（化学专业论文）基于原子力显微术的小分子配合物对dna断裂的研究.pdf

学位论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我在导师的指导下，独立进行的研 究工作及取得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论 文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡 献的个人和集体，均已在文中作了明确说明并表示谢意。本声明的法律责任 有本人承担。 作者签名幽 作者签名蔓型丝孟 学位论文授权使用声明 本人完全了解内蒙古大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保 留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版，有 权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查 阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索，有权将学位论文的标 题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。 学位论文作者签名逖圭 日期 旌! l 。坚 导师签名狒习 基于原子力显微术的小分子配合物对。n a 断竺塑 摘要 化学小分子与生物大分子的相互作用，尤其是在生理条件下断裂核酸的人 工核酸断裂试剂的研究，在d n a 序列测定、染色体分析、基因治疗以及d n a 重组方面有广泛用途。因此进行人工合成核酸定位切断试剂及对d n a 的断裂 机理研究具有重要的理论意义和应用价值。 本文合成了2 吡啶、2 吡啶氨基甲烷为配体的锰配合物，以卟啉为配体的 镝配合物，并用x 单晶衍射、氢核磁( 1 h n m r ) 、红外( 取) 光谱等进行了表征。 通过原子力显微镜研究了合成的金属配合物与d n a 之间的相互作用，发现在 中性缓冲溶液中，近生理条件下，所合成的锰、镝配合物在h 2 0 2 存在下能够 很好的断裂d n a ，而且锰配合物可以特异的选择断裂d n a ，有可能成为种 很好的人工核酸断裂试剂。 实验发现了新的d n a 断裂系统：姜黄素与重铬酸钾在过氧化氢的存在下 高效的断裂d n a 双链，在这个系统中，姜黄素可以有效的促进d n a 的断裂。 我们还进行了以寡聚脱氧核苷酸为识别单元的寡聚脱氧核苷酸铈 ( i v ) ( o d n c e 4 + ) 的合成，并考察了其与d n a 的作用，结果证实所合成的定位 断裂剂o d n c e ”配合物，在生理条件下可对d n a ( p b r 3 2 2 ) 定位切断，该 试剂对其靶向d n a 的定位切断为下一步的实验打下了基础。 关键词：原子力显微镜，d n a ，定点断裂，小分子配合物，水解 r e s e a r c h o nd n ac l e a 、7 ：f g ei ns m a l l m o l e c u l e c o m p l e x e sb ya t o m l cf o r c em i c r o s c o p y a b s t r a c t t h ei n t e r a c t i o no fc h e m i c a lm o l e c u l e sa n db i o m a c r o m o l e c u l e s ，e s p e c i a l l yt h e s t u d yo fa r t i f i c i a ln u c l e a s ef o rs i t e s p e c i f i cc l e a v a g eo fd n a u n d e rp h y s i o l o g i c a l c o n d i t i o n s ，h a v em a n ya p p l i c a t i o ns u c h a si nd n a s e q u e n c ed e t e r m i n a t i o n ， c h r o m o s o m ea n a l y s e ，g e n et h e r a p e u t i c sa n dr e c o m b i n a n td n am a n i p u l a t i o n t h e r e f o r er e s e a r c ho ns y n t h e t i cn u c