噬菌蛭弧菌在虾蟹健康养殖中的应用.doc

噬菌蛭弧菌在虾蟹健康养殖中的应用出处：水产前沿 作者： 中国水产养殖网2015-05-18 07:58:00摘要: 噬菌蛭弧菌与解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等分泌抗菌肽、依枯草菌素等抑菌物质的生防细菌不同，它主要以机械钻孔与酶解的方式破坏病原菌细胞壁，从而达到杀菌的效果。噬菌蛭弧菌的这种作用方式也决定了其杀菌范围比 .噬菌蛭弧菌作为一种具有先天独特噬菌特性的寄生性细菌，在虾蟹病害防治中逐渐崭露头角，已经成为虾蟹健康养殖的“新秀”。文/ 图 上海市水产养殖工程技术研究中心,上海高校知识服务平台上海海洋大学水产动物遗传育种中心（ZF1206） 曹海鹏上海绿奥生物科技有限公司 李家胜我国是水产养殖大国，多年来虾蟹产量居世界之首。然而，随着虾蟹养殖业的迅速发展，水质污染越来越严重，导致虾蟹发病与死亡的损失也愈加触目惊心，水质污染与病害发生已经成为制约虾蟹健康养殖可持续发展的瓶颈。据研究与调查统计表明，水质污染已经对虾蟹生长、发育、繁殖及其产量与产品品质产生了重要的不良影响，还导致了生物多样性的降低；我国虾蟹每月平均发病率和死亡率分别约高达14.03%-23.93%和3.92%-23.79%，由此造成的直接经济损失高达49.50亿元。因此，如何进行有效的养殖水体水质与病害控制无疑是虾蟹健康养殖业可持续发展所面临的巨大挑战。目前，利用微生物进行水质处理与病害防治业已证明是一种绿色环保、有效的病害防治技术与方法，在国内外均有较多的报道。其中噬菌蛭弧菌作为一种具有先天独特噬菌特性的寄生性细菌，在虾蟹病害防治中逐渐崭露头角，已经成为虾蟹健康养殖的“新秀”。本文从噬菌蛭弧菌的噬菌机理入手，进一步阐明了噬菌蛭弧菌作为一种新型生防菌剂所具有的独特功效，以期加深我国虾蟹养殖者对噬菌蛭弧菌的认识，加快噬菌蛭弧菌制剂在我国虾蟹健康养殖应用中的推广进程。一、噬菌蛭弧菌是一种具有先天独特噬菌特性的猎食性细菌自德国学者Stolp和Petzold（1962年）首次在德国的土壤中发现了这种以寄生和裂解细菌为生的噬菌蛭弧菌以来，国内外学者相继对其噬菌机理展开了研究。迄今已经证实，噬菌蛭弧菌对病原菌的作用方式为“穿入、稳定、裂解”模型，即噬菌蛭弧菌首先通过化学趋避性识别并吸附宿主细菌，然后通过酶解和机械钻孔等一系列反应，进入宿主细菌的质壁空间或细胞质，对宿主细胞进行一系列的修饰与改造，同时进行自身生物大分子合成，最终分裂形成子代蛭弧菌并释放到宿主细胞外。近年来，为了在基因与蛋白质水平深入探索噬菌蛭弧菌的噬菌机理，Beck、Barel等学者（2005）研究了噬菌蛭弧菌在宿主体内增殖时产生的蛋白与一些潜在的功能基因，发现外膜蛋白、蛋白酶基因很可能在其识别和裂解宿主菌的过程中起了非常重要的作用。这些研究为进一步阐明噬菌蛭弧菌的噬菌机理奠定了坚实的基础。二、噬菌蛭弧菌在虾蟹健康养殖应用中的独特功效1、噬菌蛭弧菌对虾蟹病原菌的杀菌范围广，噬菌效果显著噬菌蛭弧菌与解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等分泌抗菌肽、依枯草菌素等抑菌物质的生防细菌不同，它主要以机械钻孔与酶解的方式破坏病原菌细胞壁，从而达到杀菌的效果。噬菌蛭弧菌的这种作用方式也决定了其杀菌范围比其他生防细菌更为广泛。大量研究结果表明，噬菌蛭弧菌几乎能够裂解虾蟹常见的病原菌种类。例如，杨淑专和黄庆辉（1997）研究了噬菌蛭弧菌对虾蟹病原菌的寄生作用后表明，噬菌蛭弧菌对非01霍乱弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌、鳗弧菌、梅氏弧菌、溶藻弧菌、河弧菌、气单胞菌等共25株虾蟹常见病原菌具有良好的噬菌活性。