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分子光谱在化学振荡反应和核酸 测定中的应用 分析化学专业硕士研究生晏苹 指导教师黄承志教授 摘要 在某些体系中，某个组分或某些组分的浓度发生周期性的变化，这类反应现 象就是化学振荡反应。化学振荡是一种非平衡非线性现象，非平衡现象在自然界普 遍存在。其研究对解决生命起源等基本问题以及大气动力学和化工过程分析等实 际问题具有重大的影响。由于化学振荡反应的机理十分复杂，所以对这种现象产 生机理的研究和对其应用的研究而言进展比较缓慢。本文主要用共振光散射及荧 光技术对化学振荡反应进行定性表征，对产生的光谱信号的本质和机理进行了解 析，为研究化学振荡机理提供新的方法和检测手段。主要研究内容如下： ( 1 ) 在p h2 2 1 的b r 缓冲溶液中，阴离子染料二氨基蓝3 r ( d b ) 与鱼精 d n a ( f s l ) n a ) 通过阳离子表面活性剂溴化十六烷基三甲铵( c t m a b ) 的“桥梁”作 用，形成三元复合物，从而使体系的散射信号增强，其最大散射峰位于3 4 6 om 处， 增强的共振光散射强度( 出r l s ) 与0 0 3 1 op g m l 范围内的f d n a 溶液呈线性关系， 据此测定f s d n a 的含量。此方法用于合成样的测定，回收率在9 5 4 一1 0 4 2 之 问，r s d 小于2 1 。 ( 2 ) 对h 2 0 2 - k s c n c u s 0 4 - n a o h 振荡体系进行散射光谱扫描发现，不同时刻 的共振光散射信号在波长3 8 0 o 劬5 1 0 o 椭范围内有比较大的改变，最大散射峰 位于4 5 3 o 砌处。在普通荧光仪上采取定波长时间扫描模式，得到 h 2 0 2 k s c n c u s 0 4 n a o h 振荡体系随时间变化的共振光散射信号变化图，从而达 到用此共振光散射技术直观表征铜离子振荡体系的目的，建立了新的分析振荡反 应的方法。对同一振荡反应，用共振光散射光谱检测的结果与通常用的吸收光谱 结论是一致的，这表明共振光散射技术用于振荡反应的研究是可行的。 ( 3 ) 邻菲哕啉亚铁指示剂在催化b - z 振荡反应中，铁离子价态在二价和三价之 间循环，邻菲哕啉亚铁指示剂荧光强度也随之发生周期性的变化。邻菲哕啉亚铁 指示剂在2 7 7 on i n 处激发得到4 1 4 0 锄的发射峰，在此波长下，对体系进行时间扫 描得到该体系的荧光振荡图，并考察研究了加入核酸后体系周期的变化情况。 关键词：共振光散射化学振荡反应铜离子振荡b z 振荡核酸 m 南大学硕+ 学位论文 a b s 响c t t h e a p p i i c a t i o no fm o l e c u i a rs p e c t r u mi n c h e m i c a lo s c i l l a t i n gr e a c t i o n sa n d d e t e r m i n a t i o no fn u c l e i ca c i d a n a l y t i c a lc h e m i s t r ym a j o rp o s 培m d u a t ep i n gy 孤 s u p e n 厂i s o r ：p r o f e s s o rc h e n g z h ih u a n g a b s t r a c t 0 s c i l l a t i n gr e a c t i o n sa r cc o m p l e xd y n 锄i cs y s t 鲫st h a ti n v o l v e 锄p l i t i l d eo r p e r i o d i cc h a n g e sr c s p o n d i r 培t oc o n c e n 仃a t i o no f s o m ei n 乒e d i e n t s ( ar e a c t 鲫t ，ap m d u c t o ra 1 1i n t e m e d i a t e ) w 岫t i m e n 0 1 1 l i n e a r 锄dn o n e q u l i b f i u mp h e n o m e i l ai no s c i l l a t i n g c h e m i c a lr e a c t i o n sa r ee x i s t i n gc o 呦o n l yi nn a t l l r e s t u d i e so no s c i l l a t i n gc h 啪i c a l r e a c t i o na r em o s t l yi m p o n 锄ti na l l a l y t i c a lc h e m i s b 嘎c l i n i c a lt e s t ，1 i f c8 c i e n c e ，c h c i l l i c a l i n d u s t i y ，a n ds oo n h lt 1 1 i sc o n 砸b