（分析化学专业论文）生物质谱技术研究及其在蛋白质组学中的应用.pdf

作者自述：我是一匹来自西北的“狼”，满怀激动的心情，在复 旦开始学习蛋白质化学和参加蛋白质组学相关的研究课题。两年的学 习生活，有快乐的巅峰，有彷徨的进退，也有失落的底谷。两年的复 旦经历是人生的一笔财富，它将是未来灿烂人生的基石。所以，我最 想说：感谢您复旦。 中文摘要：本研究包括两方面的工作：纳升喷雾装置的研制及其在蛋白质组学 中的应用和稳定同位素化学标记新方法的探讨。放置金属丝穿过玻璃喷头中是一 种提供电接触的简单方法，为了克服使用细金属丝难于操作的局限，我们采用相 对粗的金属丝并将玻璃喷头制作成一端带有很长的玻璃丝以减缓分析液的喷雾 流速。这一改进的纳升喷雾头能长时间稳定喷雾，喷雾流速8 0 - 1 2 0n l m i n 。纳 升喷雾头有很好的检测灵敏度，3 0m i n 喷雾浓度为2 5p g l a l 利血平溶液其准分 子离子峰的平均信噪比( s n ) 为4 2 。改迸的纳升喷雾头可用于分析标准蛋白质 溶液酶解及胶上酶解肽，消耗不足1 微升样品便可实施蛋白鉴定：还可分析实际 蛋白样品，选择了7 个由两维凝胶电泳分离的人类u 9 3 7 细胞裂解液的蛋白质点， 其鉴定结果明显好于相应的l c m s 鉴定结果。同时，我们探讨了在纳升喷雾过 程中添加一辅助电极对纳升喷雾的影响，发现辅助电极的存在可显著改善纳升喷 雾的信噪比，辅助电极存在下电场分布的模拟计算也支持了这一结果。基于金属 丝提供电接触的纳升喷雾头最大缺陷是难于和其它设备在线连接，为了弥补这一 不足，我们制作一种喷雾装置。此装置借助于不锈钢三通将玻璃喷头和金属丝有 效的相连接，三通的其中一个入口作为气体通路，允许气体辅助样品装载。此装 置通过石英毛细管可于其它设备在线连接。在此装置中金属丝无须穿过玻璃喷 头，因而允许玻璃喷头保持极小的喷雾口径，这一安排使纳升喷雾有更低的分析 液流速3 0 一6 0n l m i n 和更高的检测灵敏度。2 5m i n 喷雾浓度为2 5p g l 利血平 溶液其准分子离子峰的平均信噪比( s n ) 为1 7 9 。浓度为1n g g l 的肌红蛋白和 细胞色素c 溶液酶解肽可进行蛋白鉴定，浓度为5n g l a l 的细胞色素c 可提供十 分满意的纳升喷雾的质谱图。我们比较了酸性、中性和碱性介质中蛋白溶液酶解 肽喷雾的差异，此外将喷雾装置与一注射泵连接用来监测有机化学反应的发生。 稳定同位素化学标记新方法的探讨致力寻找简单、有效的同位素化学标记方 法。我们改进了传统的氨基酸肽季铵化方法，用碳酸银替代碳酸氢钾催化季铵 化反应的发生。改进的季铵化反应以氨基酸肽季铵化的季铵化酯化产物为主， 反应体系中无大量金属离子，因而可用质谱现场检测反应产物。此外，我们制备 一个具有很好选择性的乙酰化试剂。改进的季铵化反应及选择性的乙酰化试剂在 定量蛋白质组学中的应用有待迸一步研究。 关键词：电喷雾质谱、纳升电喷雾、蛋白质组学、定量蛋白质组学、溶液酶解、 胶上酶解、稳定同位素标记、季铵化、乙酰化。 a b s t r a c t ：t h i sw o kf o c u s e do nt h ed e v e l o p m e n to f n a n o s p r a yd e v i c ea n di t su s ei n p r o t e o m i c s ，a n d t h e i n v e s t i g a t i o n o ，f a l t e r n a t i v es t a b l e i s o t o p e ，l a b e l i n g m e t h o d i n s e r t i n g am e t a lw i r e t h r o u g han a n o s p r a yt i p i sas i m p l em e t h o df o r p r o v i d i n g e l e c t r i c a lc o n t a c t i no r d e rt oo v e r c o m et h el i m i t a t i o no f h a n d l i n ga ne x c e s s i v e l vf i n e w i r e ，w ee m p l o y e dah a r dm e t a lw i r ea n df a b r i c a t e dt h es p r a y i n gt i pe n d i n gi na v e r y l o n gg l a s sf i l a m e n tt ol e s s e nt h ef l o w r a t eo f a n a l y t e t h i si m p r o v e dt i pc o u l dp e r f o r m a l o n g 。