（植物病理学专业论文）水稻分裂原活化蛋白激酶基因OsMPK4的克隆鉴定.pdf

浙江上学硕士学位论文 水稻促分裂原活化蛋白激酶基因o s m p k 4 的克隆鉴定 摘要 促分裂原活化蛋白激酶( m i t o g e n - a c f i v a t e dp r o t e i nk i n a s e , m a p k ) 级联参 与了激素、生物与非生物胁迫以及细胞分化等多种植物信号转导。本实验利用 m a p k 基因编码的氨基酸序列的保守区域进行同源性搜索，克隆鉴定了一个编码 水稻m a p k 蛋白激酶的基因o s m p 砧。0 s m p 地基因位于水稻1 0 号染色体上，由 6 4 外显子和5 个内含予组成。o s m p k 4 基因全长e d n a 为1 4 8 3b p ，包含一个1 1 3 1 b p 的开放阅读框，编码一个3 7 6 个氨基酸组成的蛋白，预测分子量为4 2 8k d a 。 预测的o s m p k 4 蛋白具有m a p k 蛋白典型的1 1 个保守结构域，及磷酸化位点 “t e y ”模体。系统进化树分析表明，o s m p k 4 属于b 组m a p k 成员，在氨基酸水 平上与z m s i m k l ( a a r l l 4 5 0 ) 、a t m p k 4 ( q 3 9 0 2 4 ) 和a t m p k 5 ( s 4 0 4 7 1 ) 的一致性 分别为9 4 6 、8 5 6 和7 9 7 ，但是与水稻其他已克隆的m a p k 基因却只存在 5 6 一7 4 的一致性，确定o s m p k 4 为水稻的一个新m a p k 基因。 为了探明o s m p k 4 在植物信号传导途径中的功能，我们将o s m p 碰基因编码 区置于植物双元表达载体p c h f 3 中，c a m v3 5 s 组成型强表达启动予的下游，运 用根癌农杆菌( a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s ) 介导的叶盘法转化烟草，经卡那霉素抗 性筛选和p c r 检测，前期获得2 1 株t o 代o s m p k 4 转基因植株，发现转基因植株较 对照有些特别之处，获得1 0 株转基因植株种籽。转基因植株的分子鉴定及其抗病 性表型测试正在进行中。 为了研究o s m p k 4 蛋白的生化功能，我们构建t p r s e t a _ i d s m p k 4 原核表 达体系，并纯化获得了重组的o s m p k 4 融合蛋白，为进一步分析0 s m p k 4 蛋白的 生化活性奠定了基础。 关键词：水稻；烟草；促分裂原活化蛋白激酶( m a p k ) 信号转导；克隆；转基 因；原核表达 浙江土学硕士学位论文 c l o n i n ga n dc h a r a c t e r i z a t i o no fo s m p k 4 ，am i t o g e n a c t i v a t e d p r o t e i nk i n a s eg e n e ，f r o mr i c e a b s t r a c t m i t o g e n a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e ( m a p k ) c a s c a d e sp l a yi m p o r t a n tr o l e s i nd e v e l o p m e n t , c e l lp r o l i f e r a t i o na n dh o r m o n er e s p o n s e , a sw e l la si nb i o t i c a n da b i o t i cs t r e s ss i g n a l i n gp a t h o w a y si np l a n t s i nt h i ss t u d 3 5w ec l o n e da n d i d e n t i f i e dan o v e lr i c em a p kg e n e , o s m p k 4b a s e do nt h ec o n s e r v e d s u b d o m a i n so fm a p k s t h ef u l l l e n g t hc d n ao fo s m p k 4c o n s i s t so f1 4 8 3b p i ns i z e , c o n t a i n i n ga no p e nr e a d i n gf r a m eo f1 1 3 1b p ，w h i c hp r e d i c t st o e n c o d eap r o t e i no f3 7 6a m i n o ，a c i d sw i t hc a l c u l a t e dm o l e c u l a rw e i g h to f4 2 8 k d a t h eo s m p k 4g e n ei sl o c a t e do nc h r o m o s o m e1 0o ft h er i c eg e n o m ea n