u t i o n ，c h a r a c t 甜z e da n da n a l y z e dq u a l i t a t i v e 锄d q u a i l t i t a t i v ea n a l ”i c a l i n f o m a t i o no f o s c i l l a t i n g c h e m i c a lr c a c t i o n sb a s e do n a b s o r b a n c e ，r c s o n 粕c e1 i g h ts c a t t d n ga 1 1 df l u o r e s c e n c et e c h n i q u e s w eh a v ea 1 1 a 1 ) ，z e d t h em e c h a i l i s m 趾de s s e n c eo ft l l e s p e c 仃ap k 札o m e n o n ，a i l do b t a i n e dt l l eu s e f i l l i n f o m a t i o nw h i c hc a i lp r o “d ean e w 趾a l 蛳c a lm e t h o do f o s c i l l a t i n gc h 锄i c a js ”t 锄s t h ep 印e rc o n s i s t so f l r e es e c t i o n sa sf o l l o w ： ( 1 ) i nt h em e d i u mo fb r i t t o n r o b i n s o n ( b r ) b u f 】衙s o l u t i o n ( p h2 2 1 ) ，at 啪a r y c o m p l e xc o u l db ef o m c di fc a t i o n i cs l 埘k t a l l ts u c h 猫c t m a bi sp r c s e n ta c t i n g 船a b r i d g eo f t h ei n t e r a c t i o no f d 盱叮aa 1 1 da i l da n i o i l i cd y e ，r e s u l t i n gi ns 仃o n g 锄h 孤c e dr l s s i 印a l s c h a r a c t e r i z e db yp e a l 【a t3 4 6 o 砌i tw 嬲f o u n dt h a tm ee n h a i l c e dr l s i n t e n s i t j e s ( j r l s ) w c r ei np r o p o r t i o nt ot h ec o n c e n 仃a t i o n so f 蠡d n a i nac e n a i nr a l l g e t h e1 m e a rm g eo fi 。i so 0 3 1 0p 咖lt h em e 1 0 di 娜b e e i lu s e df o rt l l e d e t e 瑚i n a t i o no fm j c m 跏o u n l so fi o d i n ej 1 1s y n t l l e f i c 锄p l e sw i t 量lt h em e f yo f 9 5 4 1 0 4 2 舭da r s dl e s st l l 粕2 1 ( 2 ) r e s o n a n c e1 i g h ts c a t t 嘶n g ( r l s ) s i 印a j so fh 2 0 2 一k s c n c u s 0 4 一n a 0 h 曲南大学硕士学位论文a b s t m c t o s c i l l a t i n gs y s t c ma r cc h a i l g e a b l ew i mm et i i n e t h er l st i m es c 盟i m e n s i t yw 鹬 m e 勰删a t 丑4 5 3 om f b rm ee x c j t a t i o n 柚de m i s s i o n 趾dam e t l l o di sp r o p o s e d b a s e d0 nt h er l sd e t e c t i o no fa no s c i l l a t i n gr e a c t i o ni nac l o s es y s t 锄t l l eq u a l i t a t i v e a l l a l y t i c a li n f o 咖a t i o nc o u l db eo b t a i n c d 丘d mt h i ss 仃a ig ： l t f o 州a r da i l de x p e d i t i o 惦 a p p r o a c ho fo s c i l l a t j n gc h 谢c a lr e a c t i o n s t h es e 嬲o n a lc h 