（营养与食品卫生学专业论文）微囊藻毒素lr阻抗型免疫电化学检测方法的研究.pdf

摘要 微囊藻毒素l r 阻抗型免疫电化学检测方法的研究 学科、专业：营养与食品卫生学入学时间：2 0 0 7 0 9 硕士研究生姓名：石慧答辩时间：2 0 0 9 一0 7 指导教师：王洪新教授、孙秀兰副教授授予学位时间： 微囊藻毒素l r ( m c l r ) 是淡水水体中最普遍且毒性最强的一类蓝藻毒素。目前， 藻毒素检测方法多需昂贵仪器且操作繁杂，无法满足快速检测的要求。因此，研究和建 立一种快速，灵敏，简便的检测方法具有重要意义。本文以合成m c l r 完全抗原，制 备特异性多克隆抗体为基础，并结合免疫传感技术和纳米材料自组装法等，构建电化学 阻抗型免疫传感检测方法，主要研究内容如下： 采用“活泼酯法”和“碳二亚胺法”合成m c l r 免疫抗原及检测抗原。免疫新西兰大白 兔获得多克隆抗体，纯化后其效价高于5 2 x 1 0 4 。通过间接竞争e l i s a 法作出m c l r 竞争标准曲线，线性范围为0 2 5 - - - 4p g l , 半数抑制率i c 5 0 为o 6 8 肛l 。除与m c r r 的交叉反应率约为2 1 9 外，与m c l w ，m c l f 的交叉反应率均小于1 o 。 基于l 半胱氨酸( l c y s ) 和纳米金( n a n o a u ) 固定抗体技术建立了m c l r 无标 记型免疫传感检测方法。对m c l r 的阻抗响应线性范围为0 0 5 - 3 0 0n g m l , 最低检出 限为1 8 2 x 1 0 五n g m l ( s n = 3 ) ；检测时间仅为1 5m i r a 对饮用水源水平均加标回收率在 9 6 8 1 1 2 5 之间：对修饰电极循环扫描4 2 圈后，峰电流无显著变化，变异系数为 3 5 8 ；4 。c 下保存3 0 天稳定性良好。 基于1 ，6 己二硫醇( h d t ) 自组装技术和纳米金吸附作用相结合的方法固定微囊 藻毒素抗体构建免疫传感器。结果表明，阻抗响应线性范围为0 2 5 - - - 9 5n g m l ，检出限 达8 5 1 0 之n g m l ( s n = 3 ) ；电极的重现性及稳定性较好，对同一浓度连续测定8 次，相 对标准偏差为7 8 4 14 。c 下储存3 0 天后阻抗响应信号无明显变化；应用于饮用水，样品 的平均加标回收率为9 2 6 1 1 8 3 ；检测时间为1 5m i n 。 基于多壁碳纳米管( m w n t s ) 室温离子液体( r t i l s ) 修饰电极固定抗体，构建 了m c l r 免疫传感检测方法。本法具更高的灵敏度，最低检出限为1 7 1 0 。3n g m l ( s n = 3 ) ，在5 x 1 0 弓- - - l x l 0 2n g m l 范围内成良好的线性相关；对饮用水平均加标回收 率为8 0 9 5 - - - 1 2 7 2 3 ；水中常见的离子对于m c l r 的测定均无明显干扰。 首次提出电极保护液的设计构想。基于室温离子液体的优良特性，在4 。c 下，对修 饰电极的稳定性进行了长达6 0 天的考察，筛选出了具有有利于抗体蛋白维持其稳定性的 离子液体及其最佳浓度。利用圆二色谱法初步探究了r t i l s 维持抗体蛋白的稳定性的机 理，揭示了抗体蛋白在r t i l s 中的构象变化。 本研究所建立的检测饮用水中m c l r 的阻抗型电化学免疫传感检测方法，灵敏、快 速、方便，具有良好的发展前景，为实现直接、实时、原位、在线的m c l r 日常监测工 作提供了重要的实验依据。 关键词：微囊藻毒素l r ；多克隆抗体；免疫传感器；交流阻抗谱；室温离子液体 a b s t r a c t a b s t r a c t r e c e n t l y ，w i t ht h eo c c u r r e n c eo fw i d e s p r e a dh e a v yc y a n o b a c t e r i a lb l o o m s ，s e v e r a l s e r i o u sw a t e ra n df o o ds a f e t ye p i s o d e si n v o l v i n gm i c r o c y s t i n si sa t t r a c t i n gg l o b a la t t e n t i o n m i c r o c y s t i n l r ( m c l r ) j st h em o s tc o m m o na n dt o x i ci na l lc y a n o p h y c e a nt o x i n e x i s t i n g a n a l y t i c a lm e t h o d sf o rm c - l rh a v em a n yd i s a d v e n t a g e ss u c h 舔h i g hc o