（特种经济动物饲养专业论文）柞蚕丝脱胶和丝胶蛋白提取方法的研究.pdf

沈阳农业大学硕士学位论文 摘要 本论文研究了柞蚕丝碱性溶液法与酶法脱胶的工艺，并应用冰冻法、透 析法和等电点沉淀法研究了柞蚕和家蚕丝胶的提取方法，以期研究出- - r e 简 易、廉价的脱胶和提取蚕丝丝胶蛋白的最佳工艺，为丝胶蛋白的生产和进一 步开发利用提供依据；同时，对磷酸法水解柞蚕茧衣制取柞蚕丝丝蛋白的可 行性做了初步的研究，对有关工艺参数进行了优化。 结果表明，酶法对柞蚕丝的脱胶效率要优于碱法。碱法脱胶时，以n a ，c 0 。 为脱胶剂的最佳工艺是以n a t c 0 。浓度为1 、时间l 小时和浴比1 ：3 0 为宜， 选用胰蛋白酶为反应物时的最佳工艺是以胰蛋白酶为o 5 9 l 、时间2 小时和 温度5 0 c 为宜： 提取柞蚕丝胶蛋白的最佳工艺以蚕丝脱胶液p h 为7 、一2 0 冰冻1 3 h r 为宣，回收率可达5 8 左右：丽提取家蚕丝胶的最佳工艺则以蚕丝脱胶液p h 为7 、一2 0 冰冻l l h r 为最好，回收率可达到7 5 左右；应用透析法提取丝 胶蛋白时，在所用透析膜为8 0 0 0 2 0 0 0 0 d 的情况下，柞蚕丝胶蛋白的回收 率为2 0 o ，而家蚕丝胶蛋白的回收率可达8 1 5 ；等电点法提取丝胶蛋白 时，柞蚕丝和桑蚕丝的丝胶蛋白回收率均不高，只有4 5 左右： 研究发现磷酸法水解柞蚕茧衣制取柞蚕丝氨基酸的效果较好，可以通过 控制反应时间获得不同分子量范围的柞蚕丝肽和氨基酸，以适应不同产业要 求的标准。 关键词：柞蚕；家蚕；丝胶蛋白；冰冻法；透析法：磷酸法 刚舌 月i j吾 蚕丝业起源于我国，拥有几千年的悠久历史，我国是茧丝绸生产大国， 产茧量及产丝量均为世界第一。特别是柞蚕，它是我国的特产资源之一，其 茧、丝、绸的产量约占世界总产量的8 0 ，其中辽宁省约占全国的7 0 ， 我省现拥有数十万公顷柞树资源可用于放养柞蚕，涉蚕农业人口十余万，已 形成独具特色的资源和产业优势。据调查统计，全国的桑蚕茧年产量是5 0 万吨左右，柞蚕茧年产量为5 万吨左右，蚕丝资源非常丰富，年产丝量近4 万吨。以前对于蚕丝的应用主要是将丝素纤维用做衣料，我国依靠得天独厚 的资源优势在世界市场上占据主导地位，成为世界最大的生产国和出口国。 但是，进入9 0 年代，随着社会的进步和现在科学技术的发展，我国却因为 科技滞后，产业链不紧等原因，致使这一传统产业一度陷入了困境。大力开 展蚕丝综合利用的研究，开发出新技术产品，对于扩大蚕业生产规模，提高 蚕的自身附加价值都具有着深远的意义。目前，国内外对蚕丝新功能的开发 利用格# 1 - 弓1 人注目，并已开发出系列化妆品、营养食品和医疗保健品投入市 场。但是，目前开发利用的对象主要集中于丝素，而丝胶在此方面的研究开 发甚少。而最近的研究表明，丝胶蛋白在化妆品、营养食品、医疗保健品和 功能性材料方面均有较大的利用潜力。 一、丝胶蛋白的组成成分和结构 蚕丝主要由内层的丝素和外层的丝胶两部分组成，还含有少量的脂肪、 蜡物质、色素和无机盐类。丝胶在桑蚕丝中占2 0 3 0 、柞蚕丝中占1 2 1 4 左右，它是水溶性球蛋白，相对分子质量为1 4 3 1 4 万道尔顿，分子中含有 两条肽链通过二硫键连接的结构。柞蚕丝胶蛋自由1 8 种氨基酸( 其中8 种 是人体必需氨基酸) 组成，其中丝氨酸、天门冬氨酸、苏氨酸和甘氨酸含量 较高，相对质量含量分别达到2 3 4 9 、1 7 7 2 、1 5 2 6 和1 2 ，5 3 。桑蚕丝 沈阳农业大学硕士学位论文 胶蛋白也是由1 8 种氨基酸组成，其中丝氨酸、天门冬氨酸和甘氨酸相对质 量含量分别为3 3 4 3 、1 6 7 1 和1 3 4 9 。 柞、桑蚕丝胶氨基酸组成比较( 1 0 0 9 蛋白质中氨基酸克数) 项目名称 柞蚕丝胶桑蚕丝胶 甘氨酸( g l y ) 1 2 5 58 8 0 丙氨酸( a l a ) 2 8 24 0 0 颉氨酸( v a i ) 0 5 63 1 0 侧链疏水 j 亮氨酸( l e n ) 0 6 9 o 9 0 异亮氨酸( l m n ) o 6 0o 6 0 苯丙氨酸( p h e ) 0 9 90 6 0 蛋氨酸( m e t ) 0 1 40 1 0 。