不含蛋白质的同类物质，并首次使用了“核酸 这一名称以来，人类对于核酸的 研究取得了一系列令人瞩目的成就。1 9 2 8 1 9 4 4 年期间硎伍t l l ，d a w s o n 【8 】和q s w 2 l l d 【9 j a v e r y 等证明了d n a 是遗传物质的基础，第一次向人们展示了d n a 的生理功能。1 9 5 3 年，两个年轻的科学家w 够t o n c r i c k 发现了生命的奥秘d n a 的双螺旋结构，从分 子水平上阐述了生命遗传信息，迈过了d n a 半保留复制机理，为现代分子生物学的发 展奠定了基础，从此生物学进入了分子生物学的新时代。1 9 7 5 年b e r g 建立了d n a 体 外重组技术基因工程，使核酸的研究取得了突飞猛进的进展，并逐步开始转向实际 应用。所有这些划时代的发现，无不改变着人类的生活，成为人类探索生命奥秘，创造 巨大财富的有力武器。同时，有关生命遗传物质的d n a 的研究也就成为分子生物学和 生物化学的重要课题。2 0 0 1 年2 月1 2 日，美、英、日、法、德和中国科学家宣布共同 绘制完成了人类基因组序列图。这是继发现d n a 结构之后生命科学领域的又一里程碑， * 型配合o 成& i 【e bd n a ，岱自月作月 兜 标志着人类基因组时代的正式来临。 1 1 2d n a 的组成和结构特点 d n a 是由大量脱氧核苷酸组成的、极长的大分子，其中戊糖和磷酸基起结构作用， 而碱基则携带遗传信息。d n a 古有四种碱基，其中两种为嘌呤碱，即腺嘌呤( a ) 乌嘌呤 ( g ) ，两种嘧l 蛀碱是胸腺嘧i 定( t ) 和胞嘧啶( c ) 。 嘌呤 嘧啶 、n v n h 2 气j l l o 鸟嘌呤r g l 腺嘌呤f a l 承 。事 图1 1 嘌呤与嘧啶的结构 f i g u r e l1s t n l c t m so f p u n n ca n dp ”d l n c d n a 存在a 型、b 型、z 型二二种空间构型，d n a 结构是由两条反向平行的脱氧多 核苷酸链形成，其两条链之问的螺旋呈现两种凹形，其中一条沟区较浅而另一条较深分 别称之为小沟、大沟。四种疏水性的碱基位于螺旋的内侧，带负电荷的、亲水性的磷酸 基与脱氧梭糖单位处于外侧。d n a 结构的稳定性主要柬源于三种力：一是互补碱基对 之问的氢键：二是碱基堆积力，由芳香碱基上的电子之间的相互作用产生，是比较主 要的力；第三种力来自碱酸基上的负电荷与介质中的阳离子之间的静电作用力。 o 一h 。二 洲 k 葫 “j 函纠 丘咧 圈12 核苷酸片段的结构 f 】g i l m12s t n l c m mo f m eh c t l h u c l e i ca c m 爨j k m 、 图13 d n a 双螺旋结构 f lg i l m13s t m c m f d o u b l e _ h e hd n a nh 最 黍 海南大学硕士学位论文吴姗姗 1 1 3d n a 与其靶分子的作用方式 小分子与核酸结合的部位是核酸的碱基、磷酸骨架和戊糖环。核酸由平行堆积的碱 基、聚合的阴离子磷酸骨架以及两条核苷酸形成的大沟、小沟组成小分子识别位点。作 用方式大致可分为三种：非共价结合、共价结合和剪切作用。近期研究表明，小分子与 d n a 相互作用形式还有“半嵌插结合 ( 1 l a l f i i l t e r c a l a t i o n ) ，由于超分子化学的发展，分 子与核酸还涉及到长组装( 1 0 n g 啪g 舔s 伽如l y ) 。 