（微生物与生化药学专业论文）大肠杆菌无细胞体系合成异源蛋白质的初探.pdf

浙江大学硕士论文 摘要 无细胞蛋白表达系统又称为体外翻译系统，是一种相对胞内表达系统而言的 开放表达系统。它以外源m r n a 或d n a 为模板，在细胞抽提物的酶系中补充底物 和能量来合成蛋白质。随着生物组学时代的到来，无细胞蛋白质合成系统显示出 快速、方便、易于高通量等优点，因而应用范围不断增加。 大肠杆菌无细胞蛋白质合成系统是一种以外源m r n a 或d n a 为模板，利用大 肠杆菌细胞抽提物的酶系，通过添加氨基酸、t 7r n a 聚合酶和能量物质等来表 达蛋白质的体外翻译系统。本论文开展大肠杆菌无细胞蛋白合成系统的构建工 作，采用正交法对该系统进行优化，提高了大肠杆菌无细胞蛋白合成系统的合成 目标蛋白质的能力。构建了6 种h i v 基因的大肠杆菌无细胞表达载体，并且选取 h i v 病毒感染因子( v i f ) 作为目标蛋白，在大肠杆菌无细胞蛋白质合成系统得 到了表达，为将来高通量抗h i v 药物得筛选奠定了一定的基础。最后，构建了适 宜体外表达s 一腺苷一l 一甲硫氨酸合成酶和5 一氨基乙酰丙酸合成酶的表达载体，为 将来在无细胞体系中表达具有生物活性的酶开展了探索性工作。 关键词：无细胞蛋白合成系统，大肠杆菌，h 病毒感染因子 浙江大学硕士论文 a b s t r a c t t h ec e l l f r e ee x p r e s s i o ns y s t e mi sa l li nv i t r ot r a n s l a t i o ns y s t e m ，c o m p a r ew i t h t h ei nv i v ot r a n s l a t i o ns y s t e m c e l l f r e es y n t h e s i ss y s t e me n a b l e st h ed i r e c ti nv i t r o e x p r e s s i o no fp r o t e i nf r o me x t r i n s i ct e m p l a t ed n a o rm r n a i ts y n t h e s i z e sp r o t e i n t h r o u g hc o m p l e m e n t i n gs u b s t r a t ea n de n e r g yi nt h ec e l le x t r a c t i o n i nt h en e w e r ao f “b i o - o m i c s ”，t h e c e l l f r e e e x p r e s s i o ns y s t e mo p e n san e ws t r a t e g y f o r p r o t e i n e x p r e s s i o n ，a n di su s e dw i d e l yb e c a u s ei tc a np r o d u c ep r o t e i n si n am o d eo fr a p i d ， c o n v e n i e n ta n dh i g h t h r o u g h p u te x p r e s s i o n ec o l ic e l l f r e e e x p r e s s i o ns y s t e mi so n ew i d e l yu s e ds y s t e mw h i c hc a n s y n t h e s i z ep r o t e i ne f f e c t i v e l yt h r o u 曲c o m p l e m e n t i n gs u b s t r a t ea n de n e r g y t h ee c o l ic e l l f r e ee x p r e s s i o ns y s t e mw a sc o n s t r u c t e da n do p t i m i z e di nt h ep r e s e n tp a p e r t h eo r t h o g a ld e s i g nm e t h o dw a su s e dt oi m p r o v et h ep r o d u c t i v i t yi nt h i sec o l i c e l l - f r e es y s t e m t h e ns i xv e c t o r sw e r ec o n s t r u c t e df o rt h ep u r p o s eo fe x p r e s s i n gs i x h i vg e n e si ne c o l ic e l l f r e es y s t e m a m o n gt h e m v i fg e n ec a nb ee x p r e s s e d e f f e c t i v e l yi nt h i sc e l l - f r e es y s t e m t h i