（应用化学专业论文）新苊并杂环衍生物的合成、光谱及作为DNA靶向分子的研究.pdf

大连理t ：大学博十学位论文 摘要 以高度缺电子的8 氧8 h - 苊并l ，2 b n l 咯9 腈为前体，通过芳香亲核氢取代反应， 设计合成了一系列3 位氨基、羟基和烷硫基单取代产物，并且得到了氨基单取代的异构 体6 位氨基取代产物和罕见的3 ，6 - 二氨基氢取代产物。研究了8 氧8 h - 苊并 1 ，2 _ b 】吡咯 ，9 一脖与不同亲核试剂的反应活性，发现它有以下的特点：存在两个氢取代活性位点；两 个氢可以同时被环状仲胺取代；与氮、氧、硫等不同亲核试剂都能发生氢取代反应。 通过对8 一氧一8 h - 苊并f 1 ，2 - b p 比咯9 腈进行结构改造，得到了溶解性更好的新的8 氧8 h - 苊并1 ，2 - b p l 咯9 甲酸酯前体。腈基改造为酯基后，体系仍然高度缺电子，可以 与胺亲核试剂发生芳香氢取代反应。由此，设计合成了两个系列3 位氨基取代的8 氧一8 h - 苊并1 ，2 - b l n l = 匕咯9 甲酸酯衍生物。 研究了8 氧8 h - 苊并1 ，2 - b l l t l 咯一9 甲酸甲酯的3 位伯胺基取代物的紫外吸收和荧光 光谱。发现它的吸收光谱比具有相同取代基的8 氧8 h - 苊并l ，2 - b p 比咯9 腈衍生物红移 1 7 2 0n m 左右，而发射光谱红移1 4 1 7n n l 左右( 6 0 0n m ) ，荧光量子产率降低。研 究了8 一氧8 - 苊并【l ，2 一b n l 咯9 腈( 甲酸甲酯) 的3 位仲胺基取代衍生物在不同极性溶 剂中的紫外吸收和荧光光谱，发现它与伯胺基取代化合物的光谱有明显的不同，溶剂极 性对吸收光谱和荧光量子产率的影响很大，斯托克斯位移从l o 2 0n l n 增大至6 0 9 0n l n ， 这可能是由于存在i c t ( 分子内电荷转移) 激发态造成的。 通过琼脂糖凝胶电泳、紫外可见光谱、荧光光谱、d n a 熔解温度曲线、圆二色谱 和细胞抑制试验等方法研究了8 氧8 h - 苊并1 ，2 - b 吡咯9 腈( 甲酸酯) 类化合物与d n a 的相互作用和抗肿瘤活性。结果表明，具有n ，n 二烷基和n 甲基哌嗪基侧链的化合物 与c td n a 发生强烈的相互作用，表观结合常数达到1 0 5 1 0 6 数量级。其中化合物1 - 1 在长波长( 九 4 0 0 n m ) 激发下产生单线态氧切割m 1 3m p l 8 单链环形d n a ，最低作用 浓度5 0p m 。化合物1 - 1 可以通过表面堆积和嵌入两种方式与c td n a 作用。以h e l a 人宫颈癌细胞，a 5 4 9 人肺癌细胞和p 3 8 8 小鼠白血病细胞为靶细胞的体外抑制实验结果 表明，能与d n a 强烈作用的带有n ，n 二烷基侧链取代基的化合物具有较高的细胞毒 性， 其i c 5 0 值达到1 0 - 8 1 0 l a m 。且分子中没有n ，n 二烷基侧链取代基的大部分化合 刘风玉：新苊并杂环衍生物的合成、光谱及作为d n a 靶向分子的研究 物也表现出了一定的细胞毒性，特别是带有硫吗啉基取代的化合物1 - 9 对h e l a 细胞有 很高的抑制活性，i c s o 值达到了0 1 7 m 。对化合物1 - 9 的同位素掺入实验表明，它主 要是干扰了d n a 和r n a 的合成。 关键词：d n a 靶向分子；芳香亲核氢取代反应；荧光；嵌入：抗肿瘸 大连理工大学博士学位论文 n o v e la c e n a p h t h o h e t e r o c y c l e s ：s y n t h e s i s ，s p e c t r a lb e h a v i o ra n d a p p l i c a t i o na sd n a t a r g e t m o l e c u l e s a b s t r a c t 8 - o x o 一8 h - a c e n a p h t h o 1 ，2 一b p y r r o l e - 9 一c a r b o n i t r i l e ，af l a ta n dh i g h l ye l e c t r o n d e f i c i e n t h e t e r o a r o m a t i cc o m p o u n d ，w a su s e da sp r e c u r s o rt os y n t h e s i z eas e r i e so fa m i n o ，h y d r o x y l a n dd o d e c y l s u l f a n y lm o n o s u b s t i t u t e dd e r i v a t i v e sa t3 - p o s i t i o nt h r o u g hn u c l e o p h i l i ca r o m a t i c s u b s t i t u t i o no fh y d r o g e n ( n a s h ) r e a c t i o n 6 - a m i n os u b s t i t u t e dd e r