l e i ca c i dr e a g e n t sa n dm e c h a n i s mo fd n a c l e a v a g eh a v ei m p o r t a n t t h e o r e t i c a ls i g n i f i c a n c ea n da p p l i c a t i o nv a l u e i nt h ew o r k ，m e t a lm a n g a n e s e ( m n ) c o m p l e x e so fw i t h ( 2 - p y r i d y l ) b i s ( 2 - p y r i d y l a m i n o ) m e t h a n el i g a n d s a n dd y s p r o s i u m ( d y ) c o m p l e x e so fw i t h m e s o t e t r a ( 4 - 2 h y d r o x y l p h e n y l ) p o r p h y r i nl i g a n d s h a v e b e e ns y n t h e s i z e da n d c h a r a c t e r i z e dw i t hx d i f f r a c t i o n ，h y d r o g e nn u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a n c e ( 1h 一v r r ) ， i n f r a r e d ( i r ) s p e c t r a t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nm e t a lc o m p l e x e sa n dd n a h a v e b e e ns t u d i e db ya f m t h er e s u l t ss h o w e dm na n dd yc o m p l e x e s ec o u l dc l e a v c e f f e c t i v e l yd n a i nt h ep r e s e n c eo fh 2 0 2i nt h en e u t r a lb u f f e rs o l u t i o nu n d e rn e a r p h y s i o l o g i c a lc o n d i t i o n sa n dt e m p e r a t u r e ，i ti sw o r t h yo f n o t i c et h a tm nc o m p l e x s l l c o u l ds i t e s p e e i f i ec l e a v a g ed n a ，w h i c hw o u l db eag o o da r t i f i c i a ls i t e - s p e c i f i c n u c l e i ca c i dr e a g e n t w eh a v ef o u n dan e wd n ac l e a v a g es y s t e m ，c u r c u m i na n dp o t a s s i u m d i c h r o m a t ec o u l ds t r o n g l yc l e a v a g ed n ai nt h ep r e s e n c eo fh y d r o g e np e r o x i d e ( h 2 0 2 ) i nt h i ss y s t e m ，t h ec u r c u m i nc a ne f f e c t i v e l yp r o m o t ed n af r a g m e n t a t i o n o d n c e r i u mc o m p l e xw a ss y n t h e s i z e da n dw o r k e d a st h ea r t i f i c i a l s i t e s p e c i f cn u c l e a s e ，t h es e q u e n c e - s p c i f i ce l e a v a g eo fp b r 3 2 2d n aw a ss t u d i e d b yo d nc o m p l e xu n d e rp h y s i o l o g i c a lc o n d i t i o n s i tl a i dt h ef o u n d a t i o nf o rt h e n e x ts t e pw o r k k e y w o r d s ：a t o m i cf o r c em i c r o s c o p ( a f m ) ，d n a ，s i t e s p e c i f i cc l e a v a g e ， s m a l l m o l e c u l ec o m p l e x e s ，h y d r o l y s i s i i i 翌! ! ：! 