（药理学专业论文）一种用于活细胞dna+mmr活性分析的egfp异源双链dna的构建.pdf

温州医学院硕士学位论文 一种用于活细胞d n am m r 活性分析的e g f p 异源双链 d n a 的构建 中文摘要 错配修复( m i s m a t c hr e p a i r , m m r ) 是最重要的d n a 修复途径之一，为正常 细胞生命活动过程中维持基因组稳定性所必需，该功能的减弱或丧失是导致恶性 肿瘤发生的重要原因。因此，对各种细胞在不同生理和病理状况下的d n a m m r 功能活性进行监测分析具有重要意义。 美国得州大学健康科学中心孙鲁浙教授团队于2 0 0 4 年在世界上首次提出利 用绿色荧光蛋白( e n h a n c e dg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n ，e g f p ) 基因作为报告基因来 定量监测活细胞d n am m r 活性的技术模型，并初步证实了其可行性，但由于 该模型存在一定量的e g f p 本底表达值以及实施过程较为复杂，导致该技术尚未 达到完全成熟，使其在实际科学研究应用中的巨大潜力受到限制。构建e g f p 异 源双链d n a ( h e t e r o d u p l e x ) 分子是该活细胞d n am m r 活性分析技术模型最核 心的内容，本课题在原有基础上，围绕这一核心，对e g f p 异源双链d n a 分子 的构建进行了系统的研究。 首先，运用p c r 介导的定点诱变技术通过在e g f p 基因上引入了一个无义 突变( t g g 5 8 - t a g ) 对原有质粒p g e m 5 z ( + ) 一e g f p 和其起始密码子突变型 ( a t g a t c ) 质粒p l l 7 进行改造，分别得到了新的突变型e g f p 表达质粒p 1 8 8 和p 1 8 9 ，经鉴定，新质粒p 1 8 8 与p 1 8 9 在细胞内均无任何e g f p 表达，因此， 可运用p 1 8 9 与p g e m 5 z ( + ) 。e g f p 构建含有单个碱基错配的e g f p 异源双链d n a 分子，基于错配修复引起无义突变消除而恢复e g f p 表达来监测活细胞d n a m m r 活性。 然后，在第一部分获得正常e g f p 表达质粒p 11 1 和突变型e g f p 表达质粒 p 1 8 9 的基础上，对如何高效制备e g f p 异源双链d n a 分子进行了深入研究。单 链d n a 的获取是构建异源双链d n a 分子的关键环节，为优化这一关键点，我 们改良了传统的噬菌体单链制备方法，建立了一种“噬菌粒高纯s s d n a 快速制 备法”；同时，还提出了一种基于缺刻酶的“质粒s s d n a 体外制备法”，该方法 可广泛适用于普通质粒，具有推广意义。在解决了s s d n a 的制备问题后，我们 2 温州医学院硕士学位论文 将所获取的p l l l 的编码股高纯s s d n a 与b s t x i 线性化的p 1 8 9 退火，对产物运 用一种基于p l a s m i d s a f e a t pd e p e n d e n td n a s e 的新型纯化方法处理，高效的制备 了优质e g f p 异源d s d n a 。将获得的e g f p 异源d s d n a 导入到一株d n am m r 功能正常的细胞株h e l a 和一株d n am m - r 功能丧失的细胞株h c t l l 6 ，对 e g f p 表达情况运用荧光显微镜观察和流式细胞仪分析，结果显示其能明显区分 两株细胞，初步展示了这种e g f p 异源d s d n a 对于活细胞d n a m m r 活性分析 的价值。 最后，综合对质粒运用基于无义突变策略的定点诱变技术和质粒s s d n a 体 外制备技术，以及基于p s a d 的纯化方法，我们提出了一种运用质粒构建单碱基 或多碱基错配等异源d s d n a 分子的新模式，该模式适用于普遍的质粒和目的基 因，这对于促进包括d n am m r 在内的各类d n a 修复功能机制研究具有重要科 学意义。 3 温州医学院硕士学位论文 p r e p a r a t i o no f ah e t e r o d u p l e xe g f p p l a s m i df o ri nv i v od n a m i s m a t c hr e p a i ra c t i v i t ya s s a y a bs t r a c t l o s so fd n am i s m a t c hr e p a i r ( m m r ) f u n c t i o nl e a d st ot h ed e v e l o p m e n ta n d p r o g r e s s i o no fc e r t a i nc a n c e r s m m rd e f e c t sh a v es t r o n g l ya s s o c i a t e dw i t h c e