胱氨酸( c y s ) o 2 7o 3 0 r 酪氨酸( t y r ) 5 6 44 9 0 侧链稍亲水 。 色氨酸( t r y ) o 2 0 8 5 0 l 脯氨酸( p r o ) 1 6 3 0 5 0 ，天门冬氨酸( a s p ) 1 7 7 2 1 6 8 0 f i 谷氨酸( g i u ) 6 8 6 1 0 1 0 i 苏氨酸( t l t r ) 1 5 2 6 8 5 0 i 侧链亲水 一 丝氨酸( s e r ) 2 3 4 9 3 0 1 0 l 组氨酸( h i s ) 1 , 7 0 1 4 0 赖氨酸( l y s ) 1 6 15 - 5 0 i l 精氨酸( a r g ) 5 4 94 2 0 丝胶的二级结构以无规则卷曲为主，并含有部分p 构象，几乎不含a 螺 旋结构。接近丝素的内层丝胶中含p 结构的比例相对外层丝胶来说要高，但 外层丝胶在环境条件特别是湿度的影响下，部分无规则卷曲能向p 结构发生 不可逆转化。通过对丝胶基因s e ri 进行序列分析，确定其9 个外显子中有2 3 前言 个外显子含有由1 1 4 个氨基酸( 相当于3 8 个氨基酸残基) 为重复单位组成 的构造，该重复构造中丝氨酸密码子约占4 0 8 ，其编码的肽链有可能形成 p 折叠和d 转角，因此推测丝胶中也可能含有类似于丝素的结晶区( o k m a t o h 。等，1 9 8 2 ，g a r c la ，等，1 9 9 7 ) 。 丝胶蛋白质产生于蚕体的中部绢丝腺，在中部绢丝腺的前中后三区，分 别合成丝胶i 、i i 、i 、1 v ( 小松计一，1 9 7 5 ) 。它们是氨基酸组成不同的 四种丝胶蛋白质，组成成分呈连续倾斜。丝素蛋白质经过中部绢丝腺后，就 构成了以丝素为中心的同心圆柱状，即中部绢丝腺的液状绢是内部为液状丝 素，外侧由液状丝胶包复的双层结构。两类蛋白质发生相分离，并未混合。 绢丝腺的细胞膜具有合成蛋白质的功能，氨基酸由体内的血液输送，在细胞 膜内整合。蚕在幼体时期就具备了制丝器官绢丝腺，而孵化后1 8 2 4 天后，由于五龄期大量吃食，使制丝器官快速发育成为成熟蚕。蚕在完成吐 丝准备后就吐出最初一滴蛋白质，它不是丝，而是无取向结构的糊状丝胶蛋 白质，以此为原点牵引出蚕丝纤维进行结茧。丝胶在保护丝素的同时，还起 到容易流动的润滑剂作用。 二、丝胶蛋白在保健纺织物上的应用 合成纤维系疏水性纤维，吸放湿性能较差，因此用合成纤维制作的服装 穿着的舒适度比不上天然纤维。在吸放湿性能测定上，可测定设想的室外空 气温度为2 0 、湿度为6 5 条件下的吸湿率和衣服内出汗状态下的温度为 4 0 。c 、湿度为9 0 条件下的吸湿率之差( a ) ，这种差值越大，则吸收衣服内 水蒸气( 汗) 并向衣服外散发的能力就越大，可以说是舒适性良好的材料。根 据上述设定条件和方法，对涤纶纤维、吸水整理的涤纶纤维、固着丝胶的涤 纶纤维进行了吸放湿性测定。一般吸水整理的涤纶纤维和未整理涤纶纤维在 吸放湿性上几乎没有变化，而固着丝胶的涤纶纤维的吸放湿性却有显著提 高。这是因为丝胶含有大量具有亲水性侧链的氨基酸，具有良好的水溶性和 4 沈阳农业大学硕士学位论文 吸水性。在丝胶溶液中加入一定量的交联剂( 如戊二醛，树脂等) 进行改性， 降低丝胶的溶解性，并使其成为网状结构。将合成纤维浸渍在改性后的丝胶 溶液中，或将丝胶溶液直接涂刷在织物上，即可得到改性纤维或改性织物。 丝胶分子的引入，降低了纤维的表面电位，增加了纤维表面活性吸附活化中 心，并降低了纤维结晶度，提高了内表面积，因此有利于水分子的吸附和扩 散，使改性纤维或织物的吸放湿性能提高。日本利用这种涂层技术，己成功 开发出产品，如内衣、汗衫、尿布、床上用品等。经测定，改性后的织物吸 水性可提高1 0 倍以上，静电量可减到原来的1 5 1 1 0 。此外，还具有显 著的抗菌效果。随着人们保健卫生意识的不断增强，这类新产品的销量正在 逐渐增长。 