蚰g eo ft h ep a n i c l es i z ei s c x 锄i n e df o rt h eh 2 0 2 k s c n c u s 0 4 n a o ho s c i l l a ：c i n gs ”t 锄u s i n gm er l sm e t l l o d n l u s ，an e wa i l a l ”i c a lm 砒o di sd e v e l o p e df o r 恤o s c i l l a t i n gc h 锄i c a ls y s t 锄s w e c o m p a r e dt h ep c r f b m l a n c e o fa b s o r b 甜l dt l i er s ld e t e c t i o na i l dm er e 锄l tw 粘 s a l i s 妇c t o 斜 ( 3 ) f e ( i i ) - p h e t l 一c a 诅1 ) ，z e dr c 枷o nb e 铆e e nd i a c e t o n e 觚dp o t a s s i u mb m m a t ei n a c i d i cm e d i 啪e x h i b i t so s c i l l a t i o n si nn u o r e s c e n c e w eh a v eo b s e r v e dt h es e a s o n a l c h a i l g eo f 也es i 弘a l sb yn u o r e s c e n c em o d ea t _ 伽，2 7 7 o 啪，a n d 凡x ，4 1 4 o 啪r e s u l t s s h o wt h a lm ea d d i n go f 矗d n ac a np e r t 珊bt h eo s c i l l a t i n gp e r i o dt h ee f r e c to f i n n u e n t i a lv a r i a b l e s ，s u c h 鹤m ec o n c 朗仃a t i o no f r e a c t i o nc o m p o i l e i l t s ，t e m p e r a t i l r cw 舔 s t u d i e d 1 ( e y w o r d s ：r e s o n a n c e1 i g h ts c a n c f i n gt e c h n i q u e ；o s c i l l a t i n gc h e m i c a lr c a c t i o n ； h 2 0 2 一k s c n - c u s 0 4 - n a o h 砒l db zo s c i l l a t m gs y s t 锄；n u c l e i c i d 独创性声明 学位论文题目：坌墨整鲎垒坐鲎垫益鱼庭垒墼熊巡塞空堕鏖塑 本人申明提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中 已加入了特别标注，不存在抄袭、伪造等学术不当行为。对本研究及 学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同仁均已在文中作了明确说 明并表示衷心感谢。对文中所有内容由本人负全部学术责任。 国，转 学位论文作者：嚷砑 签字日期： 沁c 群6 月彳日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院可以将学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密， 口保密期限至年月止) 。 学位论文作者签名：攫并导师签名： 签字日期：y 习年6 月毛日签字日期：， 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 日 邮编： 西南大学顶十：论文第一章绪论 第一章绪论 1 1 共振光散射技术简介及应用 光散射是一种常见的自然现象，是指一束光通过介质时，在入射光方向以外 的各个方向上观察到光辐射的现象，其实质是光波的电磁场与介质分子相互作用 的过程。如果介质分子是可极化的，就会被诱导产生以电磁场频率振荡的电偶极 子。根据电磁理论，振动的电偶极子是一个二次波源，它将产生振动的自身电磁 场，这个电磁场将以与入射光相同的频率向各个方向发出辐射，从而产生光散射 现象。 近年来，光散射理论与技术得到了快速的发展，广泛应用于在物理化学、胶 体化学、高分子化学和生命科学的研究，并在研究生物分子性质及自聚集行为、 表征聚合体微粒的形成与粒径分布、探究表面界面结构等方面发挥了十分重要的 作用。 1 9 9 3 年p 私t e m a c k 【5 】等通过在普通的荧光分光光度计上测定散射光信号建立 了共振光散射技术，用于研究卟啉类化合物【7 1 0 l 、金属配合物的聚集【i i l ；1 9 9 6 年 童沈阳等【l 州将此技术用于核酸分析和研究，开辟了生物大分子光散射研究的新领 域。