s t ，t e d i o u ss a m p l e p r e p a r a t i o na n dl o we f f i c i e n c y t h e r e f o r e ，t h ed e v e l o p m e n to fah i g h l ys e n s i t i v ea n dr a p i d d e t e c t i o nm e t h o df o rm c - l ri so fs i g n i f i c a n c e i nt h i sp a p e r , t h r o u g ht h ep r e p a r a t i o no f i m m u n ea n t i g e na n ds p e c i f i ca n t i b o d i e st om c l r ，a ni m m u n o s e n s o rw h i c hb a s e do n i m m u n o a s s a yt e c h n i q u e a n ds e l f - a s s e m b l e dn a n o m a t e r i a lw a s d e v e l o p e d f o rt h e d e t e r m i n a t i o no fm c l r t h em a i np o i n t so ft h i sd i s s e r t a t i o na r es u m m a r i z e da sf o l l o w s ： t h ei m m u n oa n dd e t e c t i o na n t i g e nw e r ep r e p a r e du s i n gt h em e t h o d so f “a c t i v e e s t e r a n d “e d cc a t a l y z e ”h i g hs e l e c t i v i t yp o l y c l o n a la n t i b o d ya g a i n s tm c - l rw a so b t a i n e d f r o mt h en e wz e a l a n dr a b b i ti m m u n i z e dw i t ht h ei m m u n o - a n t i g e n t h ea n t i s e r u mw a st e s t e d b yi n d i r e c t e de l i s a t h et i t e ro ft h i sa n t i b o d yi sh i g h e rt h a n5 2 x 10 珥a f t e rp u r i f i c a t i o n ；1 1 1 e c a l i b r a t i o nc u r v eb yi n d i r e c t e de l i s as h o w st h a tt h er a n g eo fq u a n t i t a t i v ed e t e c t i o nw a s 0 2 5 - - 4p g l 丽廿1a r ti c 5 0v a l u eo f0 6 8 “g l 1 1 l cc r o s sr e a c t i v i t yw i t hm c - r rw a s 21 9 ，a n dw e r ea l ll o w e rt h a nl 谢t l lm c - l wa n dm c l f al a b e l f r e ei m m u n o s e n s o rf o rd e t e c t i o no fm c l rh a sb e e nd e v e l o p e db yi m m o b i l i z i n g a n t i - m c l ro nn a n o - a u l - c y s t e i n ec o a t e de l e c t r o d e u s i n gt h ed e v e l o p e dm e t h o d , m c l r c o u l db ed e t e r m i n e dw i t had e t e c t i o nl i m i to f1 8 2 x10 。