d c o n s i s t so f6e x o n sa n d5i n t r o n s t h eo s m p k 4p r o t e i nc o n t a i n sa l l1 1 c o n s e r v e dd o m a i n st h a ta r ec h a r a c t e r i s t i c so fm a p k sa n dp h o s p h o r y l a t i o n s i t eo ft e y m o t i f p h y l o g e n e t i ct r e s sa n a l y s i sr e v e a l e dt h a to s m p k 4b e l o n g s t og r o u pbo ft h ep l a n tm a p k s ；h o w e v e r ，o s m p k 4s h o w sar e l a t i v e l yl o w l e v e lo f i d e n t i t y t oa l lo t h e rc h a r a c t e r i z e dr i c e m a p k s ，i n d i c a t i n gt h a t o s m p k 4i san e wm a p k g e n ei nr i c e t ob e t t e ru n d e r s t a n dt h ef u n c t i o no fo s m p k 4i np l a n td i s e a s er e s i s t a n c e , w ec l o n e dt h ec o d i n gr e g i o no fo s m p k 4i n t op l a n tb i n a r yv e c t o rp c h f 3 , u n d e rc o n t r o lo fc a m v3 5 sp r o m o t e ra n dt r a n s f o r m e dt o b a c c ol e a fd i s c sb y a g r o b a c t e r i u m - m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o n t w e n t y o n ek a n a m y c i n r e s i s t a n t t r a n s g n e i ct o b a c c ol i n e sw e r eo b t a i n e da n dc o n f i r m e db yp c rd e t e t i o n p r e l i m i n a r yr e s u l t ss h o w e dt h a tt h et r a n s g e n i cl i n e so v e r e x p r e s s i n go s m p k 4 h a v es o m em o r p h o l o g i c a la b n o r m a l i t i e sa n dr e d u c e df e r t i l i t y s t u d i e so n d i s e a s er e s i s t a n c ea n do t h e r p h e n o t y p eo f t h e t r a n s g e n i c t o b a c c ol i n e s o v e r e x p r e s s i n go s m p k 4a r e i np r o g r e s s t oc h a r a c t e r i z et h eb i o c h e m i c a lf u n c t i o no f0 s m p k 4 , t h eo s m p k 4g e n e w a sc l o n e di n t ot h ep r s e t - av e c t o rt oc r e a t ear e c o m b i n a n tp l a s m i d p r s e t a - o s m p k 4 r e c o m b i n a n to s m p k 4p r o t e i ne x p r e s s e di ne c o l iw a s p u r i f i e d ，w h i c hw i l lb e u s e dt os t u d yo s m p k 4 b i o c h e m i c a la c t i v i t y k e yw o r d s ：o r y z as a t i v al ；n i c o t i a n at a b a c u ml ；m i t o g e n a c t i v a t e dp r o t e i n k i n a s e ( m a p k ) ；s i g n a lt r a n s d u c t i o n ；c l o n i n g ；p r o k a r y o t i c e x p r e s s i o n 晰江土学硕士学位论文 2 6 4 1 烟草基因组d n a 的提取一 2 6 4 2 转o s m p k 4 基因烟草p c r 检测 。