堕墼：查差硒；生业论玄：竺：2 竺：= ! 竺：班；呈业匠x 目录 第一章前言1 1 1 引言1 1 2d n a 的组成和结构l 1 2 1d n a 的组成l 1 2 2d n a 的结构2 1 3d n a 的断裂4 1 3 1d n a 切割试剂研究的意义4 1 3 2d n a 切割试剂断裂方式5 1 3 2 1 氧化性断裂5 1 3 2 2 水解性断裂6 1 4 原子力显微镜( a f m ) 介绍7 1 4 1 原子力显微镜工作原理7 1 4 2 原子力显微镜在生物分子研究方面的应用8 1 5 选题依据9 参考文献10 第二章a f m 观测d n a 样品的制备1 3 2 1 引言。l3 2 2 实验试剂及仪器1 4 2 3实验过程1 4 2 - 3 1加入阳、阴离子表面活性剂1 4 2 3 2 镁离子修饰云母片1 4 2 3 3 溶液中加入氯化镁溶液1 4 2 3 4d n a 溶液程序升温1 4 2 3 5d n a 吸附完成后冲洗云母片表面条件的优化1 4 2 4 实验结果与分析1 5 2 5 小结。2 0 第三章姜黄素与重铬酸钾对d n a 的断裂作用2 l 3 1 引言2l 3 2 实验试剂及仪器2 2 3 3 实验过程2 3 3 3 1 姜黄素与重铬酸钾对d n a 的作用2 3 3 3 2 姜黄素与重铬酸钾对d n a 作用的机理研究2 3 3 3 3 样品的a f m 观测2 3 3 4 实验结果与分析2 3 3 4 1 姜黄素与重铬酸钾对d n a 的作用2 3 3 4 2 姜黄素与重铬酸钾对d n a 作用的机理研究2 4 3 5 小结2 6 鲎竺兰建墼：竖亟坚业y - v 塞 蝴叫- “黼口哪一r ! # v 矿v 参考文献2 7 第四章单核锰配合物对d n a 的选择性断裂2 9 4 1 引言2 9 4 2 实验试剂及仪器3l 4 3 实验过程3l 4 3 1多吡啶锰配合物的合成及表征3 l 4 3 1 1 多吡啶锰配合物的合成3 1 4 3 1 2 多吡啶锰配合物的表征3 l 4 3 2 多吡啶锰配合物与d n a 作用的a f m 研究3l 4 3 2 1 多吡啶锰配合物对d n a 的切断反应一3 l 4 3 2 2 不同浓度多吡啶锰配合物与d n a 的作用3 2 4 3 2 3 多吡啶锰配合物与d n a 的作用不同时间3 2 4 3 3d n a 的a f m 样品制备3 2 4 4 结果与讨论3 2 4 4 1 锰配合物的表征3 2 4 4 2 多吡啶锰配合物与d n a 反应的a f m 表征3 4 4 4 2 1 不同浓度多吡啶锰配合物与d n a 反应3 5 4 4 2 2 多吡啶锰配合物与d n a 反应不同时间3 6 4 5 小结3 7 参考文献3 8 第五章稀土离子对d n a 型态影响的初探3 9 5 1 引言。3 9 5 2 实验试剂及仪器3 9 5 3 实验过程4 0 5 3 1p b r 3 2 2d n a 与c e c l 3 溶液作用4 0 5 3 2p b r 3 2 2d n a 的a f m 样品制备4 0 5 4 实验结果与分析4 0 5 4 1 不同浓度c e c l 3 溶液对d n a 型态的影响4 0 5 4 2c e c l 3 与m g c l 2 对d n a 型态影响的比较4 1 5 5 小结4 3 参考文献4 4 第六章稀土卟啉d y 对d n a 断裂的研究4 5 6 1 引。言4 5 6 2 实验试剂及仪器4 6 6 3 实验过程4 6 6 3 1m e s o 5 ，1 0 ，1 5 ，2 0 四( 对羟基苯基) 卟啉的合成纯化及表征4 6 6 3 1 1 m e s o 5 ，1 0 ，1 5 ，2 0 四( 对羟基苯基) 卟啉的合成纯化4 6 6 3 1 2m e s o 5 ，1 0 ，1 5 ，2 0 四( 对羟基苯基) 卟啉的表征4 6 6 3 2m e s o 5 ，1 0 ，1 5 ，2 0 四( 对羟基苯基) 卟啉对d n a 作用的a f m 研究4 7 6 3 3d n a 的a f m 样品制备。