（分析化学专业论文）烟草中挥发性成分的指纹图谱研究.pdf

中南大学硕士学位论文 摘要 摘要 目前，天然动植物样品组成的复杂分析体系的定性定量技术已 取得很大进展，但对于烟草这类非常复杂的体系，对其中各类化学成 分还有待进一步研究。尤其随着分析仪器的发展，二维色谱数据的获 得变得非常容易，使得化学计量学可以充分利用二维色谱数据的特点 获得更多的化学信息，对成分的分析产生很大的帮助。本论文采用色 谱质谱联用技术并结合化学计量学方法对烟草中的挥发性成分的提 取工艺及指纹图谱进行了研究。 论文第一章为绪论，介绍了我国烟草行业的现状、所面临的问题 及研究的前景；化学计量学中的多元分辨技术和指纹图谱在中药复杂 体系及质量控制中的应用。 在第二章中，我们以色谱指纹图谱的信息量作为指标，利用均匀 设计的方法考察了加速溶剂萃取法提取烟草中挥发性成分的条件，优 化了提取的工艺，得到了最佳的提取条件：取2 9 烟草粉末放入萃取 池，萃取时间为2 0 m i n 、萃取温度为1 7 0 、溶剂占萃取池体积百分 比为1 0 0 。 第三章，我们选取丙酮，正己烷，无水乙醇，二氯甲烷四种极性 不同的溶剂，利用加速溶剂萃取法提取烟草中的挥发性成分，采用气 相色谱一质谱( g c m s ) 技术和化学计量学方法对其进行分析比较， 为进一步研究烟草中的挥发性成分提供了有利的科学依据。 第四章，我们选取了1 0 个不同产地的烟草样本，使用加速溶剂萃 取法提取其中的挥发性及半挥发性成分，以二维联用色谱仪器 g c m s 及化学计量学直观推导式演进特征投影法进行定性定量分 析，并分别对精密度、重复性、稳定性和l o 批次烟草挥发油特征指纹 图谱做了考察，能够很好的比对出1 0 个不同产地的烟草原料之间的成 分区别。 关键词：烟草，化学计量学，指纹图谱，挥发油，均匀设计，g c m s 中南大学硕士学位论文 a bs t r a c t i nr e c e n td e c a d e s ，t h eq u a l i t a t i v ea n dq u a n t i t a t i v et e c h n i q u eo f c o m p l i c a t e da n a l y z e ss y s t e m ，w h i c hc o n s t i t u t e do fn a t u r a la n i m a l sa n d p l a n t s h a s a l r e a d ym a d em a r k e dp r o g r e s s ，b u t f o rt h ec h e m i c a l c o m p o s i t i o n 、o ft o b a c c os t i l ln e e df u r t h e rs t u d i e s w i t ht h ed e v e l o p m e n t o fi n s t r u m e n t a lt e c h n i q u e s ，t h et w o - w a yc h r o m a t o g r a p h i cd a t ac a nb e e a s i l yr e c e i v e ds oa st op r o v i d eaf l a tt oc h e m o m e t r i c st h a tc a l lr e s o l v e m u c hm o r eu s e f u li n f o r m a t i o nt h a na n a l y t i c a li n s t r u m e n t s b yu t i l i z i n g t h ec h r o m a t o g r a p h i ct e c h n i q u e sc o m b i n i n go fc h e m o m e t r i c sa l g o r i t h m ，a r a p i dm e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no ft h ev o l a t i l ec o m p o n e n t sa n dt h e f i n g e r p r i n t so f c u tt o b a c c oh a db e e nd e v e l o p e di nt h i sp a p e r t h ef i r s tc h a p t e ro ft h i st h e s i sg i v e sag e n e r a li n t r o d u c t i o no ft h e p r o b l e m s o ft o b a c c o i n d u s t r y i no u rc o u n t r y , t h e a p p l i c a t i o n o f c h e m o m e t r i cm u l t i v a r i a t er e s o l u t i o nm e t h o d sa n df i n g e r p r i n tt e c h n i q u et o t h