（微生物学专业论文）cytophaga+hutchinsonii中结晶纤维素降解相关基因功能的研究.pdf

摘要 现代经济的发展依赖于化石资源如石油、煤炭、天然气等的开发。而这类资源为 不可再生资源，已面临短缺。可再生资源的开发利用日益引起各国政府的重视。作为 可再生资源的重要组成部分，生物质资源有着其他资源不可替代的优势。纤维素是地 球上含量最为丰富的一类生物质资源。以其为原料生产燃料乙醇被认为是燃料乙醇产 业的重要发展方向之一。但是由于目前纤维素转化效率低、成本高等因素，燃料乙醇 目前和石油依然无法竞争。 哈氏噬纤维菌( c y t o p h a g ah u t c h i n s o n i i ) 是自然界中广泛存在的可彻底降解结晶 纤维素一类好氧细菌。其在降解纤维素方面有着降解彻底，降解速度快等特点。但是 目前的研究表明其降解纤维素的机制与众不同，因此ch u t c h i n s o n i i 被美国能源部列 入其基因组计划，并于2 0 0 5 年完成其4 m b 的全基因组测序工作。本文拟在此基础上 开展相关工作，对纤维素降解相关基因的功能进行初步的探讨，为进一步揭示其纤维 素降解机制打下基础。 本文从g e n b a n k 中获得ch u t c h i n s o n i i 中与结晶纤维素降解相关基因，运用多种 生物信息学软件如t m h m m 、s i n g a l p 、s m a r t 等分析序列的相关信息。通过分析发 现，内切纤维素酶基因的催化结构域集中于g h 9 和g h 5 家族，而p 一葡萄糖苷酶则大 都属于g h 3 家族。其中c h u1 3 3 5 有着特殊的结构。它由一个g h 9 家族催化结构域 和一个推测为d 折叠桶的结构组成。从它的结构上我们推测，这个蛋白可能在膜上形 成一个通道，在纤维素降解中起到重要的作用。同时发现这些内切纤维素酶基因中大 多缺少常见的纤维素结合结构域( c b m ) ，推测其与纤维素结合的方式是特殊的。 本文利用实时荧光定量p c r ( r q p c r ) 技术检测ch u t c h i n s o n i i 在不同培养条 件下各纤维素酶基因的表达差异。通过检测发现，以有机质为培养基，不同碳源( 葡 萄糖和纤维素) 培养情况下，除c h u1 3 3 6 ，其他几个检测的基因差异都不大。而以 无机盐为培养基，不同碳源培养情况下，各基因转录情况相近。结果说明，c h u t c h i n s o n i i 中检测的这几个纤维素降解基因在转录水平上差异不大，可能存在转录 后调控。 本文以自杀质粒p l y l 0 3 为载体，将待敲除基因同源片段通过酶切连接与其连接， 然后将构建好的载体通过e c o b 的接合能力转化入ch u t c h i n s o n i i 中，让其依靠同源 重组将载体插入待敲除基因中，达到中断基因的作用。目前采用多种策略构建好多个 山东大学硕士学位论文 含同源片段的基因敲除质粒。但在将其转化进ch u t c h i n s o n i i 过程中碰到不少困难， 目前已获得一个c h u1 3 3 5 的敲除突变子，对其验证的工作正在进行。基因敲除困难 的主要原因是接合转化的效率太低，考虑到这一点，我们也尝试了电转化的方法。 本文比较了ch u t c h i n s o n i i 在葡萄糖、纤维二糖、微晶纤维素、磷酸膨胀纤维素 为碳源情况下生长和产酶的差异。通过比较发现，在以葡萄糖或纤维二糖为碳源时， ch u t c h i n s o n i i 生长几乎无延迟期，ch u t c h i n s o n i i 胞外基本检测不到酶活，且在碳源 耗尽后，其o d 也会迅速降低，推测是菌体自溶造成的结果。微晶纤维素或磷酸膨胀 纤维素培养情况下，菌体的生长量明显低于可溶性碳源为底物的培养条件，胞外都可 检测到较高的内切纤维素酶活，且磷酸膨胀纤维素条件下的产酶是微晶纤维素的3 倍 左右。研究表明纤维素底物对ch u t c h i n s o n i i 的纤维素酶产生有明显的诱导作用。同 时我们发现ch u t c h i n s o n i i 在以磷酸膨胀纤维素为碳源时胞外可累积还原糖。这是首 次发现该菌生长过程中积累胞外还原糖的现象。 通过这些对c y t o p h a g ah u t c h i n s o n i i 分子、生化方面的初步研究，我们对该茵降解 纤维素的机制有了初步的了解，为进一步揭示其纤维素降解机制奠定了良好基础。 