i v a t i v e sw e r eo b t a i n e da s t h ei s o m e r so f3 - s u b s t i t u t e dp r o d u c t s i tc a nb ec o n c l u d e df r o mu n u s u a lc h a r a c t e r i s t i c sf o r n a s hr e a c t i v i t yo ft h ep r e c u r s o rt h a tt h e r ew e r et w oa c t i v es i t e sf o rn a s hr e a c t i o ni no n e m o l e c u l e ；t w oh y d r o g e na t o m si no n ea r o m a t i cc o n j u g a t i o ns y s t e mc o u l db er e p l a c e d s i m u l t a n e o u s l y ；n a s hr e a c t i o nw i t hd i f f e r e n tn u c l e o p h i l e s ( n i t r o g e n ，h y d r o x yg r o u p ，s u l f u r ) c o u l db eh a p p e n e da l s o 8 - o x o 一8 h - a c e n a p h t h o 1 ，2 一b p y r r o l e 一9 一c a r b o x y l i ca c i d e s t e r sw i t hi m p r o v e d s o l u b i l i t y w e r eo b t a i n e df r o m 8 - o x o 一8 h - a c e n a p h t h o 1 ，2 - b p y r r o l e 一9 一c a r b o n i t r i l e ，a n d t h e h i g h l y e l e c t r o n d e f i c i e n tf e a t u r ew a sk e p ti nt h e s en o v e lp r e c u r s o r s s oas e r i e so f3 - s u b s t i t u t e d d e r i v a t i v e so ft h ee s t e rp r e c u r s o r sw e r es y n t h e s i z e db yn a s hr e a c t i o n 谢t ha m i n e s c o m p a r e dw i t ht h a to ft h ec a r b o n i t r i l ep r e c u r s o rw i t hp r i m a r ya m i n es u b s t i t u e n t sa t 3 - - p o s i t i o n ，t h em a x i m u mw a v e l e n g t hf o rt h ed e r i v a t i v e so fe s t e rp r e c u r s o r sw e r er e d - s h i f t e d a b o u t17 - 2 0m na n d14 - l7n l ni nu v - v i sa b s o r p t i o na n de m i s s i o ns p e c t r a ，r e s p e c t i v e l y ，a n d f l u o r e s c e n c eq u a n t u my i e l d sw e r ed e c r e a s e d t h e r ee x i s t e ds i g n i f i c a n td i f f e r e n c ei nu v - v i s a n de m i s s i o ns p e c t r ab e t w e e nt h ed e r i v a t i v e sw i t h3 - a l i c y c l i cs e c o n d a r ya m i n es u b s t i t u e n t s a n dt h o s ew i t h3 - p r i m a r ya m i n es u b s t i t u e n t s t h em a x i m u mw a v e l e n g t ho fu v v i sa n dt h e f l u o r e s c e n c eq u a n t u my i e l dw e r em a i n l yd e p e n d e do nt h ep o l a r i t yo fs o l v e n t sa n dal a r g e s t o k e ss h i f t ( 6 0 9 0n m ) w a so b t a i n e d ，w h i c hc o u l db ea t t r i b u t e dt ot h ee x c i t e d s t a t e i n t r a m o l e c u l a rc h a r g et r a n s f e r ( i c t ) i n t e r a c t i o nw i t hd n aa n da n t i t u m o ra b i l i t i e sf o r8 - o x o 一8 h - a c e n a p h t h o 1 ，2 - b p y r r o l e 一9 - c a r b o n i t r i l e ( c a r b o x y l i c a c i de s t e r ) a n dt h e i rd e r i v a t i v e sw e r ee v a l u a t e db y a g a r o s eg e l e l e c t r o p h o r e s i s ，u v - v i sa b s o r p t i o na n df l u o r e s c e n c es p e c t r u m ，d n am e l tc u r v e s ，c i r c u l a r 刘风玉；新苊并杂环衍生物的合成、光谱及作为d n a 靶向分子的研究 d i c h r o i s m ( c d ) s p e c t r o s c o p y ，c y t o t o x i c i t ye x p e r i e n c ee t c t h er e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a tt h e c o m p o u n d sw i t hn - d i a l k y lg r o u pa n dn - m e t h y l - p i p e r a z i n y ls i d ec h a i nc o u l db i n ds t r o n g l y w i t hc td n aa n dt h eb i n d i n gc o n s t a n t sa l ei nt h eo r d e ro f1 0 - 1 0 0 u n d e r 也ei 妇i a t i o no f l o n gw a v e l e n g t hl i g h t ( 九 4 0 0r u n ) ，c o m p o u n d1 - 1c o u l db eu s e dt oc l e a v em 1 3m p l 8s i n g l e s t r a n dc i r c u l a rd n a b yg e n e r a t i n gs i n g l e to x y g e n ，t h el o w e s te f f e c t i v ec o n c e n t r a t i o ni s5 0 i x m t h e r ew e r et w od i f f e r e n ti n t e r a c t i o nm e c h a n i s m s ( i n t e r c a l a t i o na n ds t a c k i n go r is u r f a c e ) i n v o l v e di nt h ei n t e r a c t i o np r o c e s so fc o m p o u n d1 - 1w i t hc td n a t h ei n h i b i t o r yt e s t a g a i n s th e l a a 5 4 9a n dp 3 8 8c e l ll i n e si nv i t r os h o w e dt h a tt h ec o m p o u n d s 、v i mn - d i a l k y t g r o u pa n dn - m e t h y l p i p e r a z i n y ls i d ec h a i ne x h i b i t e dh i g h e ra c t i v i t ya n dt h ei c 5 0v a l u e sa l ei n t h er a n g eo f10 - s _ 10 一m m o r e o v e r ，t h o s ec o m p o u n d sw i t h o u tn - d i a l k y lg r o u pb a s i cs i d e c h a i ns h o w e dm o d e r a t ea n t i t u m o ra c t i v i t yu n e x p e c t e d l y e s p e c i a l l yf o rc o m p o u n d1 - 9w i t l l t h i o m o r p h o l i n y ls u b s t i t u e n t , t h ei c s 0 v a l u ea g a i n s