1 5 。1 6 3 结果与分析1 6 3 1 水稻促分裂原活化蛋白激酶基因o s m p k 4 的克隆 3 2 1 0 s m p k 4 编码水稻中一个新的促分裂原活化蛋白激酶 3 3 水稻o s m p k 4 基因组d n a 的结构分析 3 4 原核表达载体p r s e t a - - o s m p k 4 的构建及鉴定 3 5p r s e t a - o s m p k 4 重组融合蛋白在e c o l i 中的表达及目的蛋白纯化 3 6 转基因双元表达载体p c h f 3 - o s m p k 4 的构建及鉴定 3 7 转o s m p k 4 基因烟草植株的获得 1 6 1 6 1 7 1 7 3 8o s m p k 4 过量表达的转基因烟草植株的分子鉴定 3 9 转o s m p k 4 基因烟草植株的表型 1 7 1 8 4 讨论与小结1 9 参考文献3 0 图片目录 图1o s m p k 4c d n ao r fp c r 扩增和重组质粒酶切鉴定 图2 水稻o s m p k 4 的全长c d n a 与基因结构以及o s m p k 4 蛋白序列与结构 图3o s m p k 4 与其它m a p kb 组成员的序列比对分析 图4 水稻o s m p k 4 与其它已知植物m a p k 的系统进化树分析 图5 原核表达载体p r s e t a - o s m p k 4 的构建与鉴定 图6 重组o s m p k 4 融合蛋白的纯化 图7 植物转基因双元表达载体p c h f 3 - - o s m p k 4 的构建与鉴定 图8 烟草叶盘转化及转基因烟草的获得 图9o s m p k 4 转基因烟草植株的p c r 检测结果 殂 勉孔 巧拍凹 嚣凹 浙江上学硕士学位论文 致谢 本论文是在导师宋凤鸣教授的悉心指导下完成的，从论文选题、构思、实验 方案的制定和实施到研究结果的分析整理、论文的修改到最后的定稿，无不凝结 着导师的心血与智慧，谨此论文完成之际向到时表示最衷心的感谢并致以最崇高 的敬意。衷心感谢郑重教授三年来在学习和论文研究中给我的帮助指导和鼓励， 郑老师渊博的学识、高尚的道德修养让我终生难忘。两位老师对我学习、工作等 多方面的关心与教诲，将使我终身受益，在此表示我最诚挚的谢意! 也感谢本实验室的广大师兄师姐师弟师妹们：罗红丽、曹亦菲、张卫东、方 丽、李大勇、张新春、刘辉志、杨雅云、谌江华、陈洁、宋莉芸、吴叶飞、张慧 娟、刘海青、李国钧等，他们给予我的支持、建议和毫无保留的帮助，使我能够 克服困难并充满信心地完成论文研究工作。与他们的融洽相处也给了我许多快了 回忆，在此向他们表示我由衷的感谢。 深深感谢一直以来都关心、理解、支持和爱护我的家人和朋友们。 任琰 2 0 0 6 年5 月于浙江大学 浙江土学硕士学位论文 1 植物的m a p k 及其功能：文献综述 植物的生长发育，受到遗传信息和环境变化两方面的调节控制。遗传基因决定个体发 育的基本模式，而环境信息又极大地影响着细胞的基因表达及增殖、分化和发育。由于生 活在自然环境中的植物是座生的，在整个生长过程中，它不能主动地移动到适宜的环境中 生活，所以植物必须具有对环境变化快速感知和主动适应的能力，当受到各种内外因素的 影响时，植物就需要正确地辨别各种信息并作出相应的反应，以确保正常的生长和发育。 胞外刺激信号包括来自外界环境的外源信号，如光照、温度、水分、重力、机械伤害、病 原因子等 而胞内信号包括激素、化学调节因子、电信号等。这种信息的胞间传递和胞内 转导过程称为植物体内的信号传导。 植物细胞信号转导( s i g n a lt r a n s d u c t i o n ) 是指细胞偶联各种刺激信号( 包括各种内、外 源刺激信号) 与其引起的特定生理效应之间的一系列分子反应机制。在植物细胞的信号反 应中，已发现有几十种信号分子。按其作用范围可分为胞间信号分子和胞内信号分子。对 于细胞信号传导的分子途径，可分为四个阶段，即：胞间信号( i n t r a c e l l u l a xs i g n e d ) 转导、 膜上信号转换、胞内信号( i n t e r c e l l u l a rs i g n a l ) 转导及蛋白质可逆磷酸化。 1 1 蛋白的可逆磷酸化 蛋白的可逆磷酸化是细胞信号传递系统的重要组成部分，也是生物体内存在的一种最 为普遍的调节方式，在许多生命活动中扮演重要角色，几乎涉及所有的生理及病理过程， 如糖代谢、细胞的生长发育、光合作用、基因表达、神经递质的合成与释放，甚至癌变等 ( h a r d i e ，1 9 9 9 ；c h e n ka n ds n a a r - j a j a l s k a , 1 9 9 9 ) 。植物体内许多功能蛋白转录后需经共价 修饰才能发挥其生理功能。植物蛋白质磷酸化与去磷酸化研究虽然起步较晚，但进入2 0 世纪9 0 年代以来，植物细胞信号转导中有关蛋白质磷酸化与去磷酸化的研究取得了很大的 进展，越来越多的研究证据表明蛋白激酶的可逆磷酸化的调控方式在植物胞内信号转导系 统中具有重要作用。