关键词：哈氏噬纤维菌实时定量p c r 基因敲除诱导 山东大学硕士学位论文 a b s t r u c t t h ed e v e l o p m e n to fc u r r e n te c o n o m yd e p e n d so nt h ee x p l o i t a t i o no ff o s s i lr e s o u r c e s s u c ha so i l ，c o a l ，n a t u r a lg a s ，e t c b u tt h e ya r en o n - r e n e w a b l ea n df a c i n gs h o r t a g e i nt h i s s i t u a t i o n , t h ee x p l o i t a t i o no fr e n e w a b l ee n e r g yi sp a i dm o r ea t t e n t i o nt ob yt h eg o v e r n m e n t b i o m a s sr e s o u r c e sw h i c ha r e i m p o r t a n tc o m p o n e n t so fr e n e w a b l er e s o u r c e s h a v e i r r e p l a c e a b l ea d v a n t a g e s c e l l u l o s ei st h em o s ta b u n d a n c eb i o m a s sr e s o u r c eo nt h ee a r t h b i o f u e lp r o d u c t i o nf i o mc e l l u l o s ei st h o u g h tt ob eo n eo ft h es o l u t i o n so ft h es h o r t a g eo f e n e r g y h o w e v e r , b i o f u e li sn o tv e r yc o m p e t i t i v ec o m p a r e dw i t ho i lf o ri t sl o wc o n v e r s i o n e f f i c i e n c ya n dt h eh i g hc o s t c y t o p h a g ah u t c h i n s o n i ii sa na e r o b i cb a c t e r i u mw h i c hc a nd e g r a d ec r y s t a l l i n ec e l l u l o s e t h o r o u g h l y i th a db e e nl i s t e di nt h el i s t e di nt h em i c r o b i a lg e n o m i cp r o j e c tb yt h e d e p a r t m e n to fe n e r g yo ft h eu s af o ri t su n u s u a lc e l l u l o s ed e g r a d a t i o nm e c h a n i s m i t s c o m p l e t eg e n o m ew a sp u b l i s h e di n2 0 0 5 b a s e do nt h et h eg e n o m i ci n f o r m a t i o n ，t h e f u n c t i o no ft h ec e l l u l a s er e l a t e dg e n e si nch u t c h i n s o n i iw a si n v e s t i g a t e di nt h i sp a p e r m a n yb i o i n f o r m a t i c st o o l ss u c ha st m h m m ，s i g n a l p , s m a r tw e r eu s e dt oa n a l y s i st h e s e q u e n c e so fc e l l u l a s er e l a t e dg e n e sf r o mt h eg e n b a n k t h ec a t a l y t i cd o m a i n so fe l e v e n e n d o g l u c a n a s e sb e l o n gt og l y c o s y lh y d r o l a s ef a m i l yg h 9o rg h 5 ，a n d1 3 - g l u c o s i d a s e s b e l o n gt og h 3m o s t l y a m o n gt h e m ，g e n ec h u 一13 3 5h a sas p e c i a ls t r u c t u r et h a tc o m p o s e s o fag h 9c a t a l y t i cd o m a i na n de l e v e nt r a n s m e m b r a n er e g i o n s t h e s et r a n s m e m b r a n e r e g i o n sw e r et h o u g h tt of o r mab a t ej e l l yr o l l b a s e do ni t s s t r u c t u r e ，c h u 一1 3 3 5w a