（微生物学专业论文）pcr技术检测乳品中金黄色葡萄球菌研究.pdf

摘要 金黄色葡萄球菌是引起细菌性食物中毒的重要病源菌之一，国内外由金黄色葡 萄球菌引发的食物中毒屡屡发生。引起食物中毒的食品多为动物性食品、乳及乳制 品等。目前，国内检测食品中金黄色葡萄球菌仍采用传统的方法，其操作繁琐，检 测时间较长，通常需要3 5 d 才能完成，且灵敏度较低。本研究针对食品中金黄色 葡萄球菌p c r 检测的特殊性，建立了快速检测乳品中金黄色葡萄球菌的p c r 方法， 消除p c r 反应抑制因子，缩短食品中金黄色葡萄球菌的检测时间，提高检测方法的 灵敏性，为金黄色葡萄球菌引起的食源性疾病的快速诊断提供技术支持。 本研究以金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因( n u c ) 为靶基因，选择特异性引物，进行 p c r 扩增，检测乳品中的金黄色葡萄球菌。对p c r 反应体系中镁离子浓度、模板量 及退火温度和循环数进行优化，以确定适宜p c r 反应体系和p c r 扩增程序，其适宜 反应体系为：5 l x l1 0 x p c rb u f f e r ( 2 0 0m mt r i s h c l p h8 3 】，5 0 0m mk c i ，1 5m m m g c l 2 ，0 1 w t v 0 1 g e l a t i n ，0 5 t w e e n2 0 ) ，4 斗1d n t p s 混合物，0 5 p l4 0 p m o t 正向 引物，0 5 p 14 0 1 a m o l 反向引物，0 2 5 p l ( 5 u r t l 。1 ) t a q ，模板2 9 l ，水3 7 7 5 p l ，总反 应体系5 0 m ；其适宜p c r 扩增程序为：p c r 反应采用冷启动，9 4 预变性4 m i n ，再 按9 4 l m i n 5 2 0 5 m i n 7 2 1 5 m i n 进行3 5 个循环，最后7 2 延伸3 5 r a i n 。p c r 反应产物在2 的琼脂糖凝胶中进行电泳，凝胶成像系统观察结果。对p c r 扩增产 物进行了d n a 测序，p c r 扩增产物d n a 序列与靶基因序列的同源性达9 9 6 ，从而 证实p c r 扩增产物确为目的扩增产物。采用p c r 方法共检测了6 0 株金黄色葡萄球菌 和2 0 株其他革兰氏阳性菌和阴性菌，结果表明6 0 株金黄色葡萄球菌中6 0 株均为阳 性结果；2 0 株其它菌株均为阴性结果，因此本研究选择的引物特异性强。p c r 方法的 灵敏度为0 6 7 5 p g 。 本研究对乳品中金黄色葡萄球菌d n a 的6 种提取方法进行了比较，确定了一种 可有效从乳品中提取金黄色葡萄球菌d n a 的方法该方法无需对样品进行增菌，可 直接从乳品中提取金黄色葡萄球菌d n a ，作为模板进行p c r 检测，检测效果良好。 采用该方法成功地从人工污染金黄色葡萄球菌的全脂乳、脱脂乳和奶酪中提取了金 黄色葡萄球菌的d n a ，消除了p c r 反应抑制因子。这种直接从乳品中检测金黄色葡 萄球菌的p c r 方法灵敏度高，耗时短，全腊乳和脱脂乳检测的灵敏度为l o c f u m l ， 奶酪检测的灵敏度为5 5 c f u g ，可在6 h 内完成对乳品中金黄色葡萄球菌的检测， 比目前普遍采用的先增菌再进行p c r 检测的方法缩短了1 2 2 4 h 本研究所采用的p c r 检测乳品中金黄色葡萄球菌方法与国标6 b4 7 8 9 1 0 9 4 方 法及两种快速检测致病性金黄色苞萄球菌测试片做了比较，结果表明： p c r 方法的敏感性为1 0 0 ，特异性为8 6 7 ，符合率为9 4 3 ，检测时间为6 h ； p e t r f i l m r s a 方法的敏感性为1 0 0 ，特异性为9 3 3 ，符合率为9 7 1 ，检测时 间为3 0 h ：b a i r d p a r k e rr p f 方法的敏感性为1 0 0 ，特异性为9 3 3 ，符合率 为9 7 1 ，检测时间为3 0 h 。三种方法的敏感性相同，p c r 方法的特异性低于其他 两种方法，p c r 方法的符合率稍低于其他两种方法，但p c r 方法捡测时间比其他两 种方法缩短了2 4 h 。 关键词：聚合酶链式反应；检测；乳品：金黄色葡萄球菌 s t u d yo np o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o na s s a yf o rd e t e c t i o no f s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s i nd a i r yp r o d u c t s y a n g y m g m a j o r ：m i c w b i o l o g y ( s c h o o l o f f o o d s c i e n c e & t e c h n o l o g y , h d x i a g l i c u l t u r a l u n i v e r s i t y ) s i 】碑m 妍：p i i d 缸s o r 丑m g