（分析化学专业论文）纳米材料在pcr体系中的应用研究.pdf

山东师范大学硕士学位论文 摘要 聚合酶链式反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，p c r ) 技术是现代分子生物 学核心技术之一。研究优化p c r 反应的方法具有重要的意义。p c r 可使目的d n a 分子的合成量呈指数增长，因此很微量的遗传物质在数小时内即能扩增数百万倍 达到检测水平来进行测序、d n a 探测、基因分析、食品检验、环境监测等，使 原来无法进行分析和检测的许多项目得以完成。p c r 技术具有特异、敏感、快速、 易自动化等突出优点，彻底改革了分子遗传学，成为现代生物学和药物科学最流 行的技术之一，与克隆、d n a 序列分析方法构成了整个现代分子生物学研究工 作的基础。尽管p c r 已发展成为一项相当成熟的技术，但在实际操作中，p c r 扩 增始终存在一些难以克服的问题，如假阴性、假阳性、非特异性扩增以及片状拖 带或涂抹带等。寻找解决p c r 中这些问题的方法至关重要。通常的办法有向p c r 体系中添加各种增效剂，优化p c r 体系的各种参数，改进p c r 的扩增策略等，这 些方法虽然一定程度地提高了p c r 的特异性、产量以及效率，但是并未彻底解决 上述难题，p c r 扩增仍达不到理想的预期效果。最近，人们试图从新兴学科与技 术中寻找优化p c r 的方法。纳米科学技术和生物科学技术相结合的纳米生物技术 由于其独特的优势性越来越引起人们的关注。纳米材料具有特殊的表面效应、尺 寸效应，表面能进行多种修饰，易与生物大分子蛋白质、核酸等相互作用，对生 物分子的结构和功能产生特别的影响。而且与生物分子相比，人工纳米结构稳定 性高，相对廉价，因此，利用人工纳米结构来替换生物分子机器中的一部份组件 就成为可能。如今越来越多的学者将纳米材料引入至u p c r 体系中，对p c r 体系做 了积极的探索与改进，优化了p c r 体系，并取得了令人振奋的成果。将纳米材料 引入到聚合酶链反应中，不仅能同时发挥纳米材料和d n a 的优点，还将使p c r 技术由均相体系扩展到复相体系，为传统的p c r 技术增添了新内容，从而大大拓 宽p c r 技术的应用范围。因此，研究基于纳米粒子表面的聚合酶链反应，具有非 常重要的理论意义和应用价值。 本论文基于前人的工作基础上，主要进行了以下的工作： 1 合成1 5n m 的金纳米粒子，考察其对p c r 体系变性温度的影响。实验结果 表明，金纳米粒子可以一定程度的拓宽p c r 体系的变性温度范围。 2 采用水相法合成了表面修饰有c o o h 的c d t e 纳米粒子和c d t e 纳米棒用 山东师范大学硕士学位论文 于p c r 体系中，考察了其对p c r 体系的影响。试验结果发现，c d t e 纳米粒子能提 高p c r 体系的特异性，而且能一定程度地拓宽p c r 的退火温度范围。而一定浓度 范围的c d t e 纳米棒能对p c r 扩增起到优化的作用，还可以部分代替p c r 体系中 m 孑+ 作用。具体的作用机制还有待于我们进一步的研究。 关键词：p c r ，金纳米粒子，变性温度，c d t e 纳米材料，特异性，退火温度 中图分类号：0 6 5 7 3 2 山东师范大学硕士学位论文 a b s t r a c t p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o ni so n eo ft h ek e r n e l t e c h n o l o g i e so fm o d e m m o l e c u l a rb i o l o g y i ti ss i g n i f i c a n tt os t u d yt h ew a y so fi m p r o v i n gp c r a m p l i f i c a t i o n o w i n gt ot h ee x p o n e n t i a la m p l i f i c a t i o na b i l i t yo fp c r ，m i l l i o n so fd n ac o p i e sc a n b ep r o d u c e di ns e v e r a lh o u r sf r o me v e nad r o po ft a r g e td n ai no r d e rt or e a c ht h e d e t e c t i n gl e v e l f o rs e q u e n c i n g ，d n a d e t e c t i n g ，g e n e t i ca n a l y s i s ，f o o dt e s t ， e n v i r o n m e n ti n s p e c t i o n ，a n ds oo n a sa r e s u l t ，m a n yi t e m st h a tc o u l dn o tb ea n a l y s e d a n dd e t e c t db e f o r e ，f i n dw a y st ob ec a r r