ec o m p l i c a t e da n a l y z es y s t e m i n c h a p t e r2 ，b yu s i n gi n f o r m a t i o nc o n t e n to fc h r o m a t o g r a p h f i n g e r p r i n ta n du n i f o r md e s i g n ，t h et h r e ee x t r a c t i o nc o n d i t i o n s ，n a m e l y t i m e ，t e m p e r a t u r ea n dt h ep e r c e n to fs o l v e n t ，h a v eb e e ni n v e s t i g a t e d m o p t i m u mt i m e ，t e m p e r a t u r ea n dt h ep e r c e n to fs o l v e n tw e r e2 0 m i n ，17 0 。c a n d10 0 ，r e s p e c t i v e l y t h e nar a p i dm e t h o df o r t h ed e t e r m i n a t i o no ft h e v o l a t i l ec o m p o n e n t si nc u tt o b a c c ow a sd e v e l o p e d i nc h a p t e r3 ，w i t ht h eh e l po fa c c e l e r a t e ds o l v e n te x t r a c t i o n m e t h o d ，v a r yt h es o l v e n t ss u c ha sn - h e x a n e ，d i c h l o r o m e t h a n e ，a c e t o n e ， e t h a n o lw h i c hh a v ed i f f e r e n tp o l a r i t yt oe x t r a c tt h ev o l a t i l ec o m p o n e n t t h e nc o m p a r e dt h ey i e l do fv o l a t i l ec o m p o n e n ta m o n ge x t r a c t e db y d i f f e r e n ts o l v e n t sb vg c - 】st e c h n i q u e sa n dc h e m o m e t r i c sa l g o r i t h m t h eo b t a i n e dr e s u l t sc a np r o v i d eu s e f u “n f o r m a t i o nf o rf u r t h e rs t u d ya n d d e v e l o p m e n to f t o b a c c o i n c h a p t e r4 ，t h ev o l a t i l ec o m p o n e n t si nc u tt o b a c c of r o mt e n d i f f e r e n tl o c a t i o n sw e r ei n v e s t i g a t e da n da n a l y z e db vg c - 】sa n dt h e h e u r i s t i ce v o l v i n gl a t e n tp r o j e c t i o n sm e t h o d m o r e o v e r , t h eg s f i n g e r p r i n tc h r o m a t o g r a m so fc u tt o b a c c of r o mt e nd i f f e r e n tl o c a t i o n s n 中南大学硕士学位论文 w e r es t u d i e d t h ed e v e l o p e dm e t h o dc a nb eu s e dt oc o m p a r et h e s a m e n e s sa n dd i f f e r e n c e so fc u tt o b a c c of r o md i f f e r e n ts o u r c e sa n df o r q u a l i t yc o n t r o lo fc i g a r e t t ep r o d u c t i o na n dm a t e r i a l s k e yw o r d s ：t o b a c c o ，c h e m o m e t r i c s ，f i n g e r p r i n t ，v o l a t i l eo i l ，u n i f o r m d e s i g n ，g c - m s i 原创性声明 本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢 的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不 包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我 共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。 