1 1 3 1 非共价结合 非共价键最主要的是氢键、离子键、范德华力和疏水作用等。虽然这些均属于弱作 用键，但在分子水平的生命现象中上述弱作用键却是一种决定性的因素，形成了核酸生 物功能所需要的空间结构。当然这种结合方式与具体的环境条件有关。其主要包括三种 不同的方式：静电结合、沟内结合和嵌插结合。 ( 1 ) 静电结合( e l e c 仃o s t a t i cb i n d i n 曲，即分子通过非特异性的相互作用结合于带负 电荷的研蛆双螺旋外部、一般认为，静电结合没有选择性，作用于磷酸骨架【l 们，在药 物的应用上价值不大。但也并非如此，例如：t m p y p 金属卟啉带正电的侧链与d n a 磷 酸骨架间的静电作用对它能嵌入结合在g c 碱基之间起了必不可少的稳定作用，文献 1 1 】 认为，核酸分子表面有静电力形成的水化层中水分子排列与碱基有关。 ( 2 ) 沟内结合( c 胁o v eb i n d i n 曲，即小分子与核酸的大沟或小沟的碱基对边缘直接 作用。通常非稠合的芳环体系能通过一定的旋转后结合在小沟中a t 富集区。近年发展 起来的反寡聚核苷酸能按严格的碱基配对原则在双螺旋的核酸的沟中形成局部的三螺 旋结构，可以精确的识别核酸的特异性序列。因此如已知靶分子的核苷酸序列，有可能 根据寡核苷酸的碱基序列直接写下抑制物的化学结构，这点有利于药物分子的合成。 ( 3 ) 嵌插结合( i n t e r c a l a t i v eb i n d i n 曲，即碱基对之间嵌入平面的或几乎平面的芳香 环系，这是芳环与碱基间的兀兀体系、偶极一偶极相互作用及疏水作用的结果，是药物分 子与d n a 发生作用的最重要的形式之一。当d n a 靶向分子嵌入d n a 碱基之后，有的 可以直接抑制d n a 的复制、转录的功能：有的则经过进一步活化后，使d n a 断裂受 损进而影响其功能。影响药物嵌插方式的因素最具影响的理论是两级互补理论【1 2 1 。具体 而言，其存在以下影响因素【l 列： id n a 的结构 不同构型的d n a 与同一化合物作用时其键合方式可能会不同。 i i 化合物的形状化合物的形状与d n a 的匹配程度决定了药物与d n a 的作用方 式。采取刚柔结合的设计思路，即有嵌入d n a 碱基对之间的刚性平面为插入点，又有 与d n a 特异结合的柔性侧链作为异向连接结构，且末端具有能断裂d n a 的生物活性 部位的不同系列化合物，有利于嵌插作用。 i i i 插入基团化合物以嵌插方式与d n a 结合要求药物的插入基团要有较好的平面 性、适中的平面面积和疏水性。药物能插入配体的平面面积与插入强度成正比，但当增 大的面积与插入基团不在同一平面内使空间位阻增大时，药物与d n a 的作用反而会减 3 新型配合物合成表征及与d n 蛋白的相互作用研究 弱。当插入基团相同，适当增加辅助支链的疏水作用，也可增强药物与d n a 的结合f 1 4 ，1 5 1 。 i v 取代基的差异当药物嵌入d n a 时，取代基空间位阻过大就会减弱这种作用。 虽然大的取代基的动力学因素不利于嵌入剂与d n a 相互作用，但却有利于与其与d n a 碱基之间的堆积作用，这很象小分子与d n a 沟槽结合的模式。同一取代基，据不同的 位置时，生物活性不一样，而且取代基不同，药物的生物活性也会发生很大的变化。但 是与未取代的化合物相比，无论是亲电子基团还是斥电子基团的取代都会增强小分子与 d n a 的结合强度。 