（神经病学专业论文）脂质体介导绿色荧光蛋白基因转染神经干细胞的实验研究.pdf

2 0 0 8 届硕上毕业生论文脂质体介导绿色荧光蛋白基因转染神经干细胞的实验研究 缩写英文全称 b f g f c n p c n s e g f f b s g f a p n e s t i n n s c n s e p b s p l l s v z e g f p l b 英文缩写 中文全称 b a s i cf i b r o b l a s tg r o 叭hf a c t o r碱性成纤维细胞生长因子 c y c l i cn u c l e o t i d ep h o s p h o h y d r o l a s e c e n t r a ln e o u ss y s t e m e p i d e n n a lg r o 、v t hf a c t o r f e t a lb o v i n es e n 】m 2 ，3 环核苷酸磷酸二脂酶 中枢神经系统 表皮细胞生长因子 胎牛血清 g 1 i a lf i b r i l l a 巧a c i d i cp r o t e i n胶质纤维酸性蛋白 n e u r o e p i t h e l i a ls t e mc e np r o t e i神经上皮干细胞蛋白 n e u r a ls t e mc e l l n e u r o ns p e c i f i ce n o l a s e 神经干细胞 神经元特异烯醇化酶 p h o s p h a l a t e db u 虢r e d s a l i n e 磷酸盐缓冲盐溶液 p o l y - l - l y s i n e s u b v e n t r i c u l a rz o n e 多聚赖氨酸 前脑室下区 e h a n c eg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t i e n增强型绿色荧光蛋白 l u r i a b e r a n im e d i u ml b 培养基 广西医科大学研究生学位论文独创性声明 秉承学校严谨的学风与优良的科学道德，本人声明所呈交的 论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包 含其他人已经发表或撰写过的研究成果，不包含本人或他人已申 请学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究 所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切责任。 论文作者签名：猿棚利于 指兰刻醛备黝 日期：善刀g 审莎月匀汐j 广西医科大学保护知识产权说明 本人完全了解广西医科大学有关保护知识产权的规定，即： 研究生在校攻读学位期间，博士后工作人员、人才小高地工作人 员在校工作期间，论文工作的知识产权单位属广西医科大学。本 人保证在校期间和离校后，发表或使用论文工作成果时署名第一 作者单位均为广西医科大学。学校有权保留论文，允许论文被查 阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、 缩印或其他复制手段保存论文。 、 论文作者签名：咎研竹 指导教师签名：喜钸 日期：0 彬留净莎月力i 罗f 关于使用本人学位论文的授权书 中国科学技术信息研究所是国家科技部直属的综合性科技信息研究和服务 机构，是国家法定的学位论文收藏单位，肩负着为国家技术创新体系提供文献保 障的任务。从六十年代开始，中国科学技术信息研究所受国家教育部、国务院学 位办、国家科技部的委托，对全国博硕士学位论文、博士后研究工作报告进行全 面的收藏、加工及服务，迄今收藏的国内研究生博硕士论文已经达到1 0 0 多万册。 学位论文是高等院校和科研院所科研水平的体现，是研究人员辛勤劳动成果 的结晶，也是社会和人类的共同知识财富。为更好的利用这一重要的信息资源， 为国家的教育和科研工作服务，在国家科技部的大力支持和越来越多的专家学者 提议下，中国科学技术信息研究所和北京万方数据股份有限公司承担并开发建设 了中国学位论文全文数据库的加工和服务任务，通过对学位论文全文进行数 字化加工处理，建成全国最大的学位论文全文数据库，并进行信息服务。 本人完全了解中国学位论文全文数据库开发建设目的和使用的相关隋况， 本人学位论文为非保密论文，现授权中国科学技术信息研究所和北京万方数据股 份有限公司将本人学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并进行信息服 务( 包括但不限于汇编、复制、发行、信息网络传播等) ，同时本人保留在其他 媒体发表论文的权利。 论文题目：邈建垒垦叠堕遐鱼麴壑她鱼伽黼寝跪毡努 毕业院校：i 亟垦盐起整 毕业时间：沙d 影空_ 7 塑 论文类型：博士论文 口硕士论文 博士后研究报告口同等学力论文 回 口 2 0 0 8 届硕士毕业生论文脂质体介导绿色荧光蛋白肇因转染神经干细胞的实验研究 脂质体介导绿色荧光蛋白基因转染 神经干细胞的实验研究 摘要 目的：探讨脂质体介导增强型绿色荧光蛋白( e g f p ) 转染神经干细胞 的最佳条件，转染的n s c s 移植入正常大鼠侧脑室后，e g f p 作为神经干细胞 示踪剂的效果，为n s c s 作为基因治疗载体提供实验依据，同时为转染其它 功能基因奠定基础。 