sw o r km a y b eh e l p f u lt of u r t h e re x p r e s s i o no f h i vg e n e si nt h ec e l l f r e es y s t e m f i n a l l y , t w om o r eg e n e s ( o n es a mb i o s y n t h e t i c g e n ea n do n ea l ab i o s y n t h e t i cg e n e ) w e r ei n s e r t e di n t oc e l l f r e ev e c t o r sf o rt h e f u r t h e re x p r e s s i o no ft h e s et w oe n z y m e si nt h ec e l l f r e es y s t e m s k e y w o r d s ：c e l l - f r e ee x p r e s s i o n ，ec o l i ，h i vv i d o ni n f e c t i v i t yf a c t o r i i 浙江大学硕士论文 日u舌 无细胞蛋白表达系统又称为体外翻译系统，是一种相对胞内表达系统而言的 开放表达系统。它以外源m r n a 或d n a 为模板，在细胞抽提物的酶系中补充底物 和能量来合成蛋白质。翻译系统内的组分和翻译条件可以根据需要进行适当的改 变，因而体外翻译系统中翻译特定的基因较胞内表达系统具有许多优点，如内源 性m r n a 干扰很小( 由于体外翻译系统是用指定的模板进行目的蛋白质合成，因 而可以大大降低或消除在体内翻译系统中由于内源m r n a 所造成的背景) ；可以 同时加入多种基因模板研究多种蛋白质的相互作用；体外翻译系统可以对基因产 物进行特异性标记，便于在反应混合物中检测。此外体外翻译系统是一种蛋白质 快速鉴定系统，蛋白质表达可以不需要先进行克隆。无细胞蛋白表达系统可以分 为真核无细胞表达系统和原核无细胞表达系统两大类。真核无细胞表达系统有兔 网织红细胞系统、麦胚提取物系统和酵母细胞抽提物系统；原核无细胞表达系统 有大肠杆菌无细胞系统和嗜热性细菌抽提物系统。 本论文的主要研究对象是大肠杆菌无细胞系统，主要目的是提高大肠杆菌无 细胞系统的产率，以及用该系统表达h i v 的部分基因和一些其他基因。本论文 的具体安排如下： 第一章文献综述对无细胞蛋白合成系统的合成机制和研究进展进行综述，简 第二章 第三章 第四章 要介绍h i v 治疗性药物，提出本论文的研究思路和研究内容。 实验材料和方法阐述了本实验中所用的仪器、试剂和相关方法。 大肠杆菌无细胞蛋白合成系统产率的提高通过实验提高大肠杆菌无细 胞蛋白合成系统的产率。 部分h i v 基因的无细胞系统的表达构建了部分h i v 基因的表达载体， 并以h i v 基因的v i f 基因为例，用大肠杆菌无细胞蛋白合成系统进行表 达实验。 第五章s a m 合成酶和a l a 合成酶表达载体的构建构建了s a m 合成酶和a l a 合成酶的表达载体。 第六章总结与展望。 浙江大学硕士论文 第一章文献综述 1 1无细胞蛋白表达系统概述 无细胞蛋白表达系统又称为体外翻译系统，是一种相对胞内表达系统而言的 开放表达系统。它以外源m r n a g j 2 d n a 为模板，在细胞抽提物的酶系中补充底物 和能量来合成蛋白质。翻译系统内的组分和翻译条件可以根据需要进行适当的改 变，因而体外翻译系统中翻译特定的基因较胞内表达系统具有许多优点，如内源 性m r n a 干扰很小( 由于体外翻译系统是用指定的模板进行目的蛋白质合成，因 而可以大大降低或消除在体内翻译系统中由于内源m r n a 所造成的背景) ；可以 同时加入多种基因模板研究多种蛋白质的相互作用；体外翻译系统可以对基因产 物进行特异性标记，便于在反应混合物中检测。此外体外翻译系统是一种蛋白质 快速鉴定系统，蛋白质表达可以不需要先进行克隆。无细胞蛋白表达系统可以分 为真核无细胞表达系统和原核无细胞表达系统两大类。原核无细胞表达系统有大 肠杆菌无细胞系统和嗜热性细菌抽提物系统；真核无细胞表达系统有兔网织红细 胞系统、麦胚提取物系统和酵母细胞抽提物系统。 1 1 1 大肠杆菌无细胞蛋白表达系统 $ 3 0 原核体外翻译系统的e c o l is 3 0 提取物是由o m p t 内切蛋白酶和l _ o n 蛋 白酶缺陷的e c o l ib 菌株制备，所以在$ 3 0 系统中表达基因可以增加产物的稳定 性，尤其适用于在体外表达时易被蛋白酶降解的蛋白质【”。$ 3 0 体外翻译系统也 适合表达那些在体内表达时由于宿主编码的抑制酶作用而表达水平低的蛋白质， 使其能高水平表达 2 】o $ 3 0 系统还可用于转录和翻译调控的研究，此外，$ 3 0 体 外翻译系统的应用还包括合成少量标记蛋白质用于蛋白纯化中作为示踪物质以 及在蛋白质中掺人非天然的氨基酸用于研究蛋白质的结构功能【3 1 。首次使用外源 模板合成蛋白是在2 0 世纪6 0 年代用大肠杆菌的抽提物进行的，当时这个系统主 要用于分析遗传密码。