r t a i n t y p e s o f c a n c e r , e s p e c i a l l yh e r e d i t a r yn o n - p o l y p o s i s c o l o r e c t a l c a n c e r ( h n p c c ) a n ds p o r a d i cc o l o r e c t a lc a n c e r al i m i t e dn u m b e ro fs t u d i e s h a v ea l s or e p o r t e dc h a n g e so f e x p r e s s i o no fm m rg e n e so rm m ra c t i v i t yd u r i n g c e l lc y c l ep r o g r e s s i o n ，b yg r o w t hf a c t o rs t i m u l a t i o n ，o ru n d e rd i f f e r e n tg r o w t h c o n d i t i o n s w h i l et h e s e ss t u d i e ss u g g e s tt h a tm m r a c t i v i t ym a yb er e g u l a t e d ，i t i sn o tc l e a rw h a tp h y s i o l o g i c a lo rp a t h o l o g i c a lc o n d i t i o n sm i g h tr e s u l ti nr e d u c e d m m r a c t i v i t yi nv a r i o u st y p e so fc e l l s o n er o a d b l o c ki na d d r e s s i n gt h e s ei s s u e s a p p e a r st ob et h el a c ko fas i m p l ea n de f f e c t i v ea s s a yt oc o m p a r ea n dm o n i t o r m m r a c t i v i t yi nv a r i o u st y p e so fl i v ec e l l su n d e rv a r i o u sp h y s i o l o g i c a la n d p a t h o l o g i c a lc o n d i t i o n s i nt h i ss t u d y , w et r yt od e v i s ea l la s s a ym o d e lu t i l i z i n gt h ee g f p b a s e dr e p o r t e r o nah e t e r o d u p l e xe g f pp l a s m i dt om o n i t o rt h em m r a c t i v i t yi nl i v ec e l l s o u r w o r ks e e k st o e x p l o i tn e wt e c h n o l o g i e st op r e p a r et h i sh e t e r o d u p l e xe g f p p l a s m i d ( d s d n a ) a sam i s m a t c h e dd n as u b s t r a t e w eh a v ef o c u s e do u re f f o r t so nt w os t r a t e g i e s ：( 1 ) d e v e l o pan o v e la n dam u t a n t e g f pg e n ee x p r e s s i o np l a s m i da n d ( 2 ) d e v e l o ps i m p l eb u te f f i c i e n tm e t h o dt h a t c a n p r e p a r ed n ah e t e r o d u p l e xu s i n gt h a tn o v e la n dm u t a n te g f pp l a s m i d ( 1 ) w i t hap c r - b a s e ds i t e d i r e c t e dm u t a g e n e s i sm e t h o d ，an o n s e n s em u t a t i o n w a si n t r o d u c e di n t ot h ee g f pg e n e ( t g g s s - - - + t a g ) o ft h ep l a s m i dpl11a n d p 1 1 7 ，a n dt w or e s u l t e dm u t a n te g f pg e n ee x p r e s s