2n g m l ( s n = 3 ) a n dl i n e a r i t yb e t w e e n o 0 5a n d3 0 0 0n e d m l t h ew h o l ed e t e c t i n gt i m ew a so n l y15m i n 1 1 1 ea v e r a g er e c o v e r yr a t e w a si nt h er a n g eo f9 6 8 112 5 1 1 l ei m m u n o s e n s o re x h i b i t e dl o n g t e r ms t a b i l i t ya n dg o o d r e p r o d u c i b i l i t yo ft h es i g n a lc o u l db eo b t a i n e du pt o4 2t i m e sb yc v ，n l ec o e f f i c i e n to f v a r i a t i o nw a s3 5 8 ；f u r t h e r m o r e ，g o o ds t a b i l i t yi n3 0d a y sa t4 i m m o b i l i z a t i o no fa n t i m c l rh a sb e e nb a s e do ns e l f - a s s e m b l e t e c h n i q u e o f 1 ，6 一h e x a n e d i t h i o la n dn a n o - a u 1 1 圮r e s u l t i n gi m m u n o s e n s o rd i s p l a y e dah i g hs e n s i t i v i t ya n d aw i d el i n e a rr a n g ef o rt h ed e t e c t i o no fm c - l r , a n dr e s p o n d e dt ot h em c l ri nt h er a n g eo f 0 2 5 9 5 0n g m lw i t hal o wd e t e c t i o nl i m i to f8 5 x 1 0 之r i g m e ( s n = 3 ) m o r e o v e r , t h e r e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o nf o re i g h tp a r a l l e ld e t e r m i n a t i o n si s7 4 8 a n dg o o ds t a b i l i t yi n3 0 d a y sa t4 1 1 1 ea v e r a g er e c o v e r i n gw a si nt h er a n g eo f9 2 6 - - 。118 3 1 1 l ed e t e t i o nt i m e w a s1 5m i n i m m o b i l i z i n g a n t i m c l ro nm u l t i - - w a l l e dc a r b o n n a n o t u b e s ( m w n t s yr o o m t e m p e r a t u r ei o n i cl i q u i d s ( r t i l s ) c o a t e de l e c t r o d e ，a ni m m u n o s e n s o rf o rd e t e c t i o no f m c l rw a sd e v e l o p e d m c l rc o u l db ed e t e r m i n e dw i t hal o w e rd e t e c t i o nl i m i to f1 7 x10 3 n g m l ( s n = 3 ) a n dl i n e a r i t yb e t w e e n5 x10 jn g m la n d1xl0 zn g m l n e a v e r a g er e c o v e r y w a si nt h er a n g eo f8 0 9 5 - - 12 7 2 3 s o m ec o m m o ni o n si nw a t e rh a v en oi n t e r f e r e n c e w i t l lm c l r i nv i e wo fs t o r a g ec o n d i t i o n so fi m m u n o s e n s o r s ，as o l u t i o nw h i c hc a np r o t e c te l e c t r o d e si s f i r s tp u tf o r w a r d t h em o d i f i e de l e c t r o d e sw e r es t o r e di na p h7 4p h o s p h a t eb u f f e rs o l u t i o n l i ! ! 兰翌! 苎呈! 