之后，z u b a y 【4 】修改了这个大肠杆菌系统，他通过降解合 成背景肽链的内源d n a 或r n a ，优化无细胞合成系统中的组分来增加蛋白产 物。后来发展了耦联的蛋白转录翻译系统，大大促进了外源基因的直接表达。由 于制备抽提物简便易行，而且反应活性较高，z u b a y 的系统流行起来并成为一个 标准程序吼本实验室已在大肠杆菌无细胞蛋白质表达系统方面作了一些实验工 浙江大学硕士论文 作，建立了自己的大肠杆菌无细胞蛋白质表达体系，并对该体系进行优化，以获 得更高的产率。上述工作将在下面章节中详细阐述。 1 1 2 嗜热性细菌抽提物系统 嗜热性细菌抽提物系统鲜有文献报道，它的研究和应用也很少。 1 1 3 兔网织红细胞系统 兔网织红细胞用新西兰大白兔制备【“，通过纯化除去兔网织红细胞以外的污 染细胞。网织红细胞裂解后，提取物用微球菌核酸酶破坏内源m r n a ，最大限 度降低翻译背景。裂解物包含蛋白质合成所必须的细胞内组分( t r n a ，核糖体， 氨基酸，起始、延伸、终止因子) 。为了使系统更适于m r n a 的翻译，兔网织红 细胞中还添加了磷酸肌酸和磷酸肌酸激酶的能量生成系统，以及氯化高铁血红素 防止翻译起始的抑制，此外还添加了t r n a s 混合物用于扩大m r n a 翻译的范围， 以及乙酸钾和乙酸镁等。兔网织红细胞具有一定的翻译后加工活性，包括翻译产 物的乙酰化，异戊二烯化，蛋白酶水解和一些磷酸化活性。信号肽切除以及蛋白 质糖基化等翻译后加工事件可以通过加入犬微粒体膜来实现m 。兔网织红细胞系 统是体外翻译中应用最广泛的一种，常用于较大的m r n a 种类鉴定，基因产物 性质的分析，转录和翻译调控的研究，以及共翻译加工的研究等等。 利用免网织红细胞体外翻译系统进行蛋白质表达鉴定免网织红细胞体外 翻译系统对外源基因进行表达具有简单、快速的优点，常被应用于对所构建的基 因进行快速鉴定，通过s d s p a g e 检测翻译后蛋白质分子量的大小以证实基因 的读码框架是否正确，以及基因表达的蛋白质是否存在错义突变，大小是否完整， 或通过测定表达产物的活性进行鉴定【8 ，9 1 。p c r 技术结合体外转录和翻译系统可 以使基因不需要先克隆而直接进行表达【1 0 1 。许多基因疾病和肿瘤都是突变的结 果，如终止密码于突变，移码或基因片段缺失，一般都导致截断的基因产物。一 般需通过测序来鉴定是否突变，这是最可靠的检测方法。但要对许多样品筛选， 测序工作量则太大。在1 9 9 3 年，r o e s t 等发展了一种蛋白质截断试验，在体外翻 译系统中快速而简单地对这些截断的突变体进行筛选1 9 1 。 1 1 4 麦胚提取物系统 麦胚提取物的制备【7 l 通过碾磨麦胚，离心去除细胞残渣，上清液通过层折将 抑制翻译的内源氨基酸和植物色素等分离出去。提取物用微球菌核酸酶处理以破 浙江大学硕士论文 坏内源m r n a ，最大限度降低翻译背景。提取物中添加磷酸肌酸和磷酸肌酸激 酶的能量生成系统和增加链延伸效的亚精胺，以及一定量的乙酸镁。麦胚提取物 系统可稳定地表达一些在免网织红细胞系统中翻译受到抑制的d n a ，比如那些 含有低浓度的双链m r n a 的模板。此外，麦胚提取物系统缺乏许多在兔网织红 细胞中翻译需要的转录因子，因此对于表达真核转录因子是一个很好的选择系 统。 1 1 5 酵母细胞抽提物系统 酵母细胞抽提物系统的研究和应用很少，这方面的文献报道很少。 1 2 无细胞蛋白表达系统的研究进展 无细胞蛋白质表达系统是一种以外源m r n a 或d n a 为模板，在细胞抽提物的 酶系中补充底物和能量来合成蛋白质的体外系统。无细胞蛋白表达系统微生物学 创始人巴斯德最早采用无细胞系统研究酵母酒精发酵中起作用的酶系问题。二十 世纪六十年代生物学家首次在大肠杆菌无细胞系统中外加外源遗传模板研究体 外多肽和蛋白质的合成，从而破解了遗传密码二十世纪八十年代中期，前苏联学 者s p i r i n 等人通过在无细胞系统中连续流加能量a t p 和底物，从而将系统中蛋白 质合成反应维持在2 0 小时以上，大大地提高了蛋白质的合成产率。此后，无细胞 蛋白质表达系统成了生物工程领域中的研究前沿和热点之一，发展了多种原核和 真核无细胞蛋白质表达系统，最常用的有原核的大肠杆菌无细胞系统，真核的麦 胚抽提物和兔网织红细胞裂解物系统，以及较少使用的酵母细胞抽提物、嗜热性 细菌抽提物、鼠【厂细胞系统等等。在最近2 0 多年中，对无细胞系统中的蛋白质合 成的反应机制和调控、能量供应、遗传模板稳定性、反应器设计和操作等方面进 行了大量的研究。不仅能够直接应用p c r 产物作为模板合成蛋白质，而且在体外 重组蛋白质生产、高通量蛋白质合成、功能蛋白质组研究和蛋白质体外定向进化 等方面展示了良好的应用前景。 我国在无细胞蛋白质表达系统方面也已经开展了一些研究工作。中科院上海 生化所金由辛等 1 1 】1 1 、军事医科院王润华等【1 2 】及山东大学微生物学系王景林等【1 3 l 都研究了兔网织红细胞裂解液的蛋白质合成体系，主要是将无细胞体系作为分子 生物学工具进行研究1 1 4 】。本实验室己在大肠杆菌无细胞蛋白质表达系统方面作了 一些实验工作，建立了自己的大肠杆菌无细胞蛋白质表达体系，并对该体系进行 浙江大学硕士论文 了优化，大大提高了大肠杆菌无细胞蛋白质表达体系的产率。