（法医学专业论文）扩增12s+rrna基因鉴定生物检材种属.pdf

! 受! 控兰! 些垦兰堕堡圭兰笪丝塞 扩增12 sr r n a 基因鉴定生物检材种属 硕士生骆宏 导师陆惠玲教授 中山大学中山医学院法医物证学教研室 广东广州( 5 1 0 0 8 0 ) 摘要 背景种属鉴定在法医学实践和打击走私动物的工作中具有重要的地位。以 往主要用血清学、细胞学或生化方法进行鉴定。但相当一部分现场检材的特殊性 和复杂性，常可能失去传统方法鉴定种属的条件。随着分子生物学技术的不断发 展，先后出现了多种新的种属鉴定方法。扩增靶基因鉴定物种来源，使检测结果 更为客观，且易于判读。但既往的研究较少涉及特殊检材、尤其是人和动物混合 检材的种属鉴定。因此，有必要对这些领域进行研究。 近年来在种属鉴定方面研究较多的是细胞色素b 基因( c y t bg e n e ) ( 占4 4 ) ， 1 2 sr r n a 基因( 占1 1 ) ，1 6 sr r n a 基因( 占8 ) 和d l o o p ( 占8 ) 。对1 2 sr r n a 基因的研究表明，该基因进化速率与m t d n a 基因组的平均进化速率基本相同， 在核d n a 中无其拷贝。通过对1 2 sr r n a 基因序列的比对分析，发现该基因在同 一物种内比较稳定，不同物种之间序列差异较大。充分利用这种序列的保守性和 差异性，设计通用引物扩增通用片段进行测序，或者设计针对目标物种的特异性 引物扩增目的片段，可以区分不同的物种。鉴于此，本研究着手探讨1 2 sr r n a 基因在种属鉴定的应用。 目的1 扩增1 2 sr r n a 基因，建立一种能够在同一反应条件下鉴定多个具 体物种，同时又满足简单，快速，特异、灵敏、准确等实用要求的种属鉴定方法。 2 用建立的方法对特殊处理检材和混合检材进行种属鉴定研究。 方法从g e n a b a n k 中搜索出人、鸡、鸭、鹅、猪、兔、鼠、绵羊、水牛、 狗、山羊等1 1 个物种的1 2 sr r n a 基因全长序列，用b i o e d i t 软件比对后，设计 一对针对上述1 1 个物种的通用引物和分别针对人、鸡和鸭等目标种属的特异引 q 嬗r 山丸肇 中山医学嚏硕士学位论文 物，同时扩增各物种1 2 sr r n a 基因，根据扩增片段的大小差异鉴定种属。以通 用引物扩增片段为参照，特异引物扩增片段用于种属鉴定，分别对陈旧血痕、新 鲜冰冻肌肉、高温处理肌肉、毛干等单一组份检材和二元混合生物检材进行鉴 定；特异引物扩增目标种属和非目标种属1 2 sr r n a 基因以检测其特异性；目标 种属扩增产物的测序结果与g e n b a n k 既有序列比对，根据其i d e n t i t i e s 分值的 高低判断被检序列与既有物种序列的一致性程度，从而检测该法能准确性；对单 一检材、混合检材稀释成不同浓度后扩增，检测本法的灵敏度；用盲测法检验本 法的实用性。 结果通用引物扩增1 1 个物种的1 2 sr r n a 基因，各物种不同类别检材均有 4 0 0 b p 左右的扩增片段，其中人3 9 4 b p 、鸡4 0 2 b p 、鸭3 9 5 b p 、猪4 0 4 b p 、鹅3 9 2 b p 、 绵羊4 0 2 b p 、牛4 0 3 b p 、鼠3 9 9 b p 、兔3 9 8 b p 、山羊4 0 1 b p 、狗3 9 9 1 ：p ；针对人、 鸡和鸭的特异引物只对各自目标种属有扩增产物，未见交叉扩增现象，各目标种 属的特异片段大小为：入1 6 3 b p 、鸡2 8 6 b p 、鸭3 7 4 b p ；目标种属测序结果与g e n b a n k 既有序列比对，i d e n t i t i e s 分值：人1 0 0 、鸡9 9 、鸭1 0 0 ；灵敏度检测： 目标物种的通用引物扩增，灵敏度为2 5 p g l 特异引物扩增人为2 5 p g ，鸡、鸭 均为2 0 0 p g ；对混合检材研究表明，组份d n a 在混合d n a 中的含量只要高于检测 灵敏度即可被准确检出，且不受其他组份干扰；盲测结果与实际检材完全相符。 结论本研究通过设计通用引物和特异引物，扩增不同物种、不同类别检材 的1 2 sr r n a 基因，实现了同一p c r 反应条件扩增多个目标物种的目的基因，从 而可同时鉴定多个物种的种属。在国内首次对人和动物的混合检材进行了种属鉴 定研究。所建立的方法操作简单、灵敏度好、结果准确、有高度的特异性和较强 的实用性，为法医学实践和打击走私动物提供了一种崭新的方法。 关键词：法医物证学种属鉴定1 2 sr r n a 基因生物检材 i i ! 垒! ! 生竺 ! 