（特种经济动物饲养专业论文）桑蚕丝丝心蛋白结晶域sfx序列替代人αsynuclein蛋白gav基序的初步研究.pdf

摘要 桑蚕b o m b y xt r i o r i 丝丝心蛋白( s i l kf i b r o i n ) 结晶域与人类帕金森综合症的致病 蛋白0 【一突触核蛋白( c 一s y n u c l e i n ，简称s y n ) 的积聚原理类似，由一段非常疏水的 氨基酸组成的保守序列和一些无规卷曲在一定条件下发生整体的结构转换而导致 纤维化所致。研究发现在这两种蛋自中存在的疏水片段是形成b 折叠的关键。在体 外试验中已经证明a s y n 蛋白很容易积聚成纤维物，并且其中的6 6 v g g a v v t g v 7 4 序列对其积聚起决定性作用。为了进一步确证这一观点，前人通过基因重组的方法 单独表达了c 【s y n 6 5 ( o t s y n 蛋白n - 末端氨基酸残基l - 6 5 ) 和c 【- s y n 7 4 ( s y n 蛋白 n 末端氮基酸残基l 一7 4 ) 蛋自片段并研究其积聚行为，结果表明蛋白质中的局部区 域对其整体的积聚行为有调节作用。g a v 基序需要存在于具有无规卷曲的结构的宿 主蛋白中才能引发其整体的结构转换，并发生纤维化。a 突触核蛋自的片段为 “6 6 v g g a v v t g v 7 4 ”( 简称g a v 基序) 。该基序由g l y , a l a ，v a l 三种氨基酸残基组 成，它们在蛋白质的积聚过程中可能起到不同的作用。g l y 最具柔性，有助于序列 在溶液中保持无规卷髓状态；a l a 可以诱导形成蛋白质二级结构：丽疏水性的v a l 具有很强的形成d 一折叠的趋向。在蚕丝丝心蛋白结晶区中含有大量疏水性的、保守 性很强的重复序列，它们主要由g l y ，a l a 和v a l 组成。丝心蛋白结晶域的几段重复 片段为“v g y g a g v ”、“v g a g y g v ”、“y g a g v g a g y ”、“g a g a g s g a g a ”和 “v g a g y g a g a g ”( 以上简称s f x ) 。而s f x 是构成b 片层的重要成分。桑蚕丝心 蛋白由无规卷曲向d 折叠的转变及积聚过程中及蚕吐丝过程存在着成核依赖型的机 理。由于o 【s y n 7 4 积聚比值s y n 更快，过程更典型，为了便于构建质粒，研究a s y n 蛋白的积聚核心在被其它积聚核心所替换后是否还可以正常纤维化，我们用桑蚕丝 丝心蛋白的重复片段替换a s y n 7 4 的核心。利用p e t 载体系列的通用引物t 7 p r o m o t e rp r i m e 和与基因序列特异性结合的引物进行p c r 反应，然后通过基因上的 n d ei 和b a m h i 酶切位点直接双酶切后，将产物插入到p e t - 3 a 表达载体上。对 一s y n 7 4 的g a v 基序用s f x 替换，构建出a s y n 7 4 s f x 。将a s y n 7 4 s f x 依次用离子 交换柱和f p l c 分子筛柱进行纯化，温育6 天后，用t h t 荧光和原子力显微镜( a t o m i c f o r c e m i c r o s c o p e ) 检测该重组蛋白的结构，发现 x - s y t t 7 4 s f x 不能纤维化，这说明人 n s y n 蛋白的g a v 基序在功能上不能被桑蚕s i l kf i b r o i n 的s f x 序列替代，成为证 明g a v 基序对人仪一s y n 蛋白的特异积聚行为起重要作用的又一有力证据，为蛋白质 淀粉样化的分子机制研究提供了借鉴，也对人工丝蛋自的研究具有指导意义。 关键词：桑蚕丝心蛋白a 突触核蛋白积聚纤维化 a b s t r a c t t h ea g g r e g a t i o np r i n c i p l eo ft h eb o m b y xm o r is i l kf i b r o i ni nt h ec r y s t a l l i z e dd o m a i n s i ss i m i l a rt ot h a to fo t s y n u c l e i nw h i c hi sap a t h o g e n e i cp r o t e i n i nh u m a np a r k i n s o n s d i s e a s e i nt h ec e r t a i nc o n d i t i o n s ，av e r yc o n s e r v a t i v es e q u e n c ec o m p o s e do fh y d r o p h o b i c a m i n oa c i d sa n ds o m er a n d o mc o l ls e q u e n c e sw o u l di n d 血et h ec o n s e r v a t i o no f t h ew h o l e p r o t e i ns