一 c o n t a i n i n gas e r i e so fr o o mt e m p e r a t u r ei o n i cl i q u i d a t4 i n6 0d a y s n es o l u t i o n m a i n t a i n sa c t i v i t yo fa n t i b o d ye f f e c t i v e l yw a ss e l e c t e d a st h eo p t i m u mo n e c i r c u l a r d i c h r o m i s ms p e c t r aw a se m p o l y e dt os t u d yo nt h em e c h a n i s mo fi n t e r a c t i o nb e t w e e nr o o m t e m p e r a t u r ei o n i cl i q u i da n da c t i v i t yo fa n t i b o d y t h ee x p e r i m e n ts h o w e dt h ec h a n g eo f p r o t e i nc o n f o r m a t i o ni nt h er o o mt e m p e r a t u r ei o n i cl i q u i d i nc o n c l u s i o n , t h es i m p l e ，h i g h l ys e n s i t i v ea n dl a b e l f r e ei m p e d i m e t r i ci m m u n o s e n s o r s f o rd e t e c t i o no fm c l ri nw a t e rh a v eb e e nd e v e l o p e d t h e yh a v eg o o dp r a c t i c a lv a l u ea n d p r o v i d ei m p o r t a n te x p e r i m e n t a l b a s i sf o rm ef u r t h e rs t u d yo ni m p l e m e n t a t i o no fd i r e c t ， r e a l t i m e ，i n - s i t u ，o n l i n e ，d a i l ye x a m i n a t i o n k e y w o r d s ：m i c r o c y s t i n - l r ；p o l y c l o n a la n t i b o d y ：i m m u n o s e n s o r ：e l e c t r o c h e m i c a l i m p e d a n c es p e c t r o s c o p y ；r o o mt e m p e r a t u r ei o n i cl i q u i d i i i 缩略语索弓 a b - a g b s a c v d m f e d c e l i s a e i s f c a f l g e g c e h d t i c 5 0 k l h l - c y s m c s m c l r m c l r b s a m c l r k l h m c r r m w n t s n a n o a u n h s n y q u i s t o d 4 5 0 p b s r t i l s 缩略语索引 抗体抗原 牛血清白蛋白 循环伏安法 n ，n 二甲基甲酰胺 碳二亚胺 酶联免疫吸附分析法 电化学交流阻抗谱 福氏完全佐剂 福氏不完全佐剂 金电极 玻碳电极 l ，6 己二硫醇 半数抑制率 匙孔血蓝蛋白 l 半胱氨酸 微囊藻毒素 微囊藻毒素l r 微囊藻毒素l r 检测抗原 微囊藻毒素l r 免疫抗原 微囊藻毒素r r 多壁碳纳米管 纳米金 n 羟基琥珀酰亚胺 尼奎斯特曲线 4 5 0 n m 吸光值 磷酸盐缓冲液 室温离子液体 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签 名： 丕整 日 期 圭咝生z9 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签名：石慧，导师签名：签名： ，导师签名： 日 期： 引言 1 引言 1 1 微囊藻毒素概述 1 1 1 微囊藻毒素的种类、结构和理化性质 微囊藻毒素( m i c r o c y s t i n s ，简称m c s ) ，是常见的藻毒素之一，主要由铜绿微囊藻产 生 1 2 1 。m c s 是一类具有生物活性环状七肽毒素，相对分子量约为1 0 0 0 d 左右。基本结 构为n 甲基脱氢丙氨酸及两个l 氨基酸残基x 和z 。结构通式为：环( d 丙氨酸l x 赤1 3 甲基一d 异天冬酸l z a d d a d 异谷氨酸n 甲基脱氢丙氨酸) 【3 】，见附图l 【4 】。其中 m e a s p 为d 赤p 甲基天冬氨酸，a d d a 为( 2 s ，3 s ，8 s ，9 s ) 3 氨基9 甲氧基1 0 苯基一4 ， 6 一二烯酸，m d h a 为n 甲基脱氢丙氨酸，d l m 为脱氢丙氨酸，x z 为两种可变的l 一氨基酸1 5 j 。