（法医学专业论文）大鼠血浆中灭多威的分析及其代谢物的质谱研究.pdf

中文论著摘要 大鼠血浆中灭多威的分析及其代谢物的质谱研究 目的 本文建立了血浆中灭多威的固相萃取高效液相色谱( s p e h p l c ) 快速定性定 量分析方法，并利用固相萃取高效液相色谱质谱( s p e h p l c m s ) 法对大鼠血浆 中的灭多威及其代谢物进行了研究。 方法 以空白大鼠血浆添加灭多威标准品及内标物安定标准品对血浆样品的前处理 方法、仪器测试条件、特异性、回收率、灵敏度、精密度、准确度、线性关系、 稳定性进行全面考察，建立血浆中灭多威的s p e h p l c 快速定性定量分析方法； h p l c m s 法在大鼠血浆中检出了灭多威及其代谢物。 采用h p l c 法：测定不同时间点大鼠血浆中灭多威的药物浓度。按照灭多威 5 m g k g 给雄性大鼠灌胃后，收集0 3 3 h ，0 6 7 h ，l h ，2 h ，3 h ，5 h ，7 h ，9h ，l l h ， 1 3 h ，1 5 h ，1 7 h ，1 9 h ，2 1 h ，2 3 h 的大鼠血浆，s p e h p l c 法测定血浆中灭多威， 并对2 4 h 内大鼠血浆中灭多威浓度的变化规律进行了描述；模拟法医鉴定，按照 灭多威5 0 m g k g 给雄性大鼠灌胃后，将大鼠尸体室温存放7 2 h ，取心血，s p e h p l c 法检测大鼠血浆中灭多威的含量；色谱柱：k r o m a s i lc 1 8 柱( 4 6 m mi d x 2 5 0 m m ， 靴m 粒径) ；流动相：甲醇：水= 4 0 ：6 0 ( v v ) ；检测波长：2 3 5 n m ；安定作为内标。 采用h p l c m s 法：分析大鼠血浆中灭多威及其代谢物。模拟法医鉴定，按 照灭多威5 0 m g k g 给雄性大鼠灌胃后，将大鼠尸体室温存放7 2 h ，取心血， s p e h p l c - m s 法检测大鼠血浆中的灭多威及其代谢物。色谱柱：x t e r r ac 。柱 ( 2 1 m mi d x 1 5 0 m m ，靴m 粒径) ；流动相：甲醇：水= 1 5 ：8 5 ( v v ) ；检测波长： 2 3 5 n m ：质谱：采用电喷雾电离方式( e s l + ) ，毛细管电压：3 0 k v ；离子源温度： 11 0 ：干燥气温度：3 0 0 ；干燥气流速：4 5 0 i h ；扫描范围：5 0 - - 一3 0 0 m z 。 结果 s p e h p l c 法测得灭多威在血浆中的线性范围是0 1 t g m l 2 0 k t g m l ( r = 0 9 9 9 3 ，p 0 0 0 1 ) ，血浆中的检测限是0 0 3 k t g m l ( s n = 3 ) ，日内、日间精密度的r s d 值 分别在8 3 3 与1 1 1 1 以内，日内、日间准确度值分别在9 0 与1 2 0 之间，回 收率值在8 8 4 4 以上；并且在灌服大量的灭多威引起中毒死亡7 2 h 后的大鼠 血浆中仍能检测到灭多威。 s p e h p l c m s 法发现，给药后的大鼠血浆中，除灭多威原体外，还有一种代 谢物，并测得其准分子离子峰及其各级碎片离子，经与对照品比较及质谱断裂规 律推断灭多威在大鼠血浆中的代谢产物为s 甲基n 羟基硫代乙酰亚胺酯。 结论 所建立的分析方法可靠、实用、便捷，可对血浆中的灭多威进行定性定量地 快速测定，并且可检出其代谢物，为灭多威中毒的法医鉴定及临床检验进一步提 供了参考。 关键词 法医毒物分析；灭多威；血浆；固相萃取( s p e ) ；高效液相色谱( h p l c ) ；质 谱( m s ) 2 英文论著摘要 a n a l y s i so fm e t h o m y li nr a tp l a s m aa n ds t u d yo n d e t e c t i o no fi t sm e t a b o l i t eb ym a s s o b j e c t i v e f o rt h ep u r p o s eo fm o r ea c c u r a t ea n dr a p i da n a l y s i so fm e t h o m y li n p l a s m a ，a s o l i d p h a s ee x t r a c t i o n 。r e v e r s e d p h a s eh i g hp e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y ( s p e h p l c ) m e t h o dw a sd e v e l o p e da n dt h eh i g hp e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y - m a s s ( h p l c - m s ) m e t h o dw a su s e di nt h ed e t e c t i o no fm e t h o m y la n di t s m e t a b o l i t ei nr a tp l a s m a m e t h o d s t h es a m p l ep r e t r e a t m e n tm e t h o d ，t h et e s tc o n d i t i o n s ，t h el i n e a r r a n g e ，t h e s e n s i t i v i t y ，t h es p e c i f i c i t y , t h ep r e c i s i o n ，t h ea c c