1 1 3 2 共价结合 共价结合包括与亲核试剂的作用和与亲电试剂的反应。主要表现为d n a 的烷基化 及d n a 的链间交联和链内交联等，与非共价结合相比，d n a 靶向分子与d n a 共价结 合的序列特异性识别能力要强的多。小分子与特定碱基作用并形成加合物，使d n a 双 链解旋并产生弯曲。例如d u o c a m y c ：i l l 及其衍生物只能在d n a 小沟中对a t 富集区识别， 分子中活泼的环丙烷与小沟内特定碱基序列中a 的n 3 共价结合后导致在该位点脱去嘌 呤【1 6 1 。 1 1 3 3 剪切作用 d n a 修复、转录和突变是很重要的一个生物学过程。具有剪切作用的分子断裂d n a 的位点是由其与d n a 结合的选择性决定的。 博来霉素( b l m ) 是一种典型的d n a 切割化合物，分子结构的特殊性使其能够识别 并结合在d n a 中5 g c 3 序列的鸟嘌呤上，然后经一系列化学反应最终导致d n a 断 链。这种双功能性对于设计人工核酸酶及发展有效的抗肿瘤药物都具有非常重要的指导 意义。事实上，已有大量研究根据这一原理把对d n a 具有剪切功能的分子与能对d n a 序列进行特异性识别的分子连接起来，以合成序列特异性更高的人工核酸酶或抗肿瘤药 物。 1 1 4 常用的研究方法 近年来，对金属配合物与生物大分子d n a 的相互作用的研究已成为生物无机化学 领域国际上十分活跃的研究课题【1 7 1 。小分子与d n a 键合常会诱发许多生物效应，如阿 霉素和柔红霉素分子的芳基部分嵌入d n a 碱基对之间，水合顺铂和d n a 链上鸟嘌呤 碱基配位而使他们具有抗癌作用。溴化乙锭和二氨基吡啶o r o f l a “n ) 因能嵌入d n a 分子 而成为研究d n a 结构以及药物与d n a 结合的探针【1 8 ，1 9 1 。d n a 的分子光开关【2 0 ，2 1 1 、 d n a 足迹试剂【2 2 】以及d n a 断裂试剂【2 3 之5 1 。 金属配合物与d n a 作用的位点( 大沟、小沟) 、作用的形式( 插入、沟结合、静电 作用) 、有无构型选择或碱基序列选择，需要用多种方法加以确定。常用的研究技术有 光谱学方法、n m r 技术、流体力学方法，另外还有热力学方法、电化学方法和序列凝 胶电泳等。 1 1 4 1 光谱法 4 海南大学硕士学位论文吴姗姗 通常配合物与d n a 结合后会导致其配体所处环境发生变化，结合强弱可通过电子 吸收光谱、发射光谱、激发态寿命等一系列变化反映出来。 ( 1 ) 紫外光谱法由于双螺旋结构的d n a 分子含有芳香碱基和磷酸生色基团，其 电子吸收光谱在2 6 0 啪左右有一强的吸收峰【2 6 ，2 7 1 ，许多d n a 靶向分子或本身具有光学 活性，或与d n a 结合后产生光学活性，因此用光谱方法通过考察悄结合其靶向分 子后结构上的变化来研究其结合机理，是非常有效和应用最为广泛的方法，其中紫外 可见吸收光谱法是研究小分子与核酸相互作用的一种最常用、最方便的技术。某些小分 子如金属配合物亦有吸收谱带，可根据其与d n a 相互作用前后d n a 或其它分子的吸 收谱带的变化对二者相互作用模式进行判断。 ( 2 ) 荧光光谱法荧光光谱法可以作为一种研究具有荧光特性靶向化合物的理想 方法，配合物与d n a 的键合方式也直接影响其稳态荧光光谱，可以根据相互作用前后 荧光强度的变化，对二者相互作用的模式进行判断。