4 7 6 4 实验结果与讨论4 7 6 4 1m e s o 5 ，1 0 ，1 5 ，2 0 四( 对羟基苯基) 卟啉的表征结果4 7 6 4 2m e s o 5 ，1 0 ，1 5 ，2 0 四( 对羟基苯基) 卟啉镝与d n a 作用的a f m 结果4 9 6 5小 结。5 2 参考文献5 3 一一 皇：! ：! 堕塞茎：查茎 亟生业论文 一竺= 竺：竺：! ： 趔土生些监x 一 第七章o i ) y c e 4 + 对d n a 定位断裂的a f m 研究5 4 7 1 引。言5 4 7 2 实验试剂及仪器5 5 7 3 实验过程5 5 7 3 1o d n 人工断裂系统的合成5 5 7 3 2o d n c e 4 + 对p b r 3 2 2d n a 的断裂5 5 7 3 3o d n - c e 4 + 对p u c l 9 d n a 的断裂5 6 7 3 4d n a 的a f m 观测样品制备5 6 7 4 实验结果与讨论5 6 7 4 1o d n - c e 4 + 对p b r 3 2 2d n a 的断裂。5 6 7 4 2o d n - c e + 对p u c19d n a 的断裂5 7 7 5 小结5 7 参考文献5 8 论文总结及展望5 9 攻读硕士学位期间发表论文情况6 0 致谢6 1 鲎! ! ：! ! 堕墼查茎 殛坚业论文 1 1 引言 第一章前言 从1 8 6 8 年瑞士青年科学家提取出最早的核酸制品核素开始，核酸研究越来越多引起人 们的注意，核酸被证实是遗传的物质基础，是生物遗传信息的存储场所，核酸的生物功能是 以它多变的核苷酸序列和结构来存储生物的全部信息，通过自我复制能将储存的遗传信息稳 定的从一代细胞传至下一代细胞。核酸存储的遗传信息通过转录和翻译产生生物体生命活动 中必需的蛋白质不仅对于生命的延续、生物物种遗传特性的保持、生长发育、细胞分化等起 着重要的作用，而且与生物变异，如肿瘤、遗传病、代谢病等也密切相关。因此核酸是分子 生物学、医学研究中的重要领域。核酸分为脱氧核糖核酸( d n a ) 和核糖核酸( r n a ) 两大类。 其中，脱氧核糖核酸( d n a ) 是生物体中的重要组成部分，是遗传信息的携带者，也是基因表 达的物质基础。它在生物的生长发育和繁殖等生命活动中具有十分重要的作用，因此d n a 是现代生物学和医学研究的重要课题之一。作为分子生物学和基因工程的核心技术，核酸断 裂和基因重组技术引起人们的极大关注。在生物演化的过程中产生了许多天然的水解酶，它 们可以催化水解断裂生物体内的大分子，然而随着生物工程和分子生物学的发展，这类水解 酶在品种和数量上都不能满足要求，而且其制备困难，价格昂贵。因此，探索金属配合物作 为人工限制性内切酶的模拟物成为当前生物无机化学十分活跃的前沿领域之一。 1 2d n a 的组成和结构1 1 1 2 1d n a 的组成 核酸是一种线型多聚核苷酸，核菅酸是核酸的基本组成单位。核苷酸分子由一个磷酸分 子、一个碱基和一个戊糖分子构成。碱基分为两类：嘧啶和嘌呤。嘌呤包括腺嘌呤( a d e n i n e ， a ) 和鸟嘌呤( g u a n i n e ，g ) 两种，嘧啶有胸腺嘧啶( t h y m i n e ，t ) 、胞嘧啶( c y t o s i n e ，c ) 和尿嘧啶 堂! ! ：! ! 望墼：查茎亟：匕肇业论窑 ( u r a c i l ，u ) - - 种，其结构如图1 1 所示，其中a 、g 、t 和c 是构成d n a 的四种碱基结构。 n 0 n h n 0 n h o o 鸟嘌吟( g )腺瞟呤( a )胞嘧啶( c )胸腺嘧啶( t ) 图1 1 构成核糖碱基结构图 f i g 1 1t h es t r u c t u r eo fd n a b a s e s 戊糖分为核糖和脱氧核糖结构如图1 2 所示，戊糖分子上第一位碳原子与嘌呤或嘧啶结 合，就成为核苷。如果戊糖是脱氧核糖，形成的核苷就是脱氧核苷；如果戊糖是核糖，形成 的核营就是核糖核苷。一个核苷或脱氧核营与一个磷酸分子结合，就成为一个核苷酸或脱氧 核昔酸。磷酸与核糖或脱氧核糖结合的部位通常是核糖或脱氧核糖的第3 位和第5 位碳原子。 1 2 2d n a 的结构 膨蹦 o ho h f a j 洲 a h m 图1 2 戊糖的基本结构 f i g u r e1 2t h eb a s i cs t r u c t u r eo fp e n t o s e 磷酸二酯键彼此间连接起来的线型多聚体，以及这四种脱氧核苷酸的排列顺序称为d n a 的一级结构，如图1 3 所示。 