三、丝胶蛋白在化妆品领域中的应用 我国明代李时珍在他的医学巨著本草纲目中曾记载，天然蚕丝可以 使皮肤变美，消除黑斑，还能治疗化脓性皮炎。经现代科学实验证明，蚕丝 中含有多种氨基酸和蛋白质，其蛋白质含量大大高于珍珠，其中氮含量比珍 珠高3 7 倍，主要氨基酸含量高1 0 倍以上。丝胶蛋白作为护肤护发化妆品主 要成分很早就受到注意。早在1 9 5 8 年，就有以o 1 1 丝胶作为护发剂 主要成分的专利申请。但以后较长时间没有进一步的应用报道。直到1 9 8 3 年，有报道以含o 0 0 1 3 丝胶作为基料的护肤品能提供其贮存稳定性， 给予肌肤营养、滋润、美白与光滑。随后有丝胶作为休浴露添加剂和以丝胶 与壬酸为活性添加剂的水基护发剂出现。丝胶蛋白与天然的纤维素、聚合物 或其它产物混合制成的化妆品具有多种优良的性能。例如丝胶蛋白与棉、羊 毛、亚麻纤维或再生纤维等混合的化妆品具有吸收脂肪和汗水、维持脂质及 防止皮肤粗糙的作用；与木质葡聚糖和粘多糖混合制成的化妆品也象甘油那 样具有很好的吸湿性效果；与米糠抽提液混合制成的化妆品能有效地改良粗 糙皮肤表面的亲水性和有效地保护角质层，能够使毛发湿润、平滑和光泽。 前言 用丝胶被覆的粉末材料也能用作化妆品的基料，并具有良好的水溶性，可维 持水溶液稳定，这种丝胶被覆粉末对皮肤无刺激、无过敏，光泽适中、透明， 能良好地掩盖皮肤表面的缺陷如坝皱纹、毛孔或粗糙组织。最近，又出现以 分子量4 6 0 k d a 丝胶蛋白与水溶性壳聚糖和三甲基胺衍生物混合，或与糖 醇、丝氨酸混合，或与一种溶点4 0 的水溶性聚醚修饰的硅或水溶性壳聚 糖衍生物混合的3 个护发剂产品。这些护发剂对因化学剂或化学烫发等处理 后引起的损伤、卷曲、起毛、泛黄等现象具有强力修复作用和优异护理作用。 皮肤角质层中应保持1 0 2 0 的水分才能使皮肤丰满而富有弹性。当 皮肤角质层中的水分在1 0 以下时，皮肤即呈干燥甚至开裂。角质层中之所 以能含有一定量的水分，一方面由于皮脂膜防止水分蒸发，另一方面角质层 中含有天然保湿因子( n a t u r a lm o i s t u r i z i n gf a c t o r ，n m f ) ，它对皮肤保湿起着 极为重要的作用。天然保湿因子主要由氨基酸类、毗咯烷酮羧酸、乳酸盐、 尿素、糖类、有机酸、多肤等物质组成。假如从角质层中将这些水溶性成分 除去，皮肤的吸湿性将丧失。丝胶具有良好的吸放湿性能，加入到化妆品中， 能起到类似天然保湿因子的作用。它之所以能成为天然保湿因子物质，其原 因是它里水溶性，其分子构象为无规则卷曲，空间结构松散、无序，使丝胶 的多肽链上许多极性亲水性基团( 例如o h 、c o o h 、- n h 2 、 n h 等) 处于 多肽链的表面，而这些亲水性基团可使体内水分传递至皮肤角质层而结合， 从而使皮肤保持一定水分，皮肤柔软而光滑。日本已有以丝胶为主要添加剂 的化妆品在市场上闷世，比如润肤霜、洁面乳、洗面奶、体浴露、洗发香波、 护发素等。 山田英幸证实 0 5 丝胶或水解物能抑制酪氨酸酶的活性，即使煮沸处 理，其活性也持续不变。在含有l 一3 ，4 一二羟基苯丙氨酸( 3 ，4 一 d i h y d r o x y p h e n y l a l a n i n e ，d o p a ) 及蘑菇酪氨酸酶( m u s h r o o mt y r o s i n a s e ) 的磷酸 缓冲液中，分别加入o 5 、1 0 的丝胶溶液后，再测定其抑制酪氨酸酶的 活性。结果证明，与对照相比，加入丝胶后，酪氨酸酶的活性分别降低到7 6 6 沈阳农业大学硕士学位论文 、5 0 。其机理可能是由于丝胶中高比例的羟基氨基酸与微量元素如铜、 铁的络合，从而影响了酪氨酸酶活性的正常发挥。人体皮肤的美白与皮基层 中能产生黑色素细胞有关，黑色素细胞中含有酪氨酸酶，首先将角朊组分中 的酪氨酸氧化，先后经过3 ，4 一二羟基苯丙氨酸( 简称多巴) 、多巴醌、5 ，6 一二羟基吲哚和吲哚5 ，6 一醌，最后聚合成黑色素。