i e do u tt o d a y t h e r ea r em a n ye x c e l l e n c e si n p c r ，s u c ha ss p e c i f i c i t y ，s e n s i t i v i t y ，s p e e d i n e s s ，r o b o t i z a t i o n i ti n n o v a t e st h e m o l e c u l a rh e r e d i t yd r a s t i c a l l y ，a n db e c o m e so n eo ft h em o s t p o p u l a rt e c h n o l o g i e si n m o d e mb i o l o g ya n dm e d i c a ls c i e n c e s y n c h r o n o u s l yi tm a k e su po ft h eb a s eo ft h e w h o l em o d e mm o l e c u l a rb i o l o g yi nc o m p a n yo fc l o n ea n dd n a s e q u e n c ea n a l y s i s a l t h o u g hp c r h a sb e c o m eam a t u r et e c h n o l o g y ，i np r a c t i c a lo p e r a t i o n ，t h e r ea r es t i l l m a n yp r o b l e m st h a tc a nn o tb eo v e r c o m e ，s u c ha sf a l s en e g a t i v es i g n a l s ，f a l s ep o s i t i v e s i g n a l s ，n o n s p e c i f i ca m p l i f i c a t i o n ，a n ds h e e tb a n d so rs m e a rb a n d s i ti so fb r o a d i n t e r e s tt oe x p l o r em e t h o d st os o l v et h e s ep r o b l e m si np c r c o m m o nm e t h o d s i n c l u d ea d d i n gv a r i o u se n h a n c i n gr e a g e n t s ，o p t i m i z i n gt h ep c r r e a c t i o nc o n d i t i o n s ， i m p r o v i n gt h ea m p l i f i c a t i o ns t r a t e g i e sa n ds of o r t h t h e s em e t h o d sc a ni m p r o v et h e s p e c i f i c i t y ，o u t p u ta n de f f i c i e n c yo fp c rt os o m ee x t e n t ，b u tt h e ys t i l lc a nn o ts o l v e t h ep r o b l e m sa b o v ed r a s t i c a l l y ，s op c ra m p l i f i c a t i o ns t i l lc a nn o tr e a c ht h e a n t i c i p a t i v ee f f e c t s r e c e n t l y ，p e o p l et r yt of i n dw a y so fo p t i m i z i n gp c rf r o mt h e r i s i n gs u b j e c t sa n dt e c h n o l o g i e s n a n o b i o l o g i c a lt e c h n o l o g yc o m i n gf r o mt h e c o m b i n a t i o no fn a n o t e c h n o l o g ya n db i o s c i e n c et e c h n o l o g yh a sc a t c h e dm o r ea n d m o r ep e o p l e sa t t e n t i o nb e c a u s eo fi t s s p e c i a ls u p e r i o r i t i e s n a n o m a t e r i a l sh a v e s p e c i a ls u p e r f i c i a la n dd i m e n s i o ne f f e c t t h e i rs u r f a c ec a nb em o d i f i e dw i t hm a n y k i n d so fs u b s t a