th e l ac e l li s1 7 x10 一m i s o t o p e i n c o r p o r a t i o ne x p e r i m e n to f c o m p o u n d1 - 9s h o w e dt h a ti td i s t u r b e dt h es y n t h e s i so f d n a a n d r n a k e yw o r d s ：d n a - t a r g e tm o l e c u l e s ；n u c l e o p h i l i ca r o m a t i cs u b s t i t u t i o no fh y d r o g e n r e a c t i o n ；f l u o r e s c e n c e ；i n t e r c a l a t e ；a n t i t u m o r 独创性说明 作者郑重声明：本博士学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工 作及取得研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得大连理 工大学或者其他单位的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。 作者签名： 大连理工大学博十研究生学位论文 大连理工大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解“大连理工大学硕士、博士学位论文版权使用 规定”，同意大连理工大学保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子 版，允诲论文被查阅和借阅。本人授权大连理工大学可以将本学位论文的全部或部分内 容壤入有关数据库进行检索，也可采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论 文。 作者签名 斗乓墨一 聊签名：凌迤照 年五月坐同 大连理工大学博士学位论文 1 绪论 1 1 引言 染料化学是一门古老的学科，1 8 5 6 年p e r k i n 发现苯胺紫标志着现代染料合成工业 的开始。在过去的1 0 0 多年罩，大量经典的传统染料被合成出来用于纤维染色等方面。 1 8 7 6 年w i t t 提出的化学结构与颜色之间的理论直至今天仍然是许多经验理论的基础， 他认为化合物之所以有颜色是由于发色团( c h r o m o p h o r e s ) 的存在和助色基团 ( a u x o c h r o m e ) 的引入f “。随着物理化学和有机化学的发展，人们认识到发色团是具有 共轭双键的线性或环状体系，而助色团则对应于一些给电子取代基( e l e c t r o n d o n n i n g g r o u p ，如n h 2 ，o h ，o 。) 。在2 0 世纪8 0 年代，功能染料( f u n c t i o n a ld y e s ) 这个术语 被提出来，所谓的“功能性”即是指具有共轭丌体系的发色团被用于染色之外的其他目 的，这种特殊功能通常与光、电、化学、生化等相联系，如应用于染料激光器、液晶显 示、热敏压敏记、光盘存储记录、太阳能转化、化学分析、生物化学、生物学、药物发 展等各个方面。 最近的二三十年间，现代生命科学迅速发展，很多学科特别是化学学科，都在为认 识生命的本质作贡献。而在分子水平上认识生命体系的过程，其核心是化学的。其中。 设计并发展用作抗癌药物的d n a 靶向化合物，及化学传感器用作荧光探针在分子水平 上实现对活细胞实时、可见的研究是两个新兴的领域，就是化学为解决生物科学中的重 要问题所做出的突破性贡献。 作为强大的分析检测工具，分子探针在生命科学、 2 - 5 1 超分子光化学1 6 。1 1 方面的研究 在全世界范围内备受瞩目，是目前热门的研究课题之一。发色团分子作为信号单元在分 子探针领域的应用不可或缺。众所周知，化学、生物学里的关键过程是分子识别和组装， 对这些分子水平的微观过程的观测和研究非常重要。经过特殊设计的分子探针具有高灵 敏度、高特异选择性，可进行实时单分子检测，将微观环境的变化信息转化为光信号， 从而使人与分子的“对话”成为可能。在发色团上引入活性基团，【2 】 1 2 1 如琥珀酰亚胺、 异硫氰酸酯、马来酰亚胺等，形成生物标记探针，它们可以通过活性基团与生物分子上 的氨基、巯基等基团通过共价键结合，从而对生物大分子进行标记。标记后生物分子的 刘风玉：新苊并杂环衍生物的合成、光谱及作为d n a 靶向分子的研究 各种变化。如蛋白质在细胞内的扩散和分布、构象变化等，可以很方便地用荧光光谱或 紫外一可见吸收光谱检测。除了标记用探针外，研究很多的还有分予识别用探针。这类 探针结构中含有( 荧光) 发色团和受体单元，【”1 客体分子与受体单元相结合后，影响发 色团的光物理性质，通过观察荧光或吸收的变化可直观地体现客体的存在。多数情况下， 客体与受体的结合作用是分子间的弱键作用，如氢键、范德华力、库仑力、兀一7 1 ：作用 等。 