因此，通过向水体中泼洒噬菌蛭弧菌，可以广泛降低水体中虾蟹病原菌的种类与数量，从而减少了虾蟹细菌性病害的发生率。此外，噬菌蛭弧菌对病原菌的噬菌效果也极为显著。杨莉等（2000）试验证实噬菌蛭弧菌能够在5天使嗜水气单胞菌含量下降103cfu/mL，在9天使嗜水气单胞菌含量下降107cfu/mL。这些研究表明噬菌蛭弧菌消除致病菌的效率高，为进一步在虾蟹细菌性病害防治上推广应用提供了重要的临床试验依据。2、噬菌蛭弧菌噬菌条件较为宽松，适应虾蟹养殖水体环境能力强虾蟹养殖生长的pH、温度范围与噬菌蛭弧菌的噬菌条件基本相同。据研究表明，目前分离的噬菌蛭弧菌菌株对pH、温度等环境因子的要求并不严格，其噬菌条件范围一般为pH6.5-8.6和4-37。例如，邵桂元等（1995）研究发现，噬菌蛭弧菌在4-37和pH6.0-8.0条件下对点状产气单胞菌有形成噬菌斑的能力；李戈强等（1998）试验也证明噬菌蛭弧菌在温度10-35和pH6.5-8.6范围内对河流弧菌均有裂解作用，并进一步指出在25-30和6.5-8.1范围内噬菌蛭弧菌对河流弧菌裂解活性最强。而且，Rice等（1998）试验也证实，水体中的天然细菌含量完全可以保持噬菌蛭弧菌的生长。这些均说明噬菌蛭弧菌对虾蟹养殖水体环境的适应能力强，对温度和pH的适应范围较宽松。3、噬菌蛭弧菌能够解决虾蟹病原菌因出现耐药性所导致的负面效应耐药性是指病原体在反复接触抗病原体药物后，其反应不断减弱，以至最后能够抵抗药物而不被杀灭或抑制的现象。耐药性的产生除了遗传因素外，主要与养殖过程中长期使用某种药物、用药方法不当以及病原体的异地传播有关。病原菌耐药性的产生，不仅会导致用药量增加，提高养殖成本，而且还会造成环境与水产品污染，进而危害人类健康。研究表明，噬菌蛭弧菌是一种具有先天噬菌特性的寄生性细菌，其噬菌作用不因病原菌是否产生耐药性而发生影响。本实验室曾观察了噬菌蛭弧菌对耐沙拉沙星和新霉素的嗜水气单胞菌的裂解作用，发现其对这些嗜水气单胞菌耐药菌株仍然具有良好的噬菌效果。因此，噬菌蛭弧菌是解决病原菌不断产生耐药问题的最佳选择之一。4、噬菌蛭弧菌具有水质改良、增强免疫力与抗病菌感染三重功效噬菌蛭弧菌作为一种寄生性细菌，除了具有良好的噬菌效果外，经研究证实还具有水质改良、增强免疫力与抗病菌感染三重功效，这是任何一种益生菌与化学消毒剂所不能比拟的。张梁等（2005）研究了噬菌蛭弧菌对水质影响后发现，噬菌蛭弧菌能够显著改善养殖环境中的主要化学指标，具体表现在：向水中泼洒含量为5104PFU/L的噬菌蛭弧菌制剂后，养殖水体的化学耗氧量、氨氮含量、硫化物含量分别下降了29.95%、33.87%和34.38%，溶解氧含量上升了12.43%；张吕平等（2009）研究进一步指出噬菌蛭弧菌（3105PFU/mL）抑制弧菌的效果明显优于二氯异氰尿酸钠（0.3mg/L）和季铵盐络合碘（0.3 mg/L）。此外，徐琴等（2007）研究表明，噬菌蛭弧菌能够明显促进中国对虾生长及非特异免疫因子活性的提高。将噬菌蛭弧菌以1%比例添加到中国对虾基础饲料中连续投喂25天后发现，对虾增长率、增重率、存活率分别提高了49.07%、74.61%、50%；溶菌酶活力、超氧化物歧化酶活力分别提高了约500%和100%，对虾抗鳗弧菌感染的相对保护率也高达52.9%。这些研究结果均显示了噬菌蛭弧菌在预防虾蟹病菌感染方面的优越性。三、噬菌蛭弧菌在虾蟹健康养殖应用中的实际案例案例一：浙江萧山南美白对虾黄腿病1、基本情况浙江杭州曹氏水产养殖有限公司，在萧山农业对外综合开发区围垦十七工段有土塘280亩（放苗6-7万尾/亩），且自有虾苗淡化场。2012年8月，两个虾塘开始偷死，原因不详。后通过对养殖水样的分析检测、细菌的分离培养鉴定，得出结论：致病弧菌引起偷死（图1）。2、治疗方案及结果图2 治疗成功，当年9月份收虾使用AB型养殖水体微生态杀菌剂（注：商品名，主要成分为噬菌蛭弧菌），2亩/包，5天/次。