本实验室用大肠杆 菌无细胞蛋白质表达体系表达了防御素、h i v 的v i f 基因等，取得了不错的效果。 下面章节将着重介绍大肠杆菌无细胞蛋白质表达体系。 1 2 1 利用无细胞蛋白质合成系统合成的产物 利用无细胞蛋白质合成系统合成的产物已有几十种蛋白质产物，有氯霉素乙 酰基转移酶、i l 6 、i l 2 、珠蛋白、降钙素、醛缩酶、二氢叶酸还原酶、荧光素酶、 功能脂蛋白和膜蛋白等。 1 2 2 大肠杆菌无细胞系统蛋白质合成的机制 大肠杆菌无细胞蛋白质合成系统是一种以外源m r n a 或d n a 为模板，利用大 肠杆菌细胞抽提物的酶系，通过添加氨基酸、t 7r n a 聚合酶和能量物质等来表 达蛋白质的体外翻译系统。大肠杆菌无细胞系统蛋白质合成的机制大致如下( 图 1 1 ) ： 1 ) 质粒d n a 或是直接的p c r 产物，在r n a 聚合酶的作用下在体外合成 m r n a ： 2 ) 利用细胞抽提物中的转录因子、各类合成蛋白质所需的酶和外加补充的氨 基酸、能源物质、t r n a 等将m r n a 翻译成蛋白质； 3 ) 转译后释放的m r n a 再循环利用无细胞系统合成蛋白质【1 5 1 ，重复数次后 失活。 图1 1 是大肠杆菌无细胞蛋白质合成系统的原理简图。 图1 1大肠杆菌无细胞蛋白质合成体系蛋白质合成机制图 浙江大学硕士论文 1 2 3 无细胞系统中蛋白质合成优越性 与成熟的体内重组蛋白体系相比，无细胞体系简化了整个实验流程，避免了 繁琐的质粒转化、细胞培养、细胞破碎等过程，工作效率大为提高1 1 6 】。具体优点 如下【1 4 】： 1 ) 可用于表达对细胞有毒害作用的蛋白质，避免毒性蛋白对宿主细胞的致 死作用； 2 ) 能够直接以p c r 产物作为模板合成蛋白质，可进行突变蛋白的快速筛选， 实现蛋白分子的体外定向进化； 3 ) 通过加入人工合成的氨基乙酰t r n a 合成含有非天然氨基酸( 如d 氨基酸) 的蛋白质； 4 ) 能够减少内源蛋白酶对目标蛋白质的攻击； 5 ) 通过控制体外反应条件来避免包含体的形成； 6 ) 能使大部分的代谢能源集中用于合成目标蛋白质，而不会消耗在细胞生 长等其他过程； 7 ) 能通过直接调节反应条件灵活地控制蛋白质的合成和翻译后的蛋白质加 工折叠等； 8 ) 能在多孔板( 例9 6 孔板) 上同时平行合成多种蛋白质，满足高通量药物 筛选和蛋白质组学的研究的要求【1 7 1 。 1 2 4 无细胞系统中蛋白合成的能量供应问题 无细胞蛋白质合成系统虽然有很多的优点，但要大量合成蛋白质，除了需要 解决细胞抽提物的制备问题以外，能量的供应和遗传模板的稳定性是影响系统效 率和成本的两个关键问题蛋白质的合成需要消耗大量能量( 如a t p 等) 在无 细胞蛋白质合成系统中，即使不加外源模板进行蛋白质合成，a t p 等能源物质亦 将被体系内各种磷酸酶快速降解，且降解生成的无机磷能抑制蛋白质的合成【1 4 1 。 有以下几种方法为蛋白质合成提供能量： 1 ) 直接添加a t p ”l 2 ) 添加带有高能磷酸键的二次能源物质和相应的外源酶促进能量再生 磷酸烯醇式丙酮酸、磷酸肌酸和乙酰磷酸这3 种二次能源物质在相应的外源 激酶作用下，可以使体系中由a t p 降解产生的a d p 重新结合上磷酸键，从而再生 浙江大学硕士论文 得到a t p 。尽管这些二次能源物质的成本较a t p 低，但是在释放能量的过程中产 生的磷酸盐却会抑制蛋白质的合成1 1 。 p r a t t l l 5 】等人通过添加磷酸烯醇丙酮酸相应的丙酮酸激酶( 图1 2 ) ， r y a b o v a l l 8 】等人通过添加乙酰磷酸和相应的乙酸激酶，使得系统中由a t p 降解产 生的a d p 重新结合上这些二次能源物质的高能磷酸键，从而再生出合成蛋白质 所需要的a t p 。k i m l l 9 】等人发展了一种采用价格相对便宜的丙酮酸和丙酮酸氧化 酶作为能源提供物的新系统( 图1 3 ) ，该系统能循环利用无机磷，从而避免了无 机磷的积累造成的翻译终止。m i c h a e lc 和j a m e sr 【2 0 】发现了一个称为“c y t o m i m ” 的新系统，它也是利用丙酮酸盐作为能源来源，在表达c a t ( c h l o r a m p h e n i c o l a c e t y l t r a n s f e r a s e ) 时，表达量能达到用丙酮酸钠作为二次能源物质的表达量的5 倍，同时能够促使磷酸盐平衡和p h 的稳定，有效减小了副产品的积累对蛋白合 成的阻碍作用。 要l ，y l t t t , r l t c 。r 声一 陌= 。火：册乒：m i 图1 2 磷酸烯醇丙酮酸相应的丙酮酸激酶作为能源提供物的新系统 图1 3 丙酮酸和丙酮酸氧化酶作为能源提供物的新系统 3 ) 添加直接利用内源酶的二次能源物质 t 函m 1 19 】等人提出了一种方法，就是在反应系统中加入丙酮酸和n a d ，此过 程能利用细胞抽提物的内源酶且不需氧气的参与，如果在系统中加入辅酶a ，则 一 一 一i 1 霉 一= k 一 一广一 一一土 一 一 一 | 翊 一 2 r昭 浙江大学硕士论文 可提高产量这个系统还可以和传统上添加磷酸烯醇丙酮酸的系统结合起来，那就 是周期性的加入磷酸烯醇丙酮酸，再加入n a d 和辅酶a ，反应系统可以利用磷 酸烯醇丙酮酸的产物丙酮酸，从而得到额外的a t p 。