w e i a b s t r a c t s t a p h y l o c o c c u sa u r e u sh a sb e e nc o n s i d e r e do n eo ft h em o s ti m p o r t a n tb a c t e r i ac a u s i n g f o o dp o i s o n i n g i nt h ew o r d ，t h e r ea r em a n yc a s e st h a ta r ec a u s e db ys a u r e u s f o o d st h a t a r ef r e q u e n t l yi n c r i m i n a t e di ns t a p h y l o c o c c a lf o o dp o i s o n i n gi n c l u d em e a ta n dm e a t p r o d u c t s ，m i l ka n dd a i r yp r o d u c t sa n ds oo n t h ec o n v e n t i o n a lm e t h o do fi n s p e c t i n gf o o df o rp o s s i b l ec o n t a m i n a t i o nb yc o a g u l a s e p o s i t i v es t a p h y l o c o c c u sa u r e u si st o ot i m e c o n s u m i n g ，w h i c hc a nt a k e3t o5d a y st o c o m p l e t e a n di ti sn o te n o u g hs e n s i t i v et od e t e c ts a u r e u s i nt h i ss t u d y s p e c i f i c a l l y p r i m e r sh a sb e e nd e s i g n e da n dar a p i dm e t h o dh a sb e e ne s t a b l i s h e dt od e t e c t s t a p h y l o c o c c u sa u r e u si nf o o dt os h o r t e nt i m eo fd e t e c t i o n ，i n c r e a s et h es e n s i t i v i t yo f m e t h o da n d p r o v i d eat e c h n i c a lh e l p i nt h i ss t u d y , d n ac o n c e n t r a t i o n ，m g c l 2c o n c e n t r a t i o n ，a n n e a l i n gt e m p e r a t u r ea n dp c r c i r c l e sa r eo p t i m i z e dt od e t e r m i n et h eo p t i m a lp c r t h er e a c t i o nm i x t u r ec o n s i s t e do f5 l o f1 0 x p c ra m p l i f i c a t i o nb u f f e r ( 2 0 0m mn i s h c l p h8 3 】，5 0 0m mk c l ，1 5m m m g a 2 ，0 1 w t v o l 】g e l a t i n ，0 5 t w e e n2 0 ) ，4 mo fd n t p s ( 1 m me a c hi ns o l u t i o n ) ，0 5 p l o fe a c hp r i m e r ( 4 0 u ms t o c ks o l u t i o n ) ，0 2 5 r qo ft a q ( 5 u 埘一o fs t o c ks o l u t i o n ) ，2 o f d n a a n d3 7 7 5mo fd o u b l e d i s t i l l e dw a t e r t h er e a c t i o nw a sr u nu n d e rt h ef o l l o w i n g c o n d i t i o n s ：c o o 】s l a r l ；d n ap r e d e n a l u r a l i o na l9 4 f o r4m i n ；d n ad e n a l u r a t i o na t9 4 f o r1r a i n ，p r i m e ra n n e a l i n ga t5 2 f o r0 5r a i n ，a n dd n ae x t e n s i o na t7 2 f o r1 5 m i nf o r3 5c y c l e s ；t h el a s te x t e n s i o nw a sp e r f o r m e da t7 2 f o r3 5m i n t h