t r u c t u r ea n d f i b r i l i i z a l l o n i th a sb e e nf o u n dt h a tt h eh y d r o p h o b i cr e g i o ni nt h e s e t w ok i n d so f p r o t e i n si st h ek e y f a c t o rt ot h ef o r m a t i o no fbs h e e t e x p e r i m e n ti nv i t r oh a s i n d i c a t e dt h a t 0 【一s y n i n w h i c ht h eo o v g g a v v t g v 4s e q u e n c e ( a b b r e v i a t e dt og a v m o t i f ) i sd e c i s i v l yi m p o r t a n t i se a s yt ob ea c c u m u l a t e dt o g e t h e rt of o h nt h ef i b e r l i k e i n o r d e rt os u r p p o r ti t ，t w ot r u n c a t e dp r o t e i n so fa s y n 6 5 ( a m i n oa c i dr e s i f l u e sl t o6 5o fo f “- s y n ) a n d0 【一s y n 7 4 ( a m i n oa c i dr e s i d u e sl t o7 4o f a s y n lw e r er e s p e c t i v e l ye x p r e s s e d a n ds t u d i e d ；t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tp a r t i a ld i s t r i c t sw i t h i np r o t e i nm i g h tr e g u l a t et h e a g g r e g a t i o nb e h a v i o ro f t h ew h o l e p r o t e i n t h eg a v m o t i fi sn e c e s s a r ya n dc a nc a u s et h e c o n v e r s i o no fi t sw h o l es t r u c t u r ei nt h eh o s t p r o t e i nw i t hr a n d o mc o i l ，t o f o r l t tt h e f i b r i u i z a t i o n g a vm o t i fi sm a i n l yc o m p o s e do fa m i n oa c i d sg l y ，a l a , a n dv a l ，w h i c h m a yt a k eo nt h ed i f f e r e n tf u n c t i o ni nt h ep r o c e s so fp r o t e i na c c u m u l a t i o n i nd e t a i l s t h e a m i n oa c i dg l yi sm o s tf l e x i b l ea n d h e l p f u lt om a i n t a i nt h er a n d o m c o l ls t a t eo fa m i n oa c i d s e q u e n c ei nt h es o l u t i o n ；t h ea m i n oa c i da l a c a r li n d u c et h ef o r m a t i o n o f p r o t e i ns e c o n d a r y s t r u c t u r e ；t h es t r o n gh y d r o p h o b i c i t yo fa m i n oa c i dv a lh a st h ei n c l i n a t i o nt of o n nb - s h e e t s e v e r a lr e p e t i t i v es e q u e n c e sm a i n l yc o m p o s e do fa m i n oa c i d sg l y ，a l aa n dv a l ，s u c ha s ”v g y g a g v ”v g a g y g v ”y g a g v g a o y ”，”g a g a g s g a g a ”，a n d ”v g a g y g a g a g ”( n a m e d a ss f x l ，a p p e a r si nt h e c r y s t a l l i z e dd o