图1 4 是丙酮酸、n a d 、c o a 再生a t p 的图示。 s y t l t h o si s ，a t p d e g r l d ；t ti o n 。n 舴， 2 。a c e 嗡t 。 图1 4丙酮酸、n a d 、c o a 再生a t p 图 k i x n 1 9 l 等人还发现以六磷酸葡萄糖作为二次能源物质，再加入n a d 和辅酶 a ，得到了比加入丙酮酸时更高的蛋白质产量。由于六磷酸葡萄糖和丙酮酸是糖 酵解途径中的初和终产物，所以以上结果表明任何一个糖酵解途经中的中间代谢 产物均可作为大肠杆菌无细胞系统中再生a t p 的二次能源物质 4 ) 添加其他耗能步骤的酶的抑制剂以使能量集中用于目标蛋白质合成 k i m l 2 1 等人报道了草酸作为磷酸烯醇丙酮酸合成酶的抑制剂，加入反应系统 能减少a t p 的损失( 从丙酮酸合成磷酸烯醇丙酮酸需要消耗a t p ) 。k i m 1 9 】等人 在添加磷酸烯醇丙酮酸、丙酮酸或添加磷酸烯醇丙酮酸和丙酮酸的反应系统中加 入草酸，从而提高了a t p 的浓度，使产量进一步提高。 5 ) 通过改变细胞抽提物中各物质含量来使能源物质集中用于目标蛋白质的合成 m 1 2 2 j 等人通过制备一种新的s 3 0 大肠杆菌抽提物，此抽提物具有低的磷酸 脂酶活力、高的半胱氨酸浓度和被抑制的谷胱甘肽合成途径，但操作过程较繁琐。 k a n g 2 3 1 等人利用去除浆膜外周间隙的磷酸脂酶以提高蛋白质合成中a t p 的利用 率，与k i m l 2 2 肄人的方法相比，此方法成本较底，且容易操作。 1 2 5 无细胞系统中的遗传模板的稳定性问题 1 4 】 在无细胞蛋白质合成系统中，遗传模板的稳定性是制约系统效率提高的另一 个关键因素。在体外的蛋白合成系统中，m r n a 雨- 以下几种来源： 1 ) 可用s p 6 或t 7 噬菌体聚合酶在转录系统中独立完成，然后纯化出m r n a ， 浙江大学硕士论文 再加入翻译系统中； 2 ) m r n a 也可以在转录翻译耦合系统中与蛋白质的合成同时进行： 3 ) 还有一种获得大量m r n a 的方法是使用qb 复制酶，这种酶能快速复制r n a 分子。 前两种合成m r n a 途径的模板d n a 可以是线性或环状的质粒，也可以是直接 的p c r 产物【2 4 1 。 编码目标蛋白的m r n a 是整个反应体系中最脆弱的成分之一，它的数量及稳 定性极大地影响了蛋白质的合成效率和产率为了提高m r n a l 奠板的稳定性，科 学家发展了多种解决策略。包括： 1 ) 传统的方法 在传统的无细胞蛋白合成系统中，一般利用缺失核糖核酸酶i 的大肠杆菌来 制备抽提物，以减少内源核糖核酸酶对外源m r n a 模板的降解；或是加入核糖核 酸酶的抑制剂以减弱核糖核酸酶的活力，但是经过这样处理的抽提物对外源 m r n a 模板的降解速度仍然很快；另外，利用转录翻译耦合系统来替代翻译系统， 因为前者在合成蛋白质的同时，不断将d n a 转录合成m r n a ，可使m r n a ：在较长 的一段时间内维持在一定水平。 2 ) 对m r n a 进行化学修饰 在原核生物的无细胞蛋白质合成系统中，m r n a 的稳定性可通过对m r n a 进行化学修饰来实现。化学修饰包括用2 - o 一乙酰基基团修饰m r n a ，加入有硫 代磷酸的m r n a 等。 o v o d o v 1 8 】等人用2 - o 一乙酰基基团修饰m r n a ，使得m r n a 的稳定性提高。 t o h d a l 2 5 1 等人则在大肠杆菌抽提物无细胞蛋白合成系统中加入有硫代磷酸的 m r n a ，结果同样使得m r n a 的稳定性增强。实验结果发现，在原核细胞的无 细胞蛋白合成系统中，将m r n a 中的任意一种n t p 的a 位点的磷用硫来取代， 生成n t pqs ，可以获得较为稳定的m r n a 模板，而且所表达的蛋白质与未经修 饰所得到的蛋白质完全一致，然而m r n a 的稳定性似乎与所取代n t p 有关，用 硫取代a t p 中a 位点的磷所修饰得到的m r n a 具有最佳的稳定性。 3 ) 引入次级结构 在原核生物的无细胞蛋白质合成系统中，m r n a 的稳定性也可以通过引入3 浙江大学硕士论文 或5 次级结构来实现。如3 的茎环结构( p e p 等) ，可以保护m r n a 免受3 外切 核酸酶的攻击，a m o l d l 2 6 l 等人报导在5 端引入稳定转录但不能翻译的首序列，如 来自大肠杆菌或t 4 噬菌体的o m p a 序列，其转录产物中含有5 茎环结构和与1 6 s 核糖体r n a 高度互补的碱基序列，被结合上的核糖体能够保护m r n a ，使其免 受外切核酸酶e 的降解。 