t e r ms t a b l es p r a ya tf l o wr a t e8 0 1 2 0n l m i n ，a n dp r o v i d eh i g hs e n s i t i v i t y ；t h e a v e r a g es no fr e s e r p i n eo v e r a3 0m i nt e s tw a s4 2 t h e s p r a y i n gt i pc o u l db eu s e d t o a n a l y z ee n z y m a t i cp e p t i d ed e r i v e df r o mb o t hi n - - s o l u t i o na n di n - g e td i g e s t i o nw i t hn o m o v et h a n1u l s a m p l ec o n s u m p t i o n t h es e n s i t i v i t yo f t h ep r e s e n tt i pw a sa l s of o u n d s u i t a b l ef o rt h ea n a l y s i so f t r a c e - l e v e lp r o t e i n sa r i s i n gf r o m 2 d g e ls p o t s 7s p o t sf r o m a 2 d - g e lo f h u m a nu 9 3 7 m o n o c y t ec e l lt y s a t ew e r ea n a l y z e db yu s i n gt h et i p ，w i t h t h em a s s s p e c t r a li d e n t i f i c a t i o nf o ra l lt h e s es p o t s a tt h es a m et i m e ，w ei n v e s t i g a t e d t h ed i s t u r b a n c eo fa i ia u x i l i a r ye l e c t r o d eo nn a n o s p r a yb e h a v i o ra n df o u n dt h a ta n a u x i l i a r ye l e c t r o d ew a sh e l p f u lf o re n h a n c i n gt h es no fa n a l y t e t h i se x p e r i m e n t a l r e s u l tw a s s u p p o r t e db y t h ec a l c u l a t e dd i s t r i b u t i o no fe l e c t r i c a lf i e l d t h ed r a w b a c ko f m e t a l w i r eb a s e dn a n o s p m yt i pi st h a ti tc o u l dn o tb ec o n n e c t e dw i t ho t h e rs a m p l e f e e d i n gs o u r c e ss u c ha sl c t om a k eu pt h es h o r t c o m i n g ，w ed e v e l o p e dan o v e l n a n o s p r a yd e v i c et h a tc o m b i n e dt h es p r a y i n gt i pw i t hm e t a lw i r e ；a aas t a i n l e s ss t e e l t e e o n eo fi n l e to ft h et e ew a su s e da s g a sa c c e s s ，t h eg a si nt u r nh e l p e ds a m p l e l o a d i n g t h i sn a n o s p r a yd e v i c ec o u l dm a i n t a i nav e r ys m a l ls p r a y i n go u t l e td u e t on o n e e do fm e t a lw i r ep a s s i n gt h r o u g ht h e s p r a y i n gt i p t h i se n a b l e dt h en a n o s p r a y d e v i c et op o s s e s sf l o wr a t eo f3 0 6 0n l m i na n dr e a c hh 碘s e n s i t i v i t y t h ea v e r a g e s no fr e s e r p i n eo v e ra2 5m i nt e s tw a s1 7 9 ；s p r a y i n ga1 n g i t le n z y m a t i cp e p t i d e s o l u t i o no fm y o g l o b i no r c