i o np l a s m i d - p 1 8 8a n d p 18 9 w e r ec o n s t r u c t e d ( 2 ) am e t h o dt h a tt h a tc a nr a p i d l yi s o l a t eh i g h l yp u r es s d n af r o mp h a g e m i da s w e l la sa ni nv i t r om e t h o dp r e p a r i n gs s d n af r o mp l a s i dw e r ed e v e l o p e da n d a p p l i e dt op r o d u c et h ec o d i n gs t r a n ds s d n ao fpl11 t h i ss s d n aw a sm i x e d 4 温州医学院硕士学位论文 a n da n n e a lw i t ht h eb s t x il i n e a r i s e dpl8 9 ，w i t hap l a s m i d - s a f ea t p d e p e n d e n td n a s ed i g e s t i o na p p r o a c h ，h i g h l yp u r ee g f ph e t e r o d u p l e xd n a i nl a r g eq u a n t i t i e sw e r eg e n e r a t e d 5 温州医学院硕士学位论文 m m r e g f p r f p d s n p s a d h n p c c m s i s s d n a d s d n a s c r c m i s m a t c hr e p a i r e n h a n c e dg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n r e df l u o r e s c e n tp r o t e i n d u p l e x s p e c i f i cn u c l e a s e p l a s m i d s a f e t ma t p d e p e n d e n t d n a s e h e r e d i t a r y n o n p o s i sc o l o r e c t a lc a n c e r m i c r o s a t e l l i t ei n s t a b i l i t y s i n g l e s t r a n d e dd n a d o u b l e s t r a n d e dd n a s p o r a d i cc o l o r e c t a lc a n c e r 错配修复 增强型绿色荧光蛋白 红色荧光蛋白 双链特异性核酸酶 质粒安全性a t p 依赖d n a 酶 遗传性非息肉病性结直肠癌 微卫星不稳定性 单链d n a 双链d n a 散发性结直肠癌 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已 经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已 在文中作了明确说明并表示谢意。 作者签名： 关于学位论文使用授权声明 本人完全了解温州医学院有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留 学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将 学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅。有权 将学位论文的内容编入有关数据库进行检索。有权将学位论文的标题和摘要汇 编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。 魄上牛型 学位论文作者签名：阀非 孙擞瑶 么锣 温州医学院硕士学位论文 _ - j 一 刖舌 d n a 错配修复系统广泛存在于生物体中，它是细胞复制后的一种修复机制 【1 】。其功能是在含有错配碱基的d n a 分子中切除配对错误的片段，然后通过 d n a 聚合酶和d n a 连接酶等的作用，重新合成配对正确的片段，使d n a 恢复 正常的核苷酸序y d 2 ，3 】。因此，它起着增强d n a 复制保真度、修复d n a 错配、 降低基因变异和维持基因组稳定性的作用 4 】。细胞d n am m r 功能减弱或丧失 是导致恶性肿瘤发生的重要原因之- - 5 】，最早发现遗传性非息肉病性结肠癌 ( h e r e d i t a r yn o n p o l y p o s i s c o l o r e c t a lc a n c e r , h n p c c ，) 【3 】与散发性结直肠癌 ( s p o r a d i cc o l o r e c t a lc a n c e r , s c r c ) 【3 是m m r 基因的突变所致。