作者签名： 学位论文版权使用授权书 本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文， 允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内 容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科 学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库， 并通过网络向社会公众提供信息服务。 作者签名： 导师签名日期：年一月一日 中南大学硕士学位论文 第一章绪论 1 1 前言 第一章绪论 烟草作为一种嗜用作物，其栽培和人类对烟草的利用历史由来己久，从哥伦 布1 4 9 2 年发现新大陆并把烟草带回西班牙开始，烟草很快传遍世界各地，由于烟 草消费的迅速增加和烟草工业的迅速发展，人们对烟草科研的投入也随之增加。 n 2 0 世纪5 0 年代后烟草化学研究取得了快速进展，人们认识到烟草中化学成分的 种类及含量在本质上影响卷烟的质量，欧美发达国家就对烟草化学成分及影响烟 草的品质的诸因素及其相互关系进行了深入研究。研究成果又反馈到卷烟工业 上，使得卷烟产品质量有了很大的提高，取得了市场竞争力和巨大的经济效益， 国外在这方面的研究还在继纠m 。 烟草不同于一般的普通植物，一方面它是世界上化学成分最为复杂的植物之 一，根据1 9 8 8 年r o b e r t 的报道，烟叶中共有3 0 4 4 种化学成分被鉴定，而卷烟烟气 中的化学成分则多达3 9 6 种，随着分析手段的发展，还将有越来越多的烟草化学 成分和烟气化学成分被鉴赳5 】；另一方面，烟草化学成分和烟气化学成分对烟草 品质的影响也不同于一般的普通植物那么简单，如甘蔗，糖含量高的就品质好， 烟草化学成分和烟气化学成分对卷烟品质的影响不但取决于其在烟草中的总量， 而且更主要的是取决于它们与样品中其它化学成分的比例关系及相互协调性 丌。这些都对烟草化学和烟气化学分析提出了很高的要求。 烟草是天然产物，其化学成分复杂，受产地、气候、年份影响很大，生产工 艺等诸多因素也会影响其质量。卷烟生产中的关键因素的质量波动必然会影响到 卷烟质量的控制。烟草化学成分的多样性和复杂性一直是其质量控制的重点和难 剧引，为了判断卷烟的质量，传统方法通常主要采用外观、常规化学成分的检测 和感官评吸等方法。目前评判卷烟风格和质量的稳定性还是以感官评析的方式为 主，但往往受到外界特别是人的因素影响而难以达到一致【9 】。因此，建立客观、 准确的质量稳定性评判方法就显得特别重要，成为卷烟质量控制的重点研究内 容。 1 2 烟草化学成分分析研究进展 随着分析化学的发展，新的烟草及其制品的分析方法层出不穷，对烟草各类 化学成分的研究已取得很大的进展。但烟草为非常复杂的体系，对其各类化 学成分还有待进一步研究，以便为基于烟草和烟气化学成分的配烟体系的研究与 建立创造条件。化学计量学多元分辨法和色谱指纹图谱已用于复杂环境监测样 中南大学硕士学位论文 第一章绪论 品、材料样品、天然动植物样品等组成的复杂分析体系的定性定量技术，该技术 已有初步应用，但还未达到成熟的阶段。系统研究烟草和烟气中的各类化学成分 与卷烟质量的关系，一直是国外烟草企业所关注的课题，其研究成果已经在指导 烟草设计、生产中得到了一定的应用。国家烟草局在2 0 0 3 年先后启动了。烟叶 中挥发性成份全二维气相色谱分析、“3 0 0 个国内品牌、1 0 0 个国外品牌卷烟全 面剖析 、“烟叶质量的近红外光谱研究等项目。拥有自主核心技术、卷烟烟叶 致香成分的分析也是国家烟草专卖局提出的近期科技工作烟草主要分析任务之 一。因此对国内卷烟烟叶中的致香成分种类及含量进行系统研究，并与国外卷烟 进行对比分析，并由此建立各类致香成分的指纹图谱，建立烟草致香成分和吸食 特性的相关性，为配方调整和工艺控制提供理论基础，具有重要的意义。 国际许多大的烟草公司都在烟草化学成分分析方面进行了大量的科研投入。 2 0 世纪8 0 年代初，如r j r e y n o i d s 公司已经将多维气相色谱质谱( m d g c m s ) 应用于烟草中挥发性成分分析【1 0 1 。各种先进分析方法在烟草分析研究中已得到 广泛应用，如近红外光谱分析技术用于总糖、还原糖、尼古丁、总氮的测定【i l 】； 液相色谱质谱( l c m s ) 测定烟草中的糖和多酚【1 2 1 、氨基酸和氨基糖【1 3 l 、烟草 特有的亚硝胺( t s n a s ) 【1 4 】；气相色谱质谱( g c m s ) 分析烟草中挥发性和和 半挥发性化学成分【1 5 , 1 6 | 、烟草特有的亚硝胺( t s n a s ) i 7 , 1 s 】等等。