生墨兰堕婴主堂垡丝苎 i d e n t i f ys p e c i e so f b i o m a t e r i a l sb ya m p l i f y i n g 1 2 sr r n ag e n e m a j o r ： f o r e n s i cs c i e n c e g r a d u a t e s t u d e n t ：h o n g l u o s u p e r v i s o rp r o f e s s o r ：h u i l i n gl u d e p a r t m e n to ff o r e n s i cs c i e n c e ，s u ny a t - s e nu n i v e r s i t y a b s t r a c t b a c k g r o u n d ：s p e c i e si d e n t i f i c a t i o ni sv e r yi m p o r t a n ti nm a n y f i e l d ss u c ha sf o r e n s i c s c i e n c e ，f o o dd e t e c t i o na n dc o n s e r v a t i o no fe n d a n g e r e da n i m a l s t h et r a d i t i o n a l m e t h o d su s e di nt h e s ef i e l d si n c l u d es e r o l o g i c a l ，c y t o l o g i c a la n db i o c h e m i c a lm e t h o d s a l lo ft h e mn e e dh i 曲q u a l i t yb i o m a t e r i a l s h o w e v e r , t h es p e c i f i c i t ya n dc o m p l e x i t y o ft h em a t e r i a l si np r a c t i c eo f t e nl o s sc o n d i t i o n sf o rt r a d i t i o n a ls p e c i e si d e n t i f i c a t i o n w i t ht h ed e v e l o p m e n to ft h em o l e c u l a rb i o l o g i c a lt e c h n o l o g y , al o to fn e wm e t h o d s w e r eu s e df o rs p e c i e si d e n t i f i c a t i o n a m p l i c o n so ft h et a r g e tg e n e sm a k ei te a s yt o i d e n t i f ys p e c i e sa n dt h er e s u l t sb e c o m em o r ea c c u r a t et h a nt r a d i t i o n a lm e t h o d s h o w e v e r , p r e v i o u ss t u d i e sf o c u s e dm o r eo nt h es i n g l ec o m p r i s em a t e r i a l w h i l e c o n c e r n e dl i t t l eo ns p e c i a lm a t e r i a l sa n dm i x t u r e s s om o r es t u d i e ss h o u l db eg i v e nt o t h e s eb i o m a t e r i a l s c y t bg e n e ，1 2 sr r n a g e n e ，1 6 sr r n ag e n ea n dd l o o pg e n eh a v eb e e ns t u d i e da s t a r g e tg e n ef o rs p e c i e si d e n t i f i c a t i o n e v i d e n c e ss h o w e d t h a t1 2 sr r n ag e n eh a dt h e s a m ee v o l u t i o ns p e e da st h ew h o l em i t o c h o n d r i a ld n ag e n o m e s ，i th a d n tc o p i e si n t h en u c l e a rd n a g e n o m e s n u c l e o t i d ec o m p a r i n gr e s u l to f1 2 sr r n ag e n es h o w e d t h ec o n s e r v a t i o ni ns a m es p e c i e sa n dv a r i a b i l i t yi nd i f f e r e n ts p e c i e s i ta l s os u g g e s t e d t h a tt h e s ec o n s e r v a t i o na n dv a r i a b i l i t yc o u l db eu s e di ns p e c i e si d e n t i f