由于x 、z 的不同以及a s p 和d h a 的甲基化和去甲基化可形成多种m c s ， 目前已发现至少6 5 种。x 和z 两个l 型氨基酸的变换对毒性的影响非常大，如m c l r 具高毒性，而m c r r 毒性较弱【6 j ，其结构见附图2 。 m c s 能耐热，在3 0 0 左右仍能维持很长时间不分解；化学性质稳定，耐强酸、强 碱；不同p h 值下，藻毒素在水体中有不同的离子化倾向。例如m c l r ：p h 2 0 9 时净 电荷为正一价，2 0 9 p h 2 1 9 时净电荷为零，2 1 9 p h 1 2 4 8 时净电荷为负二价【7 8 】。 1 1 2 微囊藻毒素的产生机制 m c s 产生的机理目前主要有两种可能性：一是环境因子影响，另一是遗传差异。微 囊藻毒素受光照、温度、营养盐等多种环境因素的影响【9 , 1 0 】，其中光照可能起着非常重 要的作用。遗传学说认为：有毒株和无毒株微囊藻是由基因决定的【1 1 1 。基因序列测定结 果表明：m c s 的合成是由毒素肽合成酶决定，产毒的微囊藻株含有具同源性的肽合成酶 基因保守序列，其中至少含有两个多肽合成酶基因，而微囊藻无毒株不具有这些基因【1 2 1 。 1 1 3 微囊藻毒素的毒效应 m c s 具有较强的肝毒性，并对心、肾、脾脏及胃肠也具有一定的毒性。它对动物及 人类均有毒害作用。动物和人类通过直接接触或饮用含有m c s 的水而中毒。动物的中毒 症状主要有肌肉痉挛、呼吸急促、腹泻、昏迷，中毒严重者在数小时至数天内死亡【1 4 j 5 】； 人类接触到含m c s 的水后，会引起皮肤及眼睛过敏、发热、疲劳、急性肠胃炎，长期接 触则会诱发肝癌【1 6 1 、皮肤癌、胃肠炎及心源性心脏病【1 7 1 钔。甚至导致死亡。 1 1 4 微囊藻毒素的污染现状 全世界很多地区、国家的天然水体中都检测出了微囊藻毒素【1 9 啦】。我国是蓝藻水华 分布最广，影响最严重的国家之一【2 3 瑚】。近年来我国的富营养化问题有增无减。经调查 发现，我国淡水湖泊中所发生的水体8 0 是有毒的，其中滇池、太湖、武汉东湖、河南 省主要饮用水水库、黄河郑州段、江苏昆山、海门、启东和泰兴的沟塘及浅井等水体均 发现含有m c s 。 1 1 5m c l r 的有关国家标准 由于m c l r 最常见且毒性最强，国际卫生组织对饮用水中的m c l r 提出了建议 江南大学硕士学位论文 标准，按人体的标准体重6 0k g ，每天饮水2l 计算，每日最大容许摄入浓度为1 0l a g l 2 9 1 。 我国国家环境保护总局最新颁布的中华人民共和国国家标准( g b 3 8 3 8 2 0 0 2 ) 中，列 出微囊藻毒素在集中式生活饮用水地表水源地以m c l r 代表的限值也是1 0p g l 。 1 1 6 国内外微囊藻毒素检测方法进展 由于m c s 对人类危害较大，因此迫切需要针对水体，特别是作为饮用水源的湖泊、 河流和水库中的m c s 进行监测。目前的监测技术主要是针对最常见且急性毒性最强的 m c l r 建立的，从原理上分大致有生物分析法、理化检测方法、免疫学检测方法三种： 1 1 6 1 生物分析法 该类检测方法主要包括蛋白磷酸酶( p p l p p 2 a ) 抑制法【3 0 1 、生物体鉴定法【3 l 】、 微毒素检测法【3 2 】、细胞毒性检测法【3 3 】等，除蛋白磷酸酶法简便快速外，该类其他方法消 耗毒素较多，且动物维持费用高，工作量大，适合最初筛选，正日益被其他方法所取代。 1 1 6 2 物理化学检测法 物理化学检测方法主要包括高效液相色谱法( h p l c ) 、液相色谱质谱联用法 ( l c m s ) 、薄层层析( t l c ) 和核磁共振法等瞰弓9 1 ，可对m c l r 进行准确定量测定， 但仪器设备价格昂贵，不能广泛普及；操作繁琐，前处理复杂；且各实验室检测程序和 条件差别较大，极大得影响了数据的准备性和可比性。 1 1 6 3 免疫学检测法 酶联免疫检测法( e l i s a ) 是近十年来迅速发展起来的一项技术，其原理是用制备 的m c l r 抗体测定m c l r 含量。由于该分析方法灵敏度高，检测限低，对样品需求 量较少，适合进行大量样品测定，是目前较推崇的一种粗筛的方法【4 0 ，4 1 1 。 1 2 阻抗型免疫传感技术 1 2 1 生物传感器概述 生物传感器是将生物技术、材料技术、纳米技术、微电子技术等结合起来形成的新 兴高科技产品，在生物工程、医学与临床、环境监测等领域展现出十分广阔的前景。电 化学生物传感器以生物材料作为敏感元件，电极作为转化元件，电位或电流等作为特征 检测信号h 3 1 。