m a i no f s i l kf i b r o i n t h es e q u e n c e s f xi so n eo ft h ei m p o r t a n tc o m p o s i t i o n st oc o n s t i t u t e3 - l a y e r a ni m p o r t a n tm e c h a n i s m o f n u c l e a t i o n - d e p e n d e n ta g g r e g a t i o nh a sb e e n f o u n di nt h ec o n v e r s i o nf r o mr a n d o mc o l lt o 1 3 - s h e e to fb o m b y xm o r is i l kf i b r o i na n di nt h ep r o c e s so fs p i n n i n gs i l kb ys i l k w o r m i n o r d e rt oe l u c i d a t ew h e t h e r0 l s y n u c l e i nc o u l db ef i b r i l l i z e da f t e rt h er e p l a c e m e n to fi t s a c c u m u l a t i n gc o r eb ya n o t h e r ，w er e p l a c e dt h ec o r er e g i o no fa s y n i 7 4 w i t ht h ec o r e r e g i o no f b m o r is i l kf i b r o i nv i ap c r t h er e c o m b i a n te x p r e s s i o np l a s m i d sa s y n 7 s f x w e r es u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t e d t h e s y n 7 4 s f xp r o t e i n sw e r er e s p e c t i v e l yp u r e d b yt h e i o ne x c h a n g ep u f i c a t i o ns y s t e ma n dt h ef p l c p u f i c a t i o ns y s t e r r lt h e ni n c u b a t e df o r6d a y s a n de x a m i n e d t h es t r u c t u r ew i t ht h et h tf l u o r e s c e n c ea n dt h ea t o m i cf o r c e m i c r o s c o p e t h er e s u l t s i n d i c a t e dt h a tt h eg a vm o t i fo fh u m a n s y nc o l u dn o tb e f u n c t i o n a l l yr e p l a c e db yt h es f xs e q u e n c e so fs i l k w o r ms i l kf i b r o i ni nt h ec r y s t a l l i z e d d o a m i n s ，w h i c hw a st ob ea n o t i i e re v i d e n c et oe l u c i d a t et h a tt h eg a vm o t i fw a s e s p e c i a l l y i m p o r t a n t t ot h e a g g r e g a t i o no fh u m a nc c s y n t h i sr e s e a r c hw o u l db eh e l p f u lt o t h e m o l e c u l a rm e c h a n i s mo f p r o t e i nf i b r i l l i z a t i o na n db es i g n i f i c a n tf o ra r t i f i c i a ls p i n n i n go f s i l kf i b r o i n k e yw o r d ：b o m b y xm o r i f i b r o i n c c - s y n u c l e i na g g r e g a t i o n f i b r i l l i z a t i o n i i 独创性声明 x 7 3 7 7 5 7 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名 时间：n f 年6 蜀 2 铲 关于论文使用授权的说明 