i c a t i o nb y d e s i g n i n gu n i v e r s a lo rs p e c i f i cp 西m e l t s c o n s i d e r i n ga l lt h o s ef a c t o r s ，w es t u d i e dt h e a p p l i c a t i o no f1 2 sr r n ag e n ei ns p e c i e si d e n t i f i c a t i o n o b j e c t i v e ：1 b u i l da na c c u r a t e ，s i m p l e ，q u i c k , s p e c i f i ca n ds e n s i t i v em e t h o df o r 1 1 1 ! 亟! 竺! 竺堂 坐堕兰堕堕主堂垡丝壅 s p e c i e si d e n t i f i c a t i o nb ya m p l i f y i n g1 2 sr r n ag e n e 2 u s et h en e wm e t h o dt oi d e n t i f yt h eo r i g i no fm i c r o a m o u n t ，s p e c i a la n dm i x e d m a t e r i a l s m e t h o d ：a f t e rd o w n l o a d e dt h ec o m p l e t e1 2 sr r n a g e n es e q u e n c e so f e l e v e ns p e c i e s i n c l u d i n gh u m a n ，c h i c k e n , d u c k ，g o o s e ，p i g ，r a t ，b a b a l u s ，r a b b i t ，g o a t ，s h e e p ，d o gf r o m g e n b a n ka n da l i g n e dt h e mw i t hb i o e d i ts o f t w a r e ap a i ro fu n i v e r s a lp r i m e r sa n d t h r e ep a i r so fs p e c i f i cp r i m e r sw e r ed e s i g n e d u n i v e r s a la m p l i c o n sa m p l i f i e dw i t h u n i v e r s a l p r i m e r sw e r e u s e da sc o n t r o l sa n ds p e c i f i ca m p l i c o n sa m p l i f i e dw i t h s p e c i f i cp r i m e r sw e r eu s e df o rs p e c i e si d e n t i f i c a t i o n s p e c i e so fs i n g l ec o m p r i s e s a m p l ea n db i n a r ym i x t u r e sc o m p r i s i n gb l o o ds t a i n s ，丘e s ho rf r e e z i n gm u s c l e s ， h e a t t r e a t e dm u s c l e s ，h a i r sw e r ei d e n t i f i e d p r i m e rs p e c i f i c i t i e sw e r ed e t e c t e dt h r o u g h c r o s sa m p l i f i c a t i o nw h i c hu s e ds p e c i f i cp r i m e r st oa m p l i f yn o n - t a r g e ts p e c i e s a c c u r a c i e s o ft h er e s u l t sw e r ed e t e c t e db yb l a s t i n g a m p l i c o n ss e q u e n c e sw i t l l c o r r e s p o n d i n gs e q u e n c e sr e p o r t e di ng e n b a n k ，i d e n t i t i e sw e r eu s e da st h ed e c i s i o n c r i t e r i o n s e n s i t i v i t yw a sd e t e c t e db ya m p l i 母i n gt a r g e tg e n eo fd i f f e r e n td i l u t e d s a m p l e s s i n g l e b l i n dt e s tw