y t o c r o m e cc o u l d p r o v i d ec o n f i d e n ti d e n t i f i c a t i o n o f p r o t e i n ；s p r a y i n ga5n g g lc y t o c r o m e cs o l u t i o ng a v ef a i r l ys a t i s f a c t o r ys p e c t r u m i n a d d i t i o n ，t h ei n f l u e n c eo fs p r a y i n gm e d i u mo fe n z y m a t i cp e p t i d es o l u t i o no np r o t e i n i d e n t i f i c a t i o nw a sa d d r e s s e d a l s o ，t h ea r r a n g e m e n to f t h e n a n o s p r a yc o n n e c t i n gw i t h o t h e re q u i p m e n tw a se x p l o i t e dt om o n i t o rt h eo c c l u t e n c eo fa n o r g a n i cr e a c t i o n 3 i nt h e p r e s e n tw o r k ，d e v e l o p i n g a s a m p l e ，e f f e c t i v e a n d u n i v e r s a ls t a b l e i s o t o p e l a b e l i n gm e t h o di s o u rs o u n dg o a l w ei m p r o v e dt h et r a d i t i o n a lr e a c t i o no f q u a t e m i z i n ga m i n o a c i da n d p e p t i d eu s i n ga 9 2 c 0 3a sc a t a l y s t t h ea b s e n c eo fm e t a l i o n si nt h er e a c t i o ns y s t e me n a b l e du st oi ns i t ud e t e c tt h eq u a t e m i z i n gp r o d u c t sb y u s i n ge l e c t r o s p r a yi o n i z a t i o nm a s ss p e c t r o m e t r y ( e s i m s ) t h i sm e t h o d c o u l do f f e ra p o t e n t i a lc h a n c ef o rc o m b i n i n gq u a n t e m i z i n ga n dm a s ss p e c t r o m e t r yw h i c h i sh e l p f u l f o rt h ef u t u r eu s eo f q u a n t e m i z i n g r e a c t i o ni nq u a n t i t a t i v ep r o t e o m i c s m e a n w h i l e ，w e p r e p a r e d as e l e c t i v ea c e t y l a t i n ga g e n ta n dh o p ei tc o u l db eu s e di np r o t e o m i c sl a t e r k e yw o r d s ：e l e c t r o s p r a ym a s ss p e c t r o m e t r y , n a n o e l e c t r o s p r a y , p r o t e o m i c s ，q u a n t i t i v e p r o t e o m i c s ，i n s o l u t i o nd i g e s t i o n ，i n g e ld i g e s t i o n ，s t a b l ei s o t o p e l a b e l i n g ， q u a n t e m i z i n g ，a c e t y l a t i n g 4 生物质谱技术研究及其在蛋白质组学中的应用 概论 1 9 0 6 年j j t h o m s o n 发明了质谱，起初只是作为无机化学研究中间位素的 分析工具。4 0 年代后，孩技术被广泛应用于有机化合物，发展成为有机质谱。2 0 世纪8 0 年代后，由于几种软电离技术相继问世，使质谱的应用拓展到分析高极 性、难挥发和热不稳定样品的范围，应用到生物大分子研究，发展成为生物质谱， 并迅速成为现代分析化学最前沿的领域之一。 