紫外线能促进这一氧化 反应，所以在夏天，人的皮肤常暴露于同光中就容易变黑。山田英幸同时证 实这种丝胶或其水解物还具有抗氧化作用，其抗氧化能力可与v c 相媲美， 能抵御紫外线、日光、微波、化学物质、大气污染物对肌肤的侵蚀。丝胶能 很好地抑制活性氧的发生，防止皮肤起皱老化。此外，丝胶中的酪氨酸、色 氨酸、苯丙氨酸等也能有效吸收紫外线。所以，当使用含有丝胶的化妆品后， 能抑制黑色素的生成，对预防日晒后的皮肤变黑具有显著效果，能保持肌肤 白净，具有美白作用。 经真皮成纤细胞体外培养试验和e l i s a 测定结果证明，在培养基中添加 1 0 k d 2 0 k d 水溶性丝胶能使这种细胞的胶原生产量提高1 0 。当这种丝胶 肽与常用皮肤外用剂成分混和后，具有防止细胞老化、促进胶原生产的作用。 当丝胶与酵母抽提物混合后也可成为一种皮肤外用药膏，它也能促进真皮纤 维细胞的胶原生产，有效防治或减缓各种皮肤病症和皮肤起皱老化、弹性下 降、粗糙、发黑、松弛等，并具有保湿功能。另外，丝胶与木质葡聚糖、紫 外吸收剂、粘多糖、羟基或烷基化羧基乙烯聚合物混合可制成保护皮肤的外 用剂。国内学者利用茧壳水解物和其它麻根等7 种中草药经过加工制成纯天 然祛斑美容面膜，这种粉状面膜能用于防治人体面部皮肤各种色斑、粉刺等， 起到保护面部皮肤弹性、祛除面部皮肤皱纹、延缓面部皮肤衰老的作用。 四、丝胶蛋白在食品上的应用 丝胶含有1 8 种氨基酸，9 0 以上的氨基酸能被人体吸收，含有人体所 必需的氨基酸达1 7 以上。因此将丝胶添加到食品中，是一个很好的氨基酸 前言 补充途径。脑脊髓星型细胞分泌的非必需氨基酸一丝氨酸是脑神经元生存和 生长所必需的( m i t o m aj 等，1 9 9 8 ) ，神经胶质细胞通过营养因子的供给促使 中央神经元细胞的生存和发育。而甘氨酸和l 一丝氨酸一样也有促进神经胶质 细胞产生营养因子的作用，能促进小脑培养神经元生存、树突发生以及电生 理发育( f u t u y as 等，2 0 0 0 ) 。丝胶蛋白中l 丝氨酸占2 3 4 9 ，而甘氨酸含量 为1 2 5 3 ，相加的总量约占总量的三分之一强。因此，多摄取丝胶及其水 解产物有利于提高人的记忆力、防止脑老化、预防痴呆症等。 食物发生褐变反应是由于食物中的脂质在多酚氧化酶的作用下发生了 过氧化反应。n o r i n i s ak 等通过实验发现，丝胶能显著抑制多酚氧化酶的 活性。将雄w i s t a r 鼠( 重量2 0 0 - - - 3 0 0 9 ) 脑组织取出，加入磷酸缓冲液，磨成 匀浆，然后分别加入牛血清白蛋( b o v i n es e r l i t na l b u m i n ，b s a l 和丝胶，在 3 7 条件下孵育1 2 0 r a i n 后，用2 一硫代巴比土酸( 2 - - t h i o b a i t u r i ca c i d ) 检测硫 代巴比土酸反应物质( t h i o b a r b i t u r i ca c i dr e a c t i v es u b s t a n c e s ，t b a b s ) 。结果发 现，含有丝胶的样品中t b a r s 的含量随着丝胶量的增加明显减少，而含牛 血清白蛋白的样品中t b a r s 的含量只有稍微减少。通过检测样品中的共扼 双烯( c o n g a t e dd i e n e ) 的含量，也发现了类似的结果。含有丝胶的样品中，共 扼双烯的含量随着时间的延长增长缓慢，而无丝胶的样品中，共扼双烯的含 量增长迅速。该结果说明丝胶的加人明显抑制了样品中多酚氧化酶的活性， 所以丝胶可以作为抗氧化剂在食品中加以利用。这种含有丝胶的饮食品能抑 制自体氧化，在食品中添加后能起到杀菌、防腐等作用，使食品品质稳定、 美味和长期保存。 早在1 9 8 9 年，就有有关丝蛋白作为食品的专利报导。由丝胶和丝素混 合后制成的凝胶状食品极其柔软、可口。丝胶还是冰冻糕点的良好成形剂。 丝胶和丝素的水解产物还用于某些瓜果食品如腌制话梅的调味液。这种话梅 因含有丰富的氨基酸，长期食用对人体非常有益。