a su s e dt od e t e c tt h eu t i l i t y r e s u l t s ：s i z e so f u n i v e r s a la m p l i c o n sw e r er e c o r d e da st h ef o l l o w i n g ：h u m a n s3 9 4 b p ， c h i c k e n s4 0 2 b p ，d u c k s3 9 5 b p ，p i g s4 0 4 b p ，g o o s e s3 9 2 b p ，s h e e p s4 0 2 b p ，b a b a l u s 4 0 3 b p ，r a t s3 9 9 b p ，r a b b i t s3 9 8 b p ，g o a t s4 0 1 b p ，d o g s3 9 9 b p s i z e so fs p e c i f i c a m p l i c o n sw e r cv a r i a n to b v i o u s l y ：h u m a n s1 6 3 b p ，c h i c k e n s2 8 6 b p ，d u c k s3 7 4 b p n oc r o s sa m p l i f i c a t i o nw a so b s e r v e d ，w h i c hm e a n st h a ts p e c i f i cp r i m e r sh a dh i g h s p e c i f i c i t i e s h u m a n si d e n t i t i e sw a s1 0 0 ，c h i c k e n sw a s9 9 ，d u c k sw a s1 0 0 r e s p e c t i v e l y s e n s i t i v i t yd e t e c t i o ns h o w e dt h a tt h em e t h o d w a ss e n s i t i v e ，t h ed e t e c t i o n l i m i t a t i o nv a r i e df r o m2 0 0 p gt o2 5 p g ，e v e nt h el o w e rp e r c e n t a g ed n ai nb i n a r y m i x t u r e sa l s oc o u l db ed e t e c t e da n dn o tb ei n h i b i t e db yt h eh i g h e rp e r c e n t a g ed n a t h es i n g l e - b l i n dr e s u l t sw e r ec o n c o r d a n tw i t ht h em a t e r i a l s c o n c l u s i o n ：n l em e t h o db u i l ti nt h i ss t u d yc o u l da m p l i f y1 2 sr r n a g e n eo f d i f f e r e n t s p e c i e s 谢t hv a r i o u ss a m p l e su n d e rt h es a m er e a c t i o ns y s t e m w h i c hm e a n st h a ti t c o u l di d e n t i f yd i f f e r e n ts p e c i e sa tt h es a m et i m e i tw a sa l s ot h ef i r s ts t u d yf o c u s i n g o ns p e c i e si d e n t i f i c a t i o no fh u m a n a n i m a lb i n a r ym i x t u r e sa n ds p e c i a lb i o m a t e r i a l s i v ! l 盘! ! 竺堂 坐匡兰堕堡圭兰垡堡壅 t h em e t h o dw a ss i m p l e ，s e n s i t i v e ，a c c u r a t e ，s p e c i f i ca n dp r a g m a t i c ，i tp r o v i d e da s e l e c t i o nn o to n l yf o rf o r e n s i cs c i e n c eb u ta l s of o rp r o t e c t i n ge n d a n g e r e da n i m a l k e yw o r d s ：f o r e n s i cb i o l o g y 、 s p e c i e si d e n t i f i c a t i o n 、 1 2 sr r n ag e n e 、 b i o m a t e r i a l s v 第1 章引言 在法医学实践和打击走私动物的活动中，常常需要对各种刑事案件的现场血 痕、碎尸块、骨骼、肌肉、交通事故逃逸车辆上附着的生物检材和私运的动物组 织等作种属鉴定，以明确检材来自人体还是某种动物，为后续个体识别和案件的 顺利侦破提供进一步的线索。