2 o h l 6 o _ 一。一 o 【” _ o o 船)d o o 图1 3d n a 的一级结构 f i g 1 3t h ep r i m a r ys t r u c t u r eo fd n a a j 1 0 女。礅 y o - z o 一、 o ， ， 嚼 c h o ，一o o 腿 o ，一 r 簪0 o 。 o 一。 致 酽v 遭：蚰讯 p e盏 终 馨 。产 ”，。 i 。 + 膨“q 吨 f 1 0 b 。 盎 肇k o 尊n - , , 双o 。 ，k 讲、 鼍、。袅 f壤，3 图1 4d n a 的二级结构 f i g 1 4t h es e c o n d a r ys t r u c t u r eo fd n a c ) d n a 的二级结构是指两条脱氧多核苷酸链反向平行盘绕所形成的双螺旋结构。通常情况 下，d n a 的二级结构为两大类：一类是右手螺旋，a d n a 、b d n a 等：另一类是左手螺旋。 ) o ，盯 ， 芬 爱 堂：! ：! 堕童茎：查茎亟土望业论童 如图1 4 所示。 o 丌环形结构 共价刚j = 超蝶旋形结构 图1 5d n a 的高级结构 f i g 1 t h ec o n f i g u r a t i o ns t r u c t u r eo fd n a d n a 的高级结构是在双螺旋结构基础上进一步折叠、扭曲及压缩而成的更紧密的结构。 有几种形式：d n a 超螺旋、负螺旋及回文序列，它们具有各自的生物学功能特征，除了少数 的r n a 病毒外，d n a 几乎是所有生物遗传信息的携带者，它存储着生物体赖以生存和繁衍的 遗传信息，因此维护d n a 分子的完整性对细胞至关紧要。d n a 与生命的异常情况，如肿瘤发 生、放射损伤、遗传性疾病等密切相关，可以说，人类所有的疾病，最终均与d n a 有关。外 界环境和生物体内部的因素都经常会导致d n a 分子的损伤或改变。 1 3d n a 的断裂 1 3 1d n a 切割试剂研究的意义 2 1 世纪将是生命科学的世纪，以基因工程为主导的生物技术在国家的科研实力中占重要 位置。作为分子生物学和基因工程的核心技术，核酸切割和基因重组技术引起人们的极大关 注。对核酸的特定位点断裂和损伤修复也是分子生物学和生物工程首先要解决的问题之一， 但是，在生理条件及非酶存在下，核酸具有很高的稳定性，在p h = 7 和温度为2 5 的环境 中d n a 中磷酸二酯键的半衰期为8 亿年，目前断裂核酸的工具酶主要是7 0 年代发现的限 制性内切酶，但天然酶识别序列短，约为4 8 个碱基，而且一般要求回文结构，所以当限制 性内切酶切割一条较长的核酸链时，这样短的识别序列出现的频率会很高，核酸链将被切成 很多碎片，这些碎片很难被进一步利用，这使得对核酸的进行序列特异性断裂存在很大的局 限性，因此进行人工核酸切断试剂的研究具有重要意义。 首先，对人工核酸切割试剂的切割机理的研究将有助于我们对核酸催化机理进行更为透 4 篁! ! ：! 壁童茎查茎亟生业i 金室 枷侧啪们枷1 。半、i 矿1 矿v 彻的理解，另外人们对金属离子催化核酸水解机理的研究，可以有助于理解金属离子参与核 酸酶催化核酸水解时所起的作用。例如b r e s l o w 等人【2 j 通过研究r n a s e a 的模拟物对r n a 的 切割机理，使人们对r n a s e a 的酶催化机理有了更为深入的认识，其次，人们对金属离子催 化核酸水解机理的研究，可以有助于理解金属离子参与核酸酶催化核酸水解时所起的作用。 另外，定点切割试剂在疾病的基因治疗中尤其是癌症的靶向药物治疗中有着十分重要的应用 【3 】，即定点切割试剂可以专一性地断裂有害的d n a 而不断裂健康细胞d n a ，从而抑制有害 蛋白的合成而达到治疗疾病的目的。 1 3 2d n a 切割试剂断裂方式 目前所报道的人工核酸断裂试剂裂解d n a 的方式主要有两种：氧化性断裂及水解断裂。 1 3 2 1 氧化性断裂 目前绝大部分d n a 化学断裂体系是以氧化还原机理起作用的，通过形成活性氧( 如o h 自由基、0 2 、h 2 0 2 等) 作用于d n a 上，氧化d n a 大沟或小沟中的氢原子，破坏核酸上的核 糖环或碱基，从而导致核酸链的断裂。这些切割试剂都能产生羟基自由基进攻核酸的糖环或 是碱基，夺去氢原子而导致其氧化破坏，进而使核酸链发生断裂。 此类切割试剂主要包括过渡金属配合物和一些抗生素类药物，而且研究集中在f e ，c u , c r 等几种会属上。 