丝胶及其水解物己用作做 饭用水添加剂。这种加有丝胶蒸煮的米饭在硬度、保质期、咀嚼性以及附着 沈阳农业大学硕士学位论文 性等方面良好，能防止米饭的水分蒸发、抑制食味下降。所以，丝胶及其水 解物作为饮食用水或做饭用水的添加剂已经上市( 山田英幸等，2 0 0 0 ) ，这种 饮食用水可用作食物蒸煮、炊饭、沏茶、化妆品、饮料加工等的水源。长期 饮用或食用加有丝胶的水制成的食品、茶、饮料等能维持健康、抑制病菌、 延迟衰老、美容养颜。 s a s a k im 等通过实验发现，丝胶还能促进肠道对矿物质的吸收。以含 有2 3 卵白蛋白的食物作对照，用含有2 0 卵白蛋白和3 丝胶的食物喂养 雄w i s t a r 鼠1 2 天，发现含有丝胶的食物能明显提高鼠对锌、铁、镁、钙元 素的吸收，增加率分别为4 1 、4 l 、2 1 和1 7 。同时检测发现，血清 和尿液中这些元素的含量都没有改变，说明丝胶增强了鼠对这些元素的吸收 和利用。所以，丝胶用作难消化性食物的食品添加剂和保健营养剂能促进矿 物质营养吸收。 在用胃蛋白、结晶胰蛋白酶或胰酶制剂等蛋白酶在生物体外进行消化试 验时，确认大分子量的丝胶有难以被消化的性质。此外，在添加丝胶的食饵 让大自鼠摄取3 周后，调查其粪便成分，也表明食饵中的大部分丝胶并末消 化，有直接从粪中被排泄的可能性。具有良好保水性的丝胶难以消化，所以 可以认为丝胶有改善便秘的可能性。并已用大白鼠进行了探讨。将大白鼠分 为两组，一组使其摄取丝胶，另一组不摄取丝胶。然后，对它们再分为投入 和末投入便秘引发剂两组。结果摄取丝胶、投入便秘引发剂的大白鼠，其粪 量和粪中含水量与摄取丝胶的一般大白鼠( 无便秘引发剂) 的基本相同，表明 如摄取丝胶，大自鼠根本不产生便秘。这就表明了丝胶有治疗便秘的功能。 研究还发现丝胶及其水解物对大肠杆菌有抑制作用。最近研究也表明，l 水溶性丝胶液以不同比例与普通蛋白胨液体培养基混合，进行大肠杆菌接 种培养试验。结果表明随着混合液体培养基中丝胶含量的提高，其抑制大肠 杆菌的能力随之增强，在全丝胶培养液中大肠杆菌生长几乎被全部抑制，而 未含丝胶的对照培养基中大肠杆菌生长良好。 9 前言 k a t on 等在证实低消化率的荞麦蛋1 刍( b u c k w h e a tp r o t e i n ) 具有抗便秘、 抗肥胖和抗肿瘤效果的同时，认为具有强保水性和抗氧化性的丝胶具有与荞 麦蛋白相类似的性质抗多种酶的分解。因此认为以丝胶、养麦蛋白这类 低消化率的蛋白质抵抗蛋1 1 1 ( r e s i s t a n t p r o t e i n ) 作为食物的添加剂，将有助 于改善肠道的生理功能，增强人体的健康。 五、丝胶蛋白的医药领域的应用 丝胶中丝氨酸、天门冬氨酸、苏氨酸和甘氨酸含量丰富。丝氨酸能降低 血液中胆固醇的浓度，治高血压，对结核菌瘸有效果，可治疗肺病。天门冬 氨酸能降低血氨，对肝有保护作用，对心肌有保护作用，可治疗心绞痛，对 心肌梗塞等有防治效果。甘氨酸也能降低血液中的胆固醇浓度，防治高血压， 能降低血液中的血糖，防治糖尿病，防治血凝、血栓，还能提高肌肉活力， 防止胃酸过多，对治疗呼吸道疾病有效。 s a s a k im 等用丝胶对鼠添食。用丝胶质量分数为1 5 或3 的食物添 食5 周，并在最初的3 周里每周注射一次二甲肼( 1 ，2 - - m e t h y l h y d r a z i n e 。d m h ) 以诱发结肠癌，结果发现鼠结肠畸形囊的发育受到抑制。用丝胶质量分数为 3 的食物添食1 1 5 天，并在最初的1 0 周里每周注射一次二甲肼，鼠结肠致 癌的几率及数量明显受到抑制。这说明丝胶有望被开发成为结肠癌的预防药 剂。最近又有发现丝胶及其水解物能抑制鼠皮肤癌的发生。用模型实验鼠经 皮肤癌诱发剂涂布1 周后，就用丝胶涂布。饲养1 6 周以后，可观察到未涂 丝胶液的对照鼠已出现较严重的皮肤癌病症，发生许多溃疡；用2 5 m g 丝胶 涂布的实验鼠有轻度的皮肤癌病症，有一处出现溃疡；而用5 0 m g 丝胶涂布 的实验鼠未观察到任何皮肤癌发生症状。