方法：( 1 ) 从胎鼠、新生大鼠、成年大鼠海马中分离n s c s ，采用n s c 克隆悬浮法，选用无血清d m e m f 1 2 培养液，添加剂b 。，碱性成纤维细胞生 长因子( b f g f ) 及表皮细胞生长因子( e g f ) 进行体外扩增培养，采用免疫 细胞化学法检测n s c 标志物n e s t i n 的表达及分化后细胞神经元特异性烯醇 化酶( n s e ) 、胶质纤维酸性蛋白( g f a p ) 和2 ，3 一环核甘酸磷酸二脂酶( c n p ) 的表达。( 2 ) 胎鼠神经干细胞离体后存活时间研究：在下列时间点进行原 代培养：3 7 组：1 2 ，1 ，2 ，3 ，4 h ；4 组1 2 ，1 ，2 ，3 ，4 天，观察细胞 生长状态。( 3 ) 检测脂质体、质粒不同剂量下、脂质体一质粒复合物不同作 用时间下、不同细胞传代次数下e g f p 转染n s c s 的转染效率。g 4 1 8 对阳性 细胞筛选，观察细胞生长情况。将筛选阳性的细胞进行传代及诱导分化的 观察，免疫细胞化法鉴定。m t t 法检测转染前后n s c s 的活力。( 4 ) 将筛选 后的n s c s 立体定向仪移植入大鼠侧脑室，分别移植后4 w ，8 w ，1 2 w ，1 5 w ，行 大鼠脑组织冰冻切片制作，荧光观察。 结果：( 1 ) 培养的n s c s n e s t i n 抗体标记阳性，分化后细胞表达神经元、 星型胶质细胞、少突胶质细胞的特异性抗原；( 2 ) 在3 7 组，脑组织离体 后1 小时，已无法培养出干细胞，在4 组，离体后3 天，仍可以培养出 n s c s 。( 3 ) 当脂质体剂量为8 p l ，质粒( p e g f p - n 1 ) 剂量为6 均，复合物作用 2 脂质体介导绿色荧光蛋白摹因转染神经十细胞的实验研究 时间为6 h ，3 代时转染效率最高，为2 7 6 。随着传代次数的增加，转染效 率逐渐降低。3 代g ：一m 期所占的比例也最高。转染率与g ：一m 期存在一定的 关系。g 4 1 8 最小致死浓度为5 0 0 p g m l 。m t t 比色法测定同期未转染和转染 n s c s 活性，两组之间无显著性差异( p o 0 5 ) ；( 4 ) 分别移植后个时间点行 大鼠脑组织冰冻切片制作。观察随着时间的推移，绿色荧光逐渐朝针口周 围扩展，在2 w 可见绿色荧光，强度较弱，在4 8 w 荧光最强，随后逐渐减 弱至1 2 w 时荧光基本消失，1 5 w 时观察不到任何的荧光。 结论：( 1 ) 从大鼠海马中分离培养出具有自我更新和多分化潜能的细 胞，该类细胞属于中枢神经系统的n s c s ，低温下更易生长，是进行转染的 良好细胞模型；( 2 ) 脂质体可较为高效转染n s c s ，移植到脑内能有效的表 达，且可在脑内迁移，与脑组织整合，e g f p 是n s c 有效的示踪方法，进一 步证实n s c s 是一种理想的基因治疗的靶细胞，为转染其它功能基因奠定了 基础。 关键词神经干细胞，细胞培养，增强型绿色荧光蛋白，基因转染 2 0 0 8 届硕士毕业生论文脂质体介导绿色荧光蛋白基因转染神经干细胞的丈验研究 1 a n s f e c t i o no fn e u r a is t e mc e i l sw i t hg r e e n f l u o r e s c e n tp r o t e i ng e n eb yl i p o f e c t a m i n e 2 0 0 0 a b s t r a c t o b j e c t i v e ： t oa p p r o a c ht h eo p t i m i z a t i o no fl i p o f e c t 锄i n e 2 0 0 0m e d i a t e dr e p o r r t e r e n h a n c e dg r e e nn u o r e s c e n tp r o t e i n ( e g f p ) g e n et r a n s f e c t i o no fn e u r a ls t e m c e u s ( n s c s ) t oo b s e r v et h ee f f e c to fe g f pa sat r a c e rf o rc e us u r v i v a la n d d i f f e r e n t i a t i o na r e r 仃a n s f e c t e dn s c sw e r et r a n s p l a n t e di n t os t r i a t 啪o fn o r m a l r a t s ，a n dp r o v i d ee x p e r i m e n t a le v i d e n c ef o ru s i n gn s c sa sar e s o u r c eo fv e h i c l e c e l l sf o rg