蛋白可逆磷酸化就是进行共价修饰的过程，蛋白质磷酸化与去磷酸化 分别由蛋白激酶( p r o t e h k i n a s e ，p k ) 和蛋白磷酸酶( p r o t e i n p h o s p h a t a s e , p p ) 催化完成，它 们是胞内信使进一步作用的靶酶，也即胞内信号通过调节胞内蛋白质的磷酸化或去磷酸化 过程而进一步转导信号。外来信号与相应的受体结合，会导致后者构象发生变化，随后就 可通过引起第二信使的释放而作用于p k ( 或p p l ，或者因有些受体本身就具有p k 的活性， 所以与信号结合后可立即得到激活。p k 可对其底物蛋白质特定的氨基酸残基进行磷酸化 修饰，从而引起相应的生理反应，以完成信号转导过程。此外，由于p k 的底物既可以是 酶，也可以是转 子( t r a n s c r i p t i o nf a c t o r s ) ，因而它们既可以直接通过对酶的磷酸化修 饰来改变酶的活性，也可以通过修饰转录因子而激活或抑制基因的表达，从而使细胞对外 来信号作出相应的反应。 蛋白质的磷酸化和去磷酸化在细胞信号转导过程中具有级联放大的作用。胞外的信号 1 晰江土学硕士学位论文 即使很微弱也可以通过一系列连锁反应得到充分放大。如动物细胞中糖原分解代谢中磷酸 化酶活性就是通过受体激活一系列的蛋白激酶，导致蛋白质磷酸化的级联( c a s c a d e ) 反应， 在一系列的反应中，前一反应的产物使后一反应的催化剂，每次修饰就产生一次放大作用。 蛋白质的磷酸化与去磷酸化共价修饰调节除了具有显著的级联反应特点外，还有调控细胞 内己存在酶的“活性酶量”( 磷酸化酶有活性，去磷酸化酶没有活性) ，使应答反应更有效； 功能上具有多样性，即蛋白质磷酸化与去磷酸化几乎涉及素有的生理过程；时效上具有持 久性，如细胞的分裂和分化等过程：在胞内介导胞外信号时具有专一应答特点。 1 2 蛋白激酶 蛋白激酶是一个大家族，编码蛋白激酶的基因可能占植物总基因的2 3 ( t r e w a v a s a n dm a l h o , 1 9 9 7 ) 。蛋白酶的共同特点是具有一定的底物专一性，但很少具有绝对专一性。 一些蛋白酶还具有自身的磷酸化作用( a u t o p h o s p h o r y l a t i o n ) ，即某种蛋白激酶可以利用它 本身作为底物，这种作用可以发生在两个酶分子之间相互磷酸化，也可以发生在同一分子 之内。底物蛋白质被磷酸化的氨基酸残基主要是丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸等少数几个氨基 酸。因此，根据磷酸化靶蛋白的氨基酸残基的种类不同，蛋白激酶分为丝氨酸苏氨酸激酶、 酪氨酸激酶、组氨酸激酶、色氨酸蛋白激酶和天冬酰基谷氨酰基蛋白激酶五类。植物中以 前三类为主，但有的蛋白激酶具有双重底物特异性，既可以使丝氨酸或苏氨酸残基磷酸化， 又可以使酪氨酸残基磷酸化，后来又发现了可以对丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸三种氨基酸残 基都进行磷酸化的蛋白激酶( 称为双特异性蛋白激酶) 。因此一般把它们分为三类：丝氨酸 苏氨酸激酶、酪氨酸激酶以及丝氨酸，苏氨酸酪氢酸激酶。丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸激酶 都有一个由2 5 0 3 0 0 个左右的氨基酸残基组成的催化结构域( c a t a l y t i cd o m a i n ) 。所有己知 的催化结构域都具有氨基酸序列同源性。h a n k s 等( 1 9 8 8 ) 及h a n k s 和q u i n n ( 1 9 9 1 ) 在对儿 百种不同的蛋白激酶催化结构域的氨基酸序列进行比较后发现，其同源性经常集中在某些 区域。根据同源性区域分布的状况h a n k s 等提议把催化结构域分为1 1 个亚区 ( s u b d o m a i n s ) ，并认为某些亚区的氨基酸序列可以用来判断蛋白激酶的特异性。例如：第 亚区的共有序列d l k p e n 一般存在于对丝氨酸苏氨酸进行磷酸化的激酶催化结构域 中。当然每个蛋白激酶的特异性需要通过实验来验证，这一点随着双特异性蛋白激酶的发 现而显得更加重要。各亚区的具体功能还不是很清楚，只有第1 亚区通过突变分析证明与 磷酸根从a t p 转移到蛋白质底物上的过程有关( c a r r e r a e t a l ，1 9 9 3 ) 。 近年来己从多种不同的植物中鉴定了许多蛋白激酶基因( h a r p e re ta 1 ，1 9 9 1 ； a n d e r b e r ga n dw a l k e r - s i n m m o m s , 1 9 9 2 ；s a n oa n dy 0 u s s e f i a n , 1 9 9 4 ；k i e g e r le ta 1 ， 2 0 0 0 ) 。但目前对绝大多数蛋白激酶的底物及其功能还不清楚，对蛋白磷酸酶底物的了解几 乎是空白：蛋白质的磷酸化和去磷酸化在生活细胞中是处于动态平衡的，正是蛋白磷酸化 的可逆性为细胞信号转导提供了一种开关作用。这些不足需要今后进一步研究填补以从真 正意义上对蛋白可逆磷酸化进行认识。 