本人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意安徽农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名 第一导师签名 时阃：王神5 卑6 窍1 瞬 时间：尹形 年月椭 1 绪论 1 1 引言 神经退行性疾病是一类与年龄相关的进行性神经系统疾病，包括阿尔茨海默症 ( a l z h e i m e r sd i s e a s e ，a d ) 、帕金森症( p a r k i n s o n sd i s e a s e ，p d ) 、p r i o n 疾病( p r i o n d i s e a s e ) 和亨廷顿疾病( h u n t i n g t o nd i s e a s e ，h d ) 等i 卜6 j 。这类疾病的发病原因比较复 杂，目前还没有效的治疗方法。组织化学研究表明，疾病患者的脑中存在不溶性沉积 物，如l e w y 体( l e w yb o d y ) 和l e w y 神经突( l e w yn e u t r i t e ) 。显微学研究发现， 这些异常沉积物是由某些蛋白质积聚或者淀粉样化形成的【7 ，8 j 。病理学、遗传学、生 物化学和生物物理学等多种学科交叉研究表明，蛋白质异常积聚与神经退行性疾病的 发生存在密切的内在联系。 帕金森症( p d ) 是第二大神经退行性疾病，它主要是由黑质中多巴胺能神经细 胞死亡引起的 9 1 0 】。在临床上，它主要表现为反应迟缓，震颤，机体僵硬，进一步失 去平衡等症状。在6 5 岁年龄的人群中，该病患者约占l 左右，而年龄达到8 5 岁的 人群中该病占的比例就上升到了4 - 5 t 5 8 1 。近年来，随着人口老龄化的进一步来到来， p d 给人们的生活带来的压力将显得越加严峻。 p d 有两个主要的病理特征口卅：一是患者大脑黑质部位多巴胺能神经细胞的程序 性死亡；二是患者脑内死亡的神经细胞中有不溶性的路易斯体( l e w yb o d i e s ) 的出 现，其主要成分为a 突触核蛋白( a s y n u c l e i n ) 的纤维化形式。目前，虽然对p d 已经 有了广泛的研究，但对其致病机理还不是完全清楚，不过至少已经知道它与环境毒素， 氧化压力，线粒体功能的丧失，泛肽蛋白酶体介导的蛋白降解通路( u p p ) 以及突触 核蛋白的异常积聚等因素都有关系。病理学研究发现，仪s y n 在p d 患者的神经元细 胞中积聚或纤维化形成细胞内积聚物( l e w yb o d i e s 和l e w yn e u r i t e s ) 1 u , 1 2 1 。免疫学 和组织化学试验发现，q s y n 蛋白不仅能够在体内积聚形成细胞内包涵体，在体外也 容易产生积聚物，而且与细胞内积聚物的形态相似b 3 - 1 6 l 。遗传学研究发现，家族性 p d 患者的a s y n 基因发生突变【1 7 】。动物模型试验也证实o t - s y n 基因敲除或过表达与 p d 的发生直接相关【i s , t g l 。这些结果表明，研究a s y n 蛋白纤维化的分子机制对于了 解p d 的致病原因具有重要意义。 人类s y n u e l e i n 家族包括三个蛋白质，一s y n 、p s y n 和t - s y n ( 表1 1 ) ，其氨基 酸序列的同源性非常高。对三者在体外进行积聚试验研究发现，0 【一s y n 蛋白能够快速 积聚形成与病人体内相似的淀粉样化纤维积聚物，而p 。s y n 和y s y n 蛋白在相同的条 件下积聚的速率十分缓慢1 2 。 表l _ 1 人类的s y n u c l e i n 家族 人的c 一突触核蛋白s y n 是由1 4 0 个氨基酸组成的酸性蛋白质【2 “，在脑部大量表 达并富集于突触前神经末梢1 2 ”。旺s y n 的生理功能目前并不十分清楚，对其表达部位 和表达高峰分布时间的研究表明：f t s y n 可能在突触的发育和可塑性过程中充当一种 突触前调控蛋白 2 6 , 2 7 1 。缸s y n 在不同种属间氨基酸序列高度保守，例如大鼠和小鼠的 a s y n 前9 3 个氨基酸完全相同，人和金丝雀的a s y n 与前二者的前9 3 个氨基酸仅相 差两个氨基酸【撇。a s y n 可以分为三个区域：n 末端区域由6 0 个氨基酸组成，可以 形成两亲性的静螺旋结构，为典型的载脂蛋白的月置结合结构域，其中包括了家族性 p d 的突变位点 2 7 , 2 8 j ；中间区域为极易淀粉样化的n a c ( n o n - a m y l o i dc o m p o n e n t ) 片段 ( 氨基酸残基6 0 一9 5 ) 【”j o j ；及由氨基酸残基9 6 ，1 4 0 组成的酸性c 末端区域。0 c s y n 的前9 5 个氨基酸残基中包含七个不完整的k t k e g v 重复序列，从而导致蛋白质疏水 性的周期性变化p ”。在体外，o r 一s y n 能够结合酸性磷脂形成的囊泡并伴随着二级结构 中a 螺旋含量的增加2 ”j 。 大量试验证据表明，n a c 这个疏水性区域对于a s y n 的积聚至关重要。