e n et h e r a p y m e t h o d s ： ( 1 ) n e u r a ls t e mc e l l sw e r ei s o l a t e d 仔o mr a th i p p o c a m p u s ， c u l t u r e da n d e x p a n d e db yd m e m f 12s e m 】 i l 一仔e em e d i u mc o n t a i n i n gg r o w t h 蠡犯t o r sb f g f 、 e g fa n db 2 7 t h ec e l l sw e r e p a s s a g e dc o n t i n u o u s l yb yd i s a s s o c i a t i n g m e c h a n i c a l l yi no r d e rt op u r i 矽a n do b t a i nt h ec e l l sb u l k t h ec e l l s m o 印h o u s w a so b s e r v e du n d e ri n v e r t e dp h a s e c o n t r a s tm i c r o s c o p e ，a n dn o wc y t o m e t 巧 w a s 印p l i e dt oe s t i m a t et h ep r o l i f e r a t i o no fn e u r a ls t e mc e l l s a p p l i c a t i o n 伊o w t h c u r v ee s t i m a t et h ec a p a b i l i 够o ft h ec e l l i m m u n o c y t o c h e m i s t l 了w a sp e r f o m e d t od e t e c tt h ee x p r e s s i o no fn e s t i n ，n e u r o n s p e c i f i ce n o l a s e ( n s e ) ，g l i a l f i b r i n a 巧a c i d i cp r o t e i n ( g f a p ) ，a n dc y c l i cn u c l e o t i d ep h o s p h o h y d i o l a s e ( c n p ) ( 2 ) a t37 a n d4 ，w ec u l t u r en s c si nd e i 行i e r e n tt i m e ，a n dt h e no b s e e t h e m ( 3 ) c o t r a n s f e c t i o no fn e u r a ls t e mc e l l sw a sc o n d u c t e du s i n gn u o r e s c e n t p l a s m i d a sa r e p o r t e rg e n e w i t h l i p o f e c t a m i n e 2 0 0 0 f o r e s t a b l i s h i n g o p t i m a l t r a n s f e c t i o nc o n d i t i o n s ，w ed e s i g n e dt h et e c h n i q u e so fd e t e n n i n i n gt h e 4 2 0 0 8 届硕士毕q k 7 卜论文脂质体介导绿色荧光蛋白基因转染神经十细胞的实验研究 e x p r e s s i o n l e v e lo fa r e p o r t e rp r o t e i nb yv a 巧i n gp a r a m e t e r s ，s u c h a s d i 行e r e m r a n s f e c t i o nt i m e ，d i 艉r e n td o s e o f1 i p o f e c t a m i n e ，d i 艉r e n td o s eo f d n a ，d i f f e r e n tp e r i o do fn e u r a ls t e mc e l l s ，a n do b s e e dt h ee x p r e s s i o no f e n h a n c e d 伊e e nn u o r e s c e n tp r o t e i n ( e g f p ) ；s c r e e n i n gc e l lc l o n e sw h i c hs t a b l e e x p r e s s i n 2g f p ，o b s e i n gt h e i rp r o p e i r t yo fg r o 、v t h 1 一 。 