2 浙江土学硕士学位论文 1 3 植物体中的m a p k 级联系统的组成 促分裂原活化蛋白激酶( m i t o g e n a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e $ , m a p k s ) 是丝氨酸苏氨酸 ( s e r t h r ) 蛋白激酶中的一个大家族，广泛存在于各种真核生物( 酵母、哺乳动物、人及植 物) 中，最早发现于受促细胞分裂原( m i t o g e n ) 刺激的动物细胞中，起初认为它只是动物促 细胞分裂原的传递体，后来发现m a p k s 还参与激素、环境胁迫以及细胞分化等有关的多 种信号传递。近年来从拟南芥、苜蓿、烟草等高等植物中分离出许多m a p k s ( m a c h i d ae t a 1 ，1 9 9 7 ) 。植物m a p k s 与动物和酵母的m a p k s 非常相似，它们的共同特点是：分子量 在3 8 5 5 k d 之间，都含有1 1 个保守的蛋白激酶亚结构域在第v i i 和第v m 个亚区之 间有一个非常保守的t x y ( t h r - x t y r ) 基序( 也称为三肽模块) ，它由苏氨酸( d 、酪氨酸) 和一个x 氨基酸( x 可以是e 、p 、g 或d ) 组成，t x y 区在三维结构上定义为“t 环结构 ( t - l o o p ) ”( c a m p se ta 1 ，1 9 9 9 ) 。与动物和酵母的不同之处在于植物t x y 中的x 常为e ( 谷氨酸) 或d ( 天冬氨酸) ，而酵母和动物中常为e 、p ( 脯氨酸) 或g ( 甘氨酸) ，因此 认为t d y 基序为植物所特有。 植物中m a p k s 的研究始于2 0 世纪9 0 年代初( m i z o g u c h ie ta 1 ，1 9 9 7 ) ，现已在植物中 发现了大量的m a p k s 家族成员，而且植物中鉴定的m a p k s 数量超过了动物和酵母，并 且也从植物中分离到相当数量编码m a p k 和一些编码m a p k k 与m a p k k k 的基因。植 物m a p k s 与动物和酵母细胞中m a p k s 具有相似的生化特点，但多数是从胞质组分中分 离到的，其分子量一般在4 0 4 8 k d 。植物中的m a p k k k 和m a p k 是s e r t h r 类蛋白激 酶，m a p k k 是s e r t h r t y r 双重特异性蛋白激酶。 m a p k 级联( m a p kc a s c a d e ) 系统的基本组成为三级激酶模式，即促分裂原活化蛋白 激酶激酶激酶( m i t o g e n a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s ek n a s ek i n a s e ，m a p k k k m a p 3 k f m e k k 1 一促分裂原活化蛋白激酶激酶( m i t o g e n - a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s ek i n a s e ，m a p k k m a p 2 k m e k ) - - i v i a p k ，按照箭头的顺序，它们依次被其上游组分磷酸化后激活，被激 活的组分去磷酸化后将信号传递给其下游的组分( w i d m a n ne ta 1 ，1 9 9 9 ) 。m a p k k k 位于 级联系统的上游，能够通过胁迫感受器或信号分子的受体或其本身直接感受胞外刺激而发 生磷酸化。m a p k k k 磷酸化后变为活化状态，可以使m a p k k 磷酸化。m a p k k 始终存 在丁细胞质中，m a p k k 磷酸化后能够通过双重磷酸化作用将m a p k 激活，磷酸化的位 点是t h r 和t y r 残基，每种m a p k k 只可以磷酸化其特异的m a p k ，功能上不能取代同 类其他的m 二a p k k ，一套特异的功能上相连的三级激酶形成一个m a p k 级联系统的基本 模块。位于m - a p k 级联信号传递链最下游的m a p k 被m a p k k 磷酸化后或者停留在细 胞质中继续磷酸化细胞骨架成分及其它蛋白激酶，或者进入细胞核激活转录因子，从而调 节特异基因的表达( j o n a ke ta 1 ，1 9 9 9 ；m i z o g u c h ie ta 1 ，1 9 9 7 ) 。m a p k 的活性调节是可 逆的( c h a n ga n dk a r i n , 2 0 0 1 ) ，m a p k 磷酸酶( m a p kp h o s p h a t a s e , m k p ) 可以通过 对m a p k 的去磷酸化而使其失活。 晰江土学硕士学位论文 1 4 植物中m a p k 的分类 目前己从高等植物中分离出5 0 余种m a p k 基因，经鉴定发现大多数m a f k 参与激 素应答、环境胁迫反应以及植物抗病反应( t e n ae ta 1 ，2 0 0 1 ；z h a n ga n dk l e s s i g , 2 0 0 1 ； l i g t e r i n ka n di - i i r t , 2 0 0 1 ；j o n a ke ta 1 ，2 0 0 2 ；p e d l e ya n dm a r t i n , 2 0 0 5 ) 。