n c e sw h i c hc a nr e a c tw i t hb i o l o g i c a lm a c r o m o l e c u l e sl i k ep r o t e i na n d n u c l e i ca c i d s o t h e yh a v es p e c i a li m p a c t so nt h es t r u c t u r ea n df u n c t i o no ft h e b i o l o g i c a lm a c r o m o l e c u l e s f u r t h e r m o r e ，a r t i f i c i a ln a n o m a t e r i a l sa r em u c hs t e a d i e r a n dc h e a p e rt h a n b i l o g i c a lm o l e c u l e s a sar e s u l t ，i t i s p o s s i b l e f o ra r t i f i c i a l 3 山东师范大学硕士学位论文 n a n o m a t e d a l st ot a k et h ep l a c eo fo n ep a r to ft h eb i o l o g i c a lm o l e c u l a rs y s t e m s n o w d a y s ，m o r ea n dm o r er e s e a r c h e r sh a v ei n t r o d u c e dn a n o m a t e r i a l si n t op o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o ns y s t e m s ，a n dh a v eo p t i m i z e dp c rb ym a k i n gm u c he x p l o r a t i o na n d i m p r o v e m e n to ni t a n dt h e yh a v ea b t a i n e dh e a r t - s t i r r i n gp r o d u c t i o n i n t r o d u c i n g n a n o m a t e f i a l si n t op o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o ns y s t e m sc a ne x e r tt h ee x c e l l e n c eo f n a n o m a t e r i a l sa n dd n a ，a n de x t e n dt h ep c rt e c h n o l o g yf r o mh o m o g e n e o u ss y s t e m s t od i p h a s eo n e s i tc a na d dn e w b o r nc o n t e n t si n t oc o n v e n t i o n a lp c ra n de x t e n dt h e a m p l i f i c a t i o na r e ao fp c rt e c h n o l o g y s oi tp o s s e s s e sv e r yi m p o r t a n ta c a d e m i ca n d a p p l i c a t i o nm e a n i n g st os t u d yt h ep o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o nb a s e d o nt h es u r f a c eo f n a n o m a t e r i a l s b a s e do nt h ew o r ko fp r e d e c e s s o r s ，w em a i n l yc a r d e do nt w oa s p e c t so f i n v e s t i g a t i o n si nt h i sw o r k ： f i r s t ，w es y n t h e s i z e da un a n o p a r t i c l e sw i t hd i a m e t e ro f15n l n ，a n da b s e r v e d t h e i re f f e c t so nt h ed e n a t u r e dt e m p e r a t u r eo fp c r t h ee x p e r i e n tr e s u l t si l l u s t r a t e d t h a ta un a n o p a r t i c l e sc o u l dw i d e nt h er a n g eo ft h ed e n a t u r e dt e m p e r a t u r eo fp c rt o s