n a c 片 段本身很容易在体外积聚生成纤维，并且能够引起a b 肽的淀粉样化，a 1 3 肽也能够作 为种子引起n a c 的淀粉样化。这些证据说明n a c 区域在蛋白质的病理积聚过程 中起了重要作用。进一步研究还发现，n a c 区域的c 末端( 对应d s y n 的氨基酸残基 7 9 9 5 ) 并不积聚，然而它的n 末端对应口s y n 的氨基酸残基6 1 7 8 ) 是可以积聚的 3 4 , 3 6 j 。 杜海宁博士的研究证明在a - s y n 的n a c 区域中存在着一个更为核心的部分，即 “v g g a v v t g v 7 4 序列，它对于a - s y n 的纤维化以及积聚物对细胞毒性的产生是必需 的【3 7 i 。另外，有报道说a 1 3 3 6 州能够独立形成异常稳定并高度有序的纡维，是影响 a 1 3 积聚速度的关键因素哪l 。人的p r p l 0 6 1 2 6 区域对p r p 转换为致病表型和产生细胞 毒性都是必需的，而且a l l 7 v 重组蛋白蛋白与家族性g s s 病 ( g e r s t m a n n s t r u s s l e r - s c h e i n k e rd i s e a s e ) 相关1 3 9 “。通过序列比较发现a o 肽、p r p 和| 【x - s y n 中均有一段由非常疏水的氨基酸残基组成的保守序列v g g a v v a g v ( a 1 3 6 m ， p r p u 7 1 2 s ，s y n 6 6 - 7 4 ) 3 0 1 0 其被命名为g a v 基序( g a vm o t i f ) 。 g a v 基序由甘氨酸g l y ，丙氨酸a l a ，缬氨酸v a l 三种氨基酸残基组成，它们在蛋 白质的积聚过程中可能起到不同的作用。g l y 最具柔性，有助于序列在溶液中保持无 规卷曲状态：a l a 可以诱导形成蛋白质二级结构：而疏水性的v a l 具有很强的形成d 折叠的趋向。蚕丝丝心蛋白结晶区中含有由g l y , a l a 组成的大量疏水性的、保j t 型很 强的重复序列。用蚕丝丝心蛋白中的重复序列替换c c - s y n 中的v g g a v v a g v 基序， 研究其对蛋白质积聚过程的影响。在蜘蛛和蚕吐丝的过程中，蚕丝蛋白分子链都存在 一种具有成核依赖性的构象转变及聚集过程。还有试验证明只有在有核或种子引入的 情况下，温度升高可以明显加速d 折叠的聚集增长过程。天然丝( 蚕丝或蜘蛛丝) 的 成丝过程是由无规卷曲向b 折叠构象转变的过程，这是一个成核依赖性的聚集态堆积 过程。p 折叠构象的成核期是整个丝腺体中由无规卷曲转变为丝纤维中p 折叠构象过程 的速率决定步骤。 大量研究还发现，多种蛋白质会发生异常积聚，导致神经退行性疾病。它们通常 具有以下类似特征：( 1 ) 抗蛋白酶水解：( 2 ) 形态通常为长宜纤维或者相互缠绕的纤 维；( 3 ) 能够与荧光染料t h i o f l a v i nt 结合，经刚果红染色后在平面偏振光下呈现双 折射；( 4 ) 具有特异性的交叉d 一折叠结构( c r o s s ps t r u c t u r e ) 【5 1 6 】：( 5 ) 形成过程遵 循成核机制 4 l ，4 引。 1 2 值- s y n c c - s y n 由1 4 0 个氨基酸残基组成，氨基酸序y u j o t m d v f m k g l s k a k e g v v a a a e k t k q g v a e a a g k t k e g v l y v g s k t k e g v v h g v a t v a e k t k e q v t n v g g a v v t g v t a v a q k t v e g a g s i a a a t g f v k k d q l g k n e e g a p q e g i l e d m p v d p d n e a y e m p s e e g y q d y e p e a c t s y n 在p d 患者脑部异常积聚形成l e w y 体和l e w y 神经突，其积聚物常与泛素 蛋白( u b i q u i t i n ) 等共存。此外，1 9 9 7 年发现a s y n 基因的错义突变引起一类家族性 p d l 4 “。体内试验发现，虽然a s y n 在中枢神经系统中大量表达，多巴胺( d a ) 神经 细胞死亡和l e w yb o d i e s 的形成却主要局限于黑质中，而且伍s y n 对于非d a 神经细 胞有保护作用1 4 “。这些发现无疑引起了人们对o 【一s y n 与帕金森症相关性研究的极大关 注。 1 2 1 a s y n 的积聚过程和积聚物特征 试验发现c t , 一s y n 的积聚过程遵循成核机制，分为以下几个阶段：( 1 ) 缓慢的成核 期( 停滞期) ；( 2 ) 快速积聚的生长期：( 3 ) 积聚物和单体之间保持、乎衡的稳态期。 在过饱和状态的成核期，向溶液中加入聚种会立即引发蛋白质积聚。