其中拟南芥全基因 组序列测定发现存在2 0 种m a p k ，1 0 种m a p k k ，6 0 种m a p k k k ( m a p kg r o u p ， 一 2 0 0 2 ) 。m a p kg r o u p 将目前发现的激酶与已经鉴定的其他植物( 苜蓿、烟草、水稻和大 麦等) 中的m a p k 相关激酶放在一起，根据m a p k 氨基酸序列中s e r t h r 保守亚结构域 的特征，制订了一套分类命名法。将植物m a p k s 传递链的末端成份m a p k ( m p k s ) 分为a n d 四组( g m u p s ) ，这4 个组中的m p k s 结构与功能特点不尽相同。根据它们被 m a p k k 磷酸化的氨基酸基序t x y 可将其分成两大亚类：即t e y 亚类和t d y 亚类，前者 又可以分为a ，b ，c 三组，后者则属于d 组( j o n a ke ta 1 1 9 9 9 ；m a p kg r o u p , 2 0 0 2 ) 。a 组的m p k s 通常参与生物胁迫和非生物胁追以及激素反应，如拟南芥的a t m p k 6 及 a t m p k 3 可被活性氧等多种环境胁迫激活( k o v t u ne ta 1 ，2 0 0 0 ) ；烟草的n t s i p k 最先是作 为s a 诱导的蛋白激酶被发现的，后来发现它和苜蓿的m s s i m k 参与了众多的生物胁迫和 非生物胁迫反应，n t s i p k 和a t m p k 3 在氨基酸序列上有很高的相似性，都参与了创伤信 号的转导( z h a n ga n dk l e s s i n g , 2 0 0 1 ；m u n n i ke ta 1 ，1 9 9 9 ) 。b 组的m p k s 虽然研究的很 少，但是己经证明它们参与了病原菌诱导的s a r 反应和细胞分裂活动。拟南芥的a t m p k 4 基因经插入转座子突变后可组成型表达s a r 反应( p e t e r s e ne ta 1 ，2 0 0 0 ) ，而苜蓿的 m s m m k 2 和烟草的n t n t f 6 可被细胞周期诱导，并特异定位于分裂末期的成膜体内 ( c a l d e r i n ie ta 1 ，1 9 9 8 ；b 6 9 r ee ta 1 ，1 9 9 9 ) 。关于c 组m p k s 的信息很有限，仅仅在微阵列 ( m i c r o a r r a y ) 检测分析中发现拟南芥a t m p k 7 基因有规律地调节细胞的生长和死亡周期 ( s c h a f f e re ta 1 ，2 0 0 1 ) 。d 组的m a p k s 包含1 4 个成员其典型特征是在t - l o o p 内存在t d y 基序。a ，b ，c 组的c 末端有一个c d 结构域，而d 组不存在该结构( t a n o u ee ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 d 组m p k s 可能与病原菌和创伤激活的m a p k 传递链有关，如水稻b w m k l 和苜蓿t d y l 基因在受到病菌侵袭及创伤形成后迅速表达( h ee ta 1 ，1 9 9 9 ；s c h o e n b e c ke ta 1 ，1 9 9 9 ) 。 1 5 植物中m a p k 的功能 蛋白激酶催化的蛋白磷酸化和蛋白磷酸酶催化的去磷酸化作用在生物与非生物胁迫以 及植物激素等多种胞外刺激因子所诱导的抗性信号传导与放大过程中起着重要作用 ( r o b i n s o na n dc o b b ，1 9 9 7 ；d a v i s ，2 0 0 0 ) ，其中m a p k 的作用受到广泛重视。在植物中 m a p k 级联信号途径与不同的生物及非生物胁迫反应、激素反应、细胞分化合发育过程有 关，其介导的生理生化反应主要有两大类：一、生长因子和激素引起的信号，引起细胞增 殖和分化；二、介导胞外环境胁迫信号，引起细胞内的抗胁迫反应。m a p k 级联信号途径 是对各种生长因子进行应答及各种诱导抗性信号传递途径的关键组成部分，当植物受到生 4 晰江土学硕士学位论文 物与非生物胁迫以及植物激素等多种胞内外刺激时，m a p k s 被不同的上游信号分子激活， 通过对下游分子的磷酸化作用，最终将外界信号传递给细胞核，调节特意基因的表达，使 细胞、组织、器官以至整个生物体作出相应的生理反应。越来越多的实验证据显示植物中 的m a p k 在生长发育调节和所有的胁迫及防卫反应中起重要作用( h i r t , 1 9 9 7 ；l i g t e r l n ke t a 1 ，2 0 0 1 ；z h a i 、ga n dk l e s s i g2 0 0 1 ；x i o n ge ta 1 ，2 0 0 2 ) 。