至今已从烟草 中鉴定出几千种物质，但由于技术保密等原因，国外有关制丝过程中烟叶化学成 分和品质的动态相关性鲜有报道。 烟叶香味物质的组成对卷烟的感官评吸质量有重要的影响，了解香味物质在 烟叶中的主要种类及其含量对指导卷烟生产和加香加料有重要的实用价值。国内 外对烟叶中香味成分作了一定研究。样品处理方法各种各样，如静态项空【1 9 1 、 吹扫捕集【2 0 1 、水蒸汽蒸馏【2 l 】、溶剂提取瞄】和柱层析【2 3 】等方法。9 0 年代中期开始 应用同时蒸馏萃取s d e 【2 4 2 5 】和固相微萃取( s p m e ) 【2 4 2 6 】等。分析方法主要是气 相色谱、气相色谱质谱法【2 5 ，2 6 1 。对烟草中挥发性和半挥发性中性【2 5 1 、挥发性和 半挥发性酸性【2 7 】及半挥发性碱性香味成分【2 8 】作了一定分析，从烤烟烟叶的鉴定 出四百多种香气成分，但这些技术目前还不是十分成熟，对非挥发性致香成分的 研究也鲜有报道，且烟草是非常复杂的体系，对其致香成分有待更深入的研究。 1 3 加速溶剂萃取 近几年来，r i c h t e r 等介绍了一种全新的称之为加速溶剂萃取的方法 ( a c c e l e r a t e ds o l v e n te x t r a c t i o n ，简称a s e ) 2 9 , 3 0 l ，如图1 1 所示。该法是一种 在提高温度和压力的条件下，用有机溶剂萃取的自动化方法9 该法已被美国e p a ( 环保局) 选定为推荐的标准方法( 标准方法编号3 5 4 5 ) 【3 1 1 。与索氏提取、超 2 中南大学硕士学位论文 第一章绪论 声、微波、超临界和经典的分液漏斗振摇等公认的成熟方法相比，加速溶剂萃取 的突出优点如下：有机溶剂用量少，1 0 9 样品一般仅需1 5 m l 溶剂；快速，完成 一次萃取全过程的时间一般仅需1 5 m i n ；基体影响小，对不同基体可用相同的萃 取条件；萃取效率高，选择性好；现已成熟的用溶剂萃取的方法都可用加速溶剂 萃取法做，且使用方便、安全性好，自动化程度高【3 2 1 。 1 3 1 加速溶剂萃取的原理 a s e 是采用常规溶剂，在较高的温度( 5 0 c - 2 0 0 c ) 和压力( 1 0 0 0 , - , 3 0 0 0 p s i 或1 0 3 2 0 6 m p a ) 下用溶剂对固体或半固体样品进行萃取的新颖的样品前处理 方法。利用升高的温度和压力，增加物质溶解度和溶质扩散效率，提高萃取效率 3 1 - 3 3 1 o 1 3 2 加速溶剂萃取仪及工作步骤 加速溶剂萃取仪主要由溶剂瓶( 带有多元溶剂自动混合器) 、泵、气路系统、 加温炉、不锈钢萃取池和收集瓶组成，可以连续进行2 4 次提取。工作时，选择一 定体积的萃取池，在底端加纤维滤纸膜，将研磨好的样品装入萃取池中，样品通 常与一定比例的硅藻土或无水n a 2 s 0 4 研磨混匀。装好的萃取池放在萃取池托架 上，对应的下方放一收集瓶。启动仪器，自动将萃取池送入加热炉内，并向萃取 池中加注溶剂到指定压力和加热到指定温度。样品处于高温、高压下( 静态萃取) 一定时间，萃取液注入收集瓶中。达到静态萃取时间后，萃取池中的提取液释放 于收集瓶中，再向萃取池注入新溶剂，进行下一静态萃取循环，直到完成设定的 循环次数，然后用一定体积的新溶剂冲洗萃取池，再用n 2 将剩余的溶剂吹入收集 瓶中，保证萃取液被全部收集。仪器自动将萃取池退出加热炉，并冲洗管路，进 行下一萃取过程【3 引。 1 3 3 加速溶剂萃取的应用 尽管加速溶剂萃取是近年才发展的新技术，但由于其突出的优点，已受到分 析化学界的极大关注。加速溶剂萃取已在环境、药物、食品和聚合物工业等领域 得到广泛应用。特别是环境分析中，已广泛用于土壤、污泥、沉积物、大气颗粒 物、粉尘、动植物组织、蔬菜和水果等样品中的多氯联苯、多环芳烃、有机磷( 或 氯) 、农药、苯氧基除草剂、三嗪除草剂、柴油、总石油烃、二恶英、呋喃、 炸药( t n t 、r d x 、h m x ) 等的萃取 3 4 1 。 3 中南大学硕士学位论文第一章绪论 p o w e rs w i t c h ( 电源开关) c o n t r o lp a n e l ( 控制面板) s o l v e n tr e s e r v o i rc o m p a r t m e n t ( 溶剂瓶仓) c e l lt r a ya n de x t r a c t i o nc e l l s ( 萃取池和萃取池托盘) a lt r a ya n dc o l l e c t i o n a l s ( 收集瓶和收集瓶托盘) o v e n a r e a ( 炉体) n e e d l em e c h a n i s m ( 收集针装置) 图1 - 1 加速溶剂萃取仪( a s e 2 0 0 ) 示意图 1 4 化学计量学在复杂分析体系中的应用 化学计量学( c h c m o m e t r i c s ) 是7 0 - - - 8 0 年代发展起来的一门新兴化学分支学 科，它应用数学、统计学与计算机科学的工具和手段设计或选择最优化学量测方 法，并通过解析化学量测数据以最大限度地获取化学及其相关信剧3 5 1 。