o m ee x t e n t s e c o n d ，w ep r o d u c e dw a t e r - s o l u b l es e m i c o n d u c t o rc d t en a n o p a r t i c l e sa n d n a n o n o d sm o d i f i e dw i t hc a r b o x y lo nt h e i rs u r f a c e ，a n di n t r o d u c e dt h e mi n t o p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o ns y s t e m ，a b s e r v i n gt h e i re f f e c t so np c r w ef o u n dt h a ta c e r t a i nc o n c e n t r a t i o nb o u n do fc d t en a n o p a r t i c l e sc a ni m p r o v et h es p e c i f i c i t yo f p c r ，a n d i ta l l o w sr e l i a b l ep c ra m p l i f i c a t i o ne v e na tl o w e r e da n n e a l i n g t e m p e r a t u r e s ，s o c d t en a n o p a r t i c l e sc a ne x t e n dt h er a n g eo ft h e a n n e a l i n g t e m p e r a t u r eo fp c r t oac e r t a i ne x t e n t t h ee x p e f i e n ts u g g e s t e dt h a tc d t en a n o r o d s c o u l di m p r o v et h es p e c i f i c i t yo fp c ra n dp l a yas i m i l a rr o l et om g + i o n si nt h e r e a c t i o nt o h e l pm a i n t a i nt h ea c t i v i t yo ft a qe n z y m e t h em a t e r i a lr e a c t i o n m e c h a n i s mn e e d st ob ef u r t h e ri n v e s t i g a t e d k e y w o r d s ：p c r ，a un a n o p a r t i c l e s ， s p e c i f i c i t y c a t e g o r yn u m b e r ：0 6 5 7 3 4 d e n a t u r e dt e m p e r a t u r e ，c d t en a n o m a t e r i a l s ， 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包 含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得 ( 注：如没有其他需要特别声明的，本栏可空) 或其他教育机构的学位或证书 使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：鸯奶导师签字：弋勘次 导师签字：影r 庐 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解堂撞有关保留、使用学位论文的规定，有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权堂撞匦可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位 论文在解密后适用本授权书) 砂使 签字日期：伽圹年幢月jre t签字日期：如7 年p 月中日 ，弋 山东师范大学硕士学位论文 第一章前言 第一节p c r 技术简介 p c r ( p o l y m c r a s e c h a i n r e a c t i o n ) t ，聚合酶链式反应，又称基因体外扩 增技术，是由一对引物介导，在体外对特定d n a 片段进行快速酶促扩增的技 术，具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点。 p c r 能把很微量的遗传物质在数小时内扩增数百万倍【2 - 4 达到检测水平，从而进 行测序 5 1 、d n a 探测【每8 1 、基因分槲9 m 1 或者食品检验【1 4 1 刀等，使原来无法进行 分析和检测的许多项目得以完成。p c r 由m u l l i s 等人于1 9 8 5 年发明，1 9 8 8 年 由于耐热d n a 聚合酶的发现，使p c r 走向实用阶段，m u l l i s 也因发明p c r 获 1 9 9 3 年诺贝尔奖。