此外m a p k 级联信号途径在传递各 种胞外刺激信号的同时，还调节着植物抗性反应的快慢和强度大小( d a v i s ，2 0 0 0 ；m a d h a n i a n df i n k , 1 9 9 8 ；h a r d i e ，1 9 9 9 ) 。 1 5 1m a p k 与植物生长发育 植物组织、器官以至整株的生长，都是以细胞生长为基础的，即通过细胞分裂增加细 胞数日，通过细胞伸长增加体积来实现的。亚细胞定位分析表明，植物中的m a p k 主要 分布于细胞质和细胞核，尤其在染色质区域最丰富，而且在活跃分裂的细胞中标记的 m a p k 密度明显高于静态细胞( p r e s t a m oe ta 1 ，1 9 9 9 ) 。 苜蓿中的m m k l ，在细胞周期的 不同时期其转录水平有所不同，其活性在细胞分裂的过程中也会发生变化( j o n a ke ta 1 ， 1 9 9 3 ) 。有些m a p k 活性具有组织或器官的特异性，如烟草和苜蓿中的m m k 3 和n t f 6 ( b 6 9 r ee ta 1 ，1 9 9 9 ；c a l d e r i n ie ta 1 ，1 9 9 8 ) 在分裂中期被激活，后期和末期活性最强，仅在 分生组织和幼嫩的器官能检测山它们的活性。在细胞分裂过程中它们的蛋白质和m r n a 水平始终保持不变说明这两种激酶的激活是转录后调控的。m m k 3 和n t f 6 在细胞分裂期 位于细胞质中，g 2 期结束时进入细胞核，它们可能在植物细胞有丝分裂中起某种调控作 用。烟草的n p k l 是参与细胞周期调控的m a p k k k ，可能是m m k l ，m m k 3 , n t f 6 等的 上游激活物( m a c h i d a e ta l 。1 9 9 8 ) 。n p k l 基因在幼嫩器官、顶端分生组织和侧根原基等处 于分裂状态的细胞中表达最活跃，而在成熟细胞中看不到n p k l 的表达。在烟草细胞周期 中，n p k l 基因的转录表达发生在从s 期导到m 期的过程中，m 期过后表达下降。从烟 草中分离到两个微管结台马达蛋白n a c k l 与n a c k 2 ( n p k l 一a c t i v a t i n gk i n e s i n - l i k e p r o t e i n s ) ，这两种蛋白都能激活n p k l ，因此它们可能是n p k l 的上游激活物与细胞分 裂信号的传递有关0 t oe ta 1 ，1 9 9 8 ) 。拟南芥中存在n p k l 的类似物a n p l 3 ，它们可能 在拟南芥中执行与n p k l 类似的功瓴n i s h i h a m ae ta 1 ，1 9 9 9 ) 。 1 5 2m a p k 在植物激素信号传递中的作用 植物激素是一类对植物生长发育起着重要调控作用的物质，它们以信号分子的形式作 用于细胞，在细胞内通过一系列信号转导过程，最终影响整个植物的生长发育。尽管人们 对植物激素的生物合成、代谢及生理功能已有较深入的认识，但是关于植物激素信号的感 受与信号转导的分子机制尚不太清楚。近年来的研究都证明，m a p k 级联途径参与了植物 激素如脱落酸( a b a ) 、乙烯和生长素的信号转导( j o n a ke ta l ，19 9 9 ) 。 a b a 是一种重要的植物激素，主要抑制植物细胞分裂，在控制种子萌芽、胚的发育以 浙江土学硕士学位论文 及对逆境胁迫的适应中发挥重要作用。m a p k 参与a b a 信号转导的最有力证据是利用 m b p ( 髓鞘碱性蛋白) 作m a p k 的底物，在大麦糊粉层细胞中a b a 可以快速激活m a p k ， 一些a b a 响应基因如砌( r e s p o n s i v e t oa b a ) 也随之被诱导( k n e t s c he ta l ，1 9 9 6 ) 。而氧化 苯j j 十( p h e n y l a r e n i co x i d e ，p a o ) 一种酪氨酸磷酸酶抑制剂能够完全抑制m a p k 的作用以 及a b a 诱导的r a b l 6 基因的表达。然而，除了大麦种子糊粉层细胞外，在其它植物或其它 组织中未发现a b a 诱导的m a p k ，说明m a p k 对a b a 信号的介导具有组织的特异性。 最近还从水稻中分离出a b a 响应基因( l i r ie ta 1 ，2 0 0 3 ) 。a b a 除了对植物生长发育有抑制 作用外，还具有明显促进气孔关闭的生理效应。而在蚕豆_ ( v i c i af a v a ) 的保卫细胞原生质体 内已经发现了a b a 诱导的m b p 激酶活性( m o r i , 1 9 9 7 ) 。 在植物发育的不同阶段、生物胁迫( 如病原菌侵害) 及环境变化等都会引起植物体内乙 烯含量的变化。对拟南芥中乙烯介导的传递途径的遗传分析表明其中同样有m a p k 级联 途径的参与( k i e b e r , 1 9 9 7 ) 。利用拟南芥的乙烯不敏感突变体e r r l ( e t h y l e n e r e s i s t a n t ) 和组 成型“三重反应”突变体c t r l ( c o n s t i t u t i v e - t r o p l er e s p o n s e ) 已分离出e t r l ，c t r l 两种与乙 烯信号传递有关的蛋白激酶。