4 ) 把m r n a 固定化 由于真核细胞的m r n a 有5 帽子结构和3 的p o l y ( a ) 尾巴，所以可以利 用其3 p o l y ( a ) 尾巴将其固定在固相介质上，以提高m r n a 的稳定性。文献 2 7 】 报导了将m r n a 固定在琼脂糖凝胶的p o l y ( u ) 上，分别在兔网织红细胞裂解 液、麦胚抽提物、鼠腹水细胞、和酵母细胞无细胞蛋白合成系统中提高了m r n a 稳定性。k o b a t a k e i 明等人则利用m r n a 3 端的p o l y ( a ) 将其固定在纤维素介质 的寡聚d t 上，利用酵母细胞无细胞蛋白质合成系统合成了多肽，实验表明这种 固定能减弱核酸酶对m r n a 的攻击。1 9 9 8 年，k o b a t a k e 2 7 j 等人又选用了在系统 中扩散性比纤维素更好的乳胶颗粒作为介质来固定m r n a ，进一步提高酵母无 细胞蛋白合成系统中的蛋白质合成效率。 5 ) 其它方法 除了以上提高m r n a 稳定性的方法之外，在反应体系中加入c u ”、沸石或 者非特异的线状d n a 也能提高m r n a 的稳定性。 n i s h i m u r a 2 8 1 等人在大肠杆菌的无细胞蛋白合成系统中加入c u 2 上，使得蛋白 质的表达量提高。n a k a n o t 2 9 1 等人发现在经聚k , z 醇沉淀浓缩得到的麦胚抽提物 系统中加入c u 2 + ，同样能使蛋白质的产量提高，而z n 2 上、n i 2 + 和p b 2 + 却没有起 作用，其原因是c u 2 + 作为核糖核酸酶的抑制剂在起作用，同时，他们还发现系 统中的a t p 降解速度也减慢了，所以c u 2 + 不但能稳定m r n a ，而且还能抑制磷 酸脂酶的活性。 j u n g 驯等人在麦胚抽提物无细胞蛋白合成系统中加入沸石，结果发现沸石能 使系统中m i 斟a 更稳定，当选用规格为m 1 0 的沸石时蛋白质的得率最大。， w a t z e l e 3 1 】等发现，在体系中添加非特异的线状d n a 可以使编码目标蛋白模板的 稳定性提高。 1 2 6 无细胞系统蛋白质合成系统的应用和发展前景 浙江大学硕士论文 无细胞合成系统的主要应用有【“1 ：利用无细胞系统合成掺入非天然的氨基酸 和带有选择性标记的氨基酸残基的特殊蛋白质或多肽【3 2 1 ；经p c r 扩增的突变 d n f 谨体外无细胞系统中的快速表达和功能分析，从而实现体外高通量筛选和 蛋白质的定向进化1 1 6 1 ；从巨大的d n a 文库中体外筛选多肽和蛋白质【1 7 】；结合p c r 技术，利用无细胞合成系统制备功能蛋白质阵列和多肽阵y d l 3 3 】：在体外组装病毒 3 4 】和合成各种功能性脂蛋白、膜蛋白1 3 5 】、抗菌肽1 3 6 1 和抗体片段【3 7 i 等。 在无细胞体系应用于体外高通量合成蛋白质或多肽方面，已经报道了多种快 速方便地平行表达多个蛋白质或多肽的研究结果。与体内表达相比，无细胞体系 已经具有很大的优越性。然而，目前商业化的无细胞合成体系成本依然比较高， 需要进一步的研究以降低成本。当无细胞体系应用于代替传统的体内基因表达方 法大规模生产异源蛋白质时，由于需要充分长期补充能量和反应底物，从而增加 了生产成本和降低了竞争力。近几年来，随着无细胞蛋白质合成系统中m r n a 稳 定性的不断提高，能量再生体系的不断完善和反应器操作方式的不断改进，一方 面无细胞系统的成本大大降低，另一方面无细胞系统的蛋白质产量已有很大提 高。因而，无细胞体系在体内难以表达的某些特殊蛋白质的大规模生产方面可能 首先具有工业化应用的前景 。 1 3h 综述 艾滋病( a c q u i r e di m m u n o d e f i c i e n c ys y n d r o m e ，a i d ) 是由人免疫缺陷病毒 ( h u m a ni m m u n o d e f i c i e n c yv i r u s ，h i v ) 感染导致人体免疫机能缺陷，而易于发生 机会性感染和肿瘤的临床综合症1 3 8 1 。h i v 是动物逆转录病毒的慢病毒( 1 e n t i v i m s f a m i l y ) 家族成员之一，是引起a d s 的病原体。这类病毒的特点包括：长期潜伏 和短期细胞病变效应相兼；病程发展缓慢和致死性消耗。艾滋病病毒有两型： h i v - i 和h i v - 2 ，为逆转录病毒，其基因组r n a 由9 7 4 9 个核苷酸组成。h i v - 1 于1 9 8 3 年法国巴斯德研究所从淋巴腺病病人分离得到，它是一种人类逆转录病毒，它的 基因组长度大约为9 3k b ，包含3 个结构基因和6 个调节基因，编码1 6 个蛋白。每 个蛋白的功能已经基本清楚【3 9 】。1 9 8 6 年从西非的h i v 感染人群分离到与h i v 在基 因序列相差达5 5 以上的另一种h ，后者被分类为h i v - 2 。h i v - 1 和h i v - 2 一样 都能引起免疫缺陷和a i d s 。但两型病毒基因的同源性仅为5 0 左右，其抗原性 也有差异。世界范围流行的以h w - 1 为主，约占9 5 左右【4 仉4 。 