p c r 彻底改革了分子遗传学，成为现代生物学和药物科学的 最流行的技术之一，与克隆、d n a 序列分析方法几乎构成了整个现代分子生物 学试验工作的基础。 p c r 的基本工作原理1 18 】是模板双链d n a 热变性成两条单链d n a ，在合适 的条件下，耐热d n a 聚合酶以单链d n a 为模板，利用反应体系中的d n t p 合 成与其互补的单链d n a ，经过变性一复性一延伸的多次循环，使d n a 的数量 以指数倍数增长的过程。p c r 的最后结果是，经n 次循环以后，一般为2 5 3 5 次( 次数过多扩增效率降低错误掺入率增加；太少则产率偏低) ，两条引物结合 位点之间的d n a 片段的拷贝数，理论上的最高值为2 n 。 p c r 反应体系包括模板、引物、d n t p 、d n a 聚合酶以及缓冲液。其基本 反应由三个步骤组成：变性，退火，延伸。 ( 1 ) 变性通过加热使模板d n a 完全变性成为单链，同时引物自身和引物之间 存在的局部双链也得以消除。模板d n a 的变性温度由其g + c 含量来决定，g 卜c 含量越高，变性温度越高。变性的时间由模板d n a 分子的长度来决定，d n a 分子越长，两条链完全分开所需的时间也越长。如果变性温度过低或者时间太 短，模板d n a 中往往只有富含a t 的区域被变性，这样在后续的反应中，随 着温度的降低，模板d n a 将会重新复性变成天然结构。对于g + c 含量5 5 的线性d n a 模板，常规p c r 的变性条件是9 4 9 5 变性4 5s 。当模板d n a 的g + c 含量 5 5 时要用更高的变性温度。 ( 2 ) 退火退火是将温度降到适宜温度，使引物和模板d n a 复性结合。退火温 5 山东师范大学硕士学位论文 度由引物长度和g c 含量决定。t m 值( 解链温度) = 4 ( g + c ) + 2 ( a + t ) ，复性温度 = t m 值( 5 1 0 ) ，在t m 值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引 物和模板间的非特异性结合，提高p c r 反应的特异性。复性时间般为3 0 - - 6 0s e c ，足以使引物与模板之间完全结合。退火温度过高，引物不能与模板很好 的复性，扩增效率很低：退火温度太低，引物将产生非特异性复性，导致非特 异性的d n a 片段的扩增。 ( 3 ) 延伸将温度升高，热稳定d n a 聚合酶以d n t p 为底物催化合成新生d n a 链延伸。通常在热稳定d n a 聚合酶催化d n a 合成的最适温度下进行。对于t a q d n a 聚合酶，最适温度一般为7 2 7 8 。延伸时间由扩增片段长度决定，1k b 以内的d n a 片段的延伸时间为lm i n ，延伸时间过长会导致非特异性扩增。 6 山东师范大学硕士学位论文 第二节p c r 技术的局限性及提高p c r 效率的方法 一、p c r 体系经常出现的问题 尽管p c r 已发展成为一项相当成熟的技术，常规实验中失误率较小，但在 实际操作中，p c r 扩增始终存在一些需要改进的问题。p c r 中经常出现的问题 有以下几点：1 假阳性。出现的p c r 扩增条带与目的靶序列条带一致，有时 其条带更整齐，亮度更高。2 出现非特异性扩增带。p c r 扩增后出现的条带与 预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。 非特异性扩增在后续电泳检测中表现为引物二聚体( p r i m ed i m e r ) 、非特异性 条带或弥散拖尾条带，甚至完全得不到目标条带。尤其是当扩增富含g c 的d n a 片段 1 9 , 2 0 ，或者从复杂的基因组中扩增低拷贝数的基因【2 1 】，以及当第一轮扩增 不成功需要进行再扩增时。3 出现片状拖带或涂抹带。p c r 扩增有时出现涂抹 带或片状带或地毯样带。 二、传统优化p c r 体系的方法 为了解决p c r 中遇到的各种问题，人们进行了许多的尝试和努力。主要有 三个方面：一是通过调整p c r 的各种参数，如退火温度、聚合酶浓度【2 2 ，2 3 1 、 m 9 2 + 浓度【2 4 - 2 6 1 、循环数等方面；二是通过引入了不同类型的增效剂来对p c r 体 系进行优化，例如甲酰胺( 1 2 5 1 0 ) 【2 刀、乙酰胺【2 8 1 、非离子去污剂( 如t w e e n 2 0a n dt r i t o n x 1 0 0 ) 2 9 】、d m s o ( 1 1 0 ) 3 0 - 3 3 】、硫酸铵【3 4 】、氯化甲基四铵 ( t m a c ，6 0m m ) 3 5 , 3 6 和甜菜碱( 1 3m ) 3 3 , 3 5 - 3 7 】等；三是通过改进p c r 的扩 增策略，如巢式p c r 、降落p c r 、热启动p c r 等多种p c r 策略。 传统方法改进p c r 技术的空间已经很小，人们开始试图从新兴的技术中来 找到提高p c r 技术的方法。 三、纳米材料对p c r 体系的影响 纳米科学技术和生物科学技术相结合产生的纳米生物技术已成为一门独立 学科越来越吸引人们的注意【3 8 , 3 9 。