e d t a 与f e ( i i ) 形成配合物，促使h 2 0 2 还原生成o h 自由基与d n a 的脱氧核糖作用， 从而导致d n a 链的断裂【4 司。 h i r o m a s ak u r o s a k i l 7 等研究表明f e ( i i ) ( 五齿配体) 在h 2 0 2 存在下能氧化切断d n a ，是 一个自由基氧化机理。s f 柚a 1 1 a s a d 【8 1 等研究表明一些过渡金属元素特别是铜在和一些生物体 内的新陈代谢中间物和前体结合后，如c u ( i i ) 在胆红素胆绿素的作用下被还原成c u ( i ) ，同时 产生活性氧自由基，自由基在同d n a 作用后，将d n a 氧化切断。三核铬配合物 c r o ( 0 2 c c h 3 ) 6 ( h 2 0 ) 3 】在h 2 0 2 存在的条件下，能通过产生的自由基切断d n a 【9 1 。博莱霉素 ( b l e o m y c i n ) 10 1 ，它与f e 2 + 、c 0 2 + 、c u 2 + 、c u 2 + 等离子结合后，由分子氧或h 2 0 2 等活化，在结 合位点断裂d n a 。 许多光活性的物质可以在光照条件下切割d n a ，如铑配合物，卟啉以及金属卟啉、铀 酰盐、双核p p 离子配合物、富勒烯和四苯基卟啉磷化合物等，它们的主要作用机理是在光 照的条件下生成o h 自由基或单线态氧，从而导致d n a 链的断裂【l l 】。 量! ! ：! 堕墼查茎亟生业论堑= ：竺：竺竺：篮占生些垃三兰 这种断裂核酸的方式存在较多的缺点：首先，严重破坏核酸链上碱基和脱氧核糖环，最 终产物往往为3 和5 磷酸末端、游离碱基及其它一些碎片，切割产生的末端不同于酶解产 生的末端，因此不能再用连接酶重新连接；其次，由于这类试剂产生的自由基很容易扩散， 会造成多个位点切割，用这类切割系统的定位切割试剂很难进行真正的定位切割；第三，自 由基对生物活体有毒副作用，无论是用于进行细胞内研究或作为药物都是不利的。最后，此 类切割试剂往往需要氧化还原活性的辅助因子，这将增加体系的复杂性。 1 3 2 2 水解性断裂 核酸中磷酸二酯键的水解也可以导致核酸的断裂，此类切割试剂主要包括一些核酸酶的 模拟物、二胺和多元胺、二肽和多元肽、碱土金属m g 及其配合物、稀土金属离子和配合物 等以及少量的c u 、f e 和c o 的配合物。 1 9 5 9 年b a m 锄【1 2 】等人首先报道了三价稀土离子对磷酸二酯键的水解作用，他们研究了 c e 3 + 和l a 3 + 在碱性条件下对核苷酸的断裂作用，指出c e 3 + 和l a 3 + 对脱氧核苷酸的断裂作用很 慢，c e 3 + 对单核苷酸的水解作用比l a 3 + 快。此后，特别是近十年来，有关稀土离子及配合物 催化水解断裂核酸逐渐成为研究热点。 k o m i y a m a 1 3 ，1 4 1 等人研究了l n 3 + 在p h = 8 ，3 0 的实验条件下对腺苷二倍体( a p a ) 及尿 苷二倍体( u p u ) 的水解断裂作用，指出t m 3 十的断裂活性最高，其它三价离子的水解活性大小 为：t m l u y n d ，e u ，s m c e ，s c ，g d ，n l p r ，d y h o ，e r y b l a 。倪嘉缵【1 5 - 1 8 1 的研究 小组则研究了稀土离子对单核苷酸的断裂作用。m a k o t ok o m i y a m a 1 9 1 等首次合成了以m 9 2 + 为 活性中心的核酸切断试剂，将吖啶修饰到配合物的三亚甲基上后，该配合物的水解能力得到 大大增强。多胺类铜配合物也被报道能够水解切断d n a 磷酸二酯键【2 0 , 2 1 】。 与自由基氧化切割核酸的试剂相比，水解类切割试剂有许多优点：首先，生成的碎片具 有3 或5 磷酸末端，碱基和核糖环不会被破坏，因此可以用连接酶重新连接；其次这类试 剂不产生易扩散的自由基，因此有利于合成高度序列专一性的定位切割试剂；第三，该体系 无需还原性的辅助因子，对生物体的毒害较小。也正鉴于以上这些原因，此类切割试剂，包 括稀土金属离子及其配合物；铁、铜、钴、锌和镁的配合物类试剂可以作为定位切割试剂的 最佳切割系统之一。 但是，到目前为止，此类核酸酶模拟物还存在许多缺陷，首先它的催化活性远低于核酸 酶，其次它多以模型化合物为底物，且反应往往在有机溶剂中进行，所以实际上酶模拟物并 不能完全模拟酶的作用，很难在生理条件下水解断裂d n a ，研究探索高效的水解断裂d n a 6 兰! ! ：! 堕童茎：查茎 亟生些i 金塞 ：竺：= ：= ：竺：竺! ： e 鲤堇：生! 