近1 0 年来，该技术由于仪器简单、操作方便和灵敏度高【6 】而在分析化学领域 得到迅速的发展，广泛用于具有聚集行为的体系研究中，各种新的光散射技术与 分析方法也应运而生，如液液界面全内反射一共振光散射门m r l s ) 技术1 2 “4 1 、后 向共振光散射( b r l s ) 技术陋1 8 】、共振光散射成像技术1 9 0 0 1 、流动注射一共振光散射 唧a r l s ) 技术2 1 02 1 、双波长比率共振光散射技术【1 9 ，2 m 4 和共振光散射免疫技术 相继建立。目前，这一技术广泛地用于无机离子【2 6 埘】、核酸【4 7 巧9 1 、蛋白质6 0 删、 药物【“删、纳米粒子【7 0 。7 5 】和细菌【7 6 _ 8 0 1 等的测定中。共振光散射技术成为分析化学 中的一种重要分析技术。 1 2 荧光分析法简介 荧光物质分子吸收了特定频率辐射后，由基态跃迁至第一电子激发态( 或更 高激发态) 的任一振动能级，在溶液中这种激发态分子与溶剂分子发生碰撞，以 热的形式损失部分能量后，而回到第一电子激发态的最低振动能级( 无辐射跃迁，。 然后再以辐射形式去活化跃迁到电子基态的任一振动能级，便产生荧光 引】。根据 这种辐射出不同波长、强度和能够反映物质特性的荧光来对该物质进行定性和定 量分析的方法称为荧光分析法。荧光分析法最主要的优势是灵敏度高和选择性好 【8 2 1 。 西南人学硕士论文 第一章绪论 二十世纪七十年代后期，荧光分析法就被分析界引广泛重视。但由于许多待 测物自身没有荧光发射的特性，而且该方法易受拉曼和散射光等背景的干扰，限 制荧光分析法在分析中的应用。为了使荧光分析法能更好以及更广泛地得到应用， 建立和发展了各类荧光分析新方法。如对于不发荧光的物质可以通过某类化学反 应即衍生的方法使其转变为适合于测定的荧光物质，对于荧光较弱的物质可以采 取荧光增敏的办法提高测定的灵敏度。近年来，还发展了各种新型荧光分析技术， 如导数荧光法、激光诱导荧光法、时间分辨荧光法、荧光探针法、光化学荧光法、 同步荧光法、三维荧光法、偏振荧光法、荧光免疫测定法、荧光成像技术、荧光 光纤传感器、以及“双体系双波长荧光光度法”等【8 3 。这些方法和技术的出现 有力地推动了荧光分析法向高效、痕量、微观和自动化等方向发展，且使其应用范 围不断扩大。目前该方法已广泛用于工业分析、食品检验、环境保护、医药、生 化分析等领域。由于荧光分析法的灵敏度高，不同的分子又都具有特征的荧光光谱， 因此该方法当用于微量和痕量待测物的分析具有较大的优越性。 1 3 化学振荡反应简介及研究现状 1 3 1 化学振荡反应简介 一般化学反应是反应物的浓度随时间的变化而下降，反应产物的浓度随时间 的变化而上升【8 ”，最终反应物和产物的浓度随时间变化而达到平衡状态，但这不 是唯一的化学反应现象。在某些化学反应体系中，当体系的某些状态参变数处在 一定范围内时，体系的某个组分或者某些组分的浓度发生周期性的变化，这类反 应现象就是化学振荡反应【踯】。这类反应又被称作化学时钟，由于其类似生物活动 的周期性，因而得到了人们的广泛关注。 化学振荡反应是在自然界中普遍存在的一种非平衡非线性现象，属于非线性 动力范畴，在开放体系( o p e ns ”t 锄) 和封闭体系中( c l o s e ds y s t 锄) 中均可发生， 但在开放体系的振荡时间要比封闭体系长。发生化学振荡需要满足三个条件【8 9 】： 反应体系必须远离热力学平衡态；反应过程中必须有自催化步骤；体系的 初始条件必须有两个稳定态。 早在1 9 2 1 年，美国科学家布雷( w c b m ”就报道了在均相溶液中碘催化双氧 水分解的振荡现象【咖。他观察双氧水、碘酸钾的稀溶液时，发现氧气产生速度与 碘浓度均发生周期性变化。由于化学振荡现象有悖于经典的热力学第二定律，所 以，布雷的实验并未引起注意。1 9 5 8 年，苏联化学家b e l o u s o v 在硫酸介质中以铈离 子做催化剂用溴酸盐氧化柠檬酸【9 ”，1 9 6 4 年，z h 抽o t i n s l ( i i 报道其他反应体系都出 现了时空有序的振荡现象9 2 1 ，因而，后人称他们的研究为b z 反应 2 西南人学硕 ：论文第一章绪论 ( b e l o u s o v z h a b o t i n s l d ir e a c t i o n ) 。由于该振荡反应用肉眼能清楚地看见c e 4 + ( 黄色) 与c e 3 + ( 无色) 或f e ( p h ) 3 + ( 蓝色) 与f e 口h ) 2 十( 红色) 交替出现，使人们相信化学 振荡反应确实存在。 常见的化学振荡反应可分为以下几种： b e l o u s o v - z 1 1 a b o t i n s l ( i i ( b - z ) 振荡反应，b r a y l i c b h a 触y ( b - l ) 振荡反应， b r i g g s 求a u s c h e r ( b - r ) 振荡反应、铜催化振荡反应、过氧化物酶一氧化酶生化振荡 器、液膜振荡器以及近年来不断出现的其它化学振荡体系。