ep c r p r o d u c t s w e r ee x a m i n e d b ye l e c t r o p h o r e s i s w i t h 2 a g a r o s eg e l s y n t h e t i c o l i g o n u c l e o t i d ep r i m e r so f2 1a n d2 4b a s e s ，r e s p e c t i v e l y , w e r eu s e di n t h ep o l y m e r a s c c h a i nr e a c t i o nt oa m p l i f yas e q u e n c eo ft h enucg e n e ，w h i c he n c o d e st h et h e r m o s t a b l e n u c l e a s eo fs t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ad n a f r a g m e n to f2 7 9b pw a sa m p l i f i e d p c r p r o d u c t sw e r ec o n f i r m e db yd n as e q u e n c i n g t h e r ew e r e8 0b a c t e r i a ls t r a i n st ob e d e t e c t e di n c l u d i n g6 0 & a u r e u ss t r a i n sa n d2 0o t h e rb a c t e r i a ls t r a i n se x c e p tf o rs a u r e u s s t r a i n si no r d e rt od e t e r m i n es p e c i f i c i t yo fa m p l i f i c a t i o no fp r i m e r s t h er e s u l t so f6 0 s t r a i n so fs t a p h y l o c o c c u sa u r e u sw e r ep o s i t i v ea n dt h o s eo f2 0o t h e rs t r a i n sw e r e n e g a t i v e w i l ht h ei s o l a t e dt a r g e tt h el o w e rd e t e c t i o nl i m i tw a s0 6 7 5p go fd n a t 1 l e e f f e c to f6m e t h o d so fe x t r a c t i n gd n af r o ms t a p h y l o c o c c u sa u r e u si nd a i r yp r o d u c t s w e r ec o m p a r e d ae f f i c i e n te x t r a c t i o np r o c e d u r ew a sc o n f i r m e df o re x t r a c t i o no f s t a p h y l o c o c c u sa u r e u sd n af r o md a i r yp r o d u c t s s t a p h y l o c o c c u sa u r e u sd n aw a s d i r e c t l ye x t r a c t e df r o md a i r yp r o d u c t sw i t h o u te n r i c h m e n t t h ee x t r a c t e dd n aw a s s u i t a b l ef o rp c rd e t e c t i o n as o l v e n te x t r a c t i o np r o c e d u r ew a ss u c c e s s f u l l ym o d i f i e df o re x t r a c t i o no f s t a p h y l o c o c c u sa u r e u sd n af r o ma r t i f i c a l l yc o n t a m i n a t e dw h o l em i l k ，s k i mm i l ka n d c h e e s e t h es e n s i t i v i t yo ft h eu n i p l e xp c ri s1 0 c f u m l o fw h o l em i l k s k i mm i l ka n d 5 5 c f u 9 1 c h e e s e t h cd e v e l o p e dm e t h o d o l o g ya l l o w sd e t e c t i o no fs t a p h y l o c o c c u sa u r e u s i nd a i r yp r o d u c t sj