随着犯罪分子作案手段的日趋狡猾，除了上述现场 检材外，不乏有高温烹煮和油炸处理碎尸组织作食品的特殊检材出现，如何对 这些特殊检材进行种属鉴定及个体识别，给法医工作者提出了新的挑战。以下就 种属鉴定的方法、技术、选用的基因及各自的特点作一叙述。 1 1 种属鉴定的方法 1 1 1 传统方法 传统的种属鉴定方法主要有：血清学方法、细胞学方法、生化方法。血清 学方法主要有沉淀反应、抗人血红蛋白胶体金试验、凝集反应和酶联免疫吸附试 验等。细胞学方法主要通过观察红细胞大小、形态、有无细胞核等来判断血痕的 物种来源。生化方法主要有纤维蛋白板法、碱变性试验、等电聚焦法等。这些方 法中，血清学方法和生化方法主要针对蛋白质水平的检测，对检材的质量要求较 高，如要求检材量较多、较新鲜、难以用于高温处理、腐败降解检材等；细胞学 方法中，血液干燥后，红细胞皱缩或破坏，则比较难观察其真正大小和形态。实 际工作中收集的检材种类繁多，有的检材己腐败降解，或受到细菌、异物等污染、 酶解；有的检材数量较少等，这些检材的特点限n t 传统方法的应用”1 。 1 1 2 分子生物学方法 近年来，随着p e r 技术的不断创新，基因库基因序列资料的不断完善，分子 生物学方法和技术在微量、特殊生物检材的种属鉴定中发挥着重要的作用。通过 扩增目的基因片段，可以区分出人源性和非人源性检材，甚至可以鉴定具体的种 ! 盘! ! 竺!生匡兰堕塑主兰垒丝塞 属。与蛋白质比较，d n a 分子相对稳定，检测结果客观，且易于判断，因而在实 际工作中得到了广泛的应用。较早前用于种属鉴定的分子生物学方法和技术有： 随机扩增多态性d n a ( r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i s md n a ，r a p d ) “1 、限制性 片段长度多态性分析( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，r f l p ) 阱1 和扩增片段长度多态性分析( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，a f l p ) ”。由于某些方法的不足( 如r a p d 存在诸如检测的变异带来源不清、个体所表 现出来的d n a 片段数没有规律、不同实验室可能导致不同的试验结果等问题； r f l p 则存在实验周期较长、对检材要求较高、检材数量较少时无法复核等问题 。1 ) ，影响了它们在实践中的运用效果。近年来，对种属特异p c r 技术 ( s p e c i e s s p e c i f i cp c r ) 9 - 1 1 实时p c r 技术( r e a l t i m ep c r ，r t p c r ) b 2 - 1 4 、 单核苷酸序列多态性技术( s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m ，s n p ) “”、焦 磷酸测序技术( p y r o s e q u e n c i n g ) “7 删进行了探索，给种属鉴定带来了新的突破。 1 1 2 1 种属特异p c r 技术 种属特异p c r 技术的特点是根据扩增的目的基因设计高特异性引物，包括单 一种属特异性引物和多种属特异性引物，相应的扩增产物有单一种属的目的片段 和多种种属的目的片段。目前国内外除了法医学应用外，还采用这种方法来鉴定 一些珍稀动物的种属来源，从而保护濒危动物1 。 i 1 2 2 实时p c r 技术 现场的生物检材难免被污染，并且数量极少，这就限制了某些方法的运用“1 。 为了能对这些检材进行分析，就要向微量化和避免二次污染的方向发展。实时 p c r 技术的运用，有效地解决了这一难题。 实时p c r 通过荧光标记探针，对p c r 过程进行实时监控，结合相应的软件对 结果进行分析，计算待测样品的初始模板量。与常规p c r 相比，具有以下优势： ( 1 ) 高灵敏度。”、高特异性、快速、高效。( 2 ) 避免检材的二次污染。实时p c r 技术，模板、引物和探针都加在同一反应管里，扩增结束后可根据实时监测的数 据进行分析，不必取产物进行电泳分析，避免了各种污染啪1 。( 3 ) 通过设计特异 虽照! ! 竺 些垦兰堕堡主兰垡堡壅 引物和通用探针进行不同的组合，复合扩增目的基因，达到既快捷又节省成本的 目的。( 4 ) 通过全程监控，用准确算法进行计算，增加了定量的精确性。 实时p c r 因其独特的技术特点而在许多行业和领域有着广泛的应用。主要 有1 ：( 1 ) 基因表达分析研究；( 2 ) 临床病原体检测；( 3 ) 食品卫生检疫；( 4 ) 利用扩增信号的种类来对基因型进行分析。但该方法在种属鉴定领域的应用研究 还比较少。w e t t o n 。”