这些结果表明丝胶及其水解物能够 有效地抑制皮肤癌发生。所以，丝胶及其水解物作为一种结肠癌的预防药剂 和皮肤癌药剂具有潜在的利用价值。 将丝胶或丝素进行硫酸化处理可制成另一种抗凝药剂( 玉田靖，1 9 9 7 ) 。 1 0 沈阳农业大学硕士学位论文 在丝胶或丝素溶液中加入浓硫酸，其加入量为丝胶或丝素蛋白的量o 5 2 0 0 倍。2 0 。c1 0 0 温度下搅拌硫酸化处理数十分钟到几小时，获得硫酸化丝 胶或丝素产物，经过滤、洗净后溶于水，再透析、冷冻干燥，最后获得水溶 性的硫酸化丝胶或丝素粉末，经抗血液凝固活性试验，发现它像肝素一样， 具有抗血液凝固活性，而未经硫酸化的丝胶或丝素就没有这种抗凝活性。所 以，硫酸化丝胶或丝素可替代肝素，具有低价、生产效率高和安全性高的特 点，有广泛的医疗用途如尿毒症病人人工透析或体外循环时血液中的抗凝 剂，病人检查或治疗时与血液接触的医疗用材料表面的抗凝处理等。前不久， 研究人员又将这种硫酸化丝蛋白抗凝剂进行抗艾滋病病毒活性评估试验，发 现它能阻止病毒与免疫细胞表面蛋白质相结合。据说，这种新抗凝物质将用 于制造牙膏和刮脸膏等，以防止艾滋病传染。 m i n o u r an 等将丝素、丝胶及两者混合物制得的各种膜，用以小鼠成 纤细胞的培养，通过调查膜与细胞的附着状况和成纤细胞的增殖速度发现， 由丝胶和丝素分别制作的膜均显示出良好的附着和增殖性，与常用哺乳动物 细胞培养基胶原质的性能基本相同。但丝胶对增殖细胞的形状有一定影 响，需要进一步改进。 王苏等用丝胶水溶液( 质量百分数为5 ) 与聚乙烯醇( p o l y v i n y la l c o h o l ， p v a ) 水溶液混合制成的含水凝胶膜，性能优良，溶解性、拉伸力学性能和透 氧性均符合医学材料的要求。 另外丝胶肽溶液对某些皮肤病有良好的消炎作用和治疗效果。在征得患 有接触性皮炎3 年和阿的平皮炎5 年的病人同意在患病各部位洗净后。分 别将o 5 丝胶液涂于患处2 0 天后接触性皮炎病症减轻近两月后病症基 本消失；而阿的平皮炎病症在一个月后大都减轻两个月后病症已基本消失。 六、丝胶蛋白在生物材料领域的应用 最近又发现丝胶对细胞和蛋白质有冻结保护作用( k a z u h i s a t 等，2 0 0 1 ) 。 前言 整个丝胶蛋白序列中含有一段由3 8 个氨基酸组成的高度保守和重复的序列， 利用这段在丝胶中高度保守和重复序列，用化学方法合成这段基因，通过基 因扩增和融合技术等在大肠杆菌中大量表达。对表达丝胶基因的大肠杆菌细 胞进行_ 2 0 。c 保存3 天的冻结忍耐试验，发现重组体的细胞比对照组存活率要 高出2 倍多。对大肠杆菌细胞添加水溶性丝胶的冻结试验也表明，丝胶的抗 冻保护作用与已知的抗冻保护剂牛血清清蛋白( b s a ) 相当。另外，通过乳酸 脱氢酶在液氮中6 0 秒至05 分钟冻融试验表明，在含表达丝胶肽和水溶性丝 胶二组中乳酸脱氢酶残存活性都要比b s a 高。这些结果证实表达丝胶肽像 天然丝胶一样具用很高的抗冻活性，作为新功能生物材料将具有重要的应用 价值。 丝胶是由氨基酸组成的天然蛋白质，当与水溶性高分子树脂混合后可制 成合成树脂，这是一种可降解材料，能被微生物分解。将丝胶粉末掺入到聚 氨脂中就可制成一种吸、放湿性优异的可降解泡沫材料。这种材料以聚氨脂 泡沫为骨架，平均粒径、 ，反渗透( 0 0 0 1 u r n ) 。其中超滤膜用于工 业废水处理等。膜分离技术发展很快，随着新的膜材料的研制及应用，膜技 术又有新的发展，应用范围不断扩大，尤其是超滤膜。超滤是近二十年来发 展起来的一种膜分离技术，它以多孔性高分子半透膜作过滤介质，因滤膜上 孔径极小，依据膜两侧的压力差能阻拦溶液中各种微粒、胶悬体及溶解的大 分子溶质，达到分离浓缩的目的。 在选用截留范围8 0 0 0 d 2 0 0 0 0 d 的透析袋时，因柞蚕丝脱胶液中低于 8 0 0 0 d 的较多，导致其提取率非常低，只有2 0 0 个百分点；桑蚕丝脱胶液中 丝胶蛋白分予量低于8 0 0 0 d 的较少，从而使其回收率高达8 1 5 个百分点。 