对于自身荧光较低的某些金属配合 物来说，当与d n a 发生嵌插作用时，常伴随着配合物荧光强度的增强及其荧光寿命的 增加，同时，其受阴离子猝灭剂的影响也较小。对于某些药物分子，可借助于荧光探针 溴化乙锭( e b ) 、亚啶橙、二氨基亚啶等对药物与d n a 的作用模式进行判断。其中e b 是应用最早的荧光探针，被广泛应用于抗癌药物的筛选和小分子与d n a 作用的研究 【2 o 】。另外，和f e ( c n ) 6 为典型荧光猝灭剂，通过考察其对小分子荧光猝灭作用 可以判断小分子与d n a 之间的作用方式。与纯水介质相比，当小分子与d n a 属于嵌 插作用时，i 。或f e ( c n ) 6 4 。的猝灭作用减弱：而当小分子与d n a 属于沟槽作用时，猝灭 作用增强。荧光偏振的变化也是判断小分子是否与d n a 发生嵌插作用的又一标准。通 常当小分子嵌插到碱基中时，其转动受阻，荧光偏振会随之变大，而非嵌插作用不会引 起荧光偏振的增大p 1 1 。 ( 3 ) 圆二色谱法圆二色谱( c d ) 以高频变换的左旋或右旋偏振光作为入射光， 为有机化合物的绝对构型、构象和反应机理的研究提供了很多有用的信息，是目前研究 有机化合物和生物大分子的构型、构象和三维空间结构强有力的工具，可现场检测构象 已知的生物大分子构象变化过程。c d 谱是d n a 螺旋构象的非常敏感的指示剂，可提 供与d n a 作用的小分子的某些基团跃迁谱带变化的信息，进而可获得二者键合方式的 信息。一方面根据d n a 在2 6 0 m 处的吸收提供有关结构信息，另一方面对一些本身没 有c d 信号，但与d n a 结合后能产生诱导c d 信号的分子，可获得一定的有关其结构 的间接信息。如测量消旋化合物对d n a 透析平衡后的透析液的c d 谱，可以帮助确定 d n a 对配合物有无异构选择性结合。另外，通过测量已拆分的异构体键合d n a 前后其 c d 谱的变化，可获得键合方式方面的一些信剧3 2 3 5 1 。 1 1 4 2 流体力学方法在确定小分子化合物与d n a 相互作用模式方面，流体力学方法 ( 如粘度法、沉降速度及在凝胶中的泳动速度等) 有其独特的应用【3 9 1 。该方法常被最 终用来验证小分子化合物是否究竟以插入方式与d n a 作用。 新型配合物合成表征及与d i n 蛋白的相互作用研究 ( 1 ) 凝胶电泳电泳是在外电场存在下，利用分子携带不同的净电荷对不同分子 量的混合物进行分离和分析的一种实验技术。序列凝胶电泳及足印迹分析技术是生物学 中用来研究d n a 与其它分子相互作用最基本的两种手段【删。凝胶电泳可以考察d n a 剪切或其它分子与d n a 螺旋共价结合留下的永久性“痕迹 ，研究其它分子与d n a 作 用的序列特异性问题。在凝胶电泳中所用到的d n a 可以分为三类：质粒d n a ；单链环 型聊姒：线性双链d n a 。它们在其它分子作用下的损伤情况如图1 4 所示，质粒d n a 超螺旋结构中的一条链被切割变成松散型进一步损伤变成碎片结构；单链环型d n a 可 以被其它分子切割为线形，进一步损伤变成小片断；线形双链d n a 被损伤成为碎片。 质粒d n a 单链环型d n a 线性双链d n a 藿一_ 雾蓉一_ 夕 c i o 一一多 _ 一 图1 4d n a 损伤结构 f i g i 】1 41 1 1 璐眦i o no fd n ad 锄a g e ( 2 ) 粘度法确定小分子化合物与d n a 作用模式方面，粘度法有其独特的应用， 在缺少晶体结构资料的情况下，粘度测定用于检测配合物与d n a 是否以插入方