u r a c y ，t h es t a b i l i t ya n dt h er e c o v e r i e s f o rt h ep l a s m aw e r ei n v e s t i g a t e db yu s i n gr a tp l a s m as p i k e dw i t hs t a n d a r dm e t h o m y l a n di n t e r n a ls t a n d a r ds u b s t a n c e ，a n daa c c u r a t ea n dr a p i ds p e h p l cm e t h o dw a s d e v e l o p e di n t h ef i n a l ；m e t h o m y la n di t sm e t a b o l i t ew e r ed e t e r m i n a t e di nt h er a t p l a s m ab ys p e h p l c m s a f t e rt h ei n t r a g a s t r i ca d m i n i s t r a t i o nw i t hm e t h o m y lb y5 m g k g ，t h er a tp l a s m a w a sc o l l e c t e da t0 3 3 h ，0 6 7 h ，l h ，2 h ，3 h ，5 h ，7 h ，9 h ，1 1 h ，1 3 h ，1 5 h ，1 7 h ，1 9 h ，2 1 h ，2 3 h ， m e t h o m y lw a sd e t e r m i n a t e di n t h er a tp l a s m ab ys p e h p l c ；i nt h es i m u l a t e d m e d i c o l e g a li n v e s t i g a t i o n ，a f t e rt h ei n t r a g a s t r i ca d m i n i s t r a t i o nw i t hm e t h o m y lb y 5 0 m g k g ，a l lt h er a t sw e r ec a u s e dd e a d ，t h ec a r c a s e so fr a t sw e r ek e p tf o r7 2h o u r si n r o o mt e m p e r a t u r e ，t h e nt h eh e a r t b l o o dw a sg e ta n d m e t h o m y lw a sd e t e r m i n a t e di nt h e r a t p l a s m ab ys p e - h p l c ；t h ea s s a yw a sc o n d u c t e do nt h ek r o m a s i lc1 8 ( 4 6 m m i d x 2 5 0 m m ，靴m ) c o l u m nw i t hm e t h a n o l - w a t e r ( 4 0 ：6 0 ) a st h em o b i l ep h a s e t h e d e t e c t i o nw a v el e n g t hw a ss e ta t2 3 5 n ma n dt h ed i a z e p a mw a st a k e na st h ei n t e r n a l s t a n d a r d i nt h es i m u l a t e dm e d i c o l e g a li n v e s t i g a t i o n ，a f t e rt h ei n t r a g a s t r i ca d m i n i s t r a t i o n w i t hm e t h o m y lb y5 0 m g k g ，a l lt h er a t sw e r ec a u s e dd e a d ，t h ec a r c a s e sw e r e k e p tf o r7 2 3 h o u r si nr o o mt e m p e r a t u r e ，t h e nt h eh e a r t b l o o dw a sg e t ，m e t h o m y la n di t sm e t a b o l i t e w e r ed e t e r m i n a t e di nt h er a tp l a s m ab ys p e - h p l c m s ；t h ea s s a yw a sc o n d u c t e do n t h ex t e r r ac 1 8 ( 2 1 m mi d x 1 5 0 m m ，靴m ) c o l u m nw i t hm e t h a n o l w a t e r ( 1 5 ：8 5 ) a st h e m o b i l ep h a s e t h ed e t e c t i o nw a v el e n g t hw a ss e ta t2 3 5 n m am a s ss p e c t r o m e t e r e q u p i e dw i t he l e c t r o s p r a yi o n i z a t i o ns o u r c ei nt h ep o s i t i v em o d ew a su s e dw i t ha n 2f l o wr a t eo f4 5 0 l h ，an2t e m p e r a t u r eo f3 0 0 c ，a ni o ns o u r c et e m p e r a t u r eo f 11 0 。