本文主要研究了 b e l o u s o v z h a b o t i n 幽i ( b z ) 振荡反应和铜催化振荡反应，现将这两种振荡反应的机 理做一个简单介绍。 由于化学振荡反应的机理十分复杂，对b z 振荡反应的研究中，最有代表性 的工作是f i e l d 、k d r o s 以及n o ”s 的研究，他们于1 9 7 2 年提出的著名的f k n 模型【9 3 】。 他们用溴酸钾、丙二酸、硝酸铈在硫酸介质中构建了b - z 振荡体系，可简单的归纳 如下： 过程a ：b 哟3 一十2 b 卜+ 3 矿+ 3c h 2 ( c o o h ) 2h 3 b r c h ( c o o h ) 2 + 3h 2 0 过程b ：b 3 + 4 c e 3 + + 5 小h 皿幻2 + 4 c c 4 + + 2h 2 0 过程c ：3 b r c h ( c o o h ) 2 + 4 c e 4 + + h 2 0 + 耶幻2 h 2 b r + 3 c 0 2 t + 4 c e + 6 h + a 、b 、c3 过程合起来构成了1 个反应的振荡周期。 当溴离子的浓度足够大时，反应体系按a 过程进行，随着溴离子的浓度下降， 反应从a 过程切换到b 过程，最后通过c 过程使溴离子再生。因此，溴离子在整个 振荡体系中相当于一个“开关”，而铈离子在反应中起催化作用。反应在【b r 】与 【c e 4 + 】 c e ”】之间出现周期性振荡变化，溶液颜色出现黄色一无色一黄色周期性的 改变。 另一个被深入研究的振荡反应是铜离子振荡体系。在碱性介质中，c u ( 毋可 作为一些振荡体系反应体系的催化剂。在c u ( i i ) 一h 2 0 2 - n a 2 s 2 0 3 k s c n 体系中，p h 值、铂电极电位及铜离子选择性电极电位都发生振荡行为 9 4 】。在 c u ( i i ) - n a 2 s 2 0 3 k s c n 体系还原电位、p h 值和氧气的浓度也都呈周期性的振荡行为 【9 5 ，6 1 。这方面研究最多的是o r b 缸发现的在强碱性液中c u ( ) 催化h 2 0 2 氧化k s c n 的 反应州，此反应在封闭体系和开放体系中都可以进行【9 8 州。 铜振荡体系的机理更复杂，l u o 和o i b 矗1 1 等在前人研究的基础上【泓1 0 2 1 ，所建 立的模型涉及3 0 个动力学方程和2 6 个独立变量【1 0 3 1 。该机理的核心是自催化过程所 西南人学硕i ：论文第一章绪论 依赖的正负反馈环。在正反馈过程中产生黄色络合物【h 0 2 - c u ( d 】。 0 s ( o ) c n - + 0 0 s ( o ) c n + h 0 2 _ 2 0 s ( 0 ) c n + + 2 0 h _ o s ( o ) c n + + c u + 【s c 盯k _ + o s ( o ) c n - + c u 计+ hs c n _ ； h 2 0 2 + c u 计+ 0 h 一h 0 2 - c u ( d y d i o w + h 2 0 该黄色络合物又在负反馈中被破坏。 h 0 2 u ( i ) y c l l o w + n s c n - - + c u 十 s c n - 】n + h 0 2 + c u + 【s c n h 的浓度决定着整个体系处于正反馈过程还是负反馈过程。中间产 物0 s ( o ) c n - 的初始浓度很低。在自由基o s ( o ) c n + 的形成与分解过程中通过自催 化步骤产生o s ( o ) c n - 。体系同时受p h 值的影响，当p h 9 时，即在强碱性介质中， 铂电极电位及溶液的颜色才能呈现周期性变化：当p h 9 时，由于h 0 2 一c u ( i ) 的形成 受阻而导致振荡停止。 1 3 2 化学振荡反应在分析化学中的应用 目前，化学振荡反应应用于分析检测的依据只要在于待测物质可以对振荡反 应产生干扰。某些待测物质可以与振荡反应体系中的某个组分发生反应，引起该 组分在反应体系中浓度的改变，从而引起振荡反应的振幅、周期或者诱导期的改 变。由于振幅、周期或者诱导期的改变与待测物质的浓度改变呈一定的线性关系， 因此可以通过振幅、周期或者诱导期的改变值来确定待测物质的浓度。 t i k l l o n o v e 在1 9 7 8 年首次使用振荡体系测定了钌离子【1 0 4 】，开辟了振荡反应在 分析检测方面的用途。目前，己报道测定的金属阳离子有银、汞、铊、锰f 肼。o 龃 等；阴离子有氟、氯、碘、硫代硫酸根及金属络合离子1 0 皿1 1 2 】；以及气体物质n o 、 c o 、c 1 2 【1 1 3 等。振荡反应也用于有机物( 药物) 的测定中，如苯酚【1 1 4 】、而苯胺磺 酸钠1 1 5 】、问苯二酚和没食子酸1 6 1 17 1 、缬氨酸1 18 1 、咖啡因9 1 、利福平【1 2 0 1 、维生 素b 1 【1 2 l l 、维生素b 2 【2 2 1 、维生素b 6 1 2 3 1 、维生素c 1 2 4 1 及香子兰醛【1 2 卯、氢刚1 2 6 1 、谷 胱甘肽旧】、1 萘胺】。