nl e s st h a n6 h t h et i m e o ft h i sd e v e l o p e dp c r a s s a yi sl e s s1 2 2 4h t h a nt h et i m eo fg e n e r a ip c ra s s a yw i t he n r i c h m e n tm e t h o d i nt h i s s t u d y , t h eu n i p l e xp c r ，g b 一4 7 8 9 1 0 9 4 ，p e r i f i l m r s ac o u n tp l a t e ，a n d b a i r d p a r k e l r p f a g a r w e r ec o m p a r e d t h er e s u l ti n d i c a t e s ：t h es e n s i t i v i t yo fp c ri s 1 0 0 ，t h es p e c i f i c i t yo fp c ri s8 6 7 t h ec o i n c i d e n c er a t e so fp c ri s9 4 3 ，t h et i m eo f d e t e c t i o ni s6 h ；t h es e n s i t i v i t yo fp e r i f i l m r s ac o u n tp l a t ei s1 0 0 ，t i l es p e c i f i c i t yo f p e r i f i l m r s ac o u n tp l a t ej s9 3 3 t h ec o i n c i d e n c er a t e so fp e r i f i l m r s ac o u n tp l a t e i s 9 7 1 t h et i m eo fd e t e c t i o ni s3 0 h ；t h es e n s i t i v i t 丫o fb a i r d p a r k e r r p f a g a r i s1 0 0 ， t h es p e c i f i c i t yo fb a i r d p a r k e r r p e a g a r i s9 3 3 t h ec o i n c i d e n c er a t e so f b a i r d p a r k e r r p e a g a r i s9 7 1 t h et i m eo fd e t e c t i o ni s3 0 h n es e n s i t i v i t yo ft h r e e a s s a y si si d e n t i c a l t h es p e c i f i c i t ya n dt h ec o i n c i d e n c er a t e so fp c r i sl e s st h a no t h e r a s s a y s ，b u tt h et i m eo fp c rd e t e c t i o ni sl e s s2 4 ht h a nt h et i m eo fp e r i f i l m r s ac o u n t p l a t ea n db a i r d p a r k e r r p e a g a r k e yw o r d s ：p c r ；d e t e c t i o n ；d a i r yp r o d u c t s ；s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑韭壅些墨茔或其他 教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：币易f 罕 签字日期：b u i 年6 月三日 学位论文版权使用授权书 本学位沦文作者完全了解堑i 垦垒些盘茎有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查 阅和借阅。本人授权塑墨堡垒些盘鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： j 渤海 导师躲退 签字日期：d 厂年f 月2 p 日签字日期：抽歹年6 月2 日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： p c r 技术检测乳晶中金黄色葡萄球菌研究 1 i 立题的背景和意义 1 引言 食品安全是一个重大的世界性的公共卫生问题。随着食品生产的工业化和新技 术、原材料、新产品的采用，造成食品污染的因素日趋复杂化；高速发展的工农业带 来的环境污染问题，也波及到食物并引发一系列的严重的食品污染事故。全球各地连 续发生一系列的食源性疾病爆发事件：英国的疯牛病；日本出血性大肠杆菌0 1 5 7 ： h 7 和雪印牛奶的葡萄球菌肠毒素中毒事件；法国的李斯特氏菌中毒；比利时的二恶 英污染；全球范围的禽流感等均引起世界范围的震惊。 