但该结果同时也说明用透析法提取丝胶蛋白时，蚕丝脱胶液中丝胶的分子量 大小与所选用的透析膜对丝胶回收率有密切联系，二者吻合时就能把回收率 提高。本研究选用的是截留分子量为8 0 0 0 2 0 0 0 0 d 的透析袋，对家蚕丝丝 胶蛋白的回收率效果较好，而对柞蚕丝胶蛋白的回收率非常低，由此说明应 讨论 用透析法制取柞蚕丝胶蛋白时，应考虑选用能截留分子量为8 0 0 0 2 0 0 0 0 d 以下的透析袋。 应用透析法时，由于这种过滤与通常的分离方法不同具有不需要加热， 不用经过相的转换，不易损坏热敏感物质，能耗低，设备简单，操作容易， 处理效率高等优点。此外，还具有回收成分无污染、纯度高、回收率高等独 特的优势。根据它的回收机理，可选择不同的膜孔径，对丝胶蛋白质进行选 择性的过滤回收。但该方法缺点是设备成本高，且要定期的对膜进行清洗和 更换。 ( 六) 等电点法回收丝胶蛋自 蛋白质具有两性性质，在p h 值较低的溶液里，蛋白质以正离子形式存 在，在p h 较高的溶液里，蛋白质以负离子形式存在。如果把溶液的p h 值 调节到上述两种情况中间的某一个值，蛋白质所带的电荷数相等，此时中性 的双极离子浓度达到最大值，这个皿 值称为蛋白质的等电点。桑蚕丝胶蛋 白的等电点在3 8 4 5 范围内。如果把精练废水的p h 值调节至一个合适的 值，使蛋白质正负离子所带的电荷数相等，此时丝胶蛋白质溶解度降至最低， 丝胶就会从溶液中析出。一般称这种回收丝胶的方法为酸析法。酸析法是丝 胶回收中最常用的方法。 等电点法的优点是工艺流程比较简单，回收的丝胶相对比较纯净，回收 所需成本低；缺点是回收率不高，而且对设备耐酸性要求较高，且丝胶中含 有h c l 或n a c l ，用作医药受到限制。总的来说，工业运行中这种回收方法 并不经济，可操作性不高。 ( 七) 各种回收丝胶蛋白方法的比较 比较上述三种回收丝胶蛋白的方法，考虑到在柞蚕丝脱胶时产生的丝胶 蛋白的分子量分布范围比较大的特点，适合于提取柞蚕丝丝胶蛋白的方法只 有冰冻法比较适合，虽然在回收率高低方面比桑蚕丝丝胶蛋白回收率稍低， 沈阳农业大学硕士学位论文 但在柞蚕丝丝胶蛋白提取方面它的丝胶回收率是最高的；根据透析法提取丝 胶蛋白的试验结果，只要选取能截留分子量范围内丝胶的透析膜，柞蚕丝丝 胶蛋白回收率将会有很大的提高。 冰冻法和透析法都适合于桑蚕丝丝胶蛋白的提取，两者相比各有优缺 点。在丝胶回收率方面冰冻法略低于透析法，但其工艺流程简单，设备投资 少，而透析法设备成本高，且要定期的对膜进行清洗和更换。 ( 八) 磷酸水解柞蚕茧衣 试验参照冀瑞琴( 2 0 0 1 ) “磷酸水解法制取柞蚕丝肽与混合氨基酸的研 究”中的水解条件进行。在磷酸水解柞蚕茧衣的预备试验中，浴比为1 ：4 ， 温度为9 0 * ( 2 时，我们利用双缩脲反应测定了茧衣的水解程度，即测定双缩脲 反应液在5 4 0 n m 处的o d 值，以判断茧衣的水解程度。o d 5 4 0 值大，双缩脉 反应液颜色深，说明产物中肽键含量多：反之，o d 5 4 0 值小，说明产物中肽 键含量少，茧衣大多被水解到复合氨基酸水平。预备试验同时表明，时间低 于1 0 m i n ，茧衣没有完全溶解。而时间为5 h r 后，o d 5 值变得很小。因此， 我们选用o 5 h r ，l h r ，2 h r ，3 h r ，4 h r 和5 h r 六个时间段。 磷酸法水解柞蚕茧衣能把柞蚕茧衣全部水解，但水解产物并不全是柞蚕 丝胶，其中含有丝素水解产物。研究发现磷酸法水解柞蚕茧衣制取柞蚕丝氨 基酸的效果较好，可以通过控制反应时间获得不同分子量范围的柞蚕丝肽和 氨基酸，以适应不同产业要求的标准。如家蚕丝和柞蚕丝在结构上的典型区 别之一是柞蚕丝具有天然的多孔性结构，它来自于线粒体及其它细胞器的自 体溶酶体或溶酶体的残骸在老熟及吐丝期开始增多，由于丝腺角质内膜及丝 质层的退化，溶酶体被释放进丝腺腔内，在丝腺腔内侵入丝素液柱。侵入的 结果是在丝素柱和茧丝上形成大量的空泡( 直径为0 5 - 5nm ) 。