此外，氨基酸位 点突变及改变蛋白质的温育条件均能加速成核过程【4 6 1 。 原子力显微成像( a t o m i cf o r c em i c r o s c o p y ，a f m ) 揭示，0 1 s y n 在积聚过程中主 要以下列形式存在：首先是单体，然后是寡聚体或原纤维，最后形成成熟纤维1 4 7 1 。 1 2 2 影响s y n 积聚的因素 ( i ) 基因突变 q t s y n 基因突变的产物a 3 0 p 和a 5 3 t 与家族性p d 有关。野生型( w i l d t y p e ，w t ) d - s y n 和重组蛋白a 5 3 t 、a 3 0 p 蛋白质具有相同的远紫外圆二色谱( c i r c u l a r d i c h r o i s m ， c d ) 及傅立叶转换红外光谱，都具有无规卷曲结构。野生型q ，s y n 和两种重组蛋白 都能够在体外积聚形成成熟纤维，并伴随着二级结构从无规卷曲变成最终的反平行6 折叠结构【4 8 1 。 ( 2 ) 温育条件 主要包括a s y n 的浓度、溶液p h 、温育的温度和时间、蛋白质种子、异源性物 质等。 a ) c c - s y n 的浓度 分别使用浓度为1 m g m l 、2 5 m g m l 和5 0 m g m l 的0 【一s y n 进行试验，发现a s y n 积聚的速度随浓度的增加而增大【4 9 l 。 b ) 溶液p h 、温育温度和时间 0 【s y n 为酸性蛋白，在中性条件下带负电荷，其内部的疏水作用微弱，在溶液中 以无规卷曲状态存在【5 0 】。电镜观察发现，在3 t c 、中性条件下形成的纤维比较高温 度或较低p h 值时形成的纤维要长，且堆积程度不高【5 ”。前人利用远紫外c d 考察溶 液在p h 分别为：8 9 、7 3 、6 4 、5 3 、4 3 、3 5 、2 7 、1 7 、和o 9 时a - s y n 的构蒙转 换，发现p h 值变化会引起蛋白c d 谱发生可逆性变化。利用荧光染料t h i o f l a v i nt ( t h t ) 荧光强度的增加来反映p h 对昏s y n 纤维化的影响，发现降低p h 后大大缩短 了停滞期，加速了形成纤维的速率5 2 i 。 利用远紫外c d 考察温度分别为：3 0 、9 0 、1 9 0 、3 1 0 、3 9 0 、4 5 0 、5 3 0 、6 2 0 、 7 2 o 、8 2 0 和9 2 0 c 时c t - s y n 的构象转换，发现温度升高可能导致仪一s y n 形成部分折 叠的中间体。动力学分析温度对c t s y n 形成纤维的速度的影响，发现与2 7 、3 7 c 、 4 7 。c 相比，5 t c 时形成纤维的速度最快【5 2 1 。 将一定浓度的c c - s y n 温育o 1 8 天，按时间段将a s y n 超速离心后墩上清，测定其 在2 8 0 n m 处的光吸收值，发现在前6 天变化不明显，温育至7 天时溶液中的a s y n 明显减少，说明在第7 天时积聚物量大大增加。在积聚时问达到1 1 天时，溶液中c c - s y n 4 的量变化越来越小，说明积聚已接近稳态期【5 ”。 c ) 蛋白质种子 向0 【s y n 溶液中加入一定量的积聚物会缩短停滞期，加速形成纤维的速度，这进 一步证实了a s y n 的核聚模式5 2 j 。 1 3 蚕丝蛋白 蚕丝主要由丝素，丝胶两种蛋白质组成，其中丝素占7 0 8 0 ，丝胶为2 0 3 0 【6 ”，丝素是一种纤维蛋白质，不溶于水，丝胶是一种球状蛋白质，溶于水。每根 蚕丝是由两根单丝平行粘合而成，每根单丝的中间为丝素纤维，外围为丝胶。因丝胶 溶于水，在中性丝光皂溶液中煮沸便可脱除。构成丝索的基本单元是氨基酸，各种氨 基酸由肽键结成肽链，再由肽链构成丝索蛋白质【6 9 j 。 蚕丝具有纯度离，来源广等一系列优点。尤其我国是蚕丝的生产大国，家蚕生丝 产量已占世界一半，对其进行详细的研究无论从基础科学还是从应用科学来看都是 很有意义的。天然的蛋白质具有特征的三维空间立体结构。蛋白质空间结构受其氨基 酸序列支配，而蛋白质功能又与其结构密切相关。天然蛋白质纤维有不同的二级结构， 如a 螺旋，d 一转角，d 一片层等。蚕丝以含p 片层折叠为其特征。d 片层折叠的丝肽链 与纤维轴平行。肽链之间靠肽键上的羰基和氨基形成氢键聚集在一起呈片层状结构。 由于肽链组成以短侧链氨基酸为主，通过疏水的相互作用使片层间紧密排列。基因工 程的发展为不同蛋白质序列的密码合成与表达提供了有力的手段1 7 。 天然丝蛋自的高度功能来源于其氨基酸序列的规则的立体结构，一方面它是高 分子( 聚合物) ，另方面它又是由分子量、序列、组成、立体结构规则性等完全被控制 的单一化合物组成。从高分子化合物的合成技术看，目前尚未研究出完全能控制上述 性质的高分子化合物的合成方法。近十多年来，由于基因操作和基因化学合成方法的 建立与发展，利用活细胞的合成体系创造新蛋白质的蛋白质工程( p r o t e i ne n g i n e e r i n g ) 诞生。从理论上说，利用2 0 种氨基酸作为素材，有可能创造出无限种类的蛋白质。 