近年来，由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒越来越多，据美国疾病控制中心报告， 由金黄色葡萄球菌引起的细菌性食物中毒居第一位，占整个细菌性食物中毒的3 3 ， 加拿大则高达4 5 0 5 ，由此而造成的经济损失也相当惨重“1 。我国由金黄色葡萄球菌引 起的食物中毒病例也时有报导。目前世界各国都把金黄色葡萄球菌列为食品卫生的法 定检测项目。 我国对金黄色葡萄球菌目前采用的方法是以国家标准g b 4 7 8 9 一l o 一9 4 及检验检 疫系统行业标准s n 0 1 7 2 - 9 2 作为依据。整个检测过程获得最终结果须时5 d 左右，既 费时又费力，并造成货物积压，电影响货物的及时出运，并使货主的仓储成本提高， 造成较大的经济损失。 我国是一个食品生产和消费大国，随着市场经济的快速发展和生活水平的提高， 特别是加入w t o 后，消费者对食品安全更加关注，食品安全与食品贸易的关系更为密 切，提高我国食品安全水平的要求越来越迫切。为确保食品安全与食品贸易，需要大 力加强食品检验的力度，传统的检验方法已不适应时代发展的要求，迫切需要建立快 速、灵敏的金黄色葡萄球菌的检验方法。 1 2 金黄色葡萄球菌简介 1 2 1 金黄色葡萄球菌生物学特征 形态与染色：典型的金黄色葡萄球菌为球型，直径0 8 啪左右，显微镜下排列成 葡萄串状。金黄色葡萄球菌无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜。革兰氏染色阳性。 培养特性：金黄色葡萄球菌营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌 氧，最适生长温度3 7 ，最适生长p h7 4 。平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直 径1 2 m m 。血平板菌落周围形成透明的溶血环。金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性， 可在1 0 0 5 1 5 n a c l 肉汤中生长。 河北农业大学硕士学位论文 生化特性：金黄色葡萄球菌可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸不产气。甲基 红反应阳性，v p 反应弱阳性。许多菌株可分解精氨酸。水解尿素，还原硝酸盐，液 化明胶。金黄色葡萄球菌具有较强的抵抗力，对磺胺类药物敏感性低，但对青霉素、 红霉素等高度敏感。 i 2 2 金黄色葡萄球菌的致病性 金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可 引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。 金黄色葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶： ( 1 ) 溶血毒素：外毒素，分a 、b 、y 、6 四种，能损伤血小板，破坏溶酶体，引起 肌体局部缺血和坏死； ( 2 ) 杀白细胞素：可破坏人的自细胞和巨噬细胞； ( 3 ) 血浆凝固酶：当金黄色葡萄球菌侵入人体时，该酶使血液或血浆中的纤维蛋白沉 积于菌体表面或凝固，阻碍吞噬细胞的吞噬作用。葡萄球菌形成的感染易局部化与此 酶有关； ( 4 ) 脱氧核糖核酸酶：金黄色葡萄球菌产生的脱氧核糖核酸酶能耐受高温，可用来作 为依据鉴定金黄色葡萄球菌； ( 5 ) 肠毒素：金黄色葡萄球菌能产生数种引起急性胃肠炎的蛋白质性肠毒素，共有a 、 b 、c ( c 1 、c 2 、c 3 ) 、d 、e 、g 、h 、i 、j 、k 、l 、m 、n , - , 0 1 4 个血清型婷1 。暴发性食物中 毒中最常见的血清型为a 和d 型，b 和c 型次之，其中a 型的毒力最强”1 。据报道含 有1 0 6 1 矿c f u g - 1 ( m l _ 1 ) 的金黄色葡萄球菌可以产生导致食物中毒症状有效量的肠毒 素。当金黄色葡萄球菌污染了含淀粉及水分较多的食品，如牛奶和奶制品、肉、蛋等， 在温度条件适宜时，经8 l o h 即可相当数量的肠毒素。肠毒素可耐受1 0 0 煮沸3 0 m i n 而不被破坏。肠毒素刺激肠上皮细胞通过环磷腺苷和环磷鸟苷分泌途径，及两个独 立于环式核苷酸的途径钠、水分泌，产生腹泻。同时肠毒素还可通过肠壁神经感受器 刺激呕吐中枢而引起呕吐。此外，金黄色葡萄球菌还产生溶表皮素、明胶酶、蛋白酶、 脂肪酶、肽酶等。 1 2 3 金黄色葡萄球菌的流行病学 金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都 可找到。作为人和动物的常见病原菌，其主要存在于人和动物的鼻腔、咽喉、头发上， 5 0 以上健康人的皮肤上都有金黄色葡萄球菌存在。因而，食品受其污染的机会很多 哪 口 金黄色葡萄球菌的流行病学一般有如下特点：季节分布，多见于春夏季；中毒食 品种类多，主要以乳及乳制品、蛋及蛋制品、各类熟肉制品，其次为含有乳制品的冷 冻食品，也有个别的淀粉类食品引起的中毒事件也有报道。上呼吸道感染患者鼻腔带 2 p c r 技术检测乳品中金黄色葡萄球菌研究 菌率8 3 ，所以人畜化脓性感染部位常成为污染源。