等选用c y t b 基因，设计针对老虎的特异性引物，采用 r e a l t i m ep c r 特异地扩增了从虎血、毛发、虎骨抽提的d n a ；并用此法成功地 鉴定了中药丸剂中重量比占0 5 的虎骨成分。m a r i a 等。”用r e a l t i m ep c r 对 牛、猪、羊、鸡、火鸡和鸵鸟的混合检材进行种属鉴定并对d n a 定量，同时研究 了检测的灵敏度。结果表明，对于混合性生物检材，该法具有高度的种属特异性 以及较佳的灵敏度，对于不能用特异引物扩增的其他种属d n a ，只要含量在2 0 以上，可以通过计算有关数据得以确认其存在。此外，c h i s h o l m “、s a w y e r “”、 j o h njr 1 4 1 等也作了类似研究。 1 1 2 3s n p 技术 s n p 在法医学个体识别方面的运用主要包括：y 染色体s n p 为基础的法医遗传 学研究、高度降解检材d n a 的分析、评估生物个体的地理起源、检测样品捐赠者 毛发或眼睛的颜色等“”。b e l f i o r e 等“”利用单碱基延伸技术，成功鉴定了四种田 鼠的种属，并比较了选用c y b 基因和p 5 3 基因作鉴定的准确度。结果显示：鉴定未 知检材时，p 5 3 基因的判别准确率是7 4 ( 2 0 2 7 ) ，而c y b 基因则较低，只有1 9 ( 4 2 1 ) 。 1 1 2 4 焦磷酸测序技术 焦磷酸测序技术的原理是利用一个级联化学反应监测核酸链延伸反应，同时 产生一个焦磷酸，焦磷酸在s u l f r y l a s e 催化下生成a t p 。a t p 在荧光素酶的作用下， 发出的荧光由p s q 9 6 系统检测。检测到的发光强度与掺入核营酸数量成正比。该 技术具有快速、高通量、准确率高等特点，不需要制胶，不需要毛细管、不需要 荧光染料和同位素，也不需要特异d n a 标记n 订。b b a l i t z k i k o r t e “”等对一块已经 3 ! 盘! 竺竺三堂些堕兰堕堡圭堂垡笙窒 冻压降解的皮肤组织抽提d n a ，扩增1 2 sr r n a 基因，利用该技术测序，结果得 出该皮肤组织来自猪，而不是人体，从而使得s t r 扩增阴性的生物检材得到了正 确鉴定。该法适合于对降解检材进行短片段扩增鉴定。k a l l s o nao 等“”也做了类 似研究，并且成功地对人和灵长类动物作了区分。 1 2 分子生物学方法鉴定种属选用的基因 1 2 1 目的基因筛选标准 鉴于对现场提取的混合检材或陈旧降解检材进行种属鉴定具有一定的复杂 性，因此，用p c r 技术鉴定种属未知检材时，需要选择合适的目的基因。筛选的 目的基因应当满足以下条件。”：( 1 ) 在种属之间尤其是进化关系比较亲近的两个 种属之间要有足够的碱基突变数量。( 2 ) 该基因在不同地域的同一种属内没有或 只有较少的碱基突变。( 3 ) 基因库里有该基因的序列资料，目的基因扩增后可以 与基因库作序列比对，以明确检材的种属来源。已用于种属鉴定的核d n a ( n u c l e a r d n a ，n d n a ) 和线粒体d n a ( m i t o c h o n d r i a ld n a ，m t d n a ) 基因有：a l u 序列啡1 、 2 8 sr r n a 基因“1 z 7 3 、s o n 基因3 端非编码区。侧、细胞色素b 基因( c y t o c h r o m eb ， e y t b ) 跚侧、短串联重复序列基因座“( s h o r tt a n d e mr e p e a t s ，s t r ) ，肿瘤 抑制基因0 1 ( t u m o rs u p p r e s s o r ，t p 5 3 ) 、线粒体d 环区“”( d l o o p ) 、1 2 sr r n a 基因1 1 1 1 8 1 ”1 和1 6 sr r n a 基因”删等。 1 2 2 目前主要应用的目的基因 1 2 2 1s t r 基因座 鉴于s t r 基因座具有良好的长度多态性和序列多态性，因此可以针对人类或 灵长类所特有的基因序列设计具有高特异性的引物扩增目的基因，其他动物则没 有扩增产物。c r o u s e 等m 1 对包括人在内的不同物种的研究表明：f e s f p s 基因座 引物对所有研究动物均没有产物，只对人d n a 有扩增产物，具有良好的种属特异 性；f 1 3 a 0 1 基因座引物除了对恒河猴没有扩增产物外，其他灵长类都有单一等 ! 盘! ! 竺竺 坐垦堂堕堡主兰竺丝茎 位基因扩增产物；c s f l p o ，t p o x ，t h 0 1 ，h p r t b 和v w f 基因座引物对非人灵长类 动物有扩增产物，电泳发现其等位基因条带多数在人等位基因条带的分型区外。 伍祥林等o ”作了类似研究表明：t h 0 1 、v w a 、a r 、c d 4 、f a b p 、d 7 s 8 0 9 、d 1 3 s 6 3 1 基因座引物对人d n a 特异，只要有p c r 扩增产物，就可以认为是人源性d n a ，具 有较好的种属特异性；f e s 、p l a 、d 1 2 s 3 9 1 、c s f l p o 、d 1 9 s 2 5 3 、d 2 1 s i1 、f g a 、 d y s l 9 基因座的引物对非人灵长类动物有扩增产物，其长度与人的相近。 