s s p e c u l a t e dt oac h a n n e li nt h ec e l lm e m b r a n e ，w h i c hw o u l db ei m p o r t a n ti ns u b s t r a t e t r a n s f e r a t i o nd u r i n gc e l l u l o s ed e g r a d a t i o n b e s i d e st h i s ，m o s to fe n d o g l u c a n a s e sw e r el a c k o fac a r b o h y d r a t e sb i n d i n gd o m a i n ( c b d ) ，w h i c hi n d i c a t et h a ti t sb i n d i n gp a t t e r nw a s d i f f e r e n tf r o mo t h e rw e l ls t u d i e dc e l l u l a s e s i nt h i sp a p e r , r e a l t i m ef l u o r e s c e n tq u a n t i t a t i v ep c r ( r q - p c r ) w a su s e dt od e t e c tt h e d i f f e r e n c eo fc e l l u l a s er e l a t e dg e n et r a n s c r i p t i o nu n d e rt h ed i f f e r e n tc u l t u r ec o n d i t i o n s i n o r g a n i cm e d i u m ，w h e nd i f f e r e n tc a r b o ns o u r c e ( g l u c o s ea n dm i c r o c r y s t a l l i n ec e l l u l o s e ) w e r eu s e d , t h et r a n s c r i p t i o no ft h es e l e c t e dg e n e sw a sn e a r l yt h es a m ee x c e p tg e n e c h u 一1 3 3 6 b u ti ni n o r g a n i cm e d i u m ，t h et r a n s c r i p t i o no ft h es e l e c t e dg e n e sw a sab i t i i i 山东大学硕士学位论文 d i f f e r e n t i ts h o w e dt h a tt h ed i f f e r e n c eo ft r a n s c r i p t i o nl e v e lo ft h es e l e c t e dg e n e sw a sn o t v e r yo b v i o u sw h e nd i f f e r e n tc a r b o ns o u r c ew e r eu s e d t h es u i c i d ep l a s m i dp l y l 0 3w a su s e da st h ev e c t o rt oi n t e r r u p tt h et a r g e tg e n e t h e h o m o l o g u eo ft a r g e tg e n e sw a sl i g a t e dt ot h ep l a s m i db ye n z y m ed i g e s t i o na n dl i g a t i o n t h e nt h er e c o m b i n e dp l a s m i dw a st r a n s f o r m e dt ot h ee c o l is 17 - l ( 2 p i r ) w h i c hc a nt r a n s f e r d n at och u t c h i n s o n i ib yc o n j u g a t i o n t h e nt h er e c o m b i n a t e dp l a s m i dw a si n s e r t e di n t o t h e t a r g e tg e n eb yh o m o l o g u er e c o m b i n a t i o nt oi n t e r r u p tt h et a r g e tg e n e s e v e r a lk n o c k o u t p l a s m i d sw e r ec o n s t r u c t e dt h r o u g ht h i sp r o t o c 0 1 b u ti t sd i f f i c u l tt og e tg e n e i n t e