按敏感元件的不同，生物传感器可以分为六类 4 4 4 刀：免疫传感器 ( i m m u n o s e n s o r ) 、酶传感器( e n z y m e s e n s o r ) 、组织传感器( t i s s u es e n s o r ) 、细胞传感器 ( o r g a n a l l s e n s o r ) 、微生物传感器( m i c r o b i a l s e n s o r ) 和d n a 传感器( d n as e n s o r ) 。 1 2 2 免疫传感器的定义、原理以及分类 1 9 9 0 年h e n r y l 4 8 j 等提出了免疫传感器的概念：将高灵敏的传感技术与特异性免疫反 应结合起来，用以监测抗原一抗体反应的生物传感器称作免疫传感器。它具有三元复合 物的结构，即感受器、转换器和电子放大器。传感与换能同步进行，既能达到定量检测 的效果，又能实时监测到传感器表面的抗原抗体反应，因此，它可促使免疫诊断方法向 定量化、操作自动化方向发展 4 9 , 5 0 】。检测抗原抗体的结合有两种基本方法：即标记法和 非标记法。前者采用酶、荧光物质等标记，抗体与抗原反应过程通过电化学、光学等手 段进行检测；后者则在抗体与其相应抗原识别结合时直接转变成可测信号【5 1 1 。 2 1 2 3 电化学交流阻抗谱 电化学阻抗谱( e l e c t r o c h e m i c a li m p e d a n c es p e c t r o s c o p y ，e i s ) 是一种频率域的测量 方法，它以测量得到的频率范围很宽的阻抗谱来研究电极系统，因而能比其他的常规的 电化学方法得到更多的动力学信息及电极界面结构的信息【5 引。电极的阻抗由实部z 和 虚部z ”组成【5 3 1 ：z - z7 + j z ”，n y q u i s t 图是以阻抗虚部z ”对阻抗实部z7 作的图，是 最常用的阻抗数据的表示形式 5 4 , 5 5 】。阻抗型免疫传感器将免疫反应的高度特异性及阻抗 谱对界面变化的灵敏反映相互融合，体现出灵敏度高、检测时间短、方法简便等优点。 1 3 纳米材料在电化学免疫传感器中的应用 由于传感技术发展的方向是设计出体积小、灵敏度高、稳定性好的新型传感器。 纳米材料的出现以及应用正好能满足微型化和高集成度的要求，因而得到广泛关注。 物质材料的结构组成相或晶粒结构小于1 0 0a m 者并具有特殊性能的材料称为纳米 材料【5 6 1 。当物质粒子尺寸进入纳米数量级时，就会具有传统材料所不具备的物理、化学 性质5 7 , 5 8 】，主要包括表面效应、小尺寸效应、量子尺寸效应、宏观量子隧道效应【5 9 , 6 0 ， 并由此产生出许多特殊性质：熔点、磁学、热阻、电学、光学、化学活性、奇异力学等。 由于纳米材料的比表面积大、表面反应活性高、表面活性中心多、吸附能力强等优异特 性，将纳米材料引入电化学免疫传感器中，将大大得提高传感器的灵敏度和再现性。 1 3 1 纳米金在电化学免疫传感器中的应用 纳米金因其具良好的电化学性能和生物兼容性发挥重要作用。强吸附作用：可以 将抗原抗体牢牢地固定在换能器上；比表面积大、生物相容性好：在保持分子识别物质 活性的前提下增加其在换能器表面的固定量，达到放大检测信号，提高灵敏度的目的。 1 3 1 2 碳纳米管在电化学免疫传感器中的应用 1 9 9 1 年，i i j i m a t 6 2 】发现了一种具有特殊结构的一维量子材料一碳纳米管。它由呈六 边形排列的碳原子构成数层到数十层的同轴圆管。由于其表面效应，即直径小、表面能 高、原子配位不足，使其表面原子活性高，易于周围的其他物质发生电子传递作用，在 电催化和电分析化学领域中具有广阔的应用前景【6 3 彤】。用碳纳米管修饰电极具有提高富 集效率、改善电极的响应特性、降低氧化还原反应的过电位、充当抗体蛋白的固定化载 体和电子传递体等一系列特殊性能 6 6 , 67 1 。 通常，通过共价或非共价的方法使碳纳米管的某些性质发生改变，即功能化使其 更易于研究和应用。常见的功能化方法有共价功能化和非共价功能化1 68 6 9 1 。共价功能化 有端口功能化、侧壁功能化等：非共价功能化有聚合物功能化、染料分子功能化、环糊 精功能化、生物分子功能化、芳香环化合物功能化、以及离子液体功能化等。 1 4 室温离子液体在电化学免疫传感器中的应用- 室温离子液体是室温下的离子电解质，由有机阳离子和无机或有机阴离子组成。 常见的阴离子有b f 4 一、b r 一、p f 6 一、n o 。一、a i c l - 等。由于其具有良好的导电性，在修饰 电极、电沉积、电容器等方面有广阔的应用前景。将带电化学活性官能团的离子液体修 饰于碳纳米管上，改善其溶解性和分散度1 7 0 j 。另外，根据电化学应用的需要，人们设计 具有特定官能团的离子液体【7 1 1 ，维持蛋白稳定性【7 2 】。 3 江南大学硕士学位论文 1 5 立题意义和研究内容 1 5 1 立题意义 微囊藻毒素对水环境和水生态系统的污染及其对人类健康的危害正日益受到重视。 虽然国内外严格限制了饮用水源水中m c l r 的含量，但由于水体富营养化和蓝藻水华 的频繁发生，水体污染严重程度迅猛增长，m c l r 超标的情况经常发生，严重威胁人民 群众的身体健康，因此急需加强对于饮用水源水的监测，维护饮用水和食品安全。 