研究发现c t r l 功能的丧失导致拟南芥在无外源乙烯存在下 显现组成型”三重反应”，因此c t r l 在乙烯信号传递中起负调控作用( c h a n ge ta 1 ，1 9 9 k i e b e re ta 1 ，1 9 9 3 ) 。c t r l 与哺乳动物r a f 激酶相似，而r a f 激酶是动物中与细胞分化： 生长有关的m a p k 级联途径的组成成分，是m a p k k 的上游激活子。根据目前的报道分 析，乙烯的信号传导过程有可能借助于m a p k 级联途径：c t r l 可能是乙烯传递途径的 中间成分，直接激活植物的m a p k k ，c t r l 的上游可能是位于质膜上的乙烯受体e t r l 或其它激酶受体。 生长素可以促进细胞分裂，调节植物的生长和分化。在诱导植物细胞愈伤组织时，生 长素作为促分裂原使细胞发生增殖和生长，只有在添加生长素时，细胞才能进入分裂周期。 发现用生长素处理烟草细胞可以激活m a p k k 和类似m a p k 的蛋白激酶，说明m a p k 级 联途径可能存在于生长素介导的信号途径( m i z o g u c h ie ta 1 ，1 9 9 4 ) 。在烟草中有一个特异 的m a p k k k - n p k l ，它能通过激活m a p k 级联从而抑制生长素介导的基因的早期基 因的转录，这个抑制作用能被m a p k 磷酸酶解除。n p k l 基因过表达的转基因烟草种子存 在发育缺陷( k o v t u n e ta 1 ，1 9 9 8 ) 。在烟草细胞m 期的末期，已活化的n p k l 蛋白迅速失活， 在正在分裂的细胞中，n p k l 的水平很低，用生长素和细胞分裂素处理成熟叶片组织，导 致n p k l 转录水平提高，单独使用两种激素结果一样( n a k a s h i m ae ta 1 ，1 9 9 8 ) 。这些研究 表明，n p k l 在调控生长素和细胞分裂素启动的细胞分裂中具有重要作用。 1 5 3m a p k 与非生物胁迫反应 植物中已发现多种m a p k s ，除参与激素等的信号传递外，在各种胁迫( 包括机械刺 激、创伤、极端温度、干旱缺水、渗透胁迫及紫外辐射) 信号传递中也起重要作用。 风是植物体在自然界中最易遭受的机械胁迫机械操作处理拟南芥的叶片后能引起特 6 晰江土学硕士学位论文 殊的m a p k 和m a p k k 基因的转录( m i z o g u c h ie ta 1 ，1 9 9 6 ) 。触碰紫花苜蓿植株2s 之 后就能诱导s a m k ( s t r e s s a c t i v a t e dm a p k ) 的瞬间表达。紫花苜蓿的悬浮培养细胞受到持 续的振荡后能持续表达s a m k ，停止振荡1h 后，s a m k 的活性逐渐消失，再振荡几秒 钟后其活性又恢复( b 6 9 r ee ta l - ，1 9 9 6 ) 。这些都为m a p k 参与机械刺激信号的传导提供 了直接的证据。与苜蓿s a m k 功能相似烟草的w i p k ( w o u n d q n d u c e dp r o t e i nk i n a s e ) 在 叶片伤口形成的早期就可以系统表达( s e oe ta 1 ，1 9 9 5 ) 。w i p k 一度被认为是烟草创伤信号 途径中关键的m a p k ，但进一步的研究发现。w i p k 在伤口信号途径中的实际表达量相对 较低，且受烟草生长条件的影响，其表达强度缺乏稳定性( z h a n ge ta 1 ，1 9 9 8 ；r o m e i se ta 1 ， 1 9 9 9 ) 。 越来越多的实验发现，干旱和冷冻胁迫涉及m a p k 的激活：紫花苜蓿中的p t t w w “蛋 白在干早和冷胁迫时被激活，它又能引起自身m r n a 水平的上升。玉米中的z m m p k 5 在冷胁迫的恢复过程中被激活( c o r o n a d oe ta 1 ，2 0 0 2 ) 。s a n g w a n 和d h i n d s a 在紫花苜蓿 中发现了两个对温度变化敏感的m a p k ，它们在2 5 。c 时均没有活性，而当细胞所处的温 度从3 7 ( 2 变成2 5 时，s a m k ( s t r e s s a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e ) 被激活，当温度从4 变 成2 5 时，h a m k ( h e a r ts h o c k a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e ) 被激活( s a n g w a n e ta l ，2 0 0 2 ) 。 渗透胁迫对烟草悬浮培养细胞的作用已得到初步了解，w i p k 和s i p k 参与了这一过 程，其中s i p k 在高渗环境和低渗环境下都被诱导激活，而w i p k 仅在低渗环境下被激活。 番茄处于热胁迫状态下时，有一个5 0k d 的m a p k 被激活f l i n ke ta 1 ，2 0 0 2 ) 。另外，u v - b