它包括 化学采样理论、化学试验设计、化学化工过程优化、化学信号处理、定性定量分 析的多元校正和多元分辨、化学模式识别、化学过程机理研究的计算机模拟方法、 化学构效关系研究、人工智能与化学数据库和专家系统等。中医理论是中国医学 几千年来实践经验和对人体总体哲理认识的积累与总结。特别是其中的辨证论治 的思路和独特的诸如君臣佐使、四性五味、药物入经等用药原则，本质上是一种 多变量协同考虑的思路。化学计量学的最大特征是将多变量分析方法引入化学研 究，这与中医用药思想很有相通之处，应可在中医药定量研究中发挥重要作用 3 6 - 3 7 o 中药本身所含化学成分非常复杂，这就向分析化学提出了一个难题，即需找 到可快速对未知复杂多组分进行同时定性定量分析的方法。联用色谱仪器将分离 与分析集于一体，是目前分析功能最强的一类新兴高维仪器，可作为中药单味药 和复方药分析的首选仪器。然而，对于上述联用分析仪器，往往由于一个样本就 4 中南大学硕士学位论文第一章绪论 能产生大量的数据，这些数据的解析和化学信息的有效提取就成为分析化学面临 的一个新课题。 1 4 1 多元分辨法 化学计量学多元校正和多元分辨解析方法的发展使得用这类仪器直接对“黑 色”或“灰色”复杂多组分体系进行定性定量分析成为可能。化学计量学中的多元 分辨方法，不但可对色谱峰纯度进行可靠的快速检验，而且还可对完全未知体系 的严重重叠的色谱峰直接进行组分数( 化学秩) 估计和定量分辨，最终获得各种 纯物质的光谱和色谱，是一种有效的复杂多组分体系定量解析方法。 化学计量学在复杂分析体系中已有广泛的应用，如小波变换和偏最d x - - 乘法 在烟草常规成分预测中的应用【3 8 1 、偏最小二乘( p l s r ) 【3 9 】等。近年来，随着物 理学及计算机技术的发展，色谱与其它各种分析技术相结合，形成诸多联用仪器， 如气相色谱与质谱联用仪( g a sc h r o m a t o g r a p h m a s ss p e c t r o m e t e r , g c m s ) ，高效 液相色谱与二极管阵列联用仪( h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h - d i o d e a r r a yd e t e c t i o n , h p l c d a d ) ，毛细管电泳与二极管阵列联用仪( c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s d i o d ea r r a yd e t e c t i o n , c e d a d ) ，高效液相色谱与质谱联用仪 ( h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h m a s ss p e c t r o m e t e r , h p l c - m s ) 等。这 些联用色谱将色谱的分离能力与光谱的表征能力相结合，借助新的分析理论和技 术，为生物学、生命科学、药物学、环境科学等学科有关分析问题的解决提供了 强有力的工具和手段 4 0 l 。色谱联用仪器可产生同时包含光谱和色谱信息的高维 数据。这种数据具有以下六个化学特征，这些化学特征对分析化学特别有用，即： ( 1 ) 二维色谱数据同时包含了光谱与色谱信息。一般说来光谱( 如质谱、红 外光谱、紫外可见光谱等) 能提供化学物质大量的定性信息，而色谱则能提供定 量信息，同时化学物质的保留时间对定性也是很有帮助，这说明二维数据与通常 的一维数据相比可提供更多信息，可以同时在光谱或色谱空间来研究样本。 ( 2 ) 色谱具有很强的分离能力，它可将一个很复杂的分析体系分解成为多个 相对简单的子体系。因此能将复杂体系变为简单体系，只需直接处理这些相对简 单的体系或子矩阵，而毋需直接用数学方法来解析复杂的多组份分析化学体系。 ( 3 ) 纯化学物质的色谱峰有且只有一个最大峰。这一化学数据的特点，可为 我们在进行数据处理和分析时带来有用信息。 ( 4 ) 在色谱流出时，不同的化学物质是依照某种化学规律依次流入和依次流 出的。这一特点，为我们确定某一物质的色谱保留时间区间带来很大方便。 ( 5 ) 在二维色谱数据中，经常很容易找到所谓的零组份区，即在一段保留时 间区域内没有任何化学物质流出，正是这样的零组份区域，为我们直接提供了在 5 中南大学硕士学位论文第一章绪论 这一样本运行条件下的仪器噪声或仪器背景方面的有用信息，这一信息将为我们 确定体系的化学组份数，分离和区别分析信号与噪声，提供重要信息。此外，如 果体系存在某种背景，零组份区域的信息也将直接为我们提供有用的仪器背景信 息。 ( 6 ) 一般二维色谱数据都是非负实数。这为我们提供很有用的数学上的非负 约束条件，从而大大缩小了搜索空间。 近年来，对具有以上化学特征的二维数据，基于自模式曲线分辨法【4 l 】 ( s e l f - m o d e l i n gc u r v er e s o l u t i o nm e t h o d ) ，分析化学计量学家们提出了许多新的 算法，对于一般的色谱重叠峰，均可以给出令人满意的结果。