有报道用化学振荡分析方法测定人血清1 2 9 ，1 3 0 1 和患者尿液 【1 3 1 】，获得很有参考价值的结果。分析化学家已经把注意力聚焦在生命科学上，试 图将生命体内的振荡现象移植于实验室中进行研究，因此。化学振荡分析更具有 生命力。金利通等人”2 。3 4 1 利用模拟生物膜振荡器研究了味觉物质，使振荡反应的 应用更具有实用价值。 1 4 本文的主要内容 非平衡非线性现象在自然界普遍存在，其研究对解决生命起源等基本问题以 4 曲丽人学坝j j 论义弟一蕈鳍t 及大气动力学和化工过程分析等实际问题具有重大的影响，是处于化学、物理学、 生命科学等多学科交叉点的前沿课题，近年来已取得很大进展，已成为化学研究 的新领域。对化学振荡反应的研究方法主要是从物理化学的观点即电化学方法去 研究它【1 2 8 ，1 3 5 1 ，也有少数用吸收光谱1 3 6 1 、p h 值( 1 3 7 1 和化学发光【1 3 8 ，1 3 9 增方法研究它。 本文在对普通三元体系散射光谱的研究基础上，选用了振荡反应中应用最广泛、 最具代表性的两个振荡反应，在普通的荧光分光光度计上，并用共振光散射和荧 光技术对化学振荡反应现象做了初步研究，拓展了振荡反应的研究方法。主要内 容如下： 1 核酸是作为重要的遗传物质，是基因表达的物质基础，也是化学、生 物等诸多学科最为活跃的研究领域之一。利用阳离子表面活性剂( 溴化十 六烷基三甲铵) 的“桥梁”作用，将阴离子染料( 二氨基蓝3 r ) 与f s d n a 连接起来，形成三元复合物，形成特征散射峰，核酸浓度和散射值呈一定 的线性关系，据此，我们提出了一种新的定量测定核酸的方法。 2 化学振荡反应是典型的非线性化学现象，铜离子体系是第一个在封闭 体系中的液相、均相、非卤素体系的振荡反应。研究铜离子振荡体系时发 现，铜离子振荡体系中共振光散射信号在波长3 8 0 on n l 5 1 0 om 范围内随 着时间的变化发生较大改变，基于此，在4 5 3 om 处采取定波长时间扫描 模式，得到振荡体系随时间变化的共振光散射信号变化图，从而达到用此 技术直观表征铜离子振荡体系的目的，建立了新的分析振荡反应的方法。 对同一溶液，同步扫描吸收光谱和共振光散射光谱，比较所得光谱，得到 了比较满意的结果。 3 b - z 振荡反应是化学反应中非线性现象的一个典型例子。邻菲哕啉亚 铁指示剂可以催化b z 振荡反应，且铁离子价态在二价和三价之间循环， 指示剂荧光强度也随之发生周期性的变化。对体系的荧光光谱研究发现， 该指示剂在2 7 7 0 姗处激发得到4 1 4 on m 的发射峰。加入鱼精子d n a 后 振荡体系的周期会发生改变，深入研究了d n a 对反应体系的具体影响。 西南人学砸i 二学位论文第二章溴化 六烷基三甲铵存在下- 二氰基蓝3 r 与d n a 作用的散射光谱及分析应用 第二章溴化十六烷基三甲铵存在下二氨基蓝3 r 与d n a 作用的 散射光谱及分析应用 q hp c 2 h 5 o 扩。喙佣 6 西南人学硕i + 学位论文第二章溴化1 六烷基三甲铵存在下二氨基蓝3 r 与d n a 作用的散射光谱及分析应用 除了核酸是生化试剂，其余试剂均为分析纯。实验用水为二次水。 2 1 2 实验仪器 f 2 5 0 0 型荧光分光光度计( 日本日立公司) ，q l 广9 0 1 旋涡混合器( 海门市其 林贝尔仪器制造有限公司) ，p h s 3 c 酸度计( 上海大中分析仪器厂) a 2 1 3 实验方法 在1 0 om l 比色管中按一定的顺序加入1 om l p h2 2 l 的b r 缓冲溶液，1 o m l 4 o 1 矿m o 儿的c t m a b 溶液，适量的f s d n a 溶液，1 o m l l o 1 0 4 m o 儿 的d b 溶液，每加入一种溶液都进行旋涡混合，最后用二次水稀释至刻度并摇匀。 散射光谱是在f - 2 5 0 0 型荧光分光光度计上同时扫描激发和发射单色器获得。 2 2 结果与讨论 2 2 1光谱特征 f i g 2l i 咖s c a t t e d i i gs p e c 缸a ( 1 ) b u 断+ c a b ；( 2 ) b u 船+ 朋；( 3 ) b u 断+ c 刑a b + d b ；( 4 ) b u 脑+ d b + d n a ；( 5 ) b u 陆+ c 刑a b + d na ；( 6 ) ( 8 ) b u 胁+ c 1 m a b + d b c 呲t r a t i s ：d b 。1 o x l o 5 姗l ，l ；硎a b ，4 o l 旷m o l ，l ；f s d n a ( m l ) ，l ，0 0 ；2 ，0o ；3 ，0 0 ；4 ，0 5 ；5 ，05 ；6 ，0 5 ；7 ，1 5 ；8 ，1 8 ；p h ，2 2 1 7 西南人学坝i ：学位论文第二章溴化十六烷基三甲铵存在下二氯基蓝3 r 与d n a 作用的散射光谱及分析垭用 图2 是在缓冲液中加入c t m a b 、d b 、f s d n a 及其混合物的r l s 光谱图。 