1 9 5 3 年w a t s o n 和c r i c k 1 4 1 提出d n a 的双螺旋结构模型，从分子水平上阐述了生命 遗传物质d n a 的半保留复制机理，从此生物学进入了分子生物学的新时代，而有关生 物基本遗传物质d n a 的研究也就成为分子生物学和生物化学的重要课题。以d n a 为 作用靶点的分子，即d n a 靶向分子与d n a 之间相互作用的研究一直受到关注。其中 以具有平面7 c 共轭刚性结构的发色团分子作为d n a 靶向化合物，用于研究小分子和d n a 的相互作用一直非常活跃，其刚性平面使之有可能通过兀堆积、范德华力等与d n a 的碱 基对发生相互作用。 本章将对小分子与d n a 相互作用的研究进展以及那些既可以作为分子探针的信号 单元，又能作为d n a 靶向分子的功能发色团的发展作简单的评述。 1 2 小分子与核酸的相互作用 d n a ( 脱氧核糖核酸) 是生物体的重要组成物质，是遗传信息的携带者，是基因表 达的物质基础，它在生物的生长、发育和繁殖等生命活动中具有十分重要的作用。因此 核酸是现代生物学、医学研究的重要课题之一。小分子与d n a 的相互作用是以d n a 为靶分子的各种物质生物效应的分子基础。一方面其键合状态可能是导致癌变、突变及 细胞死亡的重要环节，另一方面能够与d n a 结合的小分子很多又是临床上广泛应用的 抗癌药物。许多靶向分子能与d n a 发生相互作用，改变d n a 的正常结构，影响d n a 的生理和物理化学性质，改变d n a 的转译和复制，破坏其模板作用，进而影响基因调 控和表达功能坫，拍 。因此，研究d n a 与靶向分子的相互作用有助于人们对d n a 与蛋白 质相互作用方式的了解，不仅可以从分子水平阐明生命过程机理、疾病的致病机制，而 且可以引导药物的设计与合成、药物体外筛选以及探讨药物的治病机理，在抗癌药物设 大连理t 大学博士学位论文 计方面有其特殊的意义，是目前国际上非常活跃的研究领域之一。而且，d n a 靶向 分子还可作为d n a 生物传感器的各类探针标记，用于疾病诊断、遗传鉴定、环境监测、 基因疗法等，因此研究该类分子与d n a 的相互作用在探针标i 己分子的设计与筛选方面 也具有直接而有效的指导意义。 1 2 1 研究d n a 与靶向分子相互作用的意义 d n a 与靶向分子相互作用的实质是靶向分子对生物大分子d n a 特定部位的识别作 用及其对整个大分子构象所产生的影响，其内容包括靶向分子对d n a 作用位点、作用 方式及作用强度的研究。这里的靶向分子是指以d n a 为作用靶的所有分子，包括d n a 本身、蛋白质、r n a 和小分子等。d n a 平行堆积的碱基、聚合的阴离子磷酸骨架，以 及两条核苷酸链螺旋形成的大沟( m a j o rg r o o v e ) 和小沟( m i n o rg r o o v e ) 构成了靶向分 子的作用位点。为充分了解研究d n a 与靶向分子相互作用的意义，我们必须从d n a 的组成与结构、d n a 的某些重要特性以及d n a 的生物学功能等方面阐明。 1 2 1 1d n a 的组成与结构 d n a 是由四种脱氧核糖核苷酸单体组成，脱氧核苷酸由核苷( 包括碱基和戊糖) 和磷酸组成，碱基分别是腺嘌呤( a ) 、鸟嘌呤( g ) 、胞嘧啶( c ) 和胸腺嘧啶( t ) ， 脱氧核苷酸通过3 ，5 - 磷酸二酯键连接起来形成单链，称为d n a 的一级结构。由于这 些聚核苷酸的磷酸基团呈酸性，因此在生理p h 下，d n a 为聚阴离子。w a t s o n 和c r i c k 在1 9 5 3 年提出d n a 双螺旋结构模型( b d n a ) ，在分子生物学的发展上具有划时代 的贡献，为分子生物学和分子遗传学的发展奠定了基础。 w a t s o n c r i c k 模型的特点剧1 8 ：两条反向平行多核苷酸链围绕同一中心轴以右手螺 旋方式缠绕，形成直径约为2h i d ( 实测为2 3 7r i m ) 的双螺旋。碱基位于双螺旋的内侧， 磷酸基团一核糖形成骨架处在外侧，从而使带负电荷的磷酸基团间的排斥力最小。双螺 旋结构上有二条宽度不等的凹沟，即大沟和小沟。大沟携带了其他分子能够阅读的信息 ( 碱基序列) ，沟足够大，能容许蛋白质分子进入。相比之下，小沟信息较少些。两条 反向链之间的碱基通过氢键作用形成平面的碱基对，并且碱基对平面与螺旋轴几乎垂 刘风玉：新苊并杂环衍生物的合成、光谱及作为d n a 靶向分子的研究 直。w a t s o n c r i c k 模型只允许形成两种特定碱基对：a t 和g c 。这就是d n a 的二级 结构。 d n a 双螺旋结构在生理状态下是很稳定的，维持这种稳定性的主要因素是碱基平 面上兀电子云间的堆积力( b a s es t a c k i n gf o r c e ) 和疏水作用1 1 8 】。嘌呤与嘧啶碱基呈疏水 性，分布于双螺旋的内侧。大量碱基层层堆积，两相邻碱基的平面十分贴近，使双螺旋 结构内部形成一个强大的疏水区，与介质中的水分子隔开。研究表明碱基堆积作用的强 度与堆积碱基之间环的大小呈正比。嘌呤碱基和嘧啶碱基之间的堆积作用大小为：嘌呤 一嘌呤 嘌呤一嘧啶 嘧啶一嘧啶。