竖出x 一一一一 一一一一 的人工化学核酸断裂试剂己经成为许多课题组多年的研究重剧2 2 。2 4 1 。 1 4 原子力显微镜( a f m ) 介绍 原子力显微镜是具有原子级分辨率的新一代显微镜，在生命科学，尤其在生命的遗传物 质d n a 的精细结构研究中得到了极大的关注。和经典的透射电镜相比，a f m 不受成像环境 的限制、不需要采用重金属喷涂或染色来提高成像反差，并且分辨率高。a f m 与传统的x 射 线衍射、核磁共振、旋光色散等方法相比，具有分辨率高、制样简单以及在保持生物活性条 件下成像等优点( 如表1 1 ) 。 表1 1 扫描探针显微镜( s p m ) 与其他显微镜技术的各项性能指标比较 t a b l e1 1t h ep r o p e r t i e so fs p mc o m p a r e dw i t ht h eo t h e rm i c r o s c o p e s 1 4 1 原子力显微镜工作原理 7 量! ! ：! 堕塞茎：查茎亟生、业论蛮 f ，y t o t y盯w r ! # 、l 矿偾，v a f m 的基本原理是通过控制并检测样品一针尖间的相互作用力来分析研究样品的表面 性质的。它使用一个一端固定而另一端装有针尖的弹性微悬臂来检测样品表面形貌或其它表 面性质。当针尖在样品上进行扫描时，同距离有关的针尖与样品间的相互作用力( 吸引或排 斥力) ，会引起微悬臂的形变，微悬臂的形变可作为样品一针尖相互作用的直接量度。将一束 激光照射到微悬臂的背面，微悬臂将激光束反射到光电检测器，检测器不同象限接收到的激 光强度的差值同微悬臂的形变量形成一定比例关系。如果微悬臂的形变小于0 0 1n l n ，激光束 反射到光电检测器，通过测量检测器电压对应样品扫描位置的变化，从而得到样品表面原子 级的三维立体形貌图像【2 引，图1 6 为原子力显微镜成像示意图。 燎臂 图1 6 原子力显微镜( a f m ) 针尖成像示意图 f i g 1 6t h em o d l eo f a f mi m a g i n g 1 4 2 原子力显微镜在生物分子研究方面的应用 与传统显微技术相比，a f m 具有以下优点：( 1 ) 可达分子级水平的高分辨率，纵向分辨 率能达到纳米级以上水平：( 2 ) 与s e m 和s t m 相比，a f m 样品无需导电，无需用重金属包 裹或制作重金属复制物，图像的分辨率不受金属包裹物大小的限制，制备简单快捷，样品不 易受损；( 3 ) 可根据需要，在空气、真空或各种溶剂体系中直接观测，使得生物样品能在接 近生理环境的条件下直接进行研究，这是其它化学，物理分析方法所无法比拟，众多生物样 品【2 6 。2 9 1 的a f m 图像已经得到。核酸是a f m 应用最为活跃的一个领域，自从l i n d s a y 等人【3 0 】 第一次用a f m 获得d n a 的图像以来，a f m 已经成为研究核酸分子结构的重要工具 3 1 - 3 3 。国 内外学者已经获得了多种条件下的d n a 图像，如：单链、双链、三链d n a p 4 铘j 。c h e m y 观 察了不同浓度盐离子对d n a 形态的影响【3 8 】。g u t h o l d 观察了d n a r n a 聚合酶复合物在水溶 8 堂! ! ：! 堕塞茎：查：茎亟生业i 金奎 m v口岬十毕v r l 矿v 液中的装配过程【3 9 1 。为了得到更好的d n a 图像，a f m 液相成像技术也被研究出来，它的 优点在于消除了毛细作用力，针尖粘滞力，更重要的是可以在接近生理条件下考察d n a 的单分子行为。d n a 分子在缓冲溶液或水溶液中与基底结合不紧密，是液相a f m 面 临的主要困难之一。硅烷化试剂，如3 氨丙基三乙氧基硅烷( a p t e s ) 和阳离子磷脂双层 修饰的云母基底固定d n a 分子，再在缓冲液中利用a f m 成像，可以解决这一难题。 在气相条件下阳离子参与d n a 的沉积已经发展十分成熟，适于a f m 观察。在液相条 件下，a p t e s 修饰的云母基底较常用。目前d n a 的许多构象诸如弯曲、超螺旋、小 环结构、三链螺旋结构、d n a 三通接点构象、d n a 复制和重组的中间体构象、d n a 一 蛋白质复合物结构图像、分子开关结构和药物分子插入到d n a 链中的相互作用都广泛地 被a f m 考察，对此获得了许多新的理解【4 0 4 3 】。 1 5 选题依据 近年来，人工脱氧核糖核酸断裂试剂的开发研究以及与此相关联的金属配合物与d n a 、 r n a 相互作用的研究一直非常活跃。