一 lr 一 ( 4 ) s t a b l e t r a n s f e c t a n t sw e r es t e r e o t a c t i c a l l yi m p l a n t e di n t ot h es t r i n i n go f t h el i v i n gr a t s ，o b s e e dt h ee x p r e s s i o no fe n h a n c e d 铲e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i ni n v i v oi n4 ，8 ，1 2 ，1 5w e e k s r e s u l t s ： ( 1 ) i m m u n o c y t o c h e m i s t 拶s t u d y i n d i c a t e dt h a tt h e n e u r o s p h e r e s w e r e n e s t i n - p o s i t i v ea n dc o u l dd i 虢r e n t i a t ei n t om u l t i - d i r e c t i o n s s p e c i f i ca n t i g e n so f n e u r o n s ，a s t r o c ”e s ，a n do l i g o d e n d r o c ”e sw e r ee x p r e s s e da l s o ( 2 ) n s c sc a nb ep r o p a g a t e du n d e rl o wt e m p e r a t u r e ( 4 ) ( 3 ) w h e n t r a n s f e c t i o ni nm et h i r d c u l t u r e d h i p p o c a m p u sn s c s ，t h e 仃a n s f e c t i o nt i m ew a s6h o u r sa n dt h ed o s eo fl i p o f e c t 锄i n e ( p 1 ) w a s8 ，t h ed o s e o fd n a ( p 9 ) w a s6 ，t h e e f i c e n c yo fw a s2 7 6 w i t hl i p o s o m et r a n s f e c t i o n m e t h o d ，；3b e h a l fo ft h em o s te 衢c i e mt r a n s f e r ，t h e r ei sac e r t a i nr e l a t i o n s h i p b e t e w nt r a n s f e rr a t ea n dt h eg 2 - mp h a s e g 4l8m i n i m u ml e t h a lc o n c e n t r a t i o ni s 5 0 0pg m l ，m t ta s s a yo f t h es 锄ep e r i o do f t r a n s f e ra n dt h eu n t r a n s f e rn s c s ， a c t i v i t ) ，b e 研e e nt h e 帆og r o u p sn os i g l l i f i c a n td i 艉r e n c e ( p o 0 5 ) ( 4 ) n s c st r a n s f e c t e dw i t he g f pw e r ea b l et oe x p r e s se n h a n c e dg r e e n f l u o r e s c e n tp r o t e i na r e ri m p l a mi n t ov i v oi nt h e4a n d8w e e k s ，i nt h e15w e e k s w ew e r e n ts e ea n d t h i n g c o n c l u s i o n s ： ( 1 ) t h ec e l l si s o l a t e d 厅o mr a th i p p o c a m p u sc a no n l yb ec h a r a c t e r i z e da s s t e mc e l l so ft h ec e n t r a ln e r v o u ss y s t e ma c c o r d i n gt ot h e i ru n d i f r e r e n t i a t e d 2 0 0 8 届硕士毕业生论文脂质体介导绿色荧光蛋白基因转染神经十细胞的实验研究 f e a t u r e s ，t h ec 印a c i 够o fs e l 仁r e n e w i n g ，p r o l i f e r a t i o na n dp l 嘶p o t e n t i a l i 吼a n d t h ee x p r e s s i o no fn e s t i na n t i g e n ( 2 ) w | e c o n c l u l u d e dt h a tt h eo p t i m a lt r a n s f e c t i o nc o d i t i o n so fl i