桑蚕丝的丝素蛋白是由十八种氨基酸组成，如表l 所示i 删， 裹1 丝索的氮基酸组成 氯麓麓唆基数氯墓酸凌基数 ( ) 重t重量 ( 烬) 甘氮嗷 4 4 53 s 5谷氨酸l o1 6 丙氮酸 2 9 32 7 7精氟破si 0 亮氟段 sn7腱氯酸20 5 异舞氯酿 7乱9 置氯酸 l0 2 曩氯麓 2 22 7唆氯酸 30 5 苯嚣氛段 6l 2 一囊豫 30 4 丝氯酸 1 2 l1 3 5 姐氰暖 20 3 苏氯葭 91 1 色氯酸 20 4 天门察氰t 1 31 8 氯敷 s 21 0 0 - 残基数重是糖1 0 0 0 单位中的含量 其中取代基较小的甘氨酸( g l y ) 、丙氨酸( a i a ) 和丝氨酸( s e r ) 按照一定的序列结 构排列成较规整的肽段即( g a g a g s ) - 8 , 主要位于丝素蛋白的晶区内，它们的含量约为 8 5 ：而取代基较大的苯丙氨酸( p h e ) 、酪氨酸( t y r ) 和色氨酸( t r y ) 等则主要存在非晶区。 一般认为桑蚕丝的丝素蛋白分子的构象分为两类，i ! p s i l k1 和s i l k | i 结构，s i l ki 结构包 括无规线团和仪螺旋，s i l k i 结构呈反平行仁折叠。有些研究者认为桑蚕丝素蛋白是由 两种亚单元构成，大的亚单元分子量为2 8 3 0 1 0 5 ，小的亚单元分子量为2 0 3 o 1 0 4 。而最新研究认为桑蚕丝素蛋白分子是由分子量为2 8 1 0 、2 3 1 0 和2 5 x 1 0 。 的三种亚单元构成。丝纤维中丝素蛋白的聚集态结构由结晶态和无定型态两大部分组 成，结晶度为5 0 6 0 左右1 7 乱。丝心蛋白的序列中有大量的重复序列，而且这些序列 已经被证明是组成d 折叠的核心区域，也就是构成丝纤维的核心。 1 9 7 2 年s u z u k ie t “7 4 1 进行了家蚕丝心蛋白h 链基因的研究，分离了家蚕后部丝 腺的丝心蛋白m r n a 并测定了其部分序列。1 9 7 7 年o h s h i m ae t a l l 7 副从后部丝腺分 离出总d n a ，将线性化的d n a 片段力f l p o l y ( d a ) 与j 1 p o l y ( d t ) 的p m b 9 质粒连接， 结果得到1 3 个含有丝心蛋白基因的全序列或部分序列的克隆。其中之一含有丝心蛋白 的5r 端及其侧翼序列1 2 k b ，另一个含有3 端及其侧翼序列l k b ，还有一个克隆含有插 入片断，包含有丝一t l , 强白的全基因及其两端的侧翼序列。1 9 7 8 年m m m i n ge t “1 对 丝心蛋白基因及其侧翼序列进行物理图谱分析表明，丝心蛋白基因5 端富含a 2 t ，起 始区含有1 个e c o r 酶切片段，许多限制性内切酲例如h i n di l l ，h a e i i i ，b a mhi ， s 口，i ，户“i 和b i 等，仅切该基因靠近5 端和3 端的位置。编码蛋白区中没 有常用限制性内切酶的酶切位点，包括识别g g c c 序列的h a el i i ( 该酶在g c 含量达6 0 时酶切反应频率商) 和h a e1 l ，h ci i 和f 和d i 。仪有其它3 种酶的酶切位点，它 们分别是h ai ( g c g c ，切成l o 个片段) 、a ，“i ( a g c t ，切成很多小片段) 和 肋口i i ( c c g g ) 。1 9 7 9 年t s u j i m o t oc ta l 7 5 k e 较丝心蛋白基因的核苷酸序列与相 6 对应的c d n a 序列发现其中含有9 7 0 b p 的内含子序列，其5 端位于+ 6 6 ，3 + 端位于二+ l0 3 6 ，编码结晶重复区的起始位置在+ l4 4 8 。由于丝心蛋白基因重复区片段长， 克隆的不稳定性，测序很难进行。因此，g a g e e ta i l ”i 用5 端p s ti 位点和3 端e c o r i 位点切出了丝心蛋白核心重复区，根据限制性内切酶酶谱研究了核心重复区的组成， 发现该基因的1 5k b 核心重复区内有1 0 个编码结晶区的大片段( 约2k b ) ，它们分别被 编码非结晶区的片断( 约2 2 0 b p ) 所分隔。这种编码非结晶区的片断可用三个限制性内 切酶m b o ( g g a a g a ) 、ay ai i ( g g a t c c ) 和胁n 厂i ( g g a n t c ) 的酶切顺序为 代表。并认为该蛋白的结晶区和非结晶区的交互排列是丝加工和溶解性的关键。同时 非结晶区的大小和间隔距离对丝蛋白的结晶性也有影响，一定的大小和间隔距离可避 免丝蛋白在腺腔内过早形成结晶。g a g ee t a l t ”j 比较家蚕2 2 个品种的丝心蛋白h 链基因，发现了1 9 个等位基因，有丰富的多态性，其长度和内部顺序结构均有不同， 这是由于高度重复区之间的重组导致了编码结晶区长度的变化，编码的蛋白大小差异 高达1 5 。