如m a e d e r 的渐进 因子分析法( e v o l v i n gf a c t o r a n a l y s i s ，e f a ) 4 2 , 4 3 1 、m a l i n o w s k i 的窗1 2 1 因子分析 法( w i n d o wf a c t o r a n a l y s i s ，w f a ) 4 4 1 、梁逸曾和k v a l h e i m 的直观推导式演进 特征投影法( h e u r i s t i ce v o l v i n gl a t e n tp r o j e c t i o n ，h e l p ) 1 4 5 , 4 6 、交互移动窗口 因子分析法( a m w f a ) 4 7 】等。这些方法就是通常所说的渐进的方法，它有效地 利用了色谱的强分离性能，在分辩中引入了组分先入先出的假设。另外还有一类 方法是首先确定一组较好的初始解【4 3 】( 纯变量) ，然后再基于迭代或变换优化， 得到纯光谱和色谱。如g a m p e r l i n e 和v a n t e g i n s t e 的迭代目标转化因子分析法 4 9 , 5 0 ( i t e r a t i v et a r g e tt r a n s f o r m a t i o nf a t o ra n a l y s i s ，i t t f a ) ，w i n d i g 等的s i m p l i s m a t 4 8 l ( s i m p l e - t o u s ei n t e r a c t i v es e l f - m o d e l i n gm i x t u r ea n a l y s i s ) ，m a s s a r t 等的o p a 5 1 j ( o r t h o g o n a lp r o j e c t i o na p p r o a c h ) ，m a n n e 等的g e n t l e 法【5 2 5 3 】等。 现在，多元校正、多元分辨技术已经广泛地应用于中药的分析中f 蹦1 1 。 1 4 2 均匀设计法 在化学计量学中，用于实验优化的方法很多，如部分因子设计法、正交设 计法【6 2 拼】、均匀设计方法【6 5 , 7 1 1 等，已有人对各种优化方法及其应用进行了相应的 总结脚】。正交实验设计方法是一种应用非常广泛的实验设计方法，在化学化工 中有着非常广泛的应用。正交实验设计方法的试验点具有分布均匀、整齐可比的 特性，可以考虑到各因素之间的交互效应，并对各种效应关系安排实验，但正交 实验设计的试验次数较多，当实验水平数以算术级数增加时，实验次数以几何级 数急剧增加，只适用于实验水平不多的情况。均匀实验设计是一种着重在整个试 验范围内考虑试验点均匀散布以获得最多试验信息的较新的试验设计方法【6 5 1 ， 对于具有较多水平的试验安排尤为适用，现已在化学化工试验设计中得到广泛应 用【6 7 7 0 】，特别是在中药的提取分离研究中，由于影响中药活性成分提取、分离的 因素较多，所考虑因素的水平相对也较多，在中药现代化研究的热潮中，均匀设 计在中药活性成分提取、分离条件的优化试验中应用十分有优越性【7 4 】 一 6 中南大学硕士学位论文 第一章绪论 均匀设计( u n i f o r md e s i g n ) 是基于试验点在整个试验范围内均匀散布的从 均匀性角度出发的一种试验设计方法，是数论方法中的“伪蒙特卡罗方法的一 个应用，由方开泰和王元两位数学家于1 9 7 8 年创立。 所有的试验设计方法本质上都是在试验的范围内给出挑选代表性点的方 法，均匀设计也是如此，它能从全面试验点中挑选出部分代表性的试验点，这些 试验点在试验范围内充分均衡分散，但仍能反映体系的主要特征。例如正交设计 是根据正交性来挑选代表点，它在挑选代表点时有两个特点：均匀分散，整齐可 比。“均匀分散 使试验点均衡地布在试验范围内，让每个试验点有充分的代表 性，因此，即使在正交表中各列都排满的情况下，也能得到满意的结果；“整齐 可比”性使试验结果的分析十分方便，易于估计各因素的主效应和部分交互效应， 从而可分析各因素对指标影响的大小及指标的变化规律，但是，为了照顾“整齐 可比 ，正交设计的试验点并没有能做到充分“均匀分散 ，而为了达到“整齐可 比 也使得其试验点的数目比较多，而对于均匀设计，尤其在条件范围变化大而 需要进行多水平试验的情况下，均匀设计可极大地降低试验的次数，均匀设计只 考虑试验点在试验范围内充分“均匀散布一而不考虑“整齐可比。因此试验的 结果没有正交试验结果的整齐可比性，其试验结果的处理多采用回归分析方法。 整个试验设计过程一般需要两到三轮次试验，通常首轮试验先在较大的条 件范围内进行，初步建立起描述指标和因素间关系的数学模型，计算出模型在一 定试验范围( 原有试验范围或较原有试验范围适当扩大的试验范围) 内可预报的 最优值和试验条件组合，然后进行验证试验( 多是因为最优条件在试验的边界或 进行了模型的外推计算一在超出原有试验条件范围的情况下进行最优指标值和 条件的预测计算) 以检验和修正模型，之后缩小试验范围进行下一轮的更为精密 的试验并进一步修正回归模型。一般通过这样的两到三轮试验则可达到试验目 的，不但找到了最优的试验条件组合而且还建立了可定量描述指标和因素间关系 的数学模型。