然而，传统的生物检测方法难以定量，灵敏度不够，无法满足日常监测的要求；仪 器检测法不但可以定性和定量，且精确度高，但该法费时繁琐，仪器昂贵难以普及；酶联 免疫吸附检测( e l i s a ) 灵敏快速，但线性范围窄，成本高，且需专业人员操作，应用范 围受到限制。无标记型电化学免疫传感器( i m m u n o s e n s o r ) 将免疫测定法与传感技术相结 合，具有诸多以上方法所不具备的优势。例如：大大缩短检测时间、样品无需前处理、 可实现动力学反应全程监测、数据显示更为精准方便、产品方便携带等。将其应用于 m c l r 的测定，不仅简单易行、快速灵敏，且能克服以往检测方法费时费力、无法对 源水进行实时监控的缺陷【7 3 1 。 本研究在广泛查阅国内外电化学免疫传感器相关最新文献报道的基础上，结合实验 室实际条件以及原有工作，以建立灵敏度高、稳定性强、成本低、快速简单的免疫传感 器为目标，在制备高质量的微囊藻毒素多克隆抗体的基础上，试图通过一系列提高抗体 固定量和生物活性的方法，建立m c l r 的高灵敏度免疫传感的检测方法，开展其应用 基础研究，满足国内食品安全检测市场的迫切需要。 将无标记免疫传感技术应用到微囊藻毒素的快速、实时监测上，在国内外尚未进行 深入研究。因此，本研究着力构建第三代无标记型免疫传感器，以期其在饮用水源水的 日常监测方面起到一定的作用；同时在环境监测，食品检验等领域能够有广阔的应用。 1 5 2 研究内容 本研究的主要内容是建立高灵敏的m c l r 免疫传感快速检测方法，为产业化发展 打下基础。具体内容包括： l 、m c l r 人工抗原的合成及鉴定：将设计合成的m c l r 半抗原通过“活泼脂法” 和“碳二亚胺法”与k l h 和b s a 偶联，合成免疫抗原m c l r k l h 和包被原m c l r - b s a 。 通过e l i s a 试剂盒对偶联物进行鉴定； 2 、m c l r 多克隆抗体的制备及评价：用合成的免疫原m c l r k l h 免疫新西兰大 白兔获得抗血清，通过间接e l i s a 法获得所得抗血清效价及半数抑制率，作出竞争标 准曲线。 3 、基于l 半胱氨酸和纳米金固定抗体技术构建m c l r 无标记免疫传感器的研究； 4 、基于1 ，6 己二硫醇自组装技术构建m c l r 无标记型免疫传感器的研究； 5 、基于碳纳米管复合材料修饰电极构建m c l r 无标记型免疫传感器的研究； 6 、基于室温离子液体的电极保护剂的研究 4 材料与仪器 2 材料与仪器 2 1 材料 新西兰大白兔 微囊藻毒素l r ( m c l r ) 孔血蓝蛋白( k l h ) 牛血清白蛋白( b s a ) 福氏完全佐剂( f c a ) 福氏不完全佐齐u ( f i a ) 辣根过氧化物酶标记羊抗兔i g g l - 半胱氨酸( l c y s ) l ，6 一己二硫醇( h d t ，9 7 ) 、 m w n t s ( 纯度9 8 ，灰分0 2 w p a ) 氯金酸( h c l 4 a u ) 碳二亚胺盐酸盐( e d c h c i ) n 羟基琥珀酰亚胺( n h s ) 其它常规试剂均为分析纯。 2 2 仪器 p b 4 0 0 1 e 型精密电子天平 u v - 2 1 0 0 紫外扫描仪 n i e o l e tn e x u s 傅立叶变换红外光谱仪 z m d 4 0 0 0 型高效液相色谱质谱联用仪 m o s 4 5 0 圆二色谱仪 j e o lj s m 6 3 9 0 l a 扫描电镜 d f 1 0 1 s 型集热式磁力搅拌器 f t se 1 5 8 5 q 冷冻干燥仪 u n i v e r s a l 3 2 r 冷冻离心机 隔水式恒温电热培养箱 m u l t i s k a nm k 3 酶标仪 c h l 7 6 0 c 电化学工作站 金电极 铂丝电极 甘汞电极 玻碳电极 苏省农科院畜牧兽医研究所动物房 伊普瑞斯科技有限公司 北京博奥生物技术有限公司 s i g m a 进口分装 北京博奥生物技术有限公司 北京博奥生物技术有限公司 珠海百奥生化试剂公司 f l u k a 公司 s i g m a 公司 深圳纳米港有限公司 s i g m a 公司 上海延长生化科技发展有限公司 上海延长生化科技发展有限公司 梅特勒托利多仪器( 上海) 有限公司 北京瑞利公司 美国热电公司w a t e r sp l a t f o r r n 美国w a t e r s 公司 法国b i o l o g i c 公司 日本电子株式会社 江苏省金坛市正基仪器有限公司 美国f t s 公司 德国h e t t i c h 公司 上海跃进医疗器械制造厂 t h e r m ol a b s y s t e m s 公司 上海辰华仪器有限公司 上海辰华仪器有限公司 上海辰华仪器有限公司 上海辰华仪器有限公司 上海辰华仪器有限公司 江南大学硕士学位论文 3 实验方法 3 1m c - l r 人工抗原的合成和鉴定 3 1 1m c l r 免疫抗原的合成 在y uf y 报道的方法的基础上采用“活泼酯法，1 7 5 】合成了m c l r 免疫抗原。