人工纳米结构具有纳米尺度的尺寸，与生物分 子和生物分子机器相当，具有特殊的表面效应，可以进行各种修饰，与生物大分 子产生复杂的相互作用，特别是弱相互作用，因此可以对生物分子的结构和功能 产生特别的影响。将纳米材料引入到聚合酶链反应中，为传统的p c r 技术增添了 新的内容，大大拓宽p c r 技术的应用范围。到目前为止，人们将多种纳米材料引 7 山东师范大学硕士学位论文 入p c r 体系中，提高t p c r 的特异性和产量。 ( 一) 贵金属纳米粒子对p c r 体系的影响 1 金纳米粒子对p c r 的影响。 2 0 0 5 年，胡均等人f 删发现1 0n m 的金纳米粒子能提高p c r 的特异性和产 量。当金纳米粒子的浓度介于0 4n m - 08n m 之间时，随着加入的金纳米粒子浓 度不断增大，非特异性条带越来越少，目的条带( 2 8 3b p ) 逐渐增强，可以得到 单一明亮的目标条带。但当金纳米粒予浓度再继续增加到大于1 0r i m 时，p c r 的特异性又会被抑制。同时，加入纳米金可以在保持体系产量和特异性的前提 下，使体系在非最佳温度退火。常规p c r 为了使产量和特异性都达到最优的效 果，通常要尝试不同的温度来得到最佳退火温度。要提高目标产物的产量通常 需要降低退火温度，而要获得高的特异性却又需要提高退火温度。p c r 体系的 退火温度一般在5 5 左右，而加入金纳米以后，p c r 体系可以在较低的温度 下退火，印使低至2 5 ，仍然能得到较好的特异性。 幽1 - 1 退火温度对p c r 特异性的影响。泳道1 ，2 ：2 5 c ；泳遵3 ，4 ：3 0 c ；泳道5 ，6 ： 3 5 c ：泳道7 ，8 ：4 0 ：泳道m 是标记，泳道i 3 ，5 7 是没有金纳米粒子时得到的p c r 结果t 泳道2 4 6 ，8 是加入了金纳米粒子后得到的i ：c r 结果。( 上图和r 图中加入的金 纳米浓度分别是0 4 n m 和0 6 n m ) 。 金纳米之所以能影响p c r 体系的作用机理还没有研究清楚，胡君等认为金 纳米粒于是模拟了体内d n a 复制过程中的单链结合蛋白s s b 的作用。s s b 能 选择性的结合单链d n a ( s s d n a ) ，而不是双链d n a ( d s d n a ) ，这种选择性 大大减弱了d n a 复制过程中引物和模板的错配【i 。早前，通过模拟生物内的 扩增策略，n i e l s o n 等人成功的将耐热的s s b 蛋自引入到了p c r 体系中，提高 了p c r 的特异性和忠实性【4 2 删。 山东师范大学硕士学位论文 2 0 0 5 年，李敏等人】研究了1 3n m 的金纳米粒子对p c r 体系效率的影响。 实验结果表明，金纳米粒子能使p c r 体系的产量提高1 0 4 1 0 6 倍，反应时阃越 短，金纳米粒子对p c r 体系产量的提高就越明显。而且，相同量的金纳米粒子 对不同升降温速度的p c r 体系的影响不同。与不加金纳米粒子的p c r 体系相 比，金纳米粒子对升，降温速度为2 0 ，s 的实时p c r 产量的提高可高达l0 4 倍， 而对升，降温速度为2 ，s 的普通p c r 体系，金纳米粒子对其产量的提高只有 5 1 0 倍，p c r 体系的热循环越快，余纳米粒子对p c r 产量的提高就越大。1 3n m 的金纳米粒子对p c r 体系效率的影响。实验结果表明，金纳米粒子能使p c r 体系的产量提高1 0 4 1 0 6 倍反应时间越短，金纳米粒子对p c r 体系产量的提 高就越明显。 对这一反应的作用机制，李敏等人认为金具有良好的热传导性，改善了快 速升降温p c r 体系的热传导性，有利于模板与引物更高效的配对，从而提高了 p c r 的产量，优化了p c r 体系。 2 0 0 8 年，休斯顿大学的w i l l s o n 课题组【4 ”发现金纳米粒子的作用不是增加 p c r 的特异性，而是促进小片段产物的扩增，抑制大片段产物的产生。不论这 个小片段产物是特异性产物还是非特异性产物。 ：? ：i o ：+ ：i ，警：i 篡+ ：l 、嚣鼍：l 。r i * + ： 暑：= 二一二；二。一= 一= = 图i o 金纳米对产物尺寸的影响。在p c r 体系中，在有金纳米和没有金纳米两种条r 门f 对六个l a m l x l a 引物进行检测( 一个正向引物和两个逆向引物，这两个逆向引物其中之一包 含有错配) 。在有金纳米存在的情况下只有较小尺寸的产物被扩增，与特异性无关。第2 4 泳道加入了0 4 5 a m 金纳米粒子第6 ，8 ，1 0 ，1 2 加 了0 9 n m 的金纳米。 w i l l s o n 认为金纳米粒子的这种有利于小片段扩增的作用是通过金与聚合酶 的非特异性结合来实现的。他们将牛血清蛋白( b s a ) 加入到p c r 体系中。结 果发现，加入牛血清蛋白( b s a ) 能抵消金纳米粒子的作用，因为b s a 将t a q 山东师范大学硕士学位论文 聚合酶从金表面置换了下来。减少聚合酶浓度能得到与加入金纳米粒子相同的 效果，可以更有利于小片段产物产生抑制大片段产物的产生，而增加聚合酶浓 度又可以抵消金纳米粒子的这种作用。