由图2 可知，在2 2 0 o 5 0 0 o 衄波长范围内，由于静电作用的影响，c t m a b - d b ， f s d n a d b 作用较弱，散射信号较小；f s d n a c t m a b 有较强的相互作用，散射信 号较大，当加入d b 后能在3 4 6 o1 1 1 i l 左右显著增强f s d n a c t m a b 的散射强度， 说明c t m a b 二氨基蓝3 r - d n a 可以形成三元复合物。图2 还表明随着d n a 浓 度的越大，在3 4 6 0 姗左右的散射信号逐渐增强并且伴随散射峰红移现象发生。 这种现象归结为二氨基蓝3 r 在c n a 表面的j 型聚集 7 】。实验发现混合物的散射 光强度随着f s d 咐a 浓度的增加而成比例的增强，并在一定的浓度范围内呈线性关 系，据此建立了测定f d n a 方法。通过对各峰值比较后发现最大散射峰位于3 4 6 o 砌处，因此我们选择了3 4 6 on m 为最佳测定波长。 2 2 2 条件的优化 2 2 2 1 试剂加入顺序的影响 试剂的加入顺序对c t m a b 和d b 与f s d n a 的作用影响较大。通过实验研究 发现，按顺序b r c t m a b f 囝n a d b 加入试剂时体系的共振散射强度比较大， 而且体系比较稳定。因此本实验选择的试剂加入顺序为b r c t m a b f s d n a d b 。 2 2 2 2 离子强度的影响 我们用1 0 m o l l 的n a c l 溶液来控制离子强度，试验了离子强度对c t m a b f s d n a d b 体系的影响，其结果如图3 所示，可以看出，随着体系中离子强度从 o o lm o l l 增加到o 1 6m o l l 时，体系的散射强度几乎不变，这表明，离子强度对 作用体系影响作用不明显。所以本体系没有用n a c l 来控制离子强度。 2 2 2 3 酸度的影响 图4 是体系的散射强度随p h 值变化的情况。从图中可以看出，p h 值在 1 8 1 2 8 7 范围时，体系的散射强度先增大后减小，且在2 2 1 时达到最大，高于此 范围时，体系的空白值增大，即c t m a b 和舶的作用增强，且加入f s d n a 后体 系的散射值变化不大。因此，我们选择p h 值2 2 1 来控制体系的酸度。 7 5 0 6 0 0 4 5 0 3 0 0 1 5 0 0 0 0o 0 30 0 6o 0 9o 1 20 1 5o 1 8 c n a a ( m 0 1 l ) f i g 3 e 饪to f i o n i cs 咖g mo n 血er l s c u r v e1 ，d b c t m a b ；c u r v c2 ，d b - 盘d n a c m a b c o n c 仃蜀l t i o 略：d b ，1o x l 旷m 0 1 ，l ；c n 旧，4 o x l 矿 m o l 儿蠡d n a ，1 0 埘萝m k 五3 4 6 0 n n p h ，2 2 l ， 7 5 0 6 0 0 4 5 0 3 0 0 1 5 0 0 1 82 ，o2 22 42 62 83 0 p h f i g 4e 丘b c t o f p h o n l l l e r l s c u n t1 ，d b 洲a b ；c u n t2 ，d b f s j ) n a c 1 m a b c o n c e n 删i o n s ：d b ，10 x l 旷t 呻硎a b ，4 0 1 0 5 m o 儿劬n a ，i 0 g m l ，置3 4 6 ，o n r n 2 2 2 4c t m a b 浓度的影响 如图5 所示，随着c t m a b 浓度的增大，体系的散射强度逐渐增大，当c 刚a b 浓度增大到4 0 1 0 4 m o l ，l 后，体系的散射强度已基本稳定，不再增强。这是因为， 9 西南大学硕士学位论文第二章演化f 六烷基三甲钱存在下二氨基蓝3 rl | d n a 作用的散射光谱及分析应用 c t m a b 时一种阳离子表面活性剂，它与d n a 中带负电荷的磷酸根和阴离子染料 d b 之间都存在着静电作用，由此导致体系的散射信号增强，当三者结合完全，体 系的散射就不再增加，散射强度趋于稳定。 9 0 0 7 5 0 6 0 0 0 4 5 0 3 0 0 1 5 0 0 0123 4 56 7 m b ( 1 0 - 5 m 0 扎) f i g 5 e 腑c to f t l l ec o n c e i i h 缸i o no f c t m a b 佣t l l er l s c u r v e1 d b c t m a b ；c u r v e2 ，d b f s 阱q a c t m a b c o n c e n t 嘣i o n s ：d b ，1 o x l o 。5m 0 1 ，l ；f s d n a ，1 oh g ，m k 3 4 6 0n np h ，2 2 1 2 2 3 共存物质的影响 在实验优化条件下，以1 op 咖l 的翻) n a 为参照，试验了多种金属离子、 糖类、氨基酸、表面活性剂等物质对反应体系的影响，结果如表1 所示。