生物质谱技术包括质谱仪器自身的功能例如电喷雾电离( e l e c t r o s p r a y s p r a yi o n i z a t i o n ，e s i ) ，基质辅助激光解吸电离( m a t r i xa s s i s t e dl a s e r d e s o r p t i o ni o n i z a t i o n ，m a l d i ) 及串联质谱技术；同时包括质谱仪器与其它分 析仪器或化学分析手段连用的技术，最具代表性的是质谱与液相色谱、毛细管电 泳联用技术以及质谱与稳定同位素化学标记联用技术。 生物质谱法的多功能性质，已超过几乎所有其它仪器方法，应用十分广泛， 已成为复杂样品分离分析的强大武器，特别是对大规模的蛋白组学( p r o t e o m i e s ) 研究，生物质谱已成为一个不可替代的重要工具。 目前将复杂蛋白样品的所有成分鉴别并定量，主要有两条线路，其中最常用 的是双向电泳与质谱的结合。另一条是多维l c 技术与质谱及串联技术相结合。 在蛋白质组学研究中，质谱扮演着重要的角色，它在蛋白质鉴定、序列分析、转 录后加工及蛋白质相互作用等方面取得了很大成功。以下生物质谱技术在蛋白质 组学中成功应用的几个方面。 1 m a l d i t o f 肽质量指纹图( p e p t i d em a s sf n g e r p r i n t i n g ，p 肝) 肽质量指纹技术由h e n z e l 等人于1 9 9 3 年提出 1 。该技术是指蛋白质或肽 被特异性的酶如t r y p s i n ，l y s c 等酶切后再用质谱进行肽混合物质量测定，会 得到一套具有特征性的肽质量图，通过与数据库中所有蛋白质的理论酶肽质量相 匹配来鉴定蛋白质。得到酶解肽质量指纹图最快的方法是采用m a l d i t o f 质谱。 这种方法仅需要少量体积酶解肽段溶液点在v , a l d i 板上，激光轰击样品，质谱便 可在几秒钟内给出肽质量图。对于p m f 来讲，m a l d i t o f 质谱仪的质量误差范围 是非常重要参数，现在的m a l d i - t o f 质谱仪采用了离子反射器和延迟提取技术， 通过内标校正，质量误差范围可以达到i 0 3 0 p p m 。目前样品的制备，p m f 分析， 数据库的搜索已经实现了高度自动化集成系统，t r a i n im 等在不到1 0 个工作日 内鉴定了大肠杆菌双向电泳9 5 蛋白质点 2 。在此过程中对于2 d 胶上不同点的 选取以及酶解是分步进行，十分费时，并且自动化选取样品过程中不能区分重叠 的样品点。为此发展了一种分子扫描( m o l e c u l a rs c a n n e r ) 的方法 3 。它是将整 个2 一d 胶上蛋白质样品同时酶解和原位转移至另一张膜上，再直接用 m a l d i t o f m s 对膜上的全体样品进行整体扫描测定。这种思路的难点是质谱扫 描一张图谱所需的时间过长，对于1 6 c m 1 6 c m 的膜，扫描至少需要3 6 天不问断 的工作和大约4 0 g 的磁盘空间来存储如此庞大的原始数据。 2 串连质谱的肽序列标签( p e p t i d es e q u e n c et a g ，p s t ) 上述p m f 方法只有在m a l d i - t o f m s 分析中得到若干以上的肽段的质量并且 数据库存在这种蛋白质才能成功的得到鉴定。实际上，有一部分蛋白质用p m f 方法不能得到可靠的鉴定结果，因此需要进一步得到肽段的序列信息，即肽序列 标签( p e p t i d es e q u e n c et a g ，p s t ) 4 ，一般用串连质谱m s m s 测得，p s t 的优 点是数据库搜索专一性更强，肽段的分子量加上序列信息比单纯用肽段的分子量 去搜索数据库得到的结果更可信。多种类型的质谱仪器可实施串连质谱( m s m s ) 分析，如e s i 一离子阱质谱，e s t - 四极杆质谱，m a l d i - t o f 质谱等。液相色谱一质 谱联用( l c m s ，l c m s m s ) 是近几年发展迅速的新方法，l i n k 等人在研究主要组 织相容性复合体时发展了两维色谱与串联质谱联用技术，提出蛋白蛋复合物直接 分析( d i r e c ta n a l y s i so fp r o t e i ne o m p l e x sd a l p c ) 方案 5 。将蛋白质变性， 酶解后，直接加到强阳离子交换柱上，梯度洗脱进入反相液相色谱，再洗脱进入 m s m s 系统进行肽段分析。w a s h b u m 等人在二维l c m s m s 的基础上提出多维蛋白 质分离鉴定技术，成功地奋力和鉴定了酵母中1 4 8 5 种蛋白质，其中包括一些低 丰度的调控性蛋白激酶 6 。酵母中一些双向电泳技术不能检测的低丰度的蛋白 质用强阳离子交换高效液相色谱和反相m i c r o l c - e s i m s m s 联用技术得到分析 7 。