c ，a ne s in e e d l ev o l t a g eo f3 0 k v ，as c a nr a n g eo f5 0 - 3 0 0m z r e s u l t s t h el i n e a r r a n g e w a s0 1 9 9 m l - 2 0 p e d m l ( r = 0 9 9 9 3 , p 0 0 0 1 ) ，t h e l i m i to f d e t e c t i o nw a s0 o 靴g m l ( s n = 3 ) t h ei n t r aa n di n t e r d a yp r e c i s i o n so fa s s a yf o r m e t h o m y lw e r el e s st h a n8 3 3 a n d1 1 1 1 i nb l o o dr e s p e c t i v e l y t h ei n t r aa n d i n t e r - d a ya c c u r a c yo fa s s a yf o rm e t h o m y lw e r eb e t w e e n9 0 a n d1 2 0 i nb l o o d r e s p e c t i v e l y t h er e c o v e r yf o rm e t h o m y lw a sm o t et h a n8 8 4 4 i np l a s m a i nt h e s i m u l a t e dm e d i c o l e g a li n v e s t i g a t i o n ，m e t h o m y la n di t sm e t a b o l i t ew e r ef o u n di nr a t p l a s m aa t7 2h o u r so fp o i s o n i n gw i t hm e t h o m y l t h em e t a b o l i t ew a si d e n t i f i e da s s - m e t h y l n - h y d r o x y t h i o a c e t a m i d a t e c o n c l u s i o n t h em e t h o df o rq u a n t i t a t i v ea n dq u a l i t a t i o na n a l y s i so fm e t h o m y li s r a p i d ， a c c u r a t ea n dt h em e t a b o l i t ew a si d e n t i f i e d ，w h i c hi ss u i t a b l ef o rt h ei d e n t i f i c a t i o no f m e t h o m y li n t h ec a s e sw i t hs u s p e c t e dm e t h o m y lp o i s o n i n gi nm e d i c a la n df o r e n s i c s c i e n c e k e y w o r d s f o r e n s i ct o x i c o l o g i c a la n a l y s i s ；m e t h o m y l ；p l a s m a ；s p e ( s o l i dp h a s ee x t r a c t i o n ) ； h p l c ( h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ) ；m s ( m a s s ) 4 英文缩略语 英文缩写英文全称中文全称 l d 5 0 l o d q c s d r s d h p l c s p e m s i s 5 0 d e a dl i n e l i m i to fd e t e c t i o n q u a l i t yc o n t r o l s t a n d a r dd e v i a t i o n r e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n 半数致死量 检测限 质量控制 标准偏差 相对标准偏差 h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y 高效液相色谱法 s o l i dp h a s ee x t r a c t i o n m a s s i n t e r n a ls t a n d a r d 5 固相萃取法 质谱法 内标 中国医科大学研究生学位论文独创性声明 本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论 文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或 其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研 究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 论文作者签名：鲻垄三日期：丝仝：全：罗 中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在 攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离 校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师 为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学 校可以公布学位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) ，以采用影印、缩 印或其他手段保存论文。 