近年来，m m r 系统的研究越来越受重视，对m m r 作用机制及该系统的组成结构与功能分析方 面的研究正不断深入。由于在越来越多的肿瘤( 如卵巢癌、肠癌、肾癌、乳腺癌、 膀胱癌、肝癌、胰腺癌、胆囊癌、甲状腺肿瘤等) 5 8 细胞中找到d n a m m r 基 因突变或缺陷的痕迹，m m r 功能与肿瘤的发生与恶化的关系成为近十年来的研 究热点。因此，对细胞的d n am m r 功能活性进行分析具有重大意义 9 】，目前 用于细胞d n a m m r 功能分析的方法主要有： 1 ) 以噬菌体m 1 3 m p 2 及其衍生株为材料 5 ，6 】：噬菌体m 1 3 m p 2 以双链形式在 e c o l i 中繁殖，繁殖成功的的噬菌体以单链的形式从细菌中释放，再进入其他细 菌开始另一个生活周期。因此，同一类型噬菌体存在双链( d o u b l es t r a n dd n a ， d s d n a ) 和单链( s i n g l es t r a n dd n a ，s s d n a ) 两种d n a 分子。首先用限制性内 切酶将环状双链d s d n a 切割成线性d s d n a ，通过变性得到线性单链d n a ( 负 链) 与其他不同类型的环状单链d n a ( 正链) 杂交退火，这两条单链除了预设 的一个或两个突变位点以外，其余部位是互补的，可形成一个带缺刻( n i c k ) 的 环状异源d s d n a 分子。将这种含有错配碱基的异源双链d n a 分子转化本身错 配修复功能缺失的宿主菌e c o l i ( n r 9 1 6 0 ) 在培养平板上就会出现混合噬斑，透 明噬斑和篮色噬斑，成为重组克隆的特异表型。将这种含有错配碱基的异源双 链d n a 分子与错配修复功能完善的细胞提取物作用，缺刻会指导错配修复蛋白 以正链为模板，修复负链错配和未配对的碱基。再次转化n r 9 1 6 2 ，在指示平板 上，混合噬斑比率下降，而正链表型的噬斑比率增加。通过计算混合噬斑比率的 变化，就可以了解所检测样本的错配修复功能状态。该模型自构建成功以来在多 个研究中得到应用。 2 ) 以寡聚核苷酸为材料 7 】：采用人工合成的寡聚核苷酸作为含有错配碱基的 6 温州医学院硕士学位论文 d n a 模板，将其引入质粒p e t l l a x h ，构建含有错配碱基及一条链上带有缺口 的环状双链d n a ，使其成为待修复模板。如果待测样本m m r 功能完整，修复 错配碱基的同时使特异性限制性酶位点恢复。通过检测修复后限制性酶切产物的 有无和多少来对待测样本的m m r 功能进行定性和定量的检测。 这两种方法模型的共同特点是构建一个含有错配碱基的异源双链核酸分子， 将细胞提取物在体外与这种异源双链核酸分子孵育后，将其转入到细菌中去统计 不同噬菌斑比率变化或通过限制性酶切分析特异酶切位点的变化来指示细胞的 d n am m r 活性。其技术基础都是异源双链核酸分子构建 9 ，l o 】，1 ) 中采取噬 菌体能产生单链和双链两种形式的基因组d n a 的特点制备异源双链核酸分子， 2 ) 中采用人工合成的寡聚核苷酸作为含有错配碱基的d n a 模板，运用用连接 酶将其引入到质粒中。 上述两种模型自建立后，在一定程度上促进了对d n am m r 功能活性研究 的发展，但也都存较大的局限性。首先，这两种模型均为体外法，不能准确反映 生物体内的真实状况 1 1 1 3 。其次，分析过程复杂，需要多个步骤，而且指标参 数的灵敏度和准确度都较低。因此，这些方法仅限于特定生物体m m r 活性的体 外分析，很难在实际研究中广泛推广。为了克服突破这些限制，美国得州大学孙 鲁浙教授领衔的研究团队于2 0 0 4 年提出了一种利用绿色荧光蛋白( e n h a n c e d g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n ，e g f p ) 基因作为报告基因直接对活细胞d n a m m r 活性 进行定量分析的模型 1 1 】。该模型的核心是构建一个e g f p 异源双链d n a 分子， 在e g f p 基因的起始密码子设置了一个碱基错配，将e g f p 异源双链d n a 分子 导入到细胞中后，错配的修复将会导致e g f p 的表达，通过e g f p 的表达来监测 活体细胞的d n am m r 活性。绿色荧光蛋白的发明及其在生物学研究中的应用 获得2 0 0 8 年度诺贝尔奖，可见绿色荧光蛋白对于生物学研究的优越性 1 4 ，1 5 】。 该基于e g f p 的活细胞d n am m r 活性方法一旦成熟，可应用于监测各种类型 的单个细胞在不同生理状态或病理状态甚至不同细胞周期下的d n am m r 活性， 对于d n am m r 与肿瘤发生发展研究具有重大科学意义。