r r u p t e d m u t a n td u et ot h el o wr a t eo fh o m o l o g u er e c o m b i n a t i o na n dc o n j u g a t i o n c o n s i d e r i n go f t h i s ，o t h e rm e t h o d sw a su s e dt oi m p r o v et h et r a n s f o r m a t i o nr a t e ，i e e l e c t r o p o r a t i o n a tt h e s a m et i m e ，d i f f e r e n tm e t h o d sw e r eu s e dt oc o n s t r u c tt h ek n o c k - o u tp l a s m i d ，s u c ha s l f h - p c ri no r d e rt oi n c r e a s et h er a t eo fc o n j u g a t i o n i nt h i s p a p e r , t h eg r o w t h c u r v ea n dc e l l u l a s ep r o d u c t i o nu n d e rd i f f e r e n tc u l t u r e c o n d i t i o n sw i t hd i f f e r e n tc a r b o ns o u r c e sw e r es t u d i e d f o u rk i n d so fs u b s t a n c e sw e r eu s e d a st h ec a r b o ns o u r c e s ：g l u c o s e ，c e l l o b i o s e ，m i c r o c r y s t a l l i n ec e l l u l o s e ，p h o s p h a t es w o l l e n c e l l u l o s e i ts h o w e dt h a t ，e x t r a c e l l u l a rc m c a s ec o u l db eb a r e l yd e t e c t e dw h e ng l u c o s eo r c e l l o b i o s ew a su s e da st h ec a r b o ns o u r c e a n da st h er u n n i n go u to fc a r b o ns o u r c e ，t h e o p t i c a ld e n s i t yd e c r e a s e di m m e d i a t e l y , w h i c hw a st h o u g h tt ob et h er e s u l tc e l la u t o l y s i s h i g hc m c a s ec o u l db eb o t hd e t e c t e dw h e nu s i n gm i c r o c r y s t a l l i n ec e l l u l o s ea n dp h o s p h a t e s w o l l e nc e l l u l o s ea st h ec a r b o ns o u r c e a n dt h ee x t r a c e l l u l a rc m c a s ew a st w ot i m e sh i g h e r w h e np h o s p h a t es w o l l e nc e l l u l o s ew a su s e da s t h ec a r b o ns o u r c e st h a nw h e n m i c r o c r y s t a l l i n ec e l l u l o s ew a su s e d a tt h es a m et i m e ，r e d u c i n gs u g a rw a sd e t e c t e dw h e n u s i n gt h ep h o s p h a t es w o l l e nc e l l u l o s e ，w h i c hh a sn e v e rb e e nf o u n db e f o r e o u rs t u d y s h o w e dt h a tc e l l u l o s ec o u l db ei n d u c e db yc e l l u l o s ei nch u t c h i n s o n i i m o r ea n dm o r ed e t a i l so fd e g r a d a t i o no fc e l l u l o s eb yc y t o p h a g ah u t c h i n s o