增加模板或者引物的浓度不能抵消金纳 米粒子的这种作用。这些都表明聚合酶与金纳米之间发生了反应，表面化学作 用起决定作用。 纳米金还可以优化p c r 的扩增策略。2 0 0 7 年，潘加奎】等人研究了基于 纳米金的多轮扩增。实验发现由于纳米金可以抑制p c r 的非特异扩增，因此可 以将p c r 的有效扩增极限推到第7 轮，即使在第6 轮扩增中也能得到单一明亮 的目标条带。而在常规p c r 多轮扩增中，无论对d n a 模板稀释多少倍，有效 扩增只能进行到第三轮，且随着扩增数的增加，目标产物的量也呈下降趋势。 纳米金辅助的p c r 再扩增和多轮扩增在一定程度上可取代巢式p c r ，避免了巢 式p c r 需要设计两对引物的繁琐。实验还发现表面修饰了b p s 、茎环d n a 以 及t r i t o n 1 0 0 的金纳米粒子，虽然表面性质发生了改变，但是仍然能提高p c r 的特异性和产量。 对于金纳米粒子与p c r 各参数的相互作用，2 0 0 5 年，沈鹤柏【4 7 , 4 8 】等人研究了 引物共价键合到金纳米粒子表面的p c r 。实验结果表明，一条引物( 上游引物或 者下游引物) 或者两条引物连接到金纳米粒子上，在一定范围内，退火温度对p c r 体系几乎没有影响，p c r 特异性均较好。 2 0 0 7 年，米丽娟【4 9 】等人对p c r 体系中纳米金与d n a 聚合酶的相互作用机 制进行了研究。结果表明过量的纳米金之所以会抑制p c r 扩增，是因为纳米金 与聚合酶发生了相互作用，如果提高聚合酶用量，可有效消除金纳米粒子的这种 抑制作用。在p c r 体系中，纳米金通过与游离的d n a 聚合酶的可逆结合，动 态调节聚合酶的浓度，进而影响p c r 的扩增结果。但是这一机理仅从纳米金与 聚合酶的相互作用出发，考虑到p c r 体系的复杂性，纳米金还有可能与模板、 引物等发生了复杂的相互作用。更为确切的调控机制还有待于进一步的研究。 2 银、铂对p c r 体系的影响。 2 0 0 7 年，上海交通大学的陈浩【5 0 】等人利用贵金属纳米粒子的催化性能，通 过改变d n a 模板量、退火温度，探讨了银、铂纳米粒子对p c r 扩增体系的影 响。试验结果表明，银纳米粒子对l a m b d a d n a 小片段的p c r 扩增影响不大， 1 0 山东师范大学硕士学位论文 而铂纳米粒子对l a m b d a - d n a 小片段的p c r 扩增有一定的影响。铂纳米粒子浓 度较低时，能促进p c r 的反应效率；而铂纳米粒子浓度较高时，会抑制p c r 的反应。而且铂纳米粒子对大片段的p c d n a c 5 4 9 a g ( d n a 片段为2 5 0 0b p ) p c r 扩增也有有促进作用，而且这种促进作用必须在一定的模板范围内才会明显。 同时，试验发现铂纳米粒子在浓度较高时对p c r 的作用相对较弱，因此铂纳米 粒子的浓度只有在一定范围内才能对p c r 扩增起到优化作用。而且银、铂纳米 粒子不能取代p c r 体系中m 9 2 + 的作用，在没有m 9 2 + 存在时，不能使p c r 反应 正常进行。 目前，对于铂纳米粒子催化p c r 扩增反应，其作用可能有两方面：一方面 是由于金属铂有较强的配位能力，它容易与碱基a 、t 、c 、g 中含有的氮原子 配位，所以p c r 反应体系中的4 种不同脱氧核苷三磷酸( d n t p ) 、引物、单链 d n a 都可以与铂纳米粒子配位结合，吸附在纳米粒子表面富集，促使p c r 反 应形成双链d n a ；另一方面，由于双链d n a 中的碱基以氢键相连，使得双链 d n a 与铂纳米粒子的结合变弱，而制备的铂纳米粒子表面含有柠檬酸根离子， 纳米粒子是带负电的，对负电较强的双链d n a 产生排斥作用，阻止了的刚性 较强的双链d n a 分子与铂纳米粒子吸附，生成的d n a 产物离开铂纳米粒子， 铂纳米粒子又可以进行下一轮的催化。但是催化机理有待于进一步的研究。 ( 二) 磁性纳米粒子对p c r 体系的影响 2 0 0 5 年，沈何柏 4 7 , 5 1 1 等人研究了将引物共价键合到s i 0 2 包覆的y f e 2 0 3 磁 性纳米粒子表面的p c r 。实验结果表明，引物连接到y - f e 2 0 3 磁性纳米粒子表 面，在合适的条件下，p c r 反应能顺利进行。当一条引物( 上游引物或下游引 物) 连接在y - f e 2 0 3 磁性纳米粒子表面，而另一条引物( 下游引物或上游引物) 没有连接时，p c r 几乎不受退火温度的影响；但当两条引物都连接在y - f e z 0 3 磁性纳米粒子表面时，p c r 受退火温度的影响较大，在一定温度范围内，退火 温度越高，p c r 产物特异性越好。 本实验还将引物共价键合到p a m a m 分子的表面上，进行p c r 反应。电泳 结果表明，连接在p a m a m 分子表面的引物，在合适的条件下，也能够进行p c r 。 ( 三) 纳米碳对p c r 体系的影响 1 纳米碳管对p c r 体系的影响。 山东师范大学硕士学位论文 2 0 0 4 年，高华健等人【5 2 】发现单壁碳纳米管( s w n t s ) 能对p c r 产生积极 的影响。