一般说，金黄色葡萄球菌可通过 以下途径污染食品：食品加工人员、炊事员或销售人员带菌，造成食品污染；食品在 加工前本身带菌，或在j j n - r 过程中受到了污染，产生了肠毒素，引起食物中毒；熟食 制品包装不严，运输过程受到污染；奶牛患化脓性乳腺炎或禽畜局部化脓时，对肉体 其他部位的污染。 金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生问题，美国疾病预防控制中心( c d c ) 报 告在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的3 3 ，加 拿大则更多，占4 5 ，某些欧洲国家如匈牙利、芬兰等占5 0 以上。我国每年发生的 此类中毒事件也非常多。肠毒素形成条件：存放温度，在3 7 。c 内，温度越高，产毒 时间越短；存放地点，通风不良氧分压低易形成肠毒素；食物种类，含蛋白质丰富， 水分多，同时含一定量淀粉的食物，肠毒素易生成。 1 2 4 金黄色葡萄球菌污染的控制 防止金黄色葡萄球菌污染食品：防止带菌人群对各种食物的污染：定期对生产 加工人员进行健康检查，患局部化脓性感染( 如疥疮、手指化脓等) 、上呼吸道感染 ( 如鼻窦炎、化脓性肺炎、口腔疾病等) 的人员要暂时停止其工作或调换岗位。防止 金黄色葡萄球菌对奶及其制品的污染：如牛奶厂要定期检查奶牛的乳房，不能挤用患 化脓性乳腺炎的牛奶；奶挤出后，要迅速冷至一1 0 。c 以下，以防毒素生成、细菌繁殖。 奶制品要以消毒牛奶为原料，注意低温保存。对肉制品加工厂，患局部化脓感染的禽、 畜尸体应除去病变部位，经高温或其他适当方式处理后进行加工生产。 防止金黄色葡萄球菌肠毒素的生成：应在低温和通风良好的条件下贮藏食物， 以防肠毒素形成；在气温高的春夏季，食物置冷藏或通风阴凉地方也不应超过6 h ， 并且食用前要彻底加热”1 。 1 2 5 近年来由金黄色葡萄球菌导致的食物中毒事件 近年来由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒的典型事件屡见报道。由此造成的经济 损失和社会影响越来越大。2 0 0 0 年在日本由金黄色葡萄球菌引发的上万人中毒的雪 印牛奶事件；每年由于金黄色葡萄球菌食品中毒的爆发给印度人民和政府带来极为沉 重的经济负担；美国多食用禽畜肉、乳制品和糕点类，金黄色葡萄球菌食物中毒最多， 其中美国食品药品管理局( f d a ) 的“b a db u gb o o k ”中报道的典型事件是在美国德 克萨斯州发生的由于金黄色葡萄球菌污染鸡块色拉引起的食物中毒，该起食物中毒导 致1 6 所小学的5 8 2 4 名学生中有1 3 6 4 名患病。 1 9 8 9 年，我国出口到美国的蘑菇罐头被检出金黄色葡萄球菌肠毒素，美国对我 国罐头制品进行制裁，使我国罐头工业造成巨大损失 1 9 9 6 年4 月8 日，海口市某幼儿园也发生一起食用奶油黄面包引起的金黄色葡 萄球菌污染所致的食物中毒 河北农业大学硕士学位论文 1 9 9 7 年，上海市静安区发生了起因食用隔夜草莓蛋糕引起的散发性的金黄色 葡萄球菌毒素食物中毒 1 9 9 8 年；6 月l o 日2 0 时，驻津某军校发生一起食物中毒。经流行病学调查、临 床诊断和病原学鉴定，证实为一起食用猪肉引起金黄色葡萄球菌肠毒素食物中毒 2 0 0 1 年4 月1 2 曰，无锡市锡山区所辖小学、幼儿园因课间加餐饮用金黄色葡萄 球菌污染的袋装牛奶饮料导致食物中毒事件 2 0 0 2 年l o 月，山东省昌邑县发生一起因食用蒸包而引起的金黄色葡萄球菌肠毒 素食物中毒 2 0 0 4 年6 月2 2 日，南昌由金黄色葡萄球菌引发的群体性食物中毒事件，1 5 9 人 中毒 2 0 0 4 年6 月，贵州省贵阳市的三联乳业公司由于一次不规范操作。生产了一批 被金黄色葡萄球菌污染的奶粉，导致5 3 名幼儿园的孩子中毒 国际食品微生物规格委员会( i t e r n a t i o n a lc o m m i s s i o no nm i c r o b i o l o g i c a l s p e c i f i c a t i o n sf o rf o o d s ，i c m s f ) 以对金黄色葡萄球菌的危害度进行评估，将其 列为中度直接局部传播性病原菌。日本的仓田浩通过全国食物中毒统计资料中的病死 率、发病率和平均起的发病数对金黄色葡萄球菌的危害度进行评估，其结果与 i c m s f 建议的危害度系数相一致。鉴于金黄色葡萄球菌本身的危害性及其引起食物中 毒事件的严重程度，建立从食品中快速检测金黄色葡萄球菌的方法是非常必要的。传 统的检测金黄色葡萄球菌的方法为生化检测法，这种方法操作繁琐，检测时间较长， 通常需要3 j d 才能完成，且检测灵敏度较低。国外已建立从食品中检测金黄色葡萄 球菌的聚合酶链式反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，p c r ) 方法，但国内很少有人 将此方法应用的食品检测中来。本研究主要针对金黄色葡萄球菌的致病性，选择特异 引物，建立快速检测食品中金黄色葡萄球菌的p c r 方法。以期缩短金黄色葡萄球菌引 起的食物中毒的检测时间，提高检测方法的灵敏性，为金黄色葡萄球菌引起的食源性 疾病的快速诊断提供技术支持。 