n i iw e r e u n d e r s t o o dt h r o u g ht h ep r i m a r yr e s e a r c h e si nm i c r o b i o l o g ya n db i o c h e m i s t r y t h e s e r e s e a r c h e sw o u l db eo fg r e a th e l pf o rf u t u r es t u d y k e y w o r d s ：c y t o p h a g ah u t c h i n s o n i i ，r e a l - t i m eq u a n t i t a t i v ep c r , g e n ek n o c k o u t , i n d u c t i o n i v 山东大学硕士学位论文 e g c b h c b c d c b q c b o c m c n a d n s c m c a s e f i g p s c 论文中的缩写词表 e n d o p 一1 ，4 g l u c a n a s e s c e l l o b i o h y d r o l a s e s e e l l o b i a s e c a t a l 如cd o m a i n c e l l o b i o s e ：q u i n o n eo x i d o r e d u c t a s e e e l l o b i o s eo x i d a s e s o d i u mc a r b o x y m e t h y l c e l l u l o s e 3 , 5 d i n i t r o s a l i c y l i ca c i d f i g u r e p h o s p h a t es w o l l e nc e l l u l o s e 内切纤维素酶 外切纤维素酶 纤维二糖酶 催化结构域 纤维二糖：醌氧化还原酶 纤维二糖氧化酶 羧甲基纤维素钠 3 ，5 一二硝基水杨酸 内切纤维素酶 图片 磷酸膨胀纤维素 v 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明 的法律责任由本人承担。 论文作者签名：名避日 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本 人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：牲导师签名： 山东大学硕士学位论文 1 1 纤维素降解的研究意义 第一章前言 世界经济的现代化得益于化石能源，如石油、天然气与煤炭的广泛的投入应用。 因而它是建筑在化石能源基础之上的一种经济。然而据估计，这一经济的资源载体在 2 1 世纪上半叶即将迅速接近枯竭( f i g 。1 1 ) 。因此随着2 1 世纪的到来，能源危机受 到人们的重视，寻找替代能源也成为迫切需要。在这过程中，可再生资源越来越受到 人们的青睐。 蠢 兰 ； a 姜 盖 - o i lg a sc o a l f i g i - i g l o b a lp r o d u c t i o no fo i l ，g a sa n dc o a l 【1 生物质资源是可再生资源中储量最为丰富的一种，它主要包括农业废弃物、森林 废弃物、动物粪便等。纤维素是生物质资源的最主要组成部分。地球上每年光合作用 形成的纤维素物质高达1 4 0 0 1 8 0 0 亿吨，我国仅秸秆类农业废弃物每年就达7 亿吨。 世界粮油组织预测到2 0 5 0 年以生物质资源为主的可再生资源将提供全世界6 0 的电 力和4 0 的燃料。生物质资源的开发利用对于我们这样一个人口众多，资源匮乏的国 家来说更具重要的战略地位和社会意义。国家“十一五”规划中也将生物质资源的利 用作为重要的一项。预计到2 0 1 0 年，全国生物质发电装机总量将达到5 5 0 万千瓦； 非粮原料燃料乙醇利用量增加2 0 0 万吨，生物柴油年利用量达到2 0 万吨，初步实现 生物质能商业化和规模化利用 2 】。 山东大学硕士学位论文 1 2 纤维素降解的研究进展 自然界中纤维素主要由植物、海藻等靠光合作用产生，近代也发现某些细菌等微 生物也能产生纤维素【3 l 。植物纤维素是植物细胞壁的主要成分，占植物界碳含量的5 0 以上，干重占植物干重的1 5 5 0 。通常，纤维素嵌入半纤维素、木素等物质，形成 木质纤维素。由于其中的木素等物质性质稳定，因此木质纤维素较难被降解。 1 2 1 纤维素结构 纤维素化学结构是由d 吡喃葡萄糖环彼此以p 一1 , 4 糖苷键以c 1 椅式构象联结而 成的线性高分子化合物( f i g 1 - 2a ) 。对天然纤维素分子结构的研究表面，纤维素由 结晶区和非结晶区交错构成。结晶区的纤维素中大量的羟基基团形成数目庞大的氢 键，构成一个巨大的氢键网络( f i g 1 - 2b t 4 】) ，从而形成致密的晶体结构。 