g a t l i n 等实现了自动化的批处理和数据依赖实验 ( d a t a - d e p e n d e n t e x p e r i m e n t s d d e ) 8 。在d o e 中，所有的离子进入检测器被 检测，当有一个样品在h p l c 上洗脱下来进入质谱时( 质谱的总离子流的强度增 6 大) ，软件会自动从m s 切换到m s m s 模式做子离子扫描和数据库搜索。这样可以 实现l c e s i m s m s 的高通量。 3 肽段的从头测序( d en o v os e q u e n c i n g ) p m e 和p s t 实用于鉴定那些数据中已有其序列的蛋白质，对于那些数据库不 存在的蛋白质需要对其酶解的肽段进行序列测定。用m a l d i 或e s i 的串连质谱可 以对多肽进行从头( d en o v o ) 测序，该方法的原理是：选择m s m s 某一离子峰， 从该离子峰开始，向高和低的m z 的方向下去可以得到一系列的氨基酸序列。如 果n l l d i 或e s i 的串连质谱的c i d 能产生高质量的谱，例如谱图含有完整的y 和b 系列的离子。但是通常y 和b 系列的离子的判断具有很低的置信度，使得读 出最终序列很困难。通过在酶切过程中对c 末端离子的特异性同位素标记，可以 使y 系列的离子的鉴别变的容易。一般用含5 0 h 2 s o h = t 8 0 的缓冲液进行胰酶酶切 反应，所有新生肽( 除c 末端肽段) 会有一个同位素标记的c 末端羧基团，在质谱 上将表现为一对峰，其质量数相差2 个质量单位。s a r s 病毒的一个具有强抗原 性的蛋白就是用这种方法在q - s t a r 质谱上测定了全长序列 9 。 4 定量蛋白质组分析 虽然2 一d e 的重复性得到很大的提高，但图像的对比性分析仍然存在一些问 题，一些蛋白质点总会发生迁移，所以很难对这些蛋白质进行定量分析。目前用 同位素亲和标签( i s o t o p e c o d e da f f i n i t yt a g s ，i c a t ) 化学试剂结合质谱的方 法来分析蛋白质表达差异具有较好的应用前景 1 0 。i c a t 是一种人工合成的化 学试剂，其结构包括专一的化学反应基团( 与蛋白质中巯基反应) ，同位素标记的 连接子和亲和反应基团( 一种生物素) 。其连接子可由8 个氢原子( h ) 或氘( d ) 分别 标记，由不同原子标记的i c a t 分子量相差8 d a 。当不同处理条件的细胞或组织 裂解后，分别用不同的i c a t 标记总蛋白。i c a t 反应基团会专一地与蛋白质中的 半胱氨酸共价结合，待反应后，将二者等量混合，再胰酶消化。经亲和层析后， 含生物素i c a t 的酶解片段就可以进行在线l c - m s m s 分析。由于一对i c a t 标记 的两个不同样品的相同肽段在 l s 质谱图上总是出现质量数相差8 d a 或4 d a ( 两个 电荷) 的一对峰。比较这两个峰值，就能得到有表达差异的蛋白质，并用m s m s 鉴定出是何种蛋白质。i c a t 具有广泛的兼容性，可以分析任何条件下的体液、 组织、细胞等绝大部分蛋白质，可阻兼容多种生化和物理的分离策略，因此能很 好的定量分析低含量的蛋白质。但i c a t 仍然也存在一些问题。由于i c a t 分子量 约5 0 0d a ，这对肽段而言是一个较大的修饰物，这会增加数据库搜索的复杂性。 最近发展了新一代的c i c a t 于( c l e a v a b l ei c a t ) 化学试剂 1 1 ，c i c a t 在原来的 基础一做了一些改进。其连接分子分别由9 个“c 和。标记，这样由不同原子标 记的i c a t 分子量相差9 d a 。在同位素标签的连接子和亲和反应基团之间增加了 一个酸解位点，在i c a t 标记的肽段的分离纯化后可以通过酸裂解将亲和反应基 团生物素切掉，裂解后的同位素标签的分子量只有2 2 7 ( 2 3 6 ) d a ，大大减少了数 据库搜索的复杂性。c i c a t 定量蛋白质组分析一般采用两种策略，第一种策略是 分别用c l c a t 的”c 和”c 标记两个样品的蛋白质，然后等量混合后进行酶解，再 过阳离子交换柱，亲和层析柱纯化，最后进入在线l c e s im s m s 或 2 d l c - e s i m s m s 分析，也可以经过离线的l c 或2 d l c 分离，用p r o b o t 自动点 样器将样品点在m a l d i 板上，再进行m a l d im s m s 分析。第二种策略是将标记好 的蛋白质等量混合后直接用s d s p a g e 分离，然后取蛋白质条带进行酶解，亲和 层析柱纯化后再进行l c - m s m s 分析。 5 。质谱分析蛋白质的翻译后修饰( p o s t t r a n s l a t i o n a lm o d i f i c a t i o n s ) 蛋白质组研究的一个重要进展是蛋白质表达水平和翻译后修饰的分析，如磷 酸化、糖基化，甲基化等。而蛋白质的磷酸化分析是最令人关注的，因为蛋白质 的磷酸化和去磷酸化几乎调节着生命活动的所有过程，包括细胞增殖、发育与分 化、新陈代谢、信号传导等。