p o f e c t 一 锄i n e 2 0 0 0m e d i a t e d r e p o r t e rg e n e t r a n s f e c t i o n n s c s p r o v i d ee x p r i m e n t a l e v i d e n c ef o ri n v e s t i g a t i n gg e n et r a n s f e ro fn s c s ；n s c sw e r et h ei d e a lv e h i c l e c e l l so fg e n e t h e r a y ；n s c st r a n s f e c t e dw i t he g f pw e r ee a s i l yt r a c e da n d o b s e r v e df o rt r a n s p l 觚ts t u d y k e yw o r d s ： n e u r a ls t e m c e l l s ， c e nc u l t l j r e ， e n h a n c e dg r e e nn u o r e s c e n t p r o t e i n ( e g f p ) ，g e n et r a n s f e c t i o n 6 2 0 0 8 届硕上毕q k 生论文脂质体介导绿色荧光蛋白基因转染神经干细胞的实验研究 第一部分 大鼠海马神经干细胞的体外培养的研究 刖昌 由于受绝对数量和局部微环境的限制，内源性神经干细胞在中枢神经 系统损伤或变性后的自我修复作用很小，不能有效地弥补损伤后机体神经 功能的缺损，同时体内条件影响因素复杂，因此将神经干细胞分离出来， 进行体外生物学观察是非常必要的。本部分从胎鼠，新生鼠，成年大鼠海马 中培养神经干细胞，进行分化和鉴定，观察低温状态下保存脑组织对神经干 细胞原代培养的影响，为下一步神经干细胞转染和移植提供实验材料。 材料 一、实验动物 新生s d 大鼠( p 1 、p 2 ) 天，s d 孕鼠( e 1 4 1 6 天) ，成年s d 大鼠( 3 m ) ，由广 西医科大学实验动物中心提供。 二、主要设备 倒置相差显微镜( z e i s sa x i o v e r t 2 0 0 0 ，德国z e i s s 公司) 、c 0 2 恒温培 养箱( t h e r m of o r m a 3 1 1 1 ，美国热电公司) 、台式离心机( l d 5 2 a ，北京医 用离心机厂) 、定时恒温磁力搅拌器( m l 一9 0 2 ，绍兴卫星医疗设备制造有限 公司) 、医用超净工作台( 中国苏净集团安太空气技术有限公司) 、细胞培 养瓶和培养板( 北京广川生物实验材料研究所) 、水浴箱( 北京医疗设备 厂) 、手术器械一套、血细胞计数板、2 0 0 及4 0 0 目不锈钢过滤网由广西医 科大学实验中心提供。 三、主要试剂 d m e m f 1 2 干粉士赫基( g b i c o 公司) 、助( g b i c o 公司) 、b f g f ( s ig i i l a 公司) 、 7 2 0 0 8 届硕上毕业生论文脂质体介导绿色荧光蛋白基因转染神经干细胞的实验研究 e g f ( s i 肿a 公司) 、p l l ( s i g m a 公司) 、胰蛋白酶( 美国h y c l o n e 公司) 、 小鼠抗人n e s t i ni g g ( 工作浓度1 ：2 0 0 北京中杉公司) 、兔抗人n s e 多克 隆抗体( 工作浓度1 ：5 0 北京中杉公司) 、兔抗人g f a p 多克隆抗体( 工作 浓度l ：1 0 0 武汉博士德公司) 、小鼠抗人c n p 单克隆抗体( 工作浓度1 ：1 0 0 美国n e om a r k e r s 公司) 、羊抗小鼠i g g 、羊抗兔i g g ( 工作浓度l ：1 0 0 武 汉博士德公司) s a b c 试剂盒、d a b ( 武汉博士德公司) 。 方法 实验一大鼠海马神经干细胞的分离、培养和签定 ( 一) 胚鼠神经干细胞原代培养 l 、取e 1 4 d 天s d 大鼠，1 0 水合氯醛( 4 0 m g k g ) 腹腔麻醉，7 5 酒精消毒下 腹部皮肤，剖腹后获得双侧串珠样含胚胎子宫体，无菌取出胚胎，冲洗 两次，洗掉血迹。 2 、迅速打开胚胎体颅部，取脑置于盛有预冷的d h a n k s 液的培养皿中，显 微镜下分离海马，眼科剪剪成1 i 姗3 小块，加入o 2 5 胰酶与o 0 2 e d t a ( 1 ： 1 ) 边消化边用滴管吹打约5 分钟。以完全培养基中止消化。过4 0 0 目滤 网研磨过滤，用吸管反复吹打制成单细胞悬液，1 0 0 0 r p m 离心5 m i n ，弃 上清液，获得细胞沉淀，d m e m f 1 2 液重悬细胞，吸管轻柔吹散。 3 、再次1 0 0 0 r p m 离心5 m i n ，弃上清液，获得细胞沉淀，d m e m f 1 2 液重悬 细胞，吸管轻柔吹散。 4 、取少量细胞悬液滴于血球计数板，显微镜下调整细胞密度为5 x 1 0 5 m 1 ， 加入d m e m f 1 2 液至1 0 m 1 瓶，同时加入1 b 2 7 添加剂， 2 0 n g m l b f g f ，2 0 n g m l e g f ，置于3 7 ，5 c o ：培养箱常规培养每3 d 半量 换液1 次。 