由 于m c l r 含羧基( c o o h ) ，可通过碳二亚胺盐酸盐( e d c h c l ) 作为“桥联剂”，与 n 羟基琥珀酰亚胺( n h s ) 反应生成活泼酯衍生物；k l h 则具较多的活性氨基酸基团， 可结合较多的半抗原( m c l r ) 而产生更多的免疫原位点。最终，k l h 蛋白分子上的 氨基与m c l r 的活泼酯衍生物反应，形成以酰胺键连接的人工抗原偶联物。合成反应 式如图3 1 所示，步骤如下1 7 6 j ： 1 ) m c l r 的活化：将0 5m gm c l r 溶解于1 0 0t t ld m f ，加入溶解于d m f 的 e d c h c l0 7 5m g 和n h s0 7 5m g ，振荡5r a i n ，室温反应3 0m i n ，4 冰箱过夜，得m c l r 活泼酯衍生物。 2 ) 与k l h 偶联：将3m gk l h 溶解于3m lo 1m o l lp h9 6 碳酸盐缓冲液中，将 上述m c l r 活泼酯衍生物缓慢滴加入k l h 溶液中，混匀，避光室温反应6h 。反应结 束后于o 0 1m o l lp h7 4 的p b s 透析3 天。第一天每3h 换一次，后两天每天换3 次， 留样待鉴定，其余分装冷冻干燥，2 0 密封保存。 m c 。c 0 0 h + o h二凇k - - m c l j n h _ z o 苎护瑚。 图3 - 1免疫抗原的合成反应线路图式 f i g3 - 1 t h ei l l u s t r a t i o no fs y n t h e s i z er e a c t i o n so fi m m u n oa n t i g e n 3 1 2m c l r 检测抗原的合成 按照“碳二亚胺法”合成m c l r 检测抗原【7 7 1 ，使m c l r 的羧基( - c o o h ) 与e d c 反应生成中间产物，再与b s a 蛋白分子上的氨基反应，形成检测抗原偶联物。合成反 应式如图3 2 ，步骤如下1 7 6 j ： 1 ) 将0 5m gm c l r 溶解于0 2 5m l 乙醇中，后加入0 7 5m l 超纯水，再加入1 3 2m g e d c h c l 。 2 ) 逐滴加入溶于1m l2 5 乙醇的2m gb s a ，随后再加入1 3 2m ge d c h c i ，混匀， 4 反应过夜。反应结束后于0 0 1m o l lp h7 4 的p b s 透析3 天。第一天每3h 换 一次，后两天每天换3 次，留样待鉴定，其余分装冷冻干燥，2 0 c 密封保存。 o m c - c o 伽+ r - n = c 桃m c 一拦一o 然： o 。m 一墨o o 1 q h o m c 一墨一o 扪 图3 - 2 检测抗原的合成反应线路图式 f i g3 - 2 t h ei l l u s t r a t i o no fs y n t h e s i z er e a c t i o n so fd e t e c t i o na n t i g e n 3 1 3m c l r 完全抗原的鉴定 6 实验方法 参照文献m 一鲫中方法，将所合成人工抗原用p b s 缓冲液稀释为2 个梯度作为待测样 品，采用市售e l i s a 试剂盒，检测合成样品中m c - l r 含量，平行测定3 次，从而鉴定偶 联是否成功。 3 2m c - l r 抗血清的制备和鉴定 3 2 1m c l r 抗血清的制备 3 2 1 1 免疫方案 选取2 只体重为1 5 2 0 公斤，3 4 月龄的雄性新西兰大白兔，参照文献【8 0 】中具体方 法进行免疫。整个免疫过程如表3 1 所示。 表3 - 1 实验动物免疫程序 t a b l e3 - 1t h ei m m u n i t yp r o c e d u r e 3 2 1 2 抗血清的采集 冲刺免疫后测定血清效价达到要求，采集抗血清。为防止动物血脂过高，放血前禁食 2 4h 。兔颈动脉放血。将采集的血液于室温下静置，待血液凝集后放入3 7 。c 保温箱静置1 h ，4 。c 静置过夜后，4 ，3 0 0 0r p m 离心2 0m i n 后，得上清液即为抗血清。每只兔子的血 清量大约在5 0m l 。 3 2 1 3 抗血清的纯化 参照文献【8 1 1 ，采用饱和硫酸铵盐析法纯化抗体。 3 2 2 抗血清的鉴定 3 2 2 1 抗血清效价的测定 采用间接e l i s a 法测定抗血清的效价，具体方法参照文献【8 2 】。 3 2 2 2 间接竞争e l i s a 标准曲线的制作 采用间接e l i s a 法，绘制标准曲线，具体操作方法参照文献【8 3 】。 3 2 2 3 半数抑制浓度i c 5 0 的确定