1 3 金黄色葡萄球菌检测方法研究现状 目前国内外对于金黄色葡萄球菌的检测方法主要可分为两大类，一类是直接针对 肠毒素的检测方法，另一类是一些基于分子生物学的方法，其目的是检测特定基因存 在与否，来检测样品中是否存在金黄色葡萄球菌。 1 3 1 生物学方法 生物学试验是较早采用的一种金黄色葡萄球菌肠毒素检测方法“1 。通常采用染毒 食品或分离的产肠毒素的菌株的培养液喂饲敏感动物，或用腹腔注射及皮肤试验，然 后观察动物的反应。猴是首选动物，能产生与人类似的反应，对各种肠毒素反应特异， 但其成本高，来源困难给试验带来不便。豚鼠的皮肤敏感性实验表明其只对金黄色葡 4 p c r 技术检测乳品中金黄色葡萄球菌研究 萄球菌肠毒素b 敏感。由于生物学试验灵敏度低、操作繁琐、动物来源困难而不易推 广。 1 3 2 免疫学方法 检测金黄色葡萄球菌肠毒素的免疫学方法主要有免疫扩散法、反向间接凝血试验 ( r p h a ) 、反向被动乳胶凝集试验( r p l a ) 、放射免疫法( r i a ) 、酶联免疫吸附法( e l i s a ) 及免疫印迹法( i m m u u n o b l o t t i n g ) 最初应用的免疫学方法为免疫扩散法，它主要分为单向免疫扩散试验和双向免疫 扩散试验。但这两种方法的检出灵敏度较低，检测的食品标本需要浓缩，操作量大、 工作繁琐，因而未能推广。r i a 的应用将同位素测定的高灵敏性和抗原抗体反应的高 特异性有效地结合在一起，使得其检测的灵敏度和特异性均有所提高而且具有简单、 快速的特点。r i a 测定食品标本不需要浓缩，1 2 d 之内可出结果，检测各种食品的 灵敏度为1 l o n g 9 1 ”3 。但该方法存在放射性污染和需要专门的防护设备、检测仪 器等问题，也不易推广。r p h a 是将各型肠毒素抗血清吸附或偶联于绵羊、鸡和人血 球表面，再加入被检的含有相应肠毒素的标本，出现血细胞凝集即为阳性。该试验简 单、快速，l 3 h 即可判定结果。它存在的问题是有些型抗毒素抗体不易偶联于红血 球表面必须使用高效价的抗血清；受食物成分影响存在非特异反应；各型肠毒素间存 在着交叉反应。r p l a 方法同r p h a 方法的原理相同，也是一种简单快速的方法，只是 在检测小分子量的肠毒素时，反应时间较长，1 6 2 4 h 才能出现阳性结果。如果采用 一些特殊方法可以加快反应速度，如离心反应板、高密度乳胶等，可以将检测时间减 少到4 6 h 9 1 ；如果在这种方法中使用磁性颗粒和磁力来加速乳胶颗粒的沉降，效果 更佳。 e l i s a 方法是一种敏感、快速、简单的方法，应用较广。e l i s a 法是将酶分子与 抗体分子结合形成酶标记分子。当它与固相免疫吸附剂中相应的抗原或抗体、或抗原 抗体结合物相遇时形成酶抗原抗体结合物，加入酶底物，结合物中的酶水解底物，生 成有色的反应物，根据颜色的深浅，进行检测。e l i s a 法检测金黄色葡萄球菌肠毒素 从7 0 年代开始至今，国外相关报道很多。它包括直接法、间接法、夹心法等。由于 此方法可能收到食物成分及葡萄球菌蛋白a 的干扰，因此，研究人员对于此项研究致 力于消除他们的影响。降低葡萄球菌蛋白a 的影响可采用凝胶柱的方法或将兔血清加 入食品标本提取物中。随着抗各型肠毒素单克隆抗体的制备，e l i s a 诊断试剂盒已开 始广泛使用。如t e c r a 试剂盒，r i d a s c r e e n 试剂盒等。各国的研究人员也不断的对 这些试剂盒进行评估，来确定这些试剂盒是否能满足食品的安全标准。p a r k “”等采用 t e c r a 试剂盒检测火腿、蘑菇、乳酪等食品中的金黄色葡萄球菌肠毒素，肠毒素a ，b ，c 的检出限分别为0 7 5 1 o n g m l 、0 5 0 7 5 n g m l 、1 o 1 2 5 n g m l 一。1 9 9 6 年p a r k 等1 又利用r i d a s c r e e n 试剂盒检测食品中的肠毒素，结果显示火腿、奶酪中 肠毒素a 的检出限为1 o n g g ，意大利腊肠中肠毒素b 检出限为1 o n g g ，其它 样品中肠毒素d 的检出限为2 o n g g 。 河北农业大学硕士学位论文 o r d e r “”等建立的免疫印迹技术检测食品提取物中的肠毒素，检出限为 l o n g m l 一，通过电泳使分子量大于肠毒素的葡萄球菌蛋白a 与肠毒素分开，从而免 除了葡萄球菌蛋白a 的影响。r a s o o l y “3 1 等用免疫印迹法检测食品中的肠毒素a ，克 服了如抗原之间的交叉反应及对热处理食品的不敏感等e l i s a 检测的不足，可使检出 限提高为l o o p g m l1 。 1 ，3 3 基因探针技术 自1 9 7 5 年s o u t h e r n 首次提出了d n a 探针杂交技术以来，d n a 探针技术在许多方 面都已获得了改进和发展。基因探针技术检测微生物的依据是核酸杂交，其工作原理 是2 条碱基互补的d n a 链在适当的条件下可以按碱基配对原则，形成杂交d n a 分子。 已知每个生物的各种性质和特征都是由其所含的遗传基因所决定，因此，从理论上讲， 任何一个决定生物体特定生物学特征的d n a 序列都应该是独特的。通过将微生物的特 征基因的一条d n a 链进行标记，即可制成d n a 探针。