期间每次投完AB，间隔2-3天后使用AQ-I（注：商品名，主要成分为复合微生物活菌酶制剂）。使用AB后，直至9月收虾，不再出现一只死虾（图2）。案例二：江苏连云港梭子蟹育苗场荧光病1、基本情况2013年4月，江苏省连云港市老板吴强发现其梭子蟹育苗场三个育苗池暴发大规模荧光病。由于对该病的病原不清楚，因而进行了问诊。2、临床症状及诊断分析图3 左侧为未使用AB池水样，弧菌数达5万个/ml；右侧为AB使用24小时后育苗池水样，弧菌数2万个/ml肉眼检查：病蟹反应迟钝，蟹体全身均发荧光，在夜间病蟹活动时，可见到象火龙般的一道道荧光。实验室检查：从病蟹体内通过弧菌选择性培养基分离出形态均匀、大小一致的革兰氏阴性弧杆状细菌，而且水中弧菌的总浓度为5105cfu/ml（图3）。通过对分离菌进行生理生化特性鉴定和16S rRNA基因测序比对，结果证实分离菌为弧菌，故确定该病为弧菌感染所致。3、治疗方案及结果图4 使用5天后，水体弧菌含量降至27个/ml根据以上症状与诊断分析，结合育苗池底部24h增氧的有利条件，给养殖户制定了以下治疗方案：马上使用养殖水体生物杀菌剂AB，每立方米0.6克，每天1次，连用5天（图4）。按照该方案使用后，病蟹明显好转，并逐渐痊愈。考虑到育苗池水中自然弧菌含量较高，故在该病控制后，进一步建议养殖户继续使用养殖水体生物杀菌剂AB，3-5天1次。该养殖户按照该方案进行育苗后蟹苗再也未发生包括荧光病在内的细菌病。案例三：江苏南通南美白对虾甲壳溃疡病1、基本情况图5 甲壳溃疡病江苏省南通市如东县兵房镇黄老板建有一个2亩的露天池塘、一个1亩的大棚和5个0.5亩的大棚，每亩投放虾苗6-7万尾。2013年5月，该养殖户发现部分虾开始出现黑斑，即甲壳溃疡病（图5），而且其周边养殖户的虾也出现了普遍的黑斑病发病现象。2、临床症状及诊断分析肉眼检查：病虾反应迟钝，甲壳出现程度不一的黑褐色溃疡，溃疡中部凹陷，表现为数量不等的褐斑。解剖检查：病虾肝胰腺坏死，糜烂。实验室检查：从病虾肝胰腺组织中分离出形态均匀、大小一致的革兰氏阴性弧杆状细菌。通过对分离菌进行生理生化特性鉴定和16S rRNA基因测序比对，结果证实分离菌为弧菌。3、治疗方案及结果图6 病虾逐渐痊愈使用养殖水体生物杀菌剂AB，每包（227克）2亩，2天1次。按照该方案使用后2天，对虾不再死亡。之后继续使用AB，10天1次，病虾逐渐痊愈（图6）。案例小结与讨论饲养水产动物细菌病发生的原因，一是由于育苗池中弧菌大量繁衍，含量过高；二是水产动物在恶劣水环境中自身免疫力和抵抗力下降，经大量病菌侵袭而引发各类疾病在水产动物育苗及养殖过程中，要坚持防重于治的原则，定期检测水质和弧菌总量，每天巡塘。尤其是养殖中后期，随着水产动物的不断生长，残饵、粪便也逐渐增多，各种病菌，尤其是弧菌的含量增加。实践表明，一旦发现水中弧菌含量超过1000个/ml时，都需尽快使用养殖水体生物杀菌剂AB进行预防。否则，极有可能暴发各类细菌感染，造成水产动物大规模死亡（表1）。四、噬菌蛭弧菌必将成为提高虾蟹健康养殖水平的新秀虾蟹养殖业已经成为我国水产养殖的特色产业和亮点经济，对农民的就业与社会稳定的维护具有重要作用。如湛江市养虾业及相关产业链就解决了当地60多万人的生活问题。然而，虾蟹养殖户在养殖过程中解决水体污染、药残等一些瓶颈时，往往存在这样或那样的问题。例如，目前在我国渔药市场上，用于虾蟹养殖的药物五花八门，良莠不齐。不少虾（蟹）农缺乏药物基本知识，不清楚哪些药物残留时间长，哪些药物是水产养殖禁药，哪些药物毒性强，往往无意识地造成了对虾蟹产品的质量安全隐患；导致虾蟹发生中毒死亡。例如，对虾氯霉素事件曾使我国对虾产品屡遭限制和封杀；江苏盐城一养殖户因误用了硫酸铜和晶体敌百虫，使养殖的105亩水面的青虾和河蟹发生了大量中毒死亡。因此，必须树立虾蟹无公害健康养殖理念，从虾蟹苗到“餐桌”的全