磷酸化蛋白质可以用“p 标记或者用磷酸化专一性 的抗体进行免疫印迹。s o s k i c 等平行地用2 一d 胶分离同一样品，其中一块用磷 酸化专性的抗体进行免疫印迹找出磷酸化蛋白质，另一块胶进行正常的染色并 将磷酸化的蛋白质点酶解进行质谱分析 1 2 。糖基化蛋白质的检测也可以用类似 的印迹方法 1 9 。更详细的分析蛋白质的磷酸化和糖基化则可以用质谱来完成。 用质谱方法来确定蛋白磷酸化位点有以下几种可行的方法。要找出酶解的混合肽 段中哪一个肽段被磷酸化了，可以用磷酸酯酶处理和m a l d i t o f m s p m f 相结合 的方法。其原理是磷酸酯酶处理后、磷酸化的肽会丢失磷酸基团而产生特定质量 8 数的变化，m a l d i t o f m s 通过检测这种质量数的变化而确定磷酸化肽。另一种 方法可以采用三级四级杆串联质谱的前体离子扫描技术( p r e c u r s o ri o ns c a n ) 进行检测 1 4 。蛋白质酶解肽段经c i d 后会产生许多肽片段，这些特异性的片段 在串连质谱进行前体离子扫描时可以作为磷酸肽的“报告离子”。s t e e n 等用该 方法成功地分析了表皮生长因子( e g f ) 的酪氨酸磷酸化修饰 1 5 。h i n s b y 等用该 方法对成纤维细胞生长因子受体过量表达诱导下的酪氨酸磷酸化修饰的蛋白质 进行了分析 1 6 。近来，傅立叶变换离子回旋质谱的电子捕获解离( e l e c t r o n c a p t u r ed i s s o c i a t i o n 、e d c ) 已被成功地应用于鉴定肽片段的磷酸化位点 1 7 。 6 质谱与化学交连相结合分析蛋白质与蛋白质相互作用 化学交联一质谱分析是近年来发展的测定蛋白质的三级结构及研究蛋白质相 互作用分析方法 1 7 2 0 。这一方法包括交联反应部分，即使用末端交联试剂和 兴趣蛋白的活性基团如巯基或氨基反应生成交联复合物。交联试剂有很多种，常 用的交联试剂有同双功能氨基反应交联剂、同双功能巯基反应交联剂及异双功能 氨基、硫基反应交联剂。以下给出了这些交联试剂的结构通式。 同双功能氨基反应交联剂 同双功能巯基反应交联剂 0 书h 2 占 o o o 0 异双功能氨基、硫基反应交联剂 o 2 釉 o o 氨基反应交联剂是基于n 羟基琥珀酰亚胺酯能与脂肪族胺发生反应。 o 0 o 复一蛳一童+ 越一r + r n h 2 r n h 迅r + 厂7 、o h 而硫基反应交联剂则是基于马来酰亚胺与硫基类化合物的反应。 。岛。 hc 正、 址 0 人 r n i l + r ? 一s h _ + r 一 | o 0 o 兴趣蛋白与交联试剂反应生成交联复合物，该复合物经历酶解，酶解肽段由质谱 分析，从而确定交联位点。这些位点在蛋白分子内的最大距离可以表征蛋白质的 折叠或确定在一个复合物中相互作用蛋白的定向。和其它研究蛋白质结构的技术 方法如x 一单晶衍射和核磁共振相比，这一技术具有样品用量少，实验周期短等 特点。此外，由于最后的分析物是蛋白或蛋白复合物的酶解产物，故被分析蛋白 的分子量不受限制。 然而，在酶解肽段的质谱分析过程中，会出现和交联试剂相连肽段由于质谱 信号强度过低，加上没有特征的质谱峰出现而往往被忽略，从而影响蛋白质交联 复合物的结构解析。因而，科学家们采用一新的分析方法，即将稳定同位素标记、 交联及质谱相结合 2 1 2 2 】。稳定同位素标记是随着蛋白组学的兴起而出现的一项 分析新技术。此技术基于将重氢引入蛋白质反应试剂，蛋白质在同等的条件下分 别与标记试剂( d 。，反应试剂中有n 个氢被氘取代) 和未标记试剂( d o ，反应试 剂中有0 个氢被氘取代) 反应，随后将反应物等量混合( d o ：d 。= 1 ：1 ) 经历酶解， 酶解肽段由质谱( m s ) 及串联质谱( m s m s ) 分析，结合蛋白质谱库检索，确 定蛋白质的一级结构。质谱图中，重氢标记的肽段( d n ) 与正常肽段( d o ) 形成 质量相差n 的一对峰，这一对特征峰，在质谱图中很容易辨认，因而有利于低丰 度肽段的分析。同时，质量相差n 的这一对峰可被用于蛋白质的比较定量分析。 将稳定同位素标记、交联及质谱相结合是目前以质谱为基础研究蛋白质相互 作用的最新进展。其思路是将重氢标记的与未标记的交联试剂等量混合( d o ：d n = 1 ：l ，d o ，交联试剂中有0 个氢被氘取代；d n ，交联试剂中有n 个氢被氘取代) 后与蛋白质复合物反应。交联的蛋白复合物经历酶解和质谱分析，确定复合物的 组成及相互作用位点。质谱分析中，含有d n 标签的肽段峰易于辨认。 参考文献 l - h e n z e wl ，b i l l e c it m ，s t u l t sjy ，e ta l 。p r o c n a t a e a d s c i u s a ，1 9 9 3 ，9 0 ，5 0 1 1 5 0 1 5 2 t r a i n im ，g o o l e yaa ，o uk ，e ta l ，e l e c t r o p h o r e s i s , 1 9 9 8 。