但是，在该模型初步 建立并应用后，发现在两个方面上，该模型的巨大应用潜力和科学意义受到制约， 一是该模型依然采取的是以上两种模型制备异源双链核酸分子的模式，分别运用 人工合成的寡聚核苷酸作为在e g f p 基因起始密码子处含有错配碱基的d n a 模 板，运用用连接酶将其引入到质粒中获取e g f p 异源双链d n a 分子，或构建一 个噬菌粒p g e m 5 z ( + ) e g f p 和其起始密码子突变型( a t g a r c ) 质粒p 1 1 7 ， 利用p g e m 5 z ( + ) e g f p 生产的单链d n a 与限制性内切酶线性化后的p 1 1 7 退火 制备e g f p 异源双链d n a 分子，该过程依然复杂，不能高效获取高纯度的e g f p 异源双链d n a 分子。二是在应用中发现，该模型存在一定的e g f p 本底表达， 7 温州医学院硕士学位论文 原因是有一部分e g f p 的表达并不以来于其始密码子 1 1 】，因此影响了其准确性 和精密度。归结起来，存在的核心问题是e g f p 异源双链d n a 分子的构建。本 课题围绕这一核心问题，对e g f p 异源双链d n a 分子的构建进行了系统的研究， 使这种基于e g f p 报告基因的活细胞d n a m m r 活性分析技术达到成熟和完善。 温州医学院硕士学位论文 第一部分突变型e g f p 质粒的构建与鉴定 材料与方法 一、实验材料 待突变模板质粒 绿色荧光蛋白真核表达质粒p g e m 5 z ( + ) 一e g f p ( 或称p l l l ) 及其突变型质粒p 1 1 7 ( p l l l 的e g f p 基因的起始密码子由a t g 突变为a t c ) ，由美国得州大学健康 科学中心孙鲁浙教授提供。 大肠杆菌菌株 e c o l id h 5q 空白菌购自江苏碧云天生物技术研究，j m l 0 9 感受态细胞购自大连 宝生物工程有限公司。 固细胞株 宫颈癌细胞h e l a 、结肠癌细胞h c t l1 6 、r k o 及l o v o ，由美国得州大学健康科学 中心孙鲁浙教授提供。 主要试剂 1 质粒小量提取试剂盒：购自江苏碧云天生物技术研究所。 2 p c r d n a 纯化试剂盒：购自江苏碧云天生物技术研究所。 3 琼脂糖：美国b b i 公司。 4 p c r 相关：d n t p s 、d n ap f up o l y m e r a s e 为n e we n g l a n db i o l a b s 公司产品，引 物在大连宝生物工程有限公司合成。 5 限制性内切酶：n c o i 、b f a i 、d p n i 等均为n e we n g l a n db i o l a b s 公司产品。 6 细胞培养相关：d m e m 、m e m 、r p m l l 6 4 0 等培养基及胰蛋白酶等均为g i b c o 公司产品，胎牛血清购自杭州四季青生物科技公司。 7 转染试剂：l i p o f e c t a m i n e 2 0 0 0 为i n v i t r o g e n 公司产品。 9 温州医学院硕士学位论文 二、主要实验仪器及设备 1 台式低温高速离心机( 5 4 1 7 r ) ：德国e p p e n d o r f 公司 2 p c r 仪( 5 7 1 0 t ) ：德国e p p e n d o r f 公司 3 稳压稳流型电泳仪( d y y - 1 0 c ) ：北京六一仪器厂 4 凝胶成像系统( j s 3 8 0 c ) ：上海培清生物科技公司 5 恒温振荡培养箱：宁波江南仪器厂 6 细菌恒温培养箱：宁波江南仪器厂 7 紫外分光光度计( u v - 2 5 5 0 ) ：日本岛津公司 8 便携式压力蒸汽医用消毒器：上海三申医疗器械公司 9 生物安全柜( t y p e b 2 ) ：北京东联哈尔仪器制造有限公司 1 0 微波炉( d 8 0 2 3 c t l k 4 ) ：格兰氏电器公司 1 1 雪花制冰机：北京长流仪器公司 1 2 c 0 2 细胞培养箱：美国t h e r m of o r m a 公司 1 3 8 0 超低温冰箱：美国t h e r m of o r m a 公司 1 4 微量移液器：德国e p p e n d o r f 公司 1 5 超净工作台：苏净集团安泰公司 1 6 台式低速离心机：上海安亭科学仪器厂 1 7 1 1 0 0 0 0 电子天枰( g b 3 0 3 ) ：梅特勒托利仪器( 上海) 有限公司 1 8 p h s 3 c 型p h 计：上海雷磁仪器厂 1 9 纯水仪：m i l i p o r e 2 0 水浴锅：太仓市科技器材厂 2 1 倒置荧光显微镜：n i k o n 公司 三、实验方法 ( 一) 模板质粒p 1 1 1 与p 1 1 7 的转化，小量制备、鉴定与保藏 l o 温州医学院硕士学位论文 1 主要试剂的配制 1 1 l b 液体培养基 称取下列试剂，置于1 l 烧杯中。 胰蛋白胨1 0 9 酵母抽提物5 9 n a c l 1 0 9 加去离子水8 0 0 m l ，并加热搅拌至完全溶解，滴加5 nn a o h 调至p h 7 0 ，补加去 离子水将培养基定容至1 0 0 0 m l 。高温高压灭菌后，4 。c 保存。 1 2 l b a m p 固体培养基 称取下列试剂，置于l l 烧杯中。 