标记的方法可分为两种：放射性 标记探针和非放射性标记探针“。基因探针最早应用于检测金黄色葡萄球菌肠毒素的 检测研究是由n o r t e r m a n s “”等进行的，他采用的是放射性标记探针。 1 3 4 耐热核酸酶法 耐热核酸酶法是根据金黄色葡萄球菌的核酸酶的稳定性与肠毒素相似且二者的 产生有很高的符合率，以检测耐热核酸酶的产生情况，来反映金黄色葡萄球菌产肠毒 素的情况。借助核酸酶这一“窗口”式结果，推测引起食物中毒的可能性，国外已将 该方法作为食物中毒时金黄色葡萄球菌的筛选手段 1 3 5 生物传感技术 生物传感器是一种新兴的技术产品，它是以生物学组件作为主要的功能性元件， 能够感受规定的被测量并按照一定规律将其转化成可识别信号的器件或装置。生物传 感器按照敏感材料的不同可分为酶传感器、免疫传感器、微生物传感器及细胞传感器 等，而按照转换器的不同又可分为电化学传感器、光传感器、声波传感器、仿生传感 器等。随着生物检测系统的逐渐发展，该技术已应用于生物毒素检测领域。众多资料 表明，免疫标记技术和生物传感技术的结合是检测生物毒素的有效途径。s t r a c h a n “” 等报道采用自动免疫传感器只需要l o m i n 便可在乳酪中检测肠毒素b ，检测最低限为 5 n g g 。 目前，用于食品毒素检测的生物传感器主要为光学生物传感器，特别是表面等离 子激元共振( s u r f a c ep l a s m o nr e s o n a n c e ，s p r ) 生物传感器的应用。s p r 是利用表 面等离子激元共振现象和s p r 谱峰对金属表面上电解质变化敏感的特点，通过将受体 固定在金属膜上，检测其与液相配体的特异性结合。该技术最早由l i e d v e r g 1 等于 1 9 8 3 年首次应用，他们利用此技术进行抗原抗体相互作用分析，并且将它引入生物 p c r 技术检测乳品中金黄色葡萄球菌研究 传感器领域。近年来，s p r 作为一种检测方法，以其使用简单和快速的特点在食品安 全领域广泛使用。s p r 检测的缺陷是只能同时分析几种物质( 少于四种) ；不能区分 特异的靶物质和芯片表面其他样本的非特异交叉反应物；对于固定的受体，当其发生 点突变、化学改变或功能活性改变时，s p r 不能将其同完整的分析物加以区分。 b i a m s ( b i o m o l e c u l a r n t e r a c t i o na n a l y s i sm a s ss p e c t r o m e t r y ) 的应用克服了上 述不足“，它利用s p r 检测与固定在传感器芯片表面上的抗体结合的毒素，再通过辅 助矩阵激光电离光谱发进行分析。在牛奶及蘑菇样品中金黄色葡萄球菌肠毒素b 的检 出限为l n g m l ，此方法还可利用具有多亲和力的传感器芯片，同时成功的检出肠 毒素b 及t s s t 一1 两种肠毒素。l l o m o l a “”等利用动态范围可调的波导型s p r 检测牛奶 中的金黄色葡萄球菌肠毒素b ，其检出限为0 5 n g m 1 。n a i m u s h i n ”等又采用微型双 渠道s p r 传感器检测肠毒素b ，此方法可直接检测1 0 4 ( n g ) 水平的小分子蛋白毒素， 1 0 1 5 ( f g ) 水平的毒素通过扩增也可检测。 1 3 6 超抗原技术 超抗原( s u p e r a n t i g e ns a g ) 是指一类由细菌外毒素和逆转录病毒蛋白构成的新 型蛋白质抗原分子。s a g 激活t 细胞不需抗原呈递细胞( a p c ) 的作用，直接以蛋白质 形式在不同抗原的外侧与a p c 的主要组织相容性复合物( m h c ) i i 类分子结合，再与t 细胞受体( t c r ) 的v 。结合，而与t c r 的其他区域无关，故其作用广泛，可至大量t 细 胞增殖并释放大量细胞囚子产生作用。超抗原分为内源性和外源性两种，内源性 s a g 为病毒性抗原，外源性s a g 为细菌性抗原。金黄色葡萄球菌肠毒素为一种外源性 超抗原。研究表明超抗原所激活的t 细胞( c t l ) 能对表达( m h c ) i i 类分子的靶细胞产 生细胞毒作用，这种作用叫超抗原依赖的细胞介导的细胞毒副作用( s d c c ) 。美国f d a 实验室的h a w r y l u ka n dh i r s h f i e l d 啪1 采用超抗原的技术检测金黄色葡萄球菌肠毒素 a 。对于超抗原肠毒素a 活性的开发是基于它所诱导的t 淋巴细胞对于s e a b o u n dr a j i 细胞的毒性作用，通过c y t o t o x 9 6 细胞溶解检测试剂盒对死亡的靶细胞进行比色分 析，检测的灵敏度为1 0 。1 2 ( p g ) 。这种高度的灵敏性决定超抗原的检测方法会作为一 种确切的检测融入目前的肠毒素的检测中。 a o a c 检测食品中的金黄色葡萄球菌肠毒素的标准方法是微波片双向扩散法，在 培养液和浓缩食品提取物检测肠毒素的灵敏度为1 0 l o o n g m i 。我国目前尚无检 测肠毒素的标准方法，提供的参考方法是双向琼脂扩散法和酶联免疫双抗法，采用双 向琼脂扩散法检测时间长，灵敏度低。酶联免疫双抗体法易受食物成分及葡萄球菌蛋 白a 的影响。而p c r