蒙药吉日很阿嘎如-8中多糖提取及抗氧化性研究.doc

蒙药吉日很阿嘎如-8中多糖提取及抗氧化性研究 作者：乌兰格日乐 白海泉 赵玉英 张文韬【摘要】 目的从吉日很阿嘎如-8中提取，精制多糖；并研究其抗氧化性能。 方法吉日很阿嘎如-8经热水抽提，Sevag法脱蛋白，乙醇沉淀，再通过透析得白色粉末状精制多糖。并采用比色法测定其对OH和O-2的清除能力，并用甘露醇进行比较。羟基自由基(OH)由Fenton体系产生，超氧阴离子自由基(O-2) 由邻苯三酚自氧化体系产生。结果吉日很阿嘎如-8多糖对OH和O-2具有一定的清除能力，其达到50%清除率所需药物浓度EC50分别为0.81，2.80 mg/ml。同样条件下甘露醇达到50 %清除率所需药物浓度EC50分别为2.65，2.64 mg/ml。结论吉日很阿嘎如-8多糖能有效清除OH和O-2 ，其清除能力较甘露醇强，并且浓度与清除率呈正相关。 【关键词】 蒙药 多糖 提取 抗氧化Abstract:ObjectiveTo study the extraction, purification and antioxidant effect of polysaccharides from Jirihen Agaru-8. MethodsJirihen Agaru-8 polysaccharide was extracted with water. The herb was deproteined, ethanol precipitated, and purified with dialyses method. Its antioxidant effect was tested by the colorimeter and compared with Nectar. Hydroxyl (OH) was produced by Fenton reaction and super oxide radical (O-2) was produced by the oxidation of pyrogallol.ResultsPolysaccharides of Jirihen Agaru-8 had strong scavenging effect for OH and O-2. The amounts of scavenging 50 % (EC50) OH and O-2 was 0.81 mg/ml and 2.80 mg/ml. But the amount of scavenging 50 % (EC50) OH and O-2 was 2.65 mg/ml and 2.64 mg/ml of Nectar. ConclusionJirihen Agaru-8 polysaccharides has an action to scavenging OH和O-2. Its activities is strong to Nectar, and presents positive correlationship with the amounts.Key words:Mongolian medicine; Polysaccharides; Extraction; Antioxidant 在生命活动的氧化代谢过程中不断产生各种自由基，其中羟基自由基(OH)和超氧阴离子自由基(O-2)是具有代表性的自由基，超氧阴离子自由基的产生最早，OH的作用最强。自由基的产生与机体的许多障碍和疾病的发生如吞噬、炎症、肿瘤、衰老、辐射、机体损伤等有密切关系。氧化代谢过程中自由基一旦产生，便会呈几何级数增长，加入自由基清除剂后才会减少或消失1。多糖是一类具有高活性的生命大分子物质，它在抗肿瘤、抗凝血、抗炎症、刺激免疫以及降血糖方面都有一定的作用。关于蒙药多糖的研究已有报道2，吉日很阿嘎如-8是蒙医临床上用于治疗心烦失眠、神气不宁、心脏损伤、心区疼痛等病症。本文对其多糖的抗氧化性-清除氧自由基的性能进行了研究，为开发天然的抗氧化新药提供理论依据。1 材料1.1 仪器旋转蒸发器RE52CS( 上海亚荣生化仪器厂)； 721型紫外分光光度计(上海第三分析仪器厂)；PHS-3B型酸度计(上海雷磁仪器厂)；7007上皿 电子天平( 上海天平仪器厂 )；红外Pekin-elmer783红外光谱仪（Pekin-elmer公司）；UV-240型分光光度计（日本岛津）；透析袋（36DM，上海进口分装）。