胰蛋白胨1 0 9 酵母抽提物5 9 n a c l 1 0 9 加去离子水8 0 0 m l ，并加热搅拌至完全溶解，滴加5 nn a o h 调至p h 7 0 ，补加去 离子水将培养基定容至1 0 0 0 m l 后，加入1 5 9 a g a r 。高温高压灭菌后，冷却至6 0 左右。加入l m la m p ! c i l l i n ( 1 0 0 m g m 1 ) 后混匀，铺制平板，4 c 避光保存。 1 3 s o c 培养基 ( 1 ) 配制2 5 0 m mk c l 溶液。在9 0 m l 的去离子水中溶解1 8 6 9k c l 后，定容至1 0 0 m l 。 ( 2 ) 配制2 mm g c l 2 溶液。在9 0 m l 的去离子水中溶解1 9 9m g c l 2 后，定容至1 0 0 m l ， 高温高压灭菌。 ( 3 ) 配制1 m 葡萄糖溶液。将1 8 9 葡萄糖溶于9 0 m l 去离子水中，充分溶解后定容 至1 0 0 m l ，用0 2 2 9 m 滤膜过滤除菌。 ( 4 ) 取下列试剂，置于1 l 烧杯中。 胰蛋白胨2 0 酵母抽提物5 9 n a c l 0 5 9 温州医学院硕士学位论文 加入8 0 0 m l 的去离子水，充分搅拌溶解。量取1 0 m l2 5 0 m mk c l 溶液，加入到烧 杯中。滴加5 nn a o h 调至p h 7 0 ，补加去离子水定容至l l ，高温高压灭菌后， 保存。 ( 5 ) 使用前加入5 m l 灭菌的2 mm g c l 2 溶液，2 0 m l l m 葡萄糖溶液。 1 4 菌种保存液 取2 0 m 1 1 0 0 甘油置于5 0 r a l 蓝盖瓶中，向瓶中加入等体积的去离子水，混匀， 高温高压灭菌后室温保存。用时按照1 ：1 的量加入菌液中即可。 1 5 电泳缓冲液 5 0 x t a e ( p h 8 5 ) ：取2 4 2 9 t f i s 、3 7 2 9 n a 2 e d t a 2 h 2 0 置于1 l 烧杯中，向其中 加入8 0 0 m l 去离子水充分搅拌溶解后，加入5 7 1 m l 醋酸，充分溶解，取离子水 定容至1 l ，并用5 nn a o h 调至p h 为8 3 ，室温保存，使用时稀释5 0 倍。 2 质粒p l l l 与p 1 1 7 的转化 2 1 样本质粒p l l l 与p 1 1 7 的洗脱与收集：样本质粒p l l l 与p 1 1 7 是通过点在滤 纸上寄送过来的( 将含有约0 2 5 u g 的质粒溶液点在滤纸上标记的小圆圈内) ，拿 到样品质粒后首先分别将标记的小圆圈从滤纸上剪下来，尽量捣碎，置于1 5 灭 菌e p 管内，用5 0 u l 无菌去离子水浸泡悬浮后置离心机中1 0 0 0 0 9 离心1 分钟， 将上清转移至另一支准备好的灭菌e p 管，做好标记，置2 0 c 冰箱中保藏，留作 转化用。 2 2 转化：将上述洗拖得到的质粒p 1 1 1 与p 1 1 7 溶液各取5 u l ，分别转化j m l 0 9 感受态细胞，操作方法如下： 从8 0 。c 冰箱中取出感受态细胞置于冰浴中融化。 分别移取1 0 0 u l 的感受态细至两个灭菌处理过的e p 管内。 分别加入( 1 ) 中得到样品质粒p l l l 与p 1 1 7 洗脱液各5 u l ( 约1 0 n g ) 。 冰浴中放置3 0 分钟。 4 2 c 放置4 5 - - 一6 0 秒。 冰浴中放置2 3 分钟。 加入3 7 c 预温好的s o c 培养基，使终体积为l m l 。 3 7 c 振荡培养1 小时( 1 6 0 - - 2 2 5 r p m ) 。 1 2 温州医学院硕士学位论文 取适量涂布琼脂l b a m p 平板培养基。 3 7 c 过夜培养后，将长出菌落克隆的平板用封口膜密封后置4 。c 暂时保藏待 用。 2 3 质粒p l l l 与p 1 1 7 的小量制备、鉴定与保藏 ( 1 ) 菌种的培养 从1 2 中得到的新鲜转化出来的质粒p l l l 与p 1 1 7 的菌落平板上分别挑取单克隆 接种至5 m ll b a m p 液体培养基中，充分振荡( 2 2 5 r p m ) 3 7 。c 过夜培养。 ( 2 ) 菌种保种 在超净工作台上，打开细菌培养管，分别吸取7 0 0 u l 菌液至两支灭菌的冻存管， 然后向其中添加等体积的甘油保种液，混匀，封口膜封口，对应标记为j m l 0 9 p l l l 和j m l 0 9 p l1 7 ，置一2 0 。c 冰箱保存。 ( 3 ) 质粒提取 使用小量质粒抽提试剂盒抽提，试剂盒组分如下： 组分体积 溶液i ( 悬浮液) 溶液i i ( 裂解液) 溶液i i i ( 结合液) 溶液i v ( 洗涤液) 溶液v ( 洗脱液) 小量质粒纯化柱 废液收集管 5 5 m l 5 5 m l 8 0 m l 1 0 0 m l 1 2 m l 2 0 0 个 2 0 0 个 具体操作如下： 取过夜菌1 5 m l ，5 0 0 0 9 离心1 分钟收集菌沉淀，弃上清。再重复一次，每管 共收集3 m l 。 每管中加入2 5 0 u l 溶液i ，重悬细菌沉淀。确保沉淀完全散开，无可见细菌 团块。 