当s w n t s 浓度小于3 l 咖l 时，能增加p c r 扩增的产量；而当s w n t s 浓度大于3p g g l 时，又会抑制p c r 反应。此外，s w n t s 还可以一定程度地 模拟p c r 缓冲液中m 孑+ 的重要作用。当p c r 反应液中没有m g + 时，加入 s w n t s 能收到与m 9 2 + 存在时相似的效果，p c r 的产量没有太大的差别，都是 在s w n t s 浓度为3g g p l 时得到最大产量。 为了探求实验的机理，高华健等人将s w c n t s 分别与d n a ，t a q 酶进行 了孵育，结果发现这些反应成分聚集在s w c n t s 周围，能更好的接触而发生反 应，因而能提高p c r 的效率，增加p c r 反应的产量。当s w n t s 浓度过高时， 因其对p c r 反应成分的过多连接而破坏了d n a 、t a g 酶以及引物的反应条件， 从而抑制了p c r 反应。而且通过x 射线电子光谱图分析发现，在p c r 反应后， s w c n t s 的结合能增加，说明其与d n a 模板、t a q 聚合酶发生了强烈的反应， s w c n t s 与p c r 各反应成分发生了电子转移，充当了电子受体和聚合酶的稳 定剂。 2 纳米碳粉对p c r 体系的影响。 2 0 0 7 年，z h a n g 5 3 】等人将纳米碳粉( c n p ) 的水悬浮溶液用于p c r 体系中， 提高了p c r 的扩增效率，但同时也在一定程度上降低了p c r 的产量。在没有 碳纳米粉( c n p ) 的情况下，第四轮扩增就开始出现非特异性条带，第五和第 六轮扩增，出现了明显的拖尾条带，几乎没有目标条带；而加入了一定量的纳 米碳粉悬浮液后，即使到了第六轮扩增，我们也能得到单一的目标条带。而且 c n p 的浓度要在一定的范围内。 在长片段p c r 中，增加c n p 的浓度能显著减少这种严重的拖尾现象，使 特异性条带逐渐消失。 原子能显微镜方法说明c n p 与双链d n a 之间存在潜在的结合力，可能部分 阻止引物与d n a 模板之间的错配，还可能阻止没有完全配对的d n a 链形成二 聚体，而且这种结合力的强度比纳米碳管，金与d n a 的结合力要大，这种高 结合力可能可以解释为什么高浓度的c n p 会阻碍p c r 的反应。纳米碳粉对p c r 有这样的影响，有可能是纳米碳与d n a 发生作用，也有可能是与d n a 聚合酶 发生了作用。 3 富勒烯( c 6 0 ) 对p c r 反应的抑制作用 1 2 山东师范大学硕士学位论文 2 0 0 8 年，张捷等人【5 4 研究了富勒烯( c ) 对p c r 的影响。实验结果表明，随着 c 涨度的增加，p c r j 广增被显著抑制。c 一方面会抑f l i i j d n a 聚合酶的活性，且 浓度越高，抑制作用越大，另一方面又会损伤d n a 单链模板降低d n a 单链模板 起始浓度，从而造成p c r 产物量的降低。增加p c r 反应体系中d n a 聚台酶的量， 可消除c 6 0 的抑制作用，但增加起始单链d n a 模板的数量，不能消除c 的抑制作 用。张捷等人认为反应机理是c 6 0 与d n a 聚合酶的酶活性位点发生了相互作用。 导致d n a 聚合酶活性降低，同时c m 还会结合到d 1 q a 单链模板上，干扰引物、底 物与模板之间的精确配对，另外，c 6 0 可在p c r 实验条件下活化生成多种活性氧或 自由基，进而造成d n a 聚合酶构象的改变以及d n a 模板的损伤( 降解) ，从而最 终抑制t p c r 反应的进行。 ( 四) 半导体纳米材料对p c r 体系的影响 n i e 等人5 8 又发现另一种纳米材料，表面带氨基的四足状s i 0 2 包的z n o 纳 米结构对p c r 有积极的作用，能增加p c r 扩增的产量。四足状由s i 0 2 包的z n o ， 当其表面有氨基修饰，浓度由00 1u g u l 逐渐增大到0 5u g u l 时，p c r 产物的 量不断增多，但是如果纳米结构的量再多，p c r 产物的量不再增加。当表面没 有氨基修饰，z n o 的浓度 00 6u g u l 时，p c r 产物的量变化不大，当z n o 的量 ) o 1 2u u l 时，p c r 产物的量减少。 1 1 22i；o2 50 0 60 们oo l o 凹1 - 3 ( a ) p c r 体系中加入表面不带氨基的四足状由s i 岛包的z n o 纳米结构后的电泳图。 8 泳道是对照( 没有加入纳米结构) ( b ) p c r 体系中加入表面带氨基的四足状由s i 0 2 包的 z n o 纳米结构后的电泳图。8 泳道是对照( 投有加入纳米结构) 。 2 0 0 9 年，徐传来等人”考察了表面修饰了羧基的c d t e 量子点对p c r 体系 特异性的影响。实验结果表明，在不同的退火温度下c d t e 量子点能提高p c r 体系的特异性，而且在扩增短片段时量子点对p c r 体系特异性的提高比扩增长 山东师范大学硕士学位论文 片段提高的更明显，同时，量子点不能提高p c r 的效率。c d t e 量子点可以做