其次，大量存在于d n a 分子中的其他弱键在维 持双螺旋结构的稳定上也起一定的作用。这些弱键包括：互补碱基之间的氢键、磷酸基 团上的负电荷与介质中的阳离子之间形成的离子键( 静电作用力) 、范德华引力( v a nd e r w a a l sf m c e ) 等。 d n a 是一种柔性的生物大分子，这使得d n a 双螺旋可以采取不同的构象，如a 、 b 、c 、d 、z 等形式。d n a 采取何种构象，很大程度上取决于环境条件，如盐的种类、 相对湿度等。b 型是大多数天然d n a 的存在形式，其特点是两条反向平行的多核苷酸 围绕同一螺旋轴旋转形成右手螺旋。z d n a 是d n a 几种构象中唯一的左手螺旋。d n a 不同构象所具有的特征使得利用小分子识别d n a 的二级结构成为可能。 1 2 1 2 靶向分子与d n a 相互作用的生物学意义 研究通常要考虑三个生命过程中非常重要的生物靶，它们是酶、狭义受体和核酸。 理论上来看，核酸是最重要的生物靶，因为所有的酶和受体都是蛋白质，都是从d n a 经转录、翻译等过程产生的。阻断与疾病有关的早期阶段之一，就是关闭或调整合成这 些不正常的酶和受体的途径。通常认为b d n a 是主要的有生物活性的d n a 。 靶向分子与d n a 的相互作用将直接影响到基因的表达。所谓基因表达即遗传信息 的转录和翻译过程。基因表达的调节和控制已经成为最引人注目的研究课题之一。通过 对基因表达机制的认识将使我们更有效地控制生物的生长发育。靶向分子与d n a 的结 合常常诱发很多生物效应。而以d n a 空间结构的运动性为基础，研究靶向分予与d n a 的相互结合，是以d n a 为靶分子进行药物设计的分子基础。目前大部分抗肿瘤药物都 4 大连理工大学博士学位论文 是以d n a 为作用靶点，通过直接损伤d n a 或抑制d n a 的合成而达到目的。一些抗病 毒药物，如治疗艾滋病的药物也是以d n a 为作用靶点的分子。此外，一些致癌物也能 与d n a 形成加和物，这种d n a 加和物也是可能癌变的预警标志物。因此研究d n a 与 靶向分子的相互作用，将有助于人们从分子水平上了解生命现象的本质，并从基因水平 上了解某些疾病( 如癌症、艾滋病) 的发病机理，从而使通过分子设计寻找有效的治疗 和诊断药物成为可能。 此外，d n a 靶向分子的另一个重大用途是作为d n a 生物传感器的杂交指示荆。 d n a 生物传感器是2 0 世纪9 0 年代的一个新的研究热点。它是将有反应活性的已知序 列的单链d n a 固定在某种支持物上( 感受器) 作为探针，可以在含有复杂成分的环境 下特异地识别与之互补的目标d n a ，并通过换能装置转换为可记录信号。换能装置即 信号转换装置，是d n a 生物传感器的重要组成部分，而d n a 靶向分子则是标识型换 能器的杂交指示剂。 1 2 2 靶向分子与d n a 相互作用的模式 d n a 靶向分子与核酸作用的部位是核酸的碱基、磷酸骨架和戊糖环，其相互作用 方式归纳起来有三种：非共价结合、共价结合和剪切作用。 i 2 2 1 非共价结合 大多数靶向分子与d n a 的作用都是非共价结合，从化学键角度讲，其实质为氢键、 离子键、范德华力、疏水作用等分子间非共价作用力共同作用的结果。可以用实验方法 测得d n a 与靶向分子间的亲和力，即平衡常数k ，并且根据相互作用的键的类型来评 估亲和力的强弱( 表1 i ) 。 表1 1d n a 靶向分子相互作用的类型和强度 t a b l e1 1c a t e g o r i e sa n di n t e n s i t yo fd n a t a r g e t i n gd r u g si n t e r a c t i o n 键的类型 a g o k j t o o l 键的类型 a g o k j m o l 共价键- ( 1 7 0 - 4 2 0 )氢键- ( 4 - - 2 9 ) 离子键一( 2 1 , - - 4 2 ) 疏水作用 一4 偶极键- ( 4 - 2 9 ) 范德华力一( 2 - 4 ) 刘风玉：新苊并杂环衍生物的合成、光谱及作为d n a 靶向分子的研究 在分子水平的生命现象中，上述弱作用键是一种决定性因素，形成了各种生物大分 子功能所要求的空间结构，因而主导着靶向分子与d n a 作用的特异性。非共价作用主 要存在三种方式：外部静电结合( e l e c t r o s t a t i cb i n d i n g ) 、沟区结合( g r o o v eb i n d i n g ) 和嵌插结合( i n t e r c a l a t i v eb i n d i n g ) ，如图1 1 所示 1 9 1 。 g r o o v e b i “d i n g i n t e r c a l a t i v e b i n d i n g 图1 1 小分子与d n a 非共价作用的三种方式 f i g u r e1 1t h r e en o n c o v a l e n ti n t e r a c t i o nm o d e sb e t w e e ns m a l lm o l e c u l e sa n dd n a ( 1 ) 外部静电结合，即分子通过非特异性的相互作用结合于带负电荷的d n a 双螺 旋外部。