s p r a g u e 7 8 l 等推论这种大小的变异是由于基因高度重复区内发生了不等价 交换，从而产生了不同的等位基因所致，他们还认为一定的重排是允许的，因为重组 后编码的蛋白并没有明显改变p 2 折叠结构，相应的蛋白质功能也没有变化。1 9 9 4 年 m i t a w j 等对许多条蚕的丝心蛋白的h 链e d n a 进行测序，对核心重复区的结构进行 了更深一步的研究。发现h 链n 末端自m e t 起1 5 1 个氨基酸为引导肽，富含疏水氨 基酸；c 末端有3 个c y s 残基，c 端2 0 位的c y s 残基与l 链第l9 0 位c y s 残基形成 分子间二硫键，c 端4 位的c y s 残基和最末一位的c y s 残基形成分子内二硫键。除去 n 末端、c 末端，丝心蛋自h 链核心部分约含50 0 0 多个氨基酸。这50 0 0 氨基酸 的核心部分由1 0 个左右的ri i 区段和ci i 区段交错串连构成f 为一种嵌段聚合物) 。 ri i 区段约含3 5 0 5 0 0 个氨基酸，为结晶性区域；c i i 区段为7 0 多个氨基酸的无 定形区域( 非结晶区域) ，ci i 区段还含有a s p 、a s n 、g l u 、l y s 、p h e 、p r o 、t h r 、 t r p 等残基。ri i 区段是由较小的ri 区段和ci 区段交错串连构成。ri 区段是 由结晶性的a 单元和非品性的b 单元组成的重复单位。c l 区段是六肽( 2 g l y 2 s e r 2 g 1 y 2 v a l 2 g l y 2 s e r 2 ) 。a 单元由六肽( 2 g l y 2 a l a 2 g l y 2 a l a 2 g l y 2 s e r 2 ) 的多次重复构成；b 单元由十肽( 2 g l y 2 a l a 2 g l y 2 t y r 2 g l y 2 a l a 2 g l y 2 a l a 2 g l y 2 v a l 2 1 的重复构成。 最近，借助基因操作技术，研究和开始建立能够完全控制上述高分子性质的新的合 成方法，合成了各种各样的含有不同氨基酸组成和序列的新的蛋白质。许多试验室正 在进行人工合成类似蚕丝蛋( 号( f i b r o i n ) 、蜘蛛牵引丝蛋白( s p i d e rd r a g l i n es i l k l 、弹性 蛋白( e l a s t i n ) 、胶原蛋1 1 1 ( c o l l a g e n ) 、角蛋白( k e r a t i n ) 、粘连蛋l 刍( n e e t i n ) 等天然纤维 蛋白质的尝试。为了提高含重复序列蛋白质的功能，也尝试将非天然的氨基酸序列导 入蛋白质中。人工合成含重复序列蛋白质的一般程序是，首先依据该蛋白质的重复单 位( r e p e t k i v e s e q u e n c e ，r e p e a t e dd o m a i n ) 推测密码d n a 序列，化学合成人工基因片段、 7 再由酶“缩合”实现( 基因) 高分子化。将人工基因d n a 插入表达质粒，再导入宿主体 内表达区域或者导入宿主基因组，最后在宿主体内表达产生目的蛋白质。用适当的方 法纯化目的蛋白质。天然的蛋白质具有特征的三维空间立体结构。蛋白质空间结构受 其氨基酸序列支配，而蛋白质功能又与其结构密切相关。天然蛋白质纤维有不同的二 级结构，如a 一螺旋，p 转角，p 一片层，等。蚕丝和蜘蛛丝均以含1 3 一片层折叠为其特 征。1 3 片层折叠的丝肽链与纤维轴平行。肽链之间靠肽键上的羰基和氨基形成氢键 聚集在一起呈片层状结构。由于肽链组成以短侧链氨基酸为主，通过疏水的相互作用 使片层间紧密排列。基因工程的发展为不同蛋白质序列的密码合成与表达提供了有力 的手段。 w y o m i n g 大学的t i r r e u 等( 1 9 9 6 ) 合成基因并表达t 1 3 片层折叠结构和b 转 角结构重复交替排列的具有片层构造的蛋白质。它的氨基酸序列是以a g a g a g p e g 或a g a 2 g a g e g 为重复单位的。a g a g a g 部分取b 一片层结构，p e g 或e g 部分取1 3 转 角结构，妒射线衍射、红外吸收、拉曼光谱分析证实，这种重复单位的蛋白质能够形 成片层构造。质谱和电泳分析证实该蛋白质是单一分子量的蛋白质。该蛋白质在规定 厚度( 层) 取结晶型构造，功能群位于其表面。重复序列区段( g l y a 1 a ) 取b - 片层结 构，其他氨基酸( g l y 、p m 、g l u ) 包含在0 转角之中。例如，( g l y a i a ) 3 一g l y p r o g l u 或者( g l y a i a ) 4 g l y p r o g l u 在大肠杆菌ec o l i 中合成的聚合物含1 0 5 0 次重复序列。但是这些聚合物不结晶，取无定形构型。此后，进一步合成了人工蛋白 质家族( f a m i l y o f a r t i f i c i a lp r o t e i n s ) ：【( a l a g l y ) x g l u g l y 】n - a 成员：x = 3 ，n = 3 6 b 成员：x = 4 ，n = 2 8 c 成