温州医学院硕士学位论文 每管加入2 5 0 u l 溶液i i ，轻轻颠倒离心管4 - - 6 次，使细菌完全裂解，溶液透 明。 每管加入3 5 0 u l 溶液i i i ，随即颠倒离心管4 - - 6 次，可见白色絮状物产生。 1 6 0 0 0 9 室温离心l o 分钟。 将上一步离心后的上清吸入到质粒纯化柱内。1 6 0 0 0 9 离心1 分钟，倒弃收集 管内液体。 在质粒纯化柱内加入7 5 0 u l 溶液i v ，1 6 0 0 0 9 离心1 分钟，洗去杂质，倒弃收 集管内液体。 最高速再离心1 分钟，除去残留液体并使痕量乙醇完全挥发。 将质粒纯化柱置于1 5 m l 离心管上，加入5 0 u l 溶液v 至管内柱面上，放置1 分钟。 1 6 0 0 0 9 离心1 分钟，所得液体即为高纯度质粒。 ( 4 ) 质粒p i l l 与p 1 1 7 电泳及浓度测定 对所提取的质粒p l l l 与p 1 1 7 各取2 u l 在1 琼脂糖凝胶下电泳检测，并用分光 光度计测定浓度。 ( 5 ) 质粒p i l l 与p 1 1 7 酶切鉴定 取l u g 质粒p i l l 与p 1 1 7 分别用限制性内切酶n c o i 酶切，按照如下反应体系进 行： 组分用量 质粒p l l1 或p 1 1 7 双蒸水 1 0 n e bb u f f e r n c oi 总体积 2 9 l ( 约o 8 9 9 ) 1 5 5 9 l 2 9 l o 5 弘l ( 1 u ) 2 0 9 l 把b u f f e r 和水等充分混匀后再加入内切酶，加入内切酶后轻轻v o r t e x 混匀。3 7 孵育1 小时。 1 4 温州医学院硕士学位论文 反应结束后，6 5 孵育l o 分钟，使多余酶失活，取5 p l 在1 琼脂糖凝胶电泳检 测。 o 质粒p l ll 与p 1 1 7 的p c r 定点诱变 1 6 ，1 7 】 1 突变位点的分析与设计 使用生物信息学软件b i o e d i t o r 以及n e b c u t t e r 对p l l l 与p 1 1 7 进行全序列分析， 寻找能在e g f p 基因上造成一个未成熟的终止密码子的可能位点，需满足以下条 件：1 ) 该位点位置合适，能完全终止e g f p 的表达；2 ) 突变后的位点可方便的 鉴定( 最好产生或消除一个特异性的限制性内切酶位点，以方便的使用酶切电泳 鉴定) ；3 ) 突变后的序列与原质粒进行配对产生的应为t - g 或g g 错配。 2 引物的设计与合成 确定突变位点后，用定点诱变引物在线设计工具p r i m e r x 设计一对诱变引物，将 突变位点设计在5 端。 引物合成选择宝生物工程有限公司，引物合成级别为h p l c 纯度，5 端磷酸化。 3 p c r 反应 按照下表次序依次向一支0 2 m l 的e p p e n d o r f p c r 管中加入如下组分： 组分用量 d d h 2 0 l o p f up o lb u f f e r d n t p s ( 2 5 m me a c h ) p l l l 或p 1 1 7 ( 1 0 0 n g i t 1 ) p 1 ( 5 u m ) p 2 ( 5 u m ) p f up o l ( 2 5 u u 1 ) 总体积 p c r 反应程序设置如下： 洲 州 叫 哪 叫 州 ，l，l 温州医学院硕士学位论文 步骤循环数温度时间说明 l19 5 1 分钟预变性 9 5 4 5 秒变性 21 8 5 5 1 分钟退火 6 8 1 0 分钟延伸 3 17 2 1 2 分钟延伸、补全 414 存放 暂时存放 从p c r 管取1 0 9 l 在1 琼脂糖凝胶上电泳检测。 4 , d p n i 消化 1 8 ，1 9 】 在电泳检测确认后p c r 的反应体系中加入l 山d p n i ，混匀后3 7 。c 孵育1 小时。 p c r 定点诱变产物的转化、克隆的鉴定 1 p c r 定点诱变产物的转化 1 1 对d p n i 消化后的p c r 定点诱变产物进行浓缩纯化，使用碧云天p c r d n a 纯化试剂盒，其组分如下： 组分数量 溶液i ( d n a 纯化结合液) 溶液i i ( 洗涤液) 溶液i i i ( 洗脱液) d n a 纯化柱 废液收集管 2 0 m l 6 5 m l 3 m l 5 0 个 5 0 个 按照试剂盒使用说明，具体操作如下： 1 ) 加入等体积的溶液i ( 约1 0 0 1 上1 ) ，混匀。 2 ) 加入到d n a 纯化柱内，室温放置1 分钟。 1 6 温州医学院硕士学位论文 3 ) 最高速( 1 6 0 0 0 9 ) 离心1 分钟，倒弃收集管内的液体。 4 ) 在d n a 纯化柱内加入7 0 0 i _ t l 的溶液i i ，室温放置1 分钟。 5 ) 最高速离心1 分钟，洗去杂质。倒弃收集管内的液体。 6 ) 再加入5 0 0 i t l 的溶液i i ，最高速离心1 分钟，进一步洗去杂质。倒弃收集管 内的液体。 7 ) 最高速再离心1 分钟，除去残留液体并让残留的乙醇充分挥发。 