1 2 2 2t p 5 3 基因 t p 5 3 基因位于人类染色体1 7 p 1 3 1 ，含1 1 个外显子。它是一种广谱肿瘤抑制 基因，编码肿瘤抑制蛋白，在调节肿瘤的生长中有着重要的作用“。b e l l i s 等” 设计一对通用引物，对从人、家猫、鸡、牛、狗、山羊、马，猪、老鼠、绵羊、 老虎血痕中提取的d n a 扩增t p 5 3 内含子8 区域，通过改变退火温度提高扩增的特异 性，结果显示：人4 6 0 b p 、家猫2 8 3 b p 、鸡1 3 7 b p 、牛4 7 5 b p 、狗4 8 2 b p 、山羊4 0 5 b p 、 马8 5 5 b p 、猪2 9 3 b p 、绵羊4 0 0 b p ，而老鼠和老虎则没有扩增产物。 1 芝2 3m t d n a 基因 近年来用于种属鉴定的m t d n a 基因主要有：c y t b 、c y t b 联合d - - l o o p 、1 2 sr r n a 基因、1 6 s r r n a 基因等。b a t a i l l e o ”等分别设计针对c y t b 基因和d l o o p 的h v l 区的 引物，对从猪，鸡，马，牛肌肉中抽提的d n a 进行复合扩增，琼脂糖凝胶电泳显 示，人d n a 的扩增产物有两条特异带( c y t b 3 0 9 b p ，d - l o o p2 5 9 b p ) ，而动物只有 c y t b 基因的扩增产物带。说明这种复合扩增能够较好的区分人和动物检材，但不 经测序则无法鉴定具体动物的种属。m a t s u d a d 等“2 1 同样选用c y t b 基因，在对多个 物种的序列进行比对后，选择一段1 5 7 b p 大小的序列作为目的片段，设计了针对 人d n a 的高特异性引物。结果只有人有1 5 7 b p 大小的扩增产物，动物d n a 没有任何 产物。该法阳性结果能够区分出人源性和非人源性检材，但仍然没有对具体的动 物种属作出鉴定。刘宏、白丽萍等作了类似研究，对人和动物的c y t b 基因 进行测序鉴定出人和动物的具体种属，同时分析了人和动物目的片段的序列差 异。r o d r i g u e z 等“”选用1 2 sr r n a 基因，通过比对鹅、鸭、鸡、火鸡和猪的序列， 5 中 丈謦 中山医学院硕士学位论文 利用不同物种序列的保守区设计一条正向通用引物，而反向引物则根据物种的 基因变异区域进行设计。对从上述动物的肉制品中提取的d n a 进行扩增，琼脂糖 凝胶电泳结果：鹅2 4 4 b p 、鸭3 7 3b p 、鸡2 8 5b p 、猪3 8 7b p 、火鸡1 2 2b p ，特异 性和灵敏度均较好。s a u r a vg u h a 等1 用1 6 sr r n a 基因，设计不同引物，在不同 退火温度下，对物种进行了鉴定。 1 3 立题依据及研究思路 通过对既往种属鉴定的研究分析，可以看出种属鉴定目前存在的主要问题 有：( 1 ) 基因库中还有很多种属没有相应的序列资料，有些种属的目的基因可 比对序列较少，如：t p 5 3 基因，利用通用引物进行扩增后，不同实验室的同一种 属动物结果差异较大。由于缺乏可比对序列，因而无法对结果的差异进行分析， 也无法对结果的准确性作出评判阻”3 。( 2 ) 目前s n p 在种属鉴定中的研究并不多， 其中一个主要原因也是因为大多数的种属还缺乏合适的候选基因序列资料。此 外，s n p 技术的准确性需要用其它方法证实，这也加大了研究s n p 技术的难度”“。 ( 3 ) 相同的s t r 基因座采用相同的方法对相同的动物进行鉴定，不同实验室得到 明显不同的结果，说明s t r 用于种属鉴定的可靠性有待于进一步验证。 ( 4 ) 对于污染、腐败降解、陈旧检材或特殊处理( 如火烧，高温高压处理等) 的检材 可利用的d n a 量非常少，常需要用m t d n a 的基因来进行种属鉴定。但f o s t e r “”发现 目前所发表的关于人类m t d n a 序列的资料，有一半存在错误。由于资料的准确性 有限，进一步提示需要正确选择合适的目的基因用于种属鉴定。( 5 ) 对于人和 动物混合的生物检材，能够使用简单、快速、高效且不用测序或一一分离混合成 份即可同步鉴别出人和具体动物种属的方法暂未见报道。s a u r a vg u h a 等虽用 1 6 sr r n a 基因对动物混合性检材进行了研究，但需要在不同的退火温度下进行， 增加了扩增反应的次数，造成实际应用的繁琐。( 6 ) 选用c y t b 和d - l o o p 复合扩 增时，有d - l o o p 的优势扩增现象，部分动物有非特异带出现，从而造成动物也有 两条扩增带，表明其特异性有待提高。 本研究拟采用1 2 sr r n a 基因作为种属鉴定的目的基因，该基因位于m t d n a 的h 链，其大小约9 5 0 1 1 0 0 个碱基，编码1 2 sr r n a 。1 2 sr r n a 基因被广泛地 ! 垒! 三! 