根据试验的目的和支持条件的不同，也可以利用均匀设计的试验点 布点均匀、代表性强的特性，用直接观察法从所有试验中挑选表现最好的试验条 件组合而结束试验设计( 不再进行数据的分析处理) ，或挑选出最好条件后在该 条件附近缩小试验范围进行更精密些的试验，直到实现试验目的后而结束试验。 使用均匀设计法进行试验设计，我们主张尽量采用建模和进行试验优化分析的方 式，透过模型我们可以对试验规律有进一步的提高认识，而不应该停留在简单的 指标数值筛选上。 7 中南大学硕士学位论文第一章绪论 1 5 指纹图谱方法概述 1 5 1 指纹图谱的概念及属性 指纹( f i n g e r p r i n t s ) 最早的概念来源于1 9 世纪末2 0 世纪初的犯罪学和法医 学【7 5 1 ，法医学的指纹分析强调的是个体的绝对唯一性。指纹图谱鉴别借用了法 医学的指纹鉴定的概念，但不是概念的重复。指纹图谱不强调个体的绝对唯一性 ( 个体特异性) ，而强调同一群体的相似性，即物种群体内的唯一性( 共有特征 性) 。指纹图谱是以各种光谱、波谱、色谱等技术为依托的又一种质量控制模式。 与传统质量控制模式的区别在于：指纹图谱是综合地看问题，也就是强调化学谱 图的“完整面貌 即整体性，反映的质量信息是综合的。由于各种化学成分天然 潜在的不稳定性，如同日常许多模糊现象一样，化学指纹图谱具有无法精密度量 的模糊性。“整体性 和“模糊性 是指纹图谱的基本属性，指纹图谱的相似性 是通过其基本属性来体现。指纹图谱分析强调准确的辨认，而不是精密的计算， 比较图谱强调的是相似，而不是相同。在不可能将复杂成分都搞清楚的情况下， 指纹图谱的作用是反映复杂成分内在质量的均一性和稳定性【7 6 】。 综上所述，指纹图谱可以定义为“指纹图谱是一种综合的、可量化的鉴别手 段，是评价复杂天然物真实性、稳定性和一致性的质量控制模式之一一。整体性 和模糊性是它的基本属性。指纹图谱应满足专属性、重现性和实用性的技术要求。 这一定义抓住了指纹图谱的实质，说明指纹图谱是一种综合的、整体的鉴定手段， 即可鉴别真伪，又可评价质量的均一性和稳定性。从其综合和整体性能看，它可 准确且又可量化地对复杂天然物进行真伪鉴别和质量评价；而从细节上看，它又 是很模糊的，尤其是受生态环境、采集时间等因素影响，很难给出一个对所有供 试品都适用的共有峰和非共有峰的比例，更不可能一一对应【7 6 1 。 1 5 2 指纹图谱技术的应用 目前指纹图谱已成为国内外公认的鉴别中药品种和评价中药质量的最有效 手段美国食品药品管理局( f d a ) 在1 9 9 6 年制定的( f d a 关于植物制品的指南 ( 试行) 中，对植物制品补充品和植物药进行了规范和法制化。其中，对植物 药品的临床化学、生产和控制部分，要求对植物原料、植物药中间品和植物药产 品提供相应的指纹图谱( f i n g e r p r i n t ) 。2 0 0 0 年，美国f d a 允许草药保健品申报 资料可以提供色谱指纹图鉴别资料【7 7 】。英国草药典、印度草药典以及加拿大药 用及芳香植物学会、德国药用植物学会也接受色谱指纹图谱。此外，w h o 在1 9 9 6 年草药评价指导原则【7 3 】中也有规定，在有苯章节中都提到：“如果不可能鉴别 有效成分，则鉴别1 种或几种特征成分( 如色谱指纹图谱) 以保证制剂和产品质 中南大学硕士学位论文 第一章绪论 量的一致【7 8 p 欧共体在草药质量指南的注释7 9 】中提到“草药的质量稳定性单 靠测定已知的有效成分是不够的，因为草药及其制剂是以其整体作为有效物 质一。中国国家药品监督管理部门也于2 0 0 0 年发布了 ：中药注射剂的指纹图谱研 究的技术要求( 暂行) ，明确要求对新申报的中药注射剂和已上市的中药注射 剂实行指纹图谱标准【卿。 1 5 3 指纹图谱的构建方法及t f l t 以度评价 对于复杂天然物，分析方法所能表征目标物的理化分析数据越多，构建指纹 图谱的信息越丰富，建立的指纹图谱专属性、特征性也越强。随着近代色谱分析、 波谱分析和光谱分析技术的飞速发展，已有越来越多的先进手段成为构建指纹图 谱的有力工具。 指纹图谱的构建主要分四类：色谱法、光谱法、x 射线衍射法、分子生物化 学技术。 色谱法主要包括t l c 指纹图谱、g c 和g c m s 指纹图谱、h p l c 指纹图谱、 高速逆流色谱( h s c c c ) 指纹图谱、毛细管电泳( h p c e ) 指纹图谱。 光谱指纹图谱法包括紫外指纹图谱、红外指纹图谱、质谱指纹图谱、核磁共 振指纹图谱等。 x 衍射法是2 0 世纪7 0 年代后迅速崛起的新型结构分析方法，单晶x 射线 分析法为中药有效成分的结构测定及开发做出了较大贡献。 利用现代分子生物学技术构建的d n a 指纹图谱，具有高度的个体特异性， 是构建指纹图谱的新方法，具有极好的应用前景。 指纹图谱评价是运用计算分析技术对所获得的谱图数据进行处理，通过筛 选和简化，获得专属、宏观、整体的化学特征综合信息，并对样品化学组成的总 体波动情况进行估测。因此，在获取了样品指纹图谱后，如何计算并评定各批次 产品指纹图谱间的整体相似程度，定量描述它们各自化学组成的差异性和波动 情况极为重要，即指纹图谱相似性计算是化学指纹图谱分析中的核心环节之一。 1 5 4 建立指纹图谱的意义 由于复杂的自然环境、社会状况，造成了中药材在应用方面的复杂性。