5 、每天于相差显微镜下观察细胞生长状况，随机选取视野进行照相，记录。 脂质体介导绿色荧光蛋白基因转染神经干细胞的实验研究 ( 二) 传代培养 原代n s c s 培养7 d ，镜下可见形成l o o 一2 0 0 个细胞组成的n s c s 球，神 经球布满培养瓶的8 0 以上时，考虑传代培养。传代时，先用吸管在原代培 养瓶中轻轻吹打，使沉聚于瓶底的细胞球浮起，并将所有的培养瓶液移至 离心管中，静置5 分钟，吸除上1 3 培养液，去除单细胞，用吸管轻柔吹 打，吹打时用力要均匀，尽量使细胞球分散，然后1 0 0 0 r p m m i n 离心5 m i n ， 弃上清，加入d m e m f 1 2 ，过2 0 0 目筛网，调整细胞密度为5x1 0 5 m 1 接种， 传代培养，隔天半量换液。 ( 三) 细胞计数及生长曲线的绘制 随机取p 3 ，p 8 代n s c s ，将细胞消化稀释成5 o x1 0 5 m l 接种6 孔培养 板，每孔接种2 m 1 ，3 7 ，5 c o ：，饱和湿度条件下培养。每隔2 4 h 消化收 集3 孔细胞计数，取平均值。每3 d 换液一次。连续计数细胞8 d 后绘制生 长曲线。计算倍增时间，倍增时间t = t l 0 9 2 1 0 9 n 。一1 0 9 n o 其中t 为培养时 间，n 0 为接种时细胞数，n 。为接种t 小时后细胞数。 ( 四) 神经干细胞的免疫细胞化学鉴定 选取传代培养的神经干细胞球接种于预先涂有p l l 的盖玻片上，分别 于接种后2 h 后取出，免疫细胞化学步骤详见说明书( 一抗为小鼠抗人 n e s t i ni g g ，1 ：2 0 0 ，用p b s 代替一抗做空白对照) ，显微镜下观察并随机 选择3 个视野记阳性细胞数，拍照。 ( 五) 神经干细胞的自然分化 收集体外稳定培养传代2 月的n s c s ，用d m e m f 1 2 ( 不含b f g f ，e g f 和 b ：，) 重悬，用吸管吹打，分散为单细胞或小的细胞团，d h a n k s 液清洗n s c 3 次，接种至预先涂有p l l 的盖玻片上，用神经干细胞基础培养液继续培养， 每天观察细胞生长情况及细胞形态，7 天后取出盖玻片，分别对分化后的细 胞进行免疫细胞化学染色，用n s e 标记分化后的神经元，一抗为兔抗人n s e 多克隆抗体( 1 ：5 0 ) ；g f a p 标记分化后的星型胶质细胞，一抗为兔抗g f a p 多 9 2 0 0 8 届硕士毕业，卜论文脂质体介导绿色荧光蛋白基因转染神经干细胞的实验研究 克隆抗体( ( 1 ：1 0 0 ) ；c n p 标记分化后的少突胶质细胞，一抗为小鼠抗人c n p 单克隆抗体( 1 ：l o o ) 。除滴加一抗不同外，其余步骤同四 实验二胎鼠神经干细胞离体后存活时间研究 1 、标本的采集：将孕鼠杀死后，在无菌操作下取出子宫内的胚胎共1 2 只， 将其中6 只浸泡在3 7 孵箱内烧瓶的生理盐水中溺死并保存，另6 只 立即置于4 冰箱内烧瓶的生理盐水里溺死并保存。 2 、在下列时间点进行胎鼠海马神经干细胞原代培养：3 7 组：1 2 ，1 ，2 ，3 h ； 4 组在胎鼠死亡后1 2 ，l ，2 ，3 天。培养方法同实验一。 3 、观察细胞生长状态，照相。 实验一结果 一、细胞形态观察 倒置显微镜下观察，胎鼠原代培养当天细胞为单个圆球状，透明，分 散存在，大小均一( 图卜1 ) 。在神经干细胞培养基生长2 4 h 后部分细胞死亡， 形成大量的细胞碎片，大部分细胞贴壁，其中少数细胞伸出突起( 图卜2 ) 。 培养4 8 h 后，可见部分细胞分裂形成由2 8 个细胞组成的小细胞团，呈桑葚 状聚集，细胞表面光滑，折光率高，细胞核较大，即原代克隆( 图卜3 ) ，随 培养时间的增加，细胞团逐渐增大、增多，7 天时生长为数十个细胞到数百 个细胞的克隆，呈球形悬浮生长，形态规则，折光性强，无突起生长( 图卜4 ) 。 原代培养中克隆形成率在5 0 、6 0 之间。传代后出现与原代培养相同的大量 次代克隆( 图卜5 ) ，并逐渐增大，5 - 7 天可再次传代。n s c 在体外传代培养 后，己分化成熟的细胞会逐渐贴壁死亡，而n s c 则悬浮生长于培养基中， 因此利用传代培养的方法可以纯化所培养的n s c 。我们培养的细胞可传1 1 代( 图卜6 ) ，第8 代以后细胞的分裂速度明显减慢，且易贴壁，但细胞的形 态、结构与原代相比无明显变化。连续传代后细胞生长特性不变，可稳定 1 0 2 0 0 8 届硕士毕业生论文脂质体介导绿色荧光蛋白摹因转染神经干细胞的实验研究 在体外保持未分化状态2 个月以上。 二、神经干细胞的生长曲线 随机取p 3 ，p 8 代n s c s ，生长曲线比较。如图卜7 。 1 4 1 2 们鲁 1 0 毫墨 8 u 壹 6 善 4 。 