从表1 可以看出，k 十、n 矿等离子允许浓度较大，而n i 2 + 、c 一、s d s 等离子允许浓度较 低。糖类和有机小分子如尿素、氨基酸、蛋白质等物质基本没有表现出干扰。同 时我们也注意到，某些表面活性剂的允许浓度较低。总的来说，上述干扰允许量 不会产生太大的影响，不干扰结果的测定。 l o 两南人学硕l ：学位论立第一二章溴化十六烷草三甲铵存拒下二氨基蓝3 r 与d n a 作用的散射光谱及分析应用 表1 共存物质的干扰 t a b 1t 0 1 e r a i l c eo f 觚i 印s u b s 协1 1 c e s n a + ( c l _ ) _ o 70 1 l l c o 5 0+ 8 3 k + ( c 1 _ ) 5 0 0+ 1 3m a l t 0 船 5 0+ 3 5 c 0 2 1 c 1 1 2- o 4l a c t o 5 0- 0 4 n i 2 、c r ) 2 - 6 o s u c m 5 0+ 6 o b a 2 + ( c 1 - ) 5 p b 2 + ( n q 。) l o+ 4 4 a y c i n 2 6 6+ 2 4 z n 2 + ( n 0 3 ) 4 0+ 0 8 a 印盯硒n e 5 0+ 9 1 c d 2 十o i 0 3 。) 7 2 + 4 oa l i n c 5 0 0+ 4 ，9 c u l s q 2 ) 1 0 + 0 6 m g 、n 5 0+ 1 2 ，8 f e ”( c 1 ) 8 3s d s c 一+ ( c 1 ) 0 5+ 2 6v i 伽肺n ec5 0 7 8 a 1 3 + ( s 0 4 2 ， 4“6u r c a5 0 0 7 0 n o i e ：c o 呻州【强d o 略d e l0 x 1 0 4 m o 儿c 1 m a b ，4 _ o x l 旷m o l 几缸d n 1 0 咖l ，3 4 6 0 劬，p i ，2 _ 2 1 2 _ 3 分析参数与样品测定 在以上确定的最佳反应条件下，b r ，c t m a b ，d b ，与不同浓度的矗d n a 作用而产生的r l s 增强信号( 甜i l s ) 与f n a 浓度的关系如图6 所示： 吒d n a ( n gm | 1 ) f i g 6 d c t e 彻i n a t i o no f t l l el i n e a rr 柚g e c o n c e n t 豫咖s ：f s d n a ，1 0 吲毗d b ，1 o x l 0 4 1 1 1 0 儿c t m a b ，4 o 瑚儿丑，3 4 6 on 札p h 2 2 1 n ei i n 叫 r e g r e s s i o ne q u 砒i o n w 嬲a ，= 3 0 8 + o 5 9 c 扣n m l ；r = o 9 9 4 5 ；n 。1 1 ) 实验发现，增强的糸l s 和f s d n a 溶液的浓度成正比关系，其线性范围为o 0 3 1 8 扯咖l ，线性回归方程为出= 3 0 8 + o 5 9 c ( cn g ，m l ；r2 o 9 9 4 5 ；n21 1 ) 。 根据表1 共存离子的干扰特性，合成了2 个含不同干扰组分的样品，测定结果 如表2 。由此可见，本方法能在有较多干扰成分存在的情况下测定核酸，测定结果 令人满意。 t a b 2d e t e 肌i t i o nr c s u l t so f s ”t l l e n cs a m p l e so = 5 ) 样品f s d n a 的含量 s a m p l e f s d n ac 0 t a i n i n gi n 蹄呷l e ( n n t l ) 主要干扰 m a i nj i i 胁r e n c e s 测得值回收率 相对标准偏差 f o 岫dv a l u e r a v e r y ( ) r s d ( ) ( 酣t l l ，i f 5 ) 矗d n a5 0 0 n a + ，c u 2 + ，百u c o 辩，咖t o p h 蚰 5 0 99 9 4 1 0 4 22 1 f s d n a5 0 0 c 矿，c 矿，期c r o 辩，g l y d n 4 8 89 5 4 9 8 2 l ，5 c 帅州啪l i o r b ：c 1 m a b ，4 0 x 1 矿m o 儿；朋，l _ o x i o 。m 此劬咐 l o 峙h i ；n a + 0 2 m 日i ，l ；c d 2 + t7 2 x 1 0 4 m o l 皿c 矿，so ，【l d o 扎； c i | ”， o x l 0 4 肿i ，kg l l l c o 卵，1 o x l 一t 此t r y p t o p h 神，4 o x l 0 4 肿毗舳m ，4 0 x 1 0 4 m o 帆 9 1 y c i n ，4 m 1 旷m v l 棚0 。1 ； 3 4 6 0n m 1 2 西南大学硕1 一学位论文第二章溴化十六烷果二三甲铵存在下二氮基蓝3 r ，d n a 作用的散射光谱及分析应用 2 3 本章小结 阴离子染料( d b ) 可以通过阳离子