坐匡堂堕堡主兰垡堡壅 应用于脊椎动物的系统发育研究和种属鉴定研究中，它具有以下特点和优势：( 1 ) 单细胞中拷贝数较多，适合微量降解检材。微量降解检材中，d n a 降解程度不一， 可提取的核d n a 量比m t d n a 量少，若采用核d n a 基因作为目的基因，则扩增成功 率可能比m t d n a 低。因此，相对于核d n a 而言，1 2 sr r n a 基因更适合降解检材 的鉴定。( 2 ) 序列资料齐全，利于比对判定。多数物种包括一些濒危物种的1 2 s r r n a 基因全长序列资料均可在g e n b a n k 中查到，扩增后有可参比序列资料，有 利于判定种属和扩增的准确性。( 3 ) 扩增结果稳定可靠、可重复性好。既往的 研究表明呻，扩增该基因的稳定性较好，不同实验室之问结果稳定，序列资料 的准确性较高；( 4 ) 不同物种问序列差异大，有利于设计针对目标物种的高特 异性引物。1 2 sr r n a 基因的进化速率较快，且无平行基因传递现象，因而种间差 异大。( 5 ) 可用于鉴定混合检材种属。r o d r i g u e z 等“”对1 2 sr r n a 基因的研究 表明，对于动物性混合检材，通过设计高特异性引物，不需复合扩增、也不需多 个退火温度，就可以实现多个物种用同一反应体系同步扩增鉴定，避免了优势扩 增现象和多次扩增，且无交叉扩增现象。这些说明1 2 sr r n a 基因具有更高的种 属特异性。 综上所述，本研究拟设计一对通用引物和分别针对人、鸡和鸭等目标种属的 特异引物，扩增1 2 sr r n a 基因。以通用引物扩增片段为参照；特异引物扩增片 段用于种属鉴定，分别对陈旧血痕、毛干、新鲜冰冻肌肉、高温处理肌肉等多 种类型检材进行鉴定；特异引物扩增目标种属和非目标种属1 2 sr r n a 基因以检 测其特异性；目标种属扩增产物的测序结果与g e n b a n k 既有序列比对，以检测该 法的准确性；扩增不同浓度的单一或混合d n a 检测其灵敏度；用盲测方法检测 未知生物检材以验证其实用性，最终建立一种简单、快速、准确、灵敏度高、特 异性强的种属鉴定方法，为法医学实践提供更多的选择。 2 1 材料 2 1 1 主要实验仪器 高速台式离心机 高速冷冻离心机 p c r 扩增仪 紫外分光光度仪 电泳仪 垂直板电泳系统 快速混匀器 凝胶成像仪 2 1 2 主要实验试剂 c h e l e x - 1 0 0 饱和酚 氯仿 p r o t e i n a s ek s d s t r i s b o r i ca c i d t a g d n a 聚合酶 d n t p p c rb u f f e r t e m e d a p s 第2 章材料和方法 t c l 一1 6 6 t c l 一1 6 a m a s t e r c y c l e rg r a d i e n t 7 2 1 型 d y c - 3 1 a s k 一1 a l p h a d i g i d o c 上海飞鸽 上海飞鸽 e p p e n d o r f 上海第三分析仪器厂 北京三一仪器厂 自制 常州国华电器有限公司 a l p h ac o r p o r a t i o n b i o r a d 北京鼎国 广州化学试剂厂 p r o m e g a p r o m e g a p r o m e g a p r o m e g a 北京鼎国 北京鼎国 北京鼎国 p r o m e g a p r o m e g a a g a r o s e d n am a r k e r g o l d v i e w 染料 h n 0 3 a g n 0 3 n a 2 c 0 3 2 1 3 样品来源 b l o w e s t 北京天为时代 北京赛百胜 广州化学试剂厂 广州化学试剂厂 广州化学试剂厂 室温保存1 2 年的人、猪、鸡、鸭、牛、山羊、绵羊、鹅、兔、鼠和狗血 纱；从健康志愿者获取毛干；从冰冻保存3 5 天的人尸体取胸部肌肉；从菜市 场获取的新鲜鸡、鸭腿部肌肉；将0 5 9 大小的人、鸡、鸭肌肉置1 0 0o c 水中煮 3 0 m i n ，制成煮熟肌肉标本。每种样品取8 例。 2 2 主要实验方法 2 2 1 模板d n a 的抽提 2 2 1 1c h e i e x - 1 0 0 法 ( 1 ) 取约5 r e x5 啪的血纱、三段l c m 长的干净毛干，置于0 5 m l 离心管中。 ( 2 ) 血纱管加去离子水至2 3 管体积，浸泡约l o 1 5 m i n ，至血纱颜色变淡， 浸泡液变为浅红色，1 0 0 0 0 r p m 5 m i n ，弃上清，保留2 0p1 左右液体和载体。 ( 3 ) 各管加入5 c h e l e x - 1 0 02 0 0u1 ，毛干管中再加入蛋白酶k ( 1 0 m g m l ) 6 p1 ，混匀后，5 6 0 c 孵育，其中，血纱孵育0 5 2 h ，毛干孵育过夜。漩涡振荡5 - 1 0 s 。 ( 4 ) 9 8 0 c 孵育8 l o m i n ，漩涡振荡5 一l o s 。 ( 5 ) 1 0 0 0 0 r p m 2 m i n ，取上清液作p c r