c ( ) t67 1 7 ( 7 ) b ( ) - 5 9 6 2 ( 2 ) d ) - 1 0 4 0 0 ( 日 卯) 1 1 8 圆 b n 1 1 4 圆 们- 3 7 四 ) - 77 8 4 ( 8 ) h ) - 8 0 叭( 8 ) c ( ) - 1 03 3 8 ( 1 0 ) ，n - 9 6 _ 5 ( 另 f i g 1 - 2 ：八2 - ds 仃u c f u r eo fc e l l u l o s eu n i t b ，h y d r o g e nb o n d si nc e l l u l o s e c ，s k e t c hm a po f c e l l u l o s ei aa n di b 在晶体结构的研究方面，目前人们对i 型纤维素的结构研究的较为深入。已知i 型纤维素有两种不同的存在方式：i q 和i p ( f i g 1 2c ) 。纤维素i a 中以纤维二糖为单 元形成三斜晶系的p 1 结构( a = 0 6 7 1 7n l t l ，b = 0 5 9 9 6 2h i l l ，c = 1 0 4 0 0n i n ，a = 1 1 8 0 8 。，胪1 1 4 8 0 。，7 = 8 0 3 7 。) ；而纤维素ib 则是以两个纤维二糖为单元形成单斜 晶系的p 2 1 结构( a = 0 7 7 84n l n ，b = 0 8 2 0 1n m ，c = 1 0 3 8 0n l t l ，q = p = 9 0 。，丫= 9 6 2 m 东学硕t 学位论文 5 。) 。纤维素i b 中，晶格的a 向是纤维单元堆垛的方向，b 向在纤维平面与纤维链的方 向垂直，c 向是链的延长方向。 1 2 2 纤维素降解生物 纤维素降解生物在自然界中广泛存在，如真菌、细菌、植物、原生动物中都有纤 维素酶的发现。进来人们还在一些动物如自蚁、福寿螺等动物体内发现了动物内源性 纤维素【”。 1 2 0 1 纤维素降解真菌 真菌是最为人们所熟知的纤维素降解微生物，从低等的厌氧真菌到高等担子菌。 一些真菌中最原始的种类，如厌氧的壶菌纲( c h y t d o m y c e t e s ) ，能在反刍动物的胃肠 道中降解纤维素。子囊菌、担子菌、半知菌中含大量纤维素降解菌。其中b u l g a r i a ， c h a e t o m i u m ，c o r i o l u s ，p h a n e r o c h a e t e ，a s p e r g i l l u s ，p a e c i l o m y c e s ，t r i c h o d e r m a ( d e u t e r o m y c e t e s ) 等由于产生纤维素酶或者具有降解木材的能力很强，已经被深入研究 嘲。真菌中研究屉为详细的当属模式生物瑞氏木霉( t r i c h o d e r m ar e e s e i ，f i g1 3 ) 。人 们在二战期间分离到zm e s e i 门。该菌先是被归为zv i h d e ，后来人们发现其在形态学 上与其它zv i r i d e 不同，因此根据其发现者e l w y m r e e s e 的名字而重新命名。现在 一般认为zr e e s e i 为h y p o c r e a j e c o r i n a 的无性衍生物。 f i g 1 3t r i c h o d p m ar e e s e i 1 2 2 2 纤维素降解细菌 细菌是自然界结晶纤维素降解的主力军，与真菌对纤维素的低转化率不同的是， 细菌能完全彻底地降解结晶纤维素。厌氧细菌( 如c l o s t r i d i u m ) 的多酶复合体形成的 纤维小体( c e l l u l o s o m e ) 能高效降解结晶纤维素。好氧细菌也能彻底降解结品纤维素， 有的好氧细菌如c e l l u l o m o n a s 和t h e r m o b i f i d a 有与真菌相似的纤维素酶系。另一种较 为广泛存在的好氧菌即噬纤维茼属同样具有很强的降解能力，但其纤维素酶系却与众 不同。它们能在贫瘠的环境中迅速彻底地降解结晶纤维索，却检测不到胞外纤维素降 山东大学硕士学位论文 解酶活力和葡萄糖类水解产物。这显示其具有独特的纤维素酶体系。 1 2 2 3 纤维素降解放线菌 对降解纤维素的放线菌的研究相对较少，早期工作局限于分类学、生态学，直到 8 0 年代末期才有相关纤维素酶类性质的比较。对纤维素降解能力最强的是放线菌中的 小单孢菌。近年来，从堆肥中分离出了多种高温单孢菌，如弯曲高温单孢菌和褐色高 温单孢菌等。 1 2 2 4 动物内源性纤维素酶 一开始人们认为，诸如白蚁等动物之所以能降解纤维素是由于其消化道内共生的 微生物的作用，而随着研究的深入，这一理论受到了挑战。1 9 6 3 年，m a r s h a l l 等在蜗 牛( h e l i xp o m a t i a ) 无菌的肝胰腺中检测到了纤维素酶和几丁质酶的活性，同时还发 现其消化液中纤维素酶和几丁质酶的活性与消化液中菌体的含量无关【8 】。国内也有从 福寿螺( a m p u l l a r i ac r o s s e a n ) 的胃液中纯化到葡聚糖内切酶，并克隆其基因的报道 9 】。 