2 o o d 1 d 2 d 3 d4 d5 d 6 d 7 d8 d 9 d1 0 d d a y s f i 9 1 7t h eg r o e t hc u r v eo fn e u r a ls t e mc e ll so n p 3a n dp 8 图卜7p 3 ，p 8 代n s c s 生长曲线 生长曲线显示传代培养的胎鼠海马n s c s 数目不断增加，曲线均呈s 型， 符合1 0 i g i s t i c 生长曲线。传代2 4 4 8 h 为生长滞缓期，对数增长期约为3 8 天，表明体外培养的n s c s 处于持续的分裂状态，具有自我更新和繁殖能力， 对数增长期结束后进入平台期。各组倍增时间均为3 0 h 左右。随代次增加， n s c 的增值能力开始减弱。 三、神经干细胞n e s t i n 抗原的表达 传代培养后获得的神经干细胞球贴壁2 h 行神经上皮干细胞蛋白 ( n e u r o e p i t h e l i a ls t e mc e l lp r o t e i nn e s t i n ) 免疫细胞化学染色，结 果贴壁2 h 的大部分细胞显示阳性染色，可见胞浆呈棕黄色的细胞团( 图 1 8 ) 。 四、神经干细胞的自然分化及鉴定 传代2 月的后的神经干细胞球种入预先置有涂布p l l 的盖玻片的6 孔 培养板内，撤去生长因子2 4 h 后细胞球即开始贴壁，1 天后即发现从细胞 2 0 0 8 届硕士毕业乍论文 脂质体介导绿色荧光蛋白基因转染神经干细胞的实验研究 团块的边缘向外长出突起，其中的细胞有向外迁移的趋势( 图卜9 ) 。第3 d 时，细胞团块周缘出现较多的不同形态的新生的神经细胞，其突起向外呈 放射状延伸( 图卜1 0 ) 。继续培养至第7 d 时，原有的细胞团块消失，代之以 伸展成片、相互联系的细胞群体( 图卜1 1 ) 。细胞主要呈三种形态：即具有 1 ，2 个长突起，胞体呈圆形或椭圆形的神经元样细胞( 图卜1 2 ) ；具有多个粗 长突起的星型胶质细胞样细胞( 图卜1 3 ) ；具有多个细突起且不断分支的少 突胶质细胞样细胞( 图卜1 4 ) 。 取神经干细胞球贴壁分化生长7 d 的盖玻片，分别行n s e ( 神经元的标记 物) 、g f a p ( 星型胶质细胞的标记物) 、c n p ( 少突胶质细胞的标记物) 免疫细 胞化学染色，可见到n s e 、g f a p 和c n p 阳性细胞( 图卜1 5 ，卜1 6 ，卜1 7 ) ， 证实了神经干细胞的多分化潜能，即具有分化为c n s 三种主要细胞的能力。 实验二结果 细胞生长状态观察：在3 7 组，胎鼠死亡后l 2 h 时，还可以见到少量单 个的细胞( 图卜1 8 ) ，1 h 时显微镜下只能看到大量的细胞碎片；而在4 组，胎鼠脑组织离体后3 天，仍可以培养出神经干细胞球( 图卜1 9 ) ，数 量仍较多。 讨论 一、关于n s c s 的一些基本概念 为了能够更好的理解干细胞的概念，我们引用窦万臣博士论文中的干 细胞树枝模型。可以认为树木主干是一个全能的干细胞，由树木的主干发 出各级树枝代表不同级别的干细胞，从主干到分枝，其分化能力逐渐受到 限制。主干代表胚胎干细胞，具有完全分化能力，可以分化出任何级别的 细胞，为全能的干细胞；从主干发出的一级分枝是多能干细胞，对应着不 同系统器官的干细胞，如造血干细胞，肌肉干细胞，神经干细胞等；二级 1 2 2 0 0 8 届硕士毕业e 论文脂质体介导绿色荧光蛋白基因转染神经干细胞的实验研究 分枝是次级多能干细胞，代表淋巴系干细胞，髓系干细胞等；更下一级分 枝代表分化能力进一步下降的干细胞，直至成熟细胞。从这个意义上讲， 神经干细胞也可以称为能够分化为星形胶质细胞，少突胶质细胞和神经元 的多能干细胞。 二、关于n s c s 分离培养的条件 只有顺利地培养出大量的神经干细胞，才能进行其他研究。神经干细 胞体外培养成功与否取决于动物种属、年龄、取材部位、接种密度、培养 基营养条件及促有丝分裂因子的选择等。 本实验分别选择胎鼠、新生卜2 天大鼠，成年大鼠海马作为n s c s 的来 源。结果证实，胎鼠、新生卜2 天大鼠海马中所得的n s c s 的细胞、克隆数、 扩增能力和传代能力基本相同，使用新生卜2 天大鼠价格大大低于胎鼠， 易于在体外进行细胞生物学特性的研究及其他操作等。成年大鼠海马中我 们也能培养出神经干细胞，但数量非常少，且不易于体外培养，扩增能力 和传代能力相对弱得多，无法获得大量n s c s 。 n s c 的培养多采用无血清培养技术晗1 。b f g f 和e g f 是细胞分裂原信号， 是促进n s c 生长常用的生长因子，应用b f g f 或者联合应用b f g f 和e g f 后， 来源于c n s 不同部位的多潜能干细胞的分裂速度都能得到成倍地增加。本 研究联合使用e g f 和b f g f 可维持n s c 的稳定，促进增殖，抑制分化，培养 的n s c5 7 天可传代，并可在体外稳定传代培养2 月半以上。 在通常神经干细胞培养中，一般做法是脑组织取出后立即进行原代培 养，但是从大鼠死亡，到脑组织制备成单细胞悬液并加入到培养基中，所 用时间是有差别的。我们在实验中证实：在较低温度下，离体脑组织内神经 干细胞可以保存更长的时间，而在较高温度时保存时间明显缩短。这和窦 万臣博士论文中所报告的是一致的，再次证实低温对脑组织标本的保存是 十分重要的。这与我们的临床常识是一致的：在脑损伤患者，采用低温能有 效地保护脑组织。