1.2 试剂藩红花红T（生化试剂，Sigma公司）；氯化硝基四氮唑兰NBT(生化试剂，Sigma公司)；乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)；硫酸亚铁铵、邻苯三酚、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、甘露醇等均为国产分析纯。吉日很阿嘎如-8由内蒙古蒙药股份有限公司生产,批号为040204 278；实验用水为二次蒸馏水。2 方法2.1 多糖的提取及精制精确称取吉日很阿嘎如-8 (药末) 30.0 g, 放入蒸馏烧瓶中，用三氯甲烷、丙酮分别抽提除去色素，加双蒸馏水机械搅拌恒温加热，温度控制在80左右，提取3 h，共提取3次，合并提取液，用旋转蒸发仪减压浓缩至50 ml，加入浓缩液体积3倍的乙醇沉淀，静置24 h，抽滤，用无水乙醇洗3次后，再用丙酮、乙醚分别洗3次。加蒸馏水溶解，溶液经sevag法除去游离蛋白质。溶液浓缩，加入95%的乙醇，醇析，静置过夜，减压抽滤，用无水乙醇洗3次后，再用丙酮、乙醚分别洗3次得吉日很阿嘎如-8粗多糖，置于干燥器中干燥。将粗品溶解、透析、减压浓缩、醇沉、洗涤、真空干燥得精制多糖。2.2 水溶性多糖的组分分析按文献2的方法将多糖用硫酸水解、还原、乙酰化后用气相色谱进行分析。结果吉日很阿嘎如-8多糖主要由阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖组成,其摩尔比1.000.763.612.885.00。2.3 糖含量测定苯酚-硫酸法测定多糖含量，以葡萄糖为标样。标准曲线回归方程为A=4.580 86C-0.034 68(r=0.999 2),其中A代表吸光度，C代表摩尔浓度（单位为g/ml）。加样测平均回收率为99.5%，RSD=0.95。2.4 抗氧化实验方法2.4.1 清除羟自由基的实验方法OH由EDTA-Na-Fe(II)-H2O2 (Fenton) 体系产生，由于OH可特异地使藩红花红T褪色，根据褪色程度用比色法来衡量OH的含量1。反应体系在PH为7.4的磷酸缓冲液溶液中进行，藩红花红T(520 g/ml) 0.2 ml, 2 mmol的EDTA-2Na-Fe(II) 0.7 ml，不同浓度的供试液1.0 ml，6 %的H2O2 0.4 ml，混合均匀后于37水浴保温30 min，然后于波长520 nm处，用分光光度计测吸光度A值。空白组以重蒸水代替供试液。每个浓度组平行测定5次，求其平均值。实验结果以清除率E%表示，EC50表示达到50%清除率时体系中的药物浓度。按 E%=(A样品-A空白)/A样品100 % 公式进行计算。2.4.2 清除超氧阴离子自由基的实验方法邻苯三酚在碱性条件下易氧化产生超氧阴离子自由基，超氧阴离子自由基与NBT作用形成紫色化合物4，在波长为530 nm处测定吸光度A值，A值反映O-2的含量。加入不同浓度供试液，测定样品对吸光度A值的影响。取0.1 mol/L pH为8.2的Tris-HCl缓冲液2.5 ml于试管中，置25 水浴中预热20 min，加不同浓度样液0.2 ml，0.98 mmol/L的NBT 0.6 ml，10 mmol/L的邻苯三酚0.3 ml，混合均匀后在25 水浴中反应4 min,立即用8 mol/L的0.1 ml HCl终止反应，并在波长为530 nm处测定吸光度A值。空白管用重蒸水代替样品。测定结果以清除率E%=(A空白-A样品)/A空白100 % 表示。3 结果与讨论3.1 多糖的含量经苯酚-硫酸法测定吉日很阿嘎如-8中多糖的含量为76.0 %。3.2 多糖的组成见表1。表1 吉如很阿嘎如-8多糖的单糖组成及其含量（略）3.3 抗氧化活性吉日很阿嘎如-8多糖对OH的清除作用（见表2） 吉日很阿嘎如-8多糖对O-2 的清除作用（见表3）由表2和表3可见，吉日很阿嘎如-8多糖对OH和O-2清除能力较对照品甘露醇强。吉日很阿嘎如-8多糖达到50%清除率所需药物浓度EC50分别为0.81，2.80 mg/ml，同样条件下对照品甘露醇达到50%清除率所需药物浓度EC50分别为2.65 mg/ml和2.64 mg/ml。表2 吉日很阿嘎如-8多糖对OH的清除作用（略）表3 吉日很阿嘎如-8多糖对 O-2的清除作用（略）4 讨论 通过苯酚-硫酸法测定吉日很阿嘎如-8中多糖的含量和GC法测定的多糖含量误差较小。这进一步说明了苯酚-硫酸法对于测定蒙药中多糖的含