1 3 纤维素降解机制 1 3 1 真菌中三种酶协同作用机制 纤维素降解机制的研究成果主要是以丝状真菌展开的，原因是该类菌能产生大量 的胞外纤维素酶。上世纪5 0 年代，r e e s e 1 0 】等人在研究纤维素的降解过程时，首先提 出了酶解纤维素的c 1 c x 模型。该模型认为：c l 组分首先裂解纤维素的刚性结构，然 后c 。组分再水解由c l 组分释放出的纤维素链。该理论在5 0 年代曾占主导地位，但随 着酶解纤维素研究的深入，到了6 0 年代c l c x 模型则逐渐失去了广泛的接受。尽管 r e e s e 在1 9 7 7 1 1 】年对该理论进行了修改，提出c l 组分是一种通过打开共价键和氢键 等进行反应的一种性质不同的纤维素酶，然而到目前为止似乎并没有任何有关证明这 种假设的详细说明。b e r g h e m 1 2 】在1 9 7 3 年建议：事实上应该是由c x 组分首先进攻纤 维素链内部的糖苷键，产生末端，然后由c l 组分从新生成的非还原末端开始水解纤 维二糖单位。c l 组分的外切纤维素酶性质的确定支持了这种看法，并为随后的研究奠 定了基础【1 3 】【1 4 】。 目前广为接受的纤维素降解理论是7 0 年代末提出的协同作用理论【15 1 。该理论认 为：纤维素的降解是内切- 1 3 一l ，4 一葡萄糖苷酶( e n d o p 一1 ，4 一g l u c a n a s e s ，e c 3 2 1 4 ) ，简称为 内切酶( e g ) ；外切一1 3 - 1 ，4 葡萄糖苷酶( e x o - b 一1 ，4 - g l u c a n a s e s ，e c 3 2 1 9 1 ) ，简称为外切 4 m 末大学硕士学位论文 酶，又称为纤维二糖水解酶( e e l l o b i o h y d r o l a s e s ) ，简称c b h ；b 一葡萄糖苷酶 ( b 一1 ，4 一g l u c a 删e s ，e c 32 12 1 ) ，又称为纤维二糖j 晦( e e l l o b i o s e ，c b 或p g ) 三组分协同作 用的结果( f i g1 - 4 ) 。 c f i g 1 - 4 ：g e u e r a l m o d e lo f t h es y m 口m c n o f c e l l o b i o h y d r o l a s e sa n d e n d o g l u c a n a s e 协同作用一般认为是一种酶反应的顺序机理：内切葡萄糖酶首先进攻纤维素的非 结晶区，形成外切纤维素酶需要的新的游离末端。然后外切纤维素酶从多糖链的非还 原端切下纤维二糖单位。b 葡萄糖苷酶再水解纤维二糖单位形成葡萄糖口q 。g i l l i g a n 和r e e s e 1 7 1 首先证明真菌纤维素酶在消化纤维素时具有协同性。他们发现纤维素酶在 消化纤维素时具有协同性纤维素复合酶对w a l s e t h 纤维素的水解程度大于单组分 酶。此外，这种内切一外切酶间的协同作用在t r i c h o d e r m af i r i d e 和p e n i c i l l i u m f u n i e u l o s u m 1 羽，t r i c h d d e r m ak o n i n 垂i 和f u s 口r i u m b w 【2 。11 2 1 ，s p o r o t r i c h u r p “ 研w k m m 【”1 及t e l a r o m y c e s 硎州o n 讲”1 等的纤维素酶系中得到证实。w h i t e 和 b r o w n l 2 4 ) 用电子显微镜也证明了内切酶一外切酶组分间在结晶纤维素水解时的这种协 同作用。 2 0 世纪8 0 年代末期在得到了内、外切纤维素酶催化结构域( c a t a 【y f i cd o m a i n ) 的结晶，进行了序列分析和解析了其三维结构等研究的基础上，己基本上弄清纤维素 酶催化的水解反应与溶苗酶相似，即都遵循“酸碱催化”的双置换作用机制2 ”。 1 3 2 厌氧细菌中纤维素降解机制纤维小体 纤维素降解细菌中好氧菌如c e l l u o m o n a s l 2 q 2 7 1 等的纤维素酶体系与真菌中类似， 东大学硕学位论z 即内切与外切葡聚耱酶以独立酶( f t c ec e l l u l o s e ) 的形式的协同作用。而某些厌氧细 菌的降解体系则是以多酶复合体的形式存在，这种多酶复合体成为纤维小体 ( c e l l u l o s o m e ，f i g1 - 5 ) 。 f 嘻1 - 5 ：c o m p o s t i o na n ds l a r i l c t u r e o f t h ec e l l u l o s o m e i n c l o s w i d i u m t h e r m o c e l l u m 纤维小体最先由l a m e d 嘲等于1 9 8 3 年在热梭菌中发现。这一发现推翻了人们多 年以来的微生物中的纤维素酶都是独立酶的看法。