d n a 是一个高度带电的聚合电解质，它的阴离子磷酸骨架强烈地影响d n a 的 构象及其反应。这种带电的高聚物构象需要在以靶向分子作为抗衡离子的协同作用中达 到完全稳定。沿着螺旋外部的静电相互作用都是非特异性的，因此静电作用没有选择性， 作用于磷酸骨架【2 0 】，通常认为这种单纯的静电结合模式在作为药物的应用上价值不大， 但也并非完全如此，有些分子与d n a 的静电作用对靶向分子能嵌入结合在g c 碱基对 之间也起了必不可少的稳定作用。例如，t m p y p 金属卟啉带正电的侧链与d n a 磷酸酯 骨架间的静电作用对它能嵌入结合在g c 碱基对之间起了必不可少的稳定作用。 ( 2 ) 沟结合，即d n a 靶向分子与d n a 的大沟或小沟的碱基对边缘直接发生相互 作用。大沟区、小沟区在电势能、氢键特征、立体效应、水合作用上都有很大差别。很 多大分子蛋白质与d n a 特异性的结合是通过d n a 的大沟区作用。而分子量小的靶向 分子则是在小沟区作用。典型的小沟区结合靶向分子多含有几种简单的芳香杂环结构， l 蓦 ， 0 9謇 大连理t 大学 孽+ 学馕论文 如呋喃、啦咯或苯环，这些芳环由翘转自由的键来连接，由此产生合适的扭转力来配合 小沟区内的螺旋曲线，取代沟区中的水分子，并通过范德华引力与d n a 双螺旋链中沟 区的碱基对边缘形成接触从而导致靶向分子在小沟区结合的特异性。小沟区是a t 富 集区，它与o c 富集区相比更窄一些，不像g c 富集区比较宽，靶向分子结合的比较松 散，特异性不明显。而在a t 富集区，靶向分子的供体基团与沟中a ( 腺嘌呤) 上的n - 3 或t ( 胸腺嘧啶) 上c 2 上的羰基氧( c = o ) 有氢键形成。纺锤菌素和h o e c h s t 3 3 2 5 8 两 种经典的小沟结合分子与d n a 切割剂( 如阳离子卟啉) 连接后，可以得到亲和性及对 a t 序列选择性都明显增强的人工核酸酶。近年来发展起来的反义寡聚核瞢酸，因其能 按照严格的碱基对互补原则，在双螺旋d n a 的大沟中通过h o o g s t e e n 氢键结合而形成 局部的三螺旋结构，可精确识别核酸所携带信息的特异性序列。因此，一方面可通过将 一些具有特定功能的活性基团缀接于寡聚核苷酸末端，得到高度选择性的人工核酸酶或 药物分子原型；另一方面如已知靶分予的核苷酸序列，则有可能根据反义寡聚核苷酸的 碱基序列宣接写下抑制物的化学结构，这点十分有利于药物分子的合成。总之，小沟区 结合的靶向分子就这样选择性地作用于d n a 双螺旋结构中的a t 富集区，通过氢键、 范德华力等作用，非嵌入性地捆缚住d n a ，从而阻止d n a 的模板复制，起到抗瘸毒、 抗肿瘤的作用。 ( 3 ) 嵌插结合，即在碱基对之间嵌入平面的或几乎平面的芳香稠环体系。嵌插结合 的作用力来自芳环的离域丁c 体系与碱基的丁【体系间的丌尢相互作用、偶极偶极相互作用及 疏水相互作用，这是药物分子与d n a 发生作用的最重要的形式之一【2 i l 。在经典的嵌插 模型中，由于嵌插部位的形成引起碱基对的分开，螺旋伸长o 3 4n l t l ，这正是典型的芳 环体系的厚度。实际上这是一个最大值，一般观察到的螺旋伸长均小于0 3 4m 。碱基 对之阉正常的旋转角为3 6 0 ，由于嵌插，螺旋解链，造成螺旋扭转角斡减小，不同静嵌 插结构及不同的d n a 序列所造成的解链程度是不同的，乙锭及丙基哌啶与d n a 嵌插 时解链角是2 6 0 ，吖啶及吖啶橙的解链角是1 7 。，而柔红霉素及阿霉素刚是每个结合分子 令d n a 解链1 l o 。一些靶向分子正是通过嵌入d n a ，令d n a 构象发生改变，使其不 能或不易复制，而显现出抗肿瘤、抗病毒的活性【2 2 1 。由于嵌插造成的d n a 双螺旋的解 链和伸长是嵌插结合方式的一个重要特征。另外，由嵌插引起的靶向分子方面的变化特 刘风玉：新苊并杂环衍生物的合成、光谱及作为d n a 靶向分子的研究 征也是非常明显的。这是由嵌插剂与d n a 双螺旋内碱基对之间的次级键作用造成的。 嵌插入d n a 的靶向分子与碱基对形成有序的堆积，嵌插化合物表面紧挨着d n a 碱基 的芳香杂环，在双螺旋中以7 c 丌共轭、偶极偶极相互作用在电性上达到稳定。 通常稠合芳环体系都倾向于结合在g c 富集区，而对于一些含有庞大取代基的分子。 如吡啶环取代的卟啉分子，在与d n a 作用时，吡啶环取代基会尽量旋转，以保持与母 环的共平面，从而通过良好的堆积形状与d n a 碱基嵌合。当d n a 靶向分子嵌入d n a 碱基对之间后，有的可以直接抑制d n a 的复制与转录功能；有的则在经过进一步活化 后如光照下产生羟基自由基、单线态氧、超氧化自由基、超氧化阴离子自由基等活性物 质，使d n a 断裂、受损，从而影响其功能。 对于一次理想的嵌入过程，小分子的平面部分( 即发色团) 必须至少具有2 8 a 2 的 表面积，即最佳是3 4 个环。小分子嵌插到d n a 的特征变化很明显，主要表现为； ( a ) 在嵌入过程中，嵌入剂分子与d n a 碱基对发生作用，或是破坏原有氢键，使极 性嵌入剂分子的两极分别与碱基对结合：或是不破坏原有的氢键，极性的嵌入剂分子直 接与碱基对作用。