目前，虽然合成了不少d n a 断裂试剂，但是对配合物 切割d n a 的反应机理还存在争议，而且具有高度特异识别和高效断裂切割双重功能的核酸 断裂剂也比较少。 我们期望能发现对d n a 特异性断裂更加高效的人工核酸断裂试剂，自然界许多酶的活 性中心都含有金属离子，我们选择具有催化断裂d n a 活性的金属离子作为研究对象，合成 不同配体的配合物，并且用a f m 考察这些化合物对d n a 的作用，并对其机理进行初步讨论。 计划合成具有定位断裂d n a 作用的o d n c e 4 + 人工核苷酸酶，并对其效果用a f m 观测。 9 参考文献 【1 】隋丽，重离子至d n a 双链断裂的a f m 观测和机理研究，北京，中国原子能科学研究院核物理所， 2 0 0 3 【2 】b r e s l o wr ，b i f u n c t i o n a la c i d b a s ec a t a l y s i sb yi m i d a z o l eg r o u p si ne n z y m em i m i c s 【j 】，m o l e c u l a rc t a l y s i s ， 1 9 9 4 ，9 1 ( 2 ) ：1 6 1 - 1 7 4 【3 c r o o k est a n t i s e n s eo l i g o n u c l e o t i d e s c a n c e rt h e r 1 9 9 7 ，2 9 9 - 3 3 6 4 】i s h i k a w ay ，m o r i s h i t ay ，y a m a m o t ot ，c h e m i s t r yl e t t e r , 1 9 9 8 ，3 9 - 4 0 【5 】b a r b a r ac ec h u ，l e s l i ee o r g e l ，n o n e n z y m a t i cs e q u e n c e s p e c i f i cc l e a v a g eo fs i n g l e 。s t r a n d e dd n a ，【j 】 p r o c n a t l a c a d s c i ，1 9 8 5 ，8 2 ：9 6 3 - 9 6 7 【6 】g e o f f r e yb d r e y e r , p e t e rb d e r v a n ，s e q u e n c e - s p e c i f i cc l e a v a g e o f s i n g l e s t r a n d e d d n a ： o l i g o d e o x y n u c l e o t i d e e d t axf e ( i i ) ，【j 】p r o c n a t l a c a d ，1 9 8 5 ，8 2 ：9 6 8 - 9 7 2 【7 】h i r o m a s ak u r o s a k i ，a o im a r u y a m a , h i r o y u k ik o i k e ，e t c ，d n ac l e a v a g eb yp e n t a d e n t a t ei r o n ( i i ) c o m p l e x e s c o n t a i n i n gf l u o r o - s u b s t i t u t e dp h e n y lg r o u p s ，【j 】b i o o r g a n i c & m e d i c i n a lc h e m i s t r yl e t t e r s ，2 0 0 2 ，1 2 ：2 0 1 - 2 0 3 8 】s f a r h a na s a d ，s a u r a b hs i n g h , a a m i ra h m a d ，e t c ，b i l i r u b i n b i l i v e r d i n - c u ( 1 i ) i n d u c e dd n ab r e a k a g e ； r e a c t i o nm e c h a n i s ma n db i o l o g i c a ls i g n i f i c a n c e ，【j 】t o x i c o l o g yl e t t e r s ，2 0 0 2 ，131 ：181 18 9 9 】m i r o s l a vf o j t a ，l u d 6 kh a w a n ，t a t i a n ak u b i c a r o v