而在柞蚕丝 应用于化妆品行业的要求之一是尽可能的保留柞蚕丝的多孔性结构，使其具 有其它化妆品添加剂所无法比拟的吸放湿性。所以如水解产品是运用于化妆 讨论 品行业，则磷酸法水解柞蚕碱衣的最佳工艺是浴比为l ：4 ，温度为9 0 水 解2 - 3 小时。食品行业的要求之一则是水溶性好和易于人体吸收，为了符合 食品行业的标准水解产物应该是复合氨基酸，则磷酸法水解柞蚕碱衣的最佳 工艺为浴比为1 ：4 ，温度为9 0 水解5 小时。 ( 九) 分子量的测定 从s d s p a g e 凝胶电泳测定分子量的试验中可以分析出，蚕丝碱法脱胶 中柞蚕丝胶蛋白被碱水解的程度比较彻底，分子量都在i o k d 以下，而桑蚕 丝胶蛋白被碱水解的程度比较低，分子量基本上在1 0 2 0 k d 范围之间，这也 验证了在冰冻法和透析法制取柞蚕丝胶蛋白和桑蚕丝胶蛋白中柞蚕丝胶回 收率比桑蚕丝胶回收率低的事实。同时，根据分子量测定中磷酸水解柞蚕茧 衣2 小时和5 小时水解产物分子量的差异，也验证了随着时间的延长，茧农 中的肽键趋于全部断裂，茧衣被逐步地水解为复合氨基酸的分析。 s d s p a g e 凝胶电泳是分离蛋白质的常用生化方法，样品的蛋白质分子 热变性解聚后与s d s 结合形成带负电的蛋白质一s d s 复合物，复合物在电泳中 的迁移率取决于蛋白质的分子大小，使用均匀浓度的s d s p a g e 来分析分子量 在1 5 2 0 0 k d a 的蛋白质时，电泳迁移率与分子量的对数成线性关系。但常规 的t r i s 一甘氨酸一盐酸系统中电泳分离分子量小于l o k d a 的多肽效果差。而对 于小于i o k d 分子量的蛋白质的分离测定，国外曾经报道了利用三羟甲基氨基 甘氨酸( t r i c i n e ) 一s d s p a g e 方法。可分离分子量在i i o o k d 的蛋白质。因 柞蚕脱胶过程中丝胶蛋白水解的比较彻底，分子量范围比较广，而且大分子 量蛋白在活性炭脱色，过滤这一步时基本上完全损失，其分子量基本在低分 子量范围内，而一般s d s p a g e 中，1 5 k d 以上的蛋白质分离较好，低分子量 蛋白质却难以分开。所以如果要准确测量丝胶蛋白和磷酸水解柞蚕茧衣产物 的分子量范围，应采用低分子量标准蛋白和三羟甲基氨基甘氨酸( t r i c i n e ) 一s d s p a g e 凝胶系统。 沈阳农业大学硕士学位论文 四、结论 ( 一) 酶法对柞蚕丝的脱胶效率要优于碱法脱胶。选用n a 。c o ，为脱胶剂时 的最佳工艺是以n a ：c o ，浓度为1 、时间1 小时和浴比1 ：3 0 为宜；选用胰 蛋白酶为反应物时的最佳工艺是以胰蛋白酶为o 5 l 、时间2 小时和温度 5 0 为宜。 ( 二) 冰冻法提取柞蚕丝胶蛋白的最佳工艺以蚕丝脱胶液p h 为7 、- - 2 0 冰冻1 3 小时为宜，此时回收率能达到5 8 个百分点左右：而提取家蚕丝 胶的最佳工艺则以p h 为7 、一2 0 冰冻n 小时为最好，回收率可达到7 5 个百分点左右。该法投资少，工艺简便，回收率高。 ( 三) 应用透析法提取丝胶蛋白时，在所用透析膜为8 0 0 0 2 0 0 0 0 d 的情 况下，柞蚕丝胶蛋白的回收率为2 0 0 个百分点，而家蚕丝胶蛋白的回收率 则高达8 1 5 个百分点。本研究所用透析膜在提取家蚕丝胶蛋白时可以应用， 而提取柞蚕丝胶蛋白时则需选用其它规格的透析膜或者改变脱胶条件。 ( 四) 利用废弃的柞蚕茧衣磷酸水解制取柞蚕丝肽是一种变废为宝、简单 易行的方法，但需控制反应时间才能获得不同分子量范围的柞蚕丝肽，以 适应不同产业要求的标准。 4 7 参考文献 4 5 7 8 9 参考文献 秦利主编中国柞蚕学【m 】中国科学文化出版社 吕鸿声主编1 9 9 0 中国养蚕学【m 】上海：上海科学技术出版社 陈华。朱良均等2 0 0 2 蚕丝丝胶蛋白的利用研究【j 东华大学学报( 自然科学 版) 2 8 ( 3 ) ：1 3 2 1 3 6 纪佩珍1 9 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