1 9 。1 9 4 1 1 9 4 9 3 b i e n v e n u tw v ， s a n c h e z j c ，k a e m i n e a ，e t a l ， a n a l ，c h e m 1 9 9 9 ，7 1 ，4 8 0 0 4 8 0 7 4 e n gjk ，m e c o r m a c k a l ，y a t e sjr ，a m s o c j t a s s s d e e t f t l l l l , 1 9 9 4 ，5 ，9 7 6 9 8 9 5 l i n ka3 ，e n g 。s c h i e l t zdm ，e ta l ，a t b i o t e c h o , 1 9 9 9 ，1 1 6 7 6 6 8 2 6 w a s h b u mmp ，w o l t e r sd ，y a t e sjr ，n a t b i o t e e h o , 2 0 0 1 ，1 9 ，2 4 2 2 4 7 7 p e n gj ，e 1 i a sje ，t h o r e e ncc ，e ta l ，厅o t e o m er e s 2 0 0 3 ，2 ，4 3 5 0 8 g a t l i ncl ，e n gjk ，c r o s sst ，e ta l ，a n a l c h e m 2 0 0 0 ，7 2 ，7 5 7 7 6 3 9 k r o k h i n 0 ，l iy ， a n d o n o v a ， e t a l ，m e 国1 7 p ，dt e o 脚l e $ , 2 0 0 3 ，2 ，3 4 6 3 5 6 1 0 g y g isp ，n a t b f o t e e h o 1 9 9 9 ，1 7 ，9 9 4 9 9 9 1 1 l ij ，s t e e nh ，g y g isp ，m o t c e l lp r o t e o m i c 且2 0 0 3 ，2 ，1 1 9 8 1 2 0 4 1 2 s o s k i c v 。 g o r l a c h m ，p o z n a n o v i cs ， e t a l ， ，b i o c h e m 1 9 9 9 ，3 8 ，1 7 4 5 1 7 6 4 1 3 。b a t e m a nrh ，c a r r u t h e r sr ，h o y e sjb ， e t a l ，a t a m s o c m a s s s p e t r u m 2 0 0 2 ，1 3 ，7 9 2 8 0 3 1 4 w i l mm ，n e u b a u e rc ，m a n nm ，a n a l c h e r n , 1 9 9 6 ，6 8 ，5 2 7 5 5 3 1 5 s t e e nh ， k u s t e r b ， f e r r n a n d e z m ， e t ，b i 0 1 c h e m 2 0 0 2 ，2 7 7 ，1 0 3 1 1 0 3 9 1 6 h i n s b y a m ， o l s e n jv ， b e n n e tk l ， e t a l ， g o i c e l l p r o t e o m l e s 2 0 0 3 ，2 ，2 9 3 6 1 7 c h e nxhc h e nyh ，a n d e r s o nve ， 1 8 b a c kjw ，h a r t o gaf ，d e k k e rhl ， 2 0 0 1 ，1 2 ；2 2 2 2 2 7 1 9 p e a r s o nkm ，p a n n e l llk ，f a l e shm ， 1 6 ：1 4 9 一1 5 9 1 2 a n a l b i o c h e m 1 9 9 9 2 7 3 ：1 9 2 2 0 3 e ta l ，a m s o c m a s ss p e c t r o m r a p i dc e m m u n m a s s $ e c t r o m2 0 0 2 ， 2 0 m u l l e rdr ，s c h i n d l e rp ，t o m b i nh ，e ta l ，a n a l c h e m 2 0 0 1 ，7 3 ：1 9 2 7 1 9 3 4 2 1 r a p p s i i b e rj ，s i n i o s s o g l o us ，h u r tec ，e ta l ，a n a l c h e m ，2 0 0 2 ，7 2 2 6 7 - 2 7 5 2 2 w i n ern ，d i a ljm ，t o m e rkb ，e ta l ，a n a l ，c h e m , 2 0 0 2 ，7 4 ：1 9 3 9 1 9 4 5 1 3 第一章纳升喷雾装置的研制及其在蛋白质组学中的应用 第一节前言 电喷雾质谱法( e s i m s ) 是一种新发展起来的软电离质谱技术。