8 ) 将d n a 纯化柱置于1 5 m l 离心管上，加入3 0 a l 溶液i i i 至管内柱面上，放置5 分钟。 9 ) 最高速离心1 分钟，所得液体即为高纯度的d n a 。 1 2 转化：浓缩纯化的的突变产物直接用于转化，向每1 0 0 9 lj m l 0 9 感受态细胞中 加入5 “l 经过浓缩纯化的的突变产物。操作方法同1 2 ，并把转化后的菌液全部 涂布到含有a m p 的l b 平板上，过夜培养。 2 转化克隆株的鉴定 2 1 酶切鉴定 先挑取若干克隆分别接种培养小量提取质粒，然后分别按照以下反应体系用n c o i 和b f a i 酶切鉴定： 组分用量 待鉴定克隆提取质粒 双蒸水 1 0 n e bb u f f e r n c oi 总体积 2 9 l ( 约o 8 9 9 ) 1 5 5 u l 2 9 l 0 5 “l ( 1 u ) 2 0 i t l 把b u f f e r 和水等充分混匀后再加入内切酶，加入内切酶后轻轻v o r t e x 混匀。3 7 孵育1 小时。 反应结束后，6 5 c 孵育1 0 分钟，使多余酶失活，取5 p l 在1 琼脂糖凝胶电泳检 测。 1 7 温州医学院硕士学位论文 组分用量 待鉴定克隆提取质粒 双蒸水 1 0 n e bb u f f e r b f ai 总体积 2 1 x l ( 约0 8 p g ) 1 5 5 1 1 1 2 1 x l o 5 1 x l ( 1 u ) 2 0 1 x l 把b u f f e r 和水等充分混匀后再加入内切酶，加入内切酶后轻轻v o r t e x 混匀、3 7 孵育l 小时。 反应结束后，6 54 c 孵育l o 分钟，使多余酶失活，取5 1 x l 在1 琼脂糖凝胶电泳检 测。 2 2 测序鉴定 选取2 , - - , 3 株经酶切初步鉴定为潜在的成功突变克隆，将用其提取的质粒纯化后 对其突变相关区域进行测序。 2 3 效果鉴定 取质粒p l l l 、p 1 1 7 、筛选出来的成功突变质粒p 1 8 8 、p 1 8 9 各3 u g 分别与l u g 红 色荧光蛋白表达质粒p d s r e d l - n 1 共转染h c t l l 6 细胞，观察其e g f p 表达效果。 温州医学院硕士学位论文 结果 ( 一) 质粒p 1 1 1 与p l l 7 的转化，小量制各、鉴定与保藏 转化结果 样本质粒p 1 1 1 与p 1 1 7 成功转化j m l 0 9 感受态细胞得到j m l o g p 1 1 1 和 j m l 0 9 p 1 1 7 菌株克隆，结果见图1 - 1 ： 口团囝 a p b 口1 麓豸湍。氅m 1 0 9 舶茼对月 2 小量制各结果 对小量制各的质粒p 1 1 1 和p l l 7 电泳检测结果如图l 一2 圈1 2 质粘小虽挺趣i u 泳蚺祭 1 p 1 1 12d 仃 温州医学院硕士学位论文 3 酶切鉴定结果 用限制性内切酶n e o i 酶切鉴定p l l l 和p 1 1 7 理论上p i l l 应产生3 3 k b 、1 0 k b 和3 1 7 b p 大小的三条带，p 1 1 7 应产生3 3 k b 和 1 3 k b 大小的两条带。 结果与预期一致，见图1 - 3 。 - - 33 k b 3 1 7 b l - - 卧辛善镟蕊躺黼兰鬻。 2p 1 17 经o l 目瑚后的电泳结果 质粒p l l l 与p 1 1 7 的p c r 定点诱变 】突变位点预测设计结果 在e g f p 基因的第5 8 个三联密码予处，即t g g ，为最佳诱变位点，可突变为t a g ， 对诱变后的序列分析，可发现在此处正好产生一个b f a l 酶切位点。因此，可用 柬初步酶切鉴定诱变后克隆株。 2 引物设计结果 通过p r i m e r x 精确分析，最为合适的一对引物为： e g f p z i ：t a g g g c a c g g g c a g c t t g c c e g f p z 2 ：g c c c a c c c t c g t g a c c a c c 3p c r 扩增结果 p c r 反应后，全部出现扩增产物，切与m a r k e r 对照，产物条带大小在预期大小 位置，即45 k b ，见图l4 。 温州医学院硕1 。学位论文 。枞。悬翟襞糕娄戮泐。扩增抛 需舅毒基巴墨鎏警板、5 g 5 9 。1 和5 6 5 p 吐为引物的扩增产物， p c r 定点诱变产物的转化、克隆的鉴定 1 转化结果 p c r 定点诱变产物在经d p n l 消化和纯化后，用于转化j m l 0 9 感受态细胞 转化结果见图i 5 。 n 国口 婴耆? 篇灏黝篙粟 bp t l l 盼诱韭产物转化j m l 0 9 c 空自对雕9 2 - 一宿主菌j m l 0 9 p l l 7 的诱变产物转化j m l 0 9 后，选择平板上长出密度均匀的申克隆；p 1 1 1 的诱 变产物转化j m l 0 9 后，选择平板上也长出大量的单克隆；空白对照组，宿主苗 直接涂布平板无菌落克隆皓出。 温州医学院硕士学位论文 2 鉴定结果 2 1 酶切鉴定 对转化出来的克隆逐个挑取培养小量提取质粒，然后用n c o l 节酶