很快，纤维小体陆续在一些同属的 细菌和其他细菌甚至是真菌中被发现。 热梭菌中纤维小体的发现是生物化学，免疫化学，超结构和基因工程等多领域共 同努力的结果。最初，生物化学数据显示热梭菌的主要纤维素降解活力都表现在一个 山东大学硕上学位论文 多组分的细胞外大组复合物上。超微结构的分析给出了这个复合物的组成和各个组分 在细胞表面的方位。随后，传统基因操作技术使得人们能够克隆并表达出该菌中的一 些纤维素酶，结果显示这些纤维素酶都是这个复合物的组分。至此，人们得出结论， 热梭菌中的与纤维素降解相关的一系列酶是以多酶复合物的形式结合在细胞表面来 起作用的。 以热梭菌( c l o s t r i d i u mt h e r m o c e l l u m ) 【2 7 】【2 8 1 为例，其纤维小体中多种降解纤维素 所需的酶类，如外切纤维素酶、内切纤维素酶以及木聚糖酶等。热梭菌中的纤维素酶 主要有c e l a 、c e l b 、c e l d 、c e l e 、c e l f 、c e l g 、c e l h 、c e l l 、c e l j 、c e l k 、c e l s 、 c b h a 等。其中c e l s 和c b h a 为外切纤维素酶。与其他微生物中的纤维素酶一样，纤 维小体中的纤维素酶也具有一个催化结构域( c a t a l y t i cd o m a i n , c d ) 。但是不同的是， 这些酶不含有和纤维素结合的结合结构域( c e l l u l o s eb i n d i n gd o m a i n , c b d ) ，而具有一 个和脚手架蛋白( s c a f f o l d i n ) 结合的结构域( d o c k i n gd o m a i n ) 。这个结构域通过与脚 手架蛋白上的结合结构域( c o h e s i o nd o m a i n ) 结合，将纤维素酶固定在脚手架蛋白上。 除纤维素酶外，纤维小体上还含有木聚糖，他们也是依靠d o c k i n gd o m a i n 与脚手架蛋 白结合。 纤维小体主要靠两种连接将纤维素酶固定在细胞的表面。i 型连接指的是纤维素 酶的d o c k i n gd o m a i n 与脚手架蛋白的c o h e s i o nd o m a i n 结合，从而将纤维素酶类固定 在脚手架蛋白上。i i 型连接指的是脚手架蛋白的d o c k i n gd o m a i n 与细胞表面的锚定蛋 白的c o h e s i o nd o m a i n 结合从而将其固定在细胞表面。 1 3 3 氧化机制 1 3 3 1 纤维二糖脱氢酶氧化机制 真菌中的三种酶的协同作用一直是研究者对纤维素降解机制的研究重点。然而， 1 9 7 4 年，e r i k s s o n 等【2 9 1 发现氧气可以提高黄孢原毛平革菌( p h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m ) 降解纤维素的速率，表明其降解有氧化酶类的参与。此后，e r i k s s o n 等 3 0 】【3 1 】分别从只c h r y s o s p o r i u m 的纤维素培养滤液中发现了纤维二糖：醌氧化还原 酶( c e l l u b i o s e ：q u i n i n eo x i d o r e d u c t a s e , c b q ) 和纤维二糖氧化酶( c e l l o b i o s eo x i d a s e ， c b o ，现称为纤维二糖脱氢酶：c e l l o b i o s ed e h y d r o g e n a s e ，c d h ) 。 只c h r y s o s p o r i u m 的c d h 是一单体糖蛋白，含糖约9 4 ，分子量为9 0 k d ，分 子中含有个f a d 辅基和一个h e m e 辅基，在5 0 。c 以下及p h 值3 8 范围内稳定【3 2 】。 山东大学硕士学位论文 其底物较为宽泛，可以是纤维二糖，也可以是纤维三糖、纤维四糖等寡糖1 3 2 3 3 1 。c d h 可被木瓜蛋白酶水解成含f a d 和含h e i n e 区两部分，当加入纤维二糖时只有含f a d 的 片段被还原，说明f a d 可直接参与纤维二糖的氧化。可能是f a d 先被还原然后将电 子传给适当的受体 3 4 】。 尸c h r y s o s p o r i u m 可生成多种c b q 同功酶。m o r p e t h 3 s , 叭尸c h r y s o s p o r i u m 中分离 出c b q 同功酶，都是单体糖蛋白。利用沉降平衡技术测得其分子量约为5 7 8k d 。这 些同功酶的性质相似，只是含糖量不同。c b q 与c d h 催化性质形似，但c b q 不能 还原细胞色素c 。这也是用来区分c d h 和c b q 的常用方法。 r e n g a n a t h a n d 6 等发现c d h 与c b q 可以强烈地吸附在纤维素上，且吸附上去的 酶仍然可以氧化纤维二糖，说明和其他纤维素酶一样，c d h 和c b q