同一 名称的中药材可能来自不同基源的植物。同一基源的中药材由于产地不同、采收 季节和生长年限不同而存在差别。一些中药材，特别是名贵药材，常可见到伪品 与正品相混淆。由于以上因素的存在，使得不同来源的同种中药材其化学组成有 可能相同，也有可能不同，这就必然影响到中医的临床疗效和中药的实验研究， 9 第一章绪论 并影响以其为原料生产出的中成药的化学组成，从而影响其质量和疗效。此外， 我国中成药品种繁多，中成药生产过程中各工艺环节的稳定性等多种因素对产品 的化学组成也具有重要的影响。从现有的中药内在质量控制现状来看，还存在很 多问题需逐步解决。其中，最突出的问题之一就是中药整体化学特征的表征。因 此建立中药指纹图谱对于更加客观地从整体上评价中药的内在质量具有十分重 要意义。 ( 1 ) 为规范中药材质量评价体系提供科学技术平台 现行甲药材质量控制标准主要是测定一、两种“有效成分一或“指标成分一 的含量，由于不同中药材可能含有相同的有效成分，测定该成分往往无助于中药 材的鉴别，也无法说明不同中药材的用药特点。其次，由于一味中药材本身就是 一个小“复方 ，内含非常复杂的化学成分，同一化学成分可以有不同的药理活 性，不同的化学成分也可以产生相同的药理活性，而且中医辨证施治应用的是药 味，并非某个化学成分，即中药的疗效是多种成分协同作用的结果。例如，仅以 黄芪甲菅含量来评价黄芪质量，就难以解释黄芪多糖在黄芪补气疗效中所起的主 要作用。中药材指纹图谱研究的提出，在一定程度上为实现通过控制中药材的整 体信息特征来控制其质量的方法成为可能，并将为进一步规范和完善中药材质量 评价体系提供科学的技术平台。 ( 2 ) 促进中医药行业和中药产业质量控制的规范化 对于中医药行业来说，进行中药材指纹图谱研究将进一步规范中药材的质量 控制标准，同时能够形成出口产品质量的标准化和规范化，也可以有理有据地对 待国际贸易中出现的各种质量纠纷，在一定程度上可保证中药材及其产品价格的 稳定，使之不再重复近年来中药产品销量增加而总销售额降低的尴尬局面。 对于中药产业来说，中药材指纹图谱的制定不但对中药产品质量的稳定起到 保障作用，而且可以提高行业和产业的管理水平。还可以促进中药材种植的产业 化、规范化和标准化，为进一步推广g a p ，规范和提高中华人民共和国药典 对中药材及复方质量控制的标准提供科学依据。 ( 3 ) 加速中药数字化的进程 进行中药材指纹图谱研究的过程，也是对中药进行数字化表述和数据库积累 的过程。无论是建立反映中药数字化信息的色谱或光谱，还是建立反映中药基原 的分子生物信息谱，都需要对中药的特征进行定性和定量表达，以便更高效、全 面地反应中药的综合信息特征。中药材指纹图谱的制定，是以不同产地、品种和 采收时间的中药材为研究对象，将反映它们之间本质属性的特征以数字的形式表 达出来，达到以数字化形式来描述中药真伪优劣的目的。中药材指纹图谱的深入 研究将进一步加速中药数字化的进展。 1 0 中南大学硕士学位论文第一章绪论 1 5 5 指纹图谱技术在烟草工业中的研究现状 指纹图谱在中药质量控制中发挥了重要的作用，目前已经广泛应用于中药质 量控制。近年来，对于中药指纹图谱的研究及应用取得了很多成果，也为指纹图 谱方法应用于复杂天然植物的分析研究开创了一个成功的先例。烟草作为复杂天 然植物之一，其质量控制的方法和各项研究仍在不停的发展过程中，指纹图谱技 术的发展，也为烟草的质量控制提供了一种新的方法，经过许多烟草工作者的探 索和努力，烟草指纹图谱的研究也取得了一定的进展。目前，指纹图谱技术在烟 草工业中的研究主要涉及两个方面：卷烟( 烟丝、烟气) 指纹图谱和烟用香精香 料指纹图谱。指纹图谱的构建方法以色谱法为主，尤其以气相色谱一质谱联用 ( g c - - m s ) 方法应用最为广泛。余苓等【8 l 】建立了烟丝硅烷化g c 指纹图谱，并 进行了p c r 分析；廖惠云等【8 2 】针对南京卷烟厂某牌号卷烟，运用同时蒸馏萃取、 气相色谱质谱法，建立了卷烟挥发性、半挥发性香味成分的指纹图谱，并采用 总峰数、共有峰率和相似度等几个指标对六个不同批次的卷烟进行了评价，同时 将聚类分析用于卷烟品质的模式识别。指纹图谱技术为真假卷烟的鉴别提供了一 种新方法，廖垄等【8 3 】运用固相微萃取一气相色谱一质谱法建立卷烟挥发性和半 挥发性物质的指纹图谱，通过指纹图谱相似度评价软件，对1 2 批正品卷烟和1 个 假冒品卷烟的指纹图谱进行了相似度计算，结果表明：1 2 批样品间相似度很好， 而假冒品卷烟与正品卷烟的相似度很低；李军等科】用固相微萃取气相色谱一 质谱联用方法测定了2 种国产名牌卷烟和仿冒卷烟的挥发性和半挥发性成分，根 据其化学组成的差别，分别建立了卷烟的特征指纹图谱，并与其仿冒产品对照用 于真假卷烟的鉴别。卷烟烟气指纹图谱的研究报道的并不多，余苓等【8 5 】研究了 指纹图谱异常指数法在烟气色谱数据处理中的应用。 关于烟用香精的指纹图谱研究是近年来烟草工业中的一个研究热点，这方面 的报道的很多 a t , - 船】。郭方道等【8 9 】采用同时蒸馏萃取、水蒸气蒸馏、固相微萃取 和溶剂萃取法分别提取烟用香精中的挥发性成分，并采用g c 和g c m s 进行测定， 通过比较色谱指纹图谱中提取特征组分的数目、含量和表征香精指纹性的能力， 以及提取方法的重复性，结