1 9 6 8 年， d o l e 等 1 首先发现了从一带电毛细管尖端喷射溶液而产生大分子气态离子的 可能性。然而，这一早期工作被应用于离子迁移光谱仪，而不是质谱仪的离子 分析。直到本世纪8 0 年代中期，f e n n 等 2 以d o l e 等的思路为基础，才将电喷 雾真正发展为质谱仪的接口。短短十几年来，e s i m s 技术取得了迅速的发展， 尤其在生命科学领域中得到了广泛的应用。e s i m s 能直接分析溶液样品，由于 它不象电子轰击( e 工) 、化学电离( c i ) 等常规电离技术存在样品加热汽化的过 程，因而特别适合分析强极性、难挥发或热不稳定的化合物，特别是生命科学中 感兴趣的物质。由于e s i 能产生多重电荷形式的离子，因而利用常规m z 范围 的质谱仪即可实现大分子质量离子的测定，能快速、灵敏、准确地测定分子质量 高达几万到十几万d a 的生物大分子。e s i - m s m s 技术在推断大分子序列结构方面 有卓越的表现。e s i m s 与h p l c 、c e 在线联用技术是目前分析复杂生物介质中痕 量生物活性物质的最佳手段。以下就电喷雾的原理及其应用做一简单的讨论。 1 电喷雾的基本原理 电喷雾的实验过程可简述为：常压下，分析物的溶液通过一带高电压的毛细 管，在约几千伏的高电场作用下，产生高度带电荷的雾状液滴，它们沿着电压和 压力梯度，经刮削器( s k i m m e r ) 到达质谱仪的分析器。在迁移过程中，液滴由 于溶剂蒸发或库仑爆炸而体积逐渐减小，最后产生完全脱溶剂的离子( 见图1 ) 。 电喷雾过程可被分为3 个阶段：液滴形成、液滴萎缩和气态离子形成。已有 几篇综述 3 - 6 概括了目前对电喷雾过程几个阶段的机理的认识。溶液被输送至 一带高电压的电喷雾毛细管尖端，假设在正电压下，溶液中的正离子会在表面累 积，并沿低场方向被吸出，形成“t a y l o r 锥”。如果所加的电场足够高，使静 电力超过表面张力时，锥被抽成细丝，经过“发芽”( b u d d i n g ) 过程，产生带 正电荷的液滴。当带电液滴沿压力梯度向质谱仪的分析器迁移时，溶剂从液滴上 蒸发，导致液滴体积缩小，表面的电荷密度增大，当达到r a y l e i g h 极限时，电 荷间的库仑斥力足以抵消使液滴保持完整的表面张力，液滴发生碎裂，即库仑爆 炸，形成更小的液滴。对电喷雾过程中产生气态离子机理的解释主要有两种：d o l e 的“单一离子液滴理论” 1 认为，液滴由于溶剂蒸发或库仑爆炸而体积逐渐减 小，最终可能导致形成仅含单一离子的液滴，随着溶剂的进一步蒸发，可能生成 完全脱溶剂的气态离子。i r i b a r n e 和t h o m s o n 的“离子蒸发理论” 7 ，8 认为， 由于带电离子与液滴中其他电荷的相互排斥作用，可能从小的、高度带电的液滴 上蒸发出离子。许多质谱学家对上述理论进行了补充与完善，并提出了更新的观 点 9 一1 1 。需要说明的是，离子向气相的转移不是一个能量过程，研究表明，去 溶剂化的过程使离子冷却 1 2 。另外，由e s i 产生的单一分子形式的气态离子 可能有几种电荷态，而在接口中经历离子一分子碰撞，还可能导致气态离子电荷 态的变化，这样，通常会观察到多重电荷形式。 图i 电喷雾过程 秽芝蠢0 = = ：= = 面i o ，曲0 2 2 业半吒。 o t o 穆t 舯 。s 。o l v e n 。t 。d r o | j 。p l 。e t j ：嚣篮嚣：。 2 利用e s i m s 研究非共价键复合物 电喷雾是一种软电离技术，样品分子在电喷雾电离时通常不发生裂解，它能 够在非常接近天然溶液状态的情况下将非常弱的蛋白质非共价键复合物从液相 转变为气相而进行测定。由于电喷雾接口的主要功能之一是消除分析物和溶剂分 子间的非共价相互作用，即保证充分去除溶剂，因此，拦截这一过程可能保留分 析物的相对较强的非共价相互作用。令人感兴趣的非共价相互作用主要有：影响 离子三维结构的离子内相互作用、相同或结构相似组分的聚合作用以及由特异性 生物功能相关联的结构不相似组分的相互作用。近几年来，研究特异性生物分子 一有机分子复合物成为热门课题 1 3 ，利用e s i m s 法已初步研究了溶液中蛋白质 一配体 1 4 ，1 5 、酶一活化n 抑制剂 1 6 ，1 7 、d n a 一药物 1 8 、离子通道一抑制 剂 1 9 等非共价相互作用，在研究生物分子结构及药物作用机理、药物的构效关 系等方面取得了较大进展，为从分子水平筛选药物先导物开辟了新途径。 3 e s i m s 与h p l c 或c e 联用 h p l c e s i m s 或c e e s i m s 联用法是分离和分析相结合的技术，目前已成 为分析复杂生物体系中痕量生物活性物质的强有力手段，现有的商品仪器己相当 成熟。由于电喷雾接口中样品溶液的流速通常在3 2 0 ul m i n 的范围内，为了 与常规的“分析型”h p l c 相匹配，已进行了努力，使仪器适应高得多的流速。 h e n i o n 等 2 0 设计了一个雾化器辅助电喷雾接口，允许与流速高至2m l m i n 的 色谱柱相