因此，在神经干细胞的培养过程中，要尽量注意做到低 1 3 2 0 0 8 届硕士毕业牛论文 脂质体介导绿色荧光蛋白基因转染神经干细胞的实验研究 温操作，这样有利于提高培养的成功率。 三、关于神经干细胞的鉴定 目前对神经干细胞的鉴定，主要是依据细胞的生物学特性( 自我更新及 多分化潜能) 及特异性的细胞标志物。其中，n e s t i n ( 巢蛋白) 为神经干细 胞的标志物，神经元特异烯醇化酶( n s e ) 为成熟神经元标记物；星形胶质 细胞标记物( g f a p ) ；少突胶质细胞标记物( c n p ) 等。n e s t i n 是一种中间 丝蛋白，只在具有多分化潜能的神经外胚层细胞中表达，随着神经上皮的 分化、成熟而逐渐消失1 。有研究表明，在少数保持神经发生功能的部位， n e s t i n 仍有表达。但也有研究表明，不是所有的n s c s 都表达n e s t i n ，在 n s c 分化过程中，n e s t i n 只是瞬间表达，另外在海马的成熟神经元和某些 活跃的星型胶质细胞及一些神经系统肿瘤中也有n e s t i n 的表达。尽管如此， 目前还没有代替n e s t i n 鉴定神经干细胞的物质。 实验中发现：应用神经干细胞培养基从胎鼠、新生卜2 天大鼠，成年大 鼠海马培养分离出的细胞，与文献报道的神经干细胞球外部形态大体相同， 并且原代和传代细胞均可自我增殖，经免疫细胞化学检测，原代及传代细 胞n e s t i n 均为阳性，诱导分化后可表达神经元和星形胶质细胞的特异性抗 原n s e 、g f a p 和c n p ，具备了n s c s 的基本属性。 四、成体n s c s 的应用前景 我们在成年大鼠海马中也能培养出神经干细胞( 图卜2 0 ，卜2 1 ，卜2 2 ) ， 与s v e n d s e n 等h 1 报道的神经干细胞也存在于成熟的人类c n s 中的结论相 符，虽然数量非常的少，不易于体外培养，扩增能力和传代能力弱，但仍 然能看到它光明的前景! 成年个体中枢神经干细胞的发现，为神经发育研究和中枢神经功能的 重建提供了一条新的途径。例如可以诱发处于静止状态的神经干细胞的激 活，使它们迁移到特定脑区，发育成所需要的神经元。尽管设想距离实现 还很远，但无疑具有巨大的理论和临床应用价值。然而目前，我们还不知 1 4 2 0 0 8 届硕士毕业生论文脂质体介导绿色荧光蛋白基因转染神经干细胞的实验研究 道神经干细胞增殖的内在调节机制，以及多潜能神经干细胞是如何进一步 分化的，有多少细胞需要进行分裂，分裂的次数如何控制，以及自我更新 过程的详细细节，怎样才能有效诱导成体内源性神经干细胞活化，向所需 要的细胞类型分化等。相信随着对成体神经干细胞研究的不断深入，这些 问题终将得到解决。 2 0 0 8 届硕士毕业乍论文脂质体介导绿色荧光蛋白摹因转染神经干细胞的实验研究 参考文献 1 v i l l aa ，s n y d e re y v e s x o v ia ，e ta 1 e s t a b l i s h m e n ta j l dp r o p e r t i e so fa 铲。嘶h f a c t o r - d e p e n d e n t ，p e r p e u a ln e u r a ls t e mc e l ll i n e 矗o mt h eh u m a nc n s e x p n e u r 0 1 2 0 0 0 ，1 6 l ( 1 ) ：6 7 - 8 4 2 b r a r m e nc l ，s u g a y ak i nv i t r od i f r e r e n t i t a t i o no fm u l t i p o t e n th u m a nn e u r a l p r o g e n i t o r si ns e m m 一行e em e d i u m n e u r o r e p o r t ，2 0 0 0 ，1 l ( 5 ) ：1 1 2 3 1 1 2 8 3 1 y i m gh k ，s u n d h o l m - p e t e r s ，e ta 1 d i s 仃i b u t i o no f d o u b l e c o r t i n e x p r e s s i n g c e l l sn e a rm el a t e r a lv e n t r i c l e si nt h ea d u l tm o u s eb r a i n jn e u r o s c i r o s 2 0 0 4 ，7 6 ( 3 ) ：2 8 2 9 5 4 s v e n d s e nc n ，c a l d w e l lm a ，o s t e n f e l dt h u m a nn e u r a ls t e mc e l l s ：i s o l a t i o - n ， e x p a n s i o na n dt r a n s p i a n t a t i o n j 】b r a i np a t h o l ，1 9 9 9 ，9 ( 3 ) ：4 9 9 51 3 1 6 2 0 0 8 届硕士毕业生论文 脂质体介导绿色荧光蛋白