浙江大学硕士论文 】3 1h i v 基因组与h i v 侵入靶细胞的机制 。 1 3 1 1h w 基因组 h i v 基因组与普通的逆转录酶病毒基因缎类似，有三个结构基因g a g 、 p o l 和e r l v 。这些基因编码h i v 的主要结构和功能成分，包括包膜蛋白和逆转录酶。 g a g 基因编码的主要成分有核蛋白v 5 5 、p 4 0 ，衣壳p 2 4 ，矩阵p 1 7 和核壳体p 7 ； p o l 基因主要编码蛋白酶p 6 6 、逆转录酶p 5 1 、蛋白水解酶p l l 和整合酶p 3 2 ；e n v 基 因编6 2 0 j h i v 主结构中的包膜耱蛋白类，包括外包膜糖蛋白g p l 2 0 和由糖蛋白g p l 6 0 衍生得到的穿膜糖蛋i 刍g p 4 1 。h i v - 1 为单链r n a 病毒，属于逆转录病毒。它有9 个基因，其中3 个结构基因，& j g a g 基因、p o l 基因、e n v 基因，3 个调节基因和3 个功能未明基因。它的基因组长度大约为9 3k b l 4 2 , 4 3 , 4 4 1 。图1 5 是h i v 的结构基因 及其编码成分。 图1 5h i v 的结构基因及其编码成分 h i v 携带的附属基因有t a t 、r e v 、n e f 、v i f 、v p r 和v p u ( h i v - 1 ) 或v p x ( f o r h w - 2 ) 。我们已经了解其中部分基因的功能。t a t 基因产生一种调控蛋白， 这种蛋白能够加快h i v 前病毒的转译过程。r e v 基因编码一种调控蛋白，这种调 控蛋白控制病毒r n a 的转译过程，在这个转译过程中，病毒r n a 转译成为能够 主导已确定的感染、导致病毒结构蛋白和酶蛋白产生的形式。n e 睡因产生一种 调控蛋白，这种调控蛋白调整受感染细胞，使其更适于病毒体的产生。v f f 、v p r 和v p u 基因编码具有传染性和病态效果的蛋白【“, 4 3 4 4 1 。图1 6 是h i v - 1 基因组的图 示。 浙江大学硕士论文 + r e v - n e q i l t r g a g v i fi e n v c p o l v p r 一t a t 图1 6h i v - 1 基因组 1 3 1 2 h i v - 1 侵入靶细胞的机制 关于h i v - 1 侵入靶细胞的机制，己知病毒首先通过其表面的包膜糖蛋i 刍g p l 2 0 与细胞表面的c d 4 分子结合。此结合导致g p l 2 0 构象发生改变，暴露出其原来隐 蔽( 或者新形成) 的辅助受体结合位点。继而，g p l 2 0 与细胞表面的辅助受体c x c r 4 9 戈c c r 5 结合，暴露出m v - 1 跨膜糖蛋白g p 4 1 的疏水n 端。g p 4 1n 端与靶细胞膜作 用，导致h i v 与靶细胞发生膜融合，病毒核衣壳进入靶细胞。在这一过程中，病 毒的包膜糖蛋白印1 2 0v 3 环( v 31 0 0 p ) 参与g p l 2 0 与辅助受体的相互作用【3 8 4 5 托4 7 。 图1 7 是h i v - 1 侵入靶细胞的机制的图示。 图1 7h i v - 1 侵入靶细胞的机制 1 3 2a i d s 的针对性治疗药物 艾滋病已成为全球第四大杀手，夺去了超过2 4 0 0 万人的生命。a i d s 的预防 及治疗已经成为全社会共同的责任。h i v 是a i d s 的病原体，消灭该病毒是彻底 治愈a i d s 的关键。h i v 寄生在淋巴细胞中，其生活史有十几个步骤，干扰其中 的任何一步都可以抑制其生存，其中关键是抑制病毒的复制。迄今尚无针对h 的特效药物。病毒逆转录抑制药物和中草药的研究已经取得一定进展，有些针对 新的作用靶点的药物正在研究中。 1 3 2 1 病毒逆转录抑制药物和针对新的作用靶点的药物 目前大多数成功的经验来自于对病毒逆转录的抑制。主要的抗病毒药物有核 浙江大学硕士论文 苷类逆转录酶抑制剂( n r n ) 、非核苷类逆转录酶抑制剂( n n r l l ) 和蛋白酶抑 制剂( p i ) 3 ：k 类。 ( 1 ) 核苷类逆转录酶抑制剂( n u c l e o s i d er e v e r s et r a n s c r i p t a s ei n h i b i t o r s ，n r t i ) n r t i 通过与天然酶的竞争而抑制逆转录酶的活性，包括齐多夫定( z i d o v u d i n ， z d v ，a z t ) ，双脱氧胞苷( d i d e o x y e y t i d i n e ，d d c ) ，双脱氧肌苷 ( d i d e o x y i n o s i n e ，d i d a n o s i n e ，d d i ) 及其肠溶制剂( d d i e c ) ，司他夫定 ( s t a v u d i n e ，d 4 t ) ，拉米夫定( l a m i v u d i n e ，3 t c ) 。 ( 2 ) 非核苷类逆转录酶抑制剂( n o n u e l e o s i d er e v e r s et r a n s c r i p t a s ei n h i b i t o r s ， n n r t i ) n n r t i 是与逆转录酶结合使其发生变构而失去酶的活性，主要制剂有 以下几种：奈韦拉平( n e v i r a p i n e ，n v p ) ，罗韦拉得( l o v i r i d e ) ，地拉 韦定( d e l a v i r d i n e ，d l v ) ，依法韦伦( e f a v i r e n z ，e f v ) 。 ( 3 ) 蛋白酶抑制剂( p r o t e i n a s ei n h i b i t o r s ，p i ) h i v 的蛋白酶能将蛋白前体降 解成病毒的结构蛋白和酶，在病毒的装配过程中起着十分重要的作用。因此蛋白 酶抑制剂可阻止病毒结构蛋白和酶的形成，从而使其无法装配成成熟的h i v 颗 粒。包括：沙奎那韦( s a q u i n a v i r ，s q v ) ，茚地那韦( i n d i n a v i r ，i d v ) ， 奈非那韦( n e l f m a v i r ，r v f ) ，利托那韦( r i t o n a v i r ，r t v ) 等。 上述3 类药物多数均有不良反应，单用很难有效抑制病毒的复制，且易产生 耐药性。随着h i v 蛋白酶抑制剂的出现以及高效抗逆转录病毒联合疗法( h i g h l y a c f i v ea n t i r e t r o v i r a lt h e r a p y ，h a a r t ) 的应用，大大提高了抗h i v 的疗效【4 8 ，4 9 】。 目前有些针对新的作用靶点的药物正在研究中。下面将详细讲述。 ( 4 ) 整合酶抑制剂( i n t e g r a s ei n h i b i t o r s ) 阻断病毒d n a 整合进入宿主细胞染 色体，与现有的药物没有交叉抗药性，动物实验显示用药后c d 细胞计数有所上 升，病毒载量显著下降，对抗药性病毒有抑制作用，而且没有明显的毒副作用。 l 菊苣酸、4 芳基一2 ，4 二酮酸、咖啡酰奎宁酸、咖啡酰葡糖苷等可以抑$ ! j n r v 整合酶的活眭1 5 0 , s i 5 2 , 5 3 l 。 ( 5 ) 辅助受体阻断剂：c x c r 4 和c c r 5 是h i v 与t 细胞融合的必备辅助受体。 h i v 除与受体c d 4 结合外，必须再与宿主细胞表面的辅受体作用，才能感染细胞， 因此通过阻断h i v 与辅受体的相互作用为治疗a i d s 提供了新思路。多硫酸盐、多 磺酸盐和z i n t e v i r 等与之有较强的亲和力，从而抑$ 1 j h i v 与t 细胞的融合。 浙江大学硕士论文 ( 6 ) 封闭病毒蛋白印4 1 ：针x h i v - 1 糖蛋白g p 4 1 的药物h i v - 1 与靶细胞融合是促 使其基因物质进入靶细胞的重要环节，因此，很多研究致力于阻止病毒与靶细胞 的融合过程。斯阿霉素和桦木酸等可以和病毒糖蛋 刍g p 4 1 特异结合，阻止病毒和 人体细胞融合。 ( 7 ) 针对h w - 1 糖蛋白g p l 2 0 的药物h i v - 1 糖蛋! 兰l g p l 2 0 v 3 n 在感染过程中起着 重要作用，因此作用于v 3 的药物可望能够有效的抑制感染。美国纽约血液中一t l , 生化研究室最先开展了这方面的研究，为了筛选作用于v 3 区的药物，该研究室 的姜世勃博士建立了一种快速检测方法。其基本方法是应用抗v 3 区的单克隆抗 体和标记的第二抗体及底物。姜世勃博士发现1 4 种卟啉类衍生物能作用于v 3 区， 即能抑帝o h r v - 1 的感染，且其中8 种衍生物抑制作用较强，而中位四羟基苯卟啉 ( m i cp p ) 和锡一原卟啉区( s n p t p ) h i v - 1 的抑制作用最强，对细胞的毒性最 小。这是两种很有发展前景的抗h i v - 1 的新药。 ( 8 ) 其他靶点抑制剂：戊聚糖多硫酸酯可以抑制h - 1 的t a t 蛋白，抑n m v 的 转录和翻译【5 4 1 。通过特异地结合n c p 7 的锌指结构可以阻断h 1 v 的组装过程。 ( 9 ) 此外，已经开发了编码h w 结构抗原e n v 、g a g 、p o l 以及调节基因和辅助 基因的h i v - 1 核酸疫苗。 1 3 2 2 中草药治疗 中草药对治疗a i d s 有着独特的作用，其中对a i d s 有治疗作用，对h i v 有抑 制作用的有：甘草甜素【5 5 l 、天花粉蛋白【5 6 1 、黄芩1 5 7 1 、大蒜、蘑菇、番木瓜、人 参、柴胡、丹参、天花粉，夏枯草、白花蛇舌草、黄连、金银花、紫草、穿心莲、 人参、藜芦、白头翁、防风、灵芝、黄芪、板蓝根、桑寄生、苦瓜( 灌肠) 、牛蒡 子、淫羊藿杜仲、苦参等。虽然大部分文献资料不完整，缺乏严密的临床科研设 计及实验室指标，但是其在调节机体免疫功能和抗病毒、预防和治疗a i d s 方面 有较大潜力【5 8 】，能增强啉巴细胞活力，改善a i d s 症状，延长生存期及降低h i v 携带者的发病率，需进一步研究，被认为是寻找新的抗a i d s 药物一条