其中破坏氢键要吸热，药物分子与碱基对结合为放热。利用测定热力 学参数的变化，可以分析嵌入剂分子结构因素对d n a 亲和力的影响。 ( b ) 嵌入剂和d n a 双螺旋内碱基对之间的电性相反。嵌入d n a 的小分子与碱基对 形成有序的堆积，化合物表面紧紧地挨着d n a 碱基对的芳香杂环，在双螺旋链中以兀一7 c 共轭，偶极与偶极相互作用，从而使电荷分布上达到稳定。这些变化可以通过一些光谱 现象，如紫外减色效应、荧光淬灭、1 h - n m r 谱的化学位移向高场移动等现象来说明。 利用d n a 嵌入剂嵌入d n a 后引起d n a 拓扑结构的变化，进而影响拓扑异构酶对 d n a 的识别和作用这一特点，大量的d n a 嵌入剂，如1 ，8 萘酰皿胺类、毗啶并咔唑类、 蒽醌类、棘霉素类、吖啶类、放射菌素类、苯并咪唑 1 ，2 c 喹啉类等，都被用作抗肿 瘤研究，并取得了一些进展。 1 2 2 2 共价结合以及剪切作用 共价结合是指小分子化合物与d n a 中的碱基、糖环或磷酸酯键形成共价键，主要 表现为d n a 的烷基化及d n a 的链间交联、链内交联。与非共价结合作用相比，d n a 大连理工大学博士学位论文 靶向分子与d n a 共价结合的序列特异性识别能力要强得多。例如d u o c a r m y c i n 及其衍 生物只能在d n a 小沟中对a t 富集区识别，分子中活泼的环丙烷与小沟内特定碱基序 列中a ( 腺嘌呤) 上的n 3 共价结合后，导致在该位点脱去嘌呤【2 3 1 。晶体衍射及其它一 些方法也都证实了顺铂中的p t 原子能够与d n a 小沟中同一条链上相邻鸟嘌呤 d ( g p g ) 】 的n 7 共价结合形成链内加成物，并使d n a 双链解旋及产生弯曲，以便于蛋白质的结 合。 有些特殊结构的配体能够识别并结合在d n a 碱基对中，经一系列化学反应，最终 导致d n a 链的断裂。这种双功能性对于设计人工核酸酶及发展有效的抗肿瘤药物有具 有非常重要的指导意义。如b l m ( b l e o m y c i n ，博来霉素) 是一种典型的d n a 切割化 合物，分子结构的特殊性使其能够识别并结合在d n a 中5 - g c 3 序列的鸟嘌呤上，然 后经一系列活化反应最终导致d n a 断链。事实上，根据这一原理已经有大量研究，把 对d n a 具有剪切功能的分子与特异性识别d n a 序列的分子连接起来，获得序列特异 性更高的人工核酸酶或抗肿瘤药物。 影响靶向分子与d n a 相互作用的因素很多，靶向分子的结构不同，整个分子与核 酸的结合方式也不同【2 。 小分子与d n a 相互作用的研究是新型药物设计及一些癌症和病毒性免疫化疗的理 论基础，特别是嵌插作用，它诱导了核酸的一些生理与物化性质的改变，在核酸的识别、 分离及分析中有很大的应用潜力。许多药物与核酸之间存在着可逆的相互作用，并且核 酸是当代新药发展的首选作用目标。其中，在小分子肽及寡聚核苷酸在作为特效药物及 特异核酸序列识别方面已取得了令人鼓舞的成果【2 5 _ 2 8 1 。尽管小分子化合物与核酸的亲和 力及核酸序列的选择性都不太高，但从药物设计原理看，对核酸高亲和力及选择性并不 是具有生物活性的药物所必须的。因此，开发一些具有特殊功能的小分子化合物将在未 来的核酸研究中越来越受到重视29 1 ，尤其在新型药物设计方面。 1 2 3 研究靶向分子与d n a 相互作用的方法 d n a 与其靶向分子间的相互作用研究，以及其在药物设计与合成、药物作用机理 研究方面的重要意义，引起众多学者的兴趣。许多方法及技术被引入到该研究领域。 刘风玉：新苊并杂环衍生物的合成、光谱及作为d n a 靶向分子的研究 1 2 3 1 光谱法 ( 1 ) 紫外可见吸收光谱法 紫外可见吸收光谱是研究小分子与核酸相互作用的一种最方便、最常用的技术。小 分子与核酸的相互作用会导致吸收谱带变宽、吸收带的红移现象或减色效应，尤其是当 靶向分子以嵌插方式结合在双螺旋碱基对之间时，变化会更加明显。吸光度减小、吸收 带红移以及等吸收点的形成等是小分子与d n a 发生嵌插作用的光谱标志 3 0 - 3 7 l 。红移的 出现是因为插入配体与d n a 碱基对发生代电子堆积，插入配体的兀+ 空轨道与碱基的兀电 子轨道发生耦合，能级下降，从而导致7 c 兀跃迁能量减少。同时，耦合后的兀+ 轨道因部 分填充电子，使卅7 【跃迁几率减小，产生减色效应。静电结合对小分子的吸收峰位置与 吸收强度影响较小，几乎不出现消光性与最大吸收波长的移动，因此常用小分子与d n a 作用后的光谱变化作为其与d n a 作用模式的判据。 ( 2 ) 荧光光谱法 荧光光谱法是研究小分子与核酸相互作用的主要手段。有些靶向分子与d n a 结合 后，会产生荧光增强或荧光淬灭效应，根据所得的光谱滴定数据，可以测定结合物表观 结合常数、结合位点等。溴乙锭( e b ) 是应用最早的荧光探针，被广泛应用于抗癌药物 的筛选和小分子与d n a 作用的研究【3 8 4 m 。 ( 3 ) 线二色谱( l d ) 和圆二色谱( c d ) 法 线二色谱( l d ) 采用与固定光轴方向平行或垂直的平面偏振光，