论文作者签名： 指导教师签名： 日 期： 论文 大鼠血浆中灭多威的分析及其代谢物的质谱研究 s 丫n 认s 丫n 、 6 材料与方法 一、实验动物与分组 雄性w i s t a r 大鼠，体重2 0 0 只2 2 0 只，共4 5 只( 中国医科大学动物部) 。 随机均分为9 组，并编号为l 组9 组，所有大鼠在灌胃前，均空腹1 2 h 。 二、药品与试剂 灭多威( 沈阳化工研究院全国农药标准化中心，含量：9 9 7 ) ，安定( 中国药品 生物制品检定所，含量：9 9 8 ) ；甲醇( h p i x z 级) ，乙腈( h p l c 级) ，乙酸乙酯( a r ) ， 二氯甲烷( a r ) ，醋酸铵溶液( 0 1 m o l m l ，p h 6 8 - - - 7 0 含有2 的n a f ) ，n a f ( 9 8 5 ) ， 肝素( 1 5 0 u m g ) ，超纯水。 三、实验仪器 s s iw a 2 0 0 2 s f 高效液相色谱仪( 美国s s i 公司) ，l a b a l l i a n c e 色谱工作站( 天津 l a b a l l i a n c e 公司) ，m o d e l5 2 5 紫外检测器( 美国s s i 公司) ，s e p p a kc 1 8 固相萃取微 柱( 美国w a t e r s 公司) ，t h e r m of i n n i g a nl c qa d v a n c e d 离子阱质谱仪( 配有 a g i l e n t1 1 0 0s e r i e s 高效液相色谱系统) ；h s 1 2 0 0 d 型超声波清洗机( 上海新芝生物 技术研究所1 ；上海t g l - 1 6 g 台式高速离心机。 四、给药及取样方法 参照l d 【1 7 1 灌胃：用号灌胃溶液( 5 m g k g ) 给第1 组8 组大鼠灌胃；用 号灌胃溶液( 5 0 m g k g ) 给第9 组大鼠灌胃：第1 组8 组的血浆样品分别在大鼠灌 胃前o h 和灌胃后第0 3 3 h ，0 6 7 h ，l h ，2 h ，3 h ，5 h ，7 h ，9 h ，1 1 h ，1 3 h ，1 5 h ， 1 7 h ，1 9 h ，2 1 h ，2 3 h 获取；第9 组的血浆样品在大鼠灌胃前0 h 和灌胃致死后第 7 2 h 获取；第1 组8 组血均取尾静脉血，第9 组血均取心血，迅速放入试管内， 2 0 冷冻。 五、实验方法 ( 一) 溶液配制 1 、灭多威系列标准品溶液：准确配制浓度分别为l p g m l 、2 比g m l 、5 p g m l 、 ：0 # g m l 、2 0 p g m l 、5 0 p g m l 、1 0 0 # g m l 、2 0 0 # g m i 的灭多威甲醇溶液储存于4 c 7 备用。 2 、内标物溶液：准确配制浓度为2 0 比g m l 的安定甲醇溶液储存于4 c 备用。 3 、号灌胃溶液：准确配制浓度为l m g m l 的灭多威水溶液储存于4 备用。 4 、号灌胃溶液：准确配制浓度为1 0 m g m l 的灭多威水溶液储存于4 c 备用。 ( 二) h p l c 条件 色谱柱：k r o m a s i lc 1 8 柱( 4 6 m mi d x 2 5 0 m m ，靴m 粒径) ；保护柱：a l l t e c hc 1 8 ( 4 6 m mi d x 2 0 m m ，跏m 粒径) ；流动相：甲醇：水= 4 0 ：6 0 ( v ，) ；检测波长： 2 3 5 n m ；流速：l m l m i m 进样量：1 吮l ；柱温：3 5 。 ( 三) h p l c m s 条件 色谱柱：x t e r r ac 1 8 柱( 2 1 m mi d x 1 5 0 m m ，靴m 粒径) ，保护柱：x t e r r ac 1 8 柱 ( 2 1 m mi d x 1 0 m m ，靴m 粒径) ；流动相：甲醇：水= 1 5 ：8 5 ( v v ) , 检测波长：2 3 5 n m ； 流速；l m l m i n 进样量：1 0 , t l ：柱温：2 5 c 。采用电喷雾电离方式( e s i + ) ，毛细 管电压：3 0k v ；离子源温度：1 1 0 ；干燥气温度：3 0 0 。c ；干燥气流速：4 5 0 m ； 雾化气压力：0 2 8 m p a ；扫描范围：5 0 - - - 3 0 0 m z 。采用全扫描一级质谱及选择离子 二级质谱和全扫描三级质谱方式进行检测。 ( 四) 血浆样品前处理 s e p - p a kc 。8 固相萃取微柱的活化：按2 m l 乙腈、2 m l 乙腈水溶液【乙腈：水= 1 - 1 ( v v ) 】及2 m l 水的顺序进行反向浸湿活化。 取0 1 m l 血浆样品，加入甲醇及内标物溶液各1 吮l ，加入l m l 醋酸铵溶液， 涡旋l m i n 后，1 60 0 0 r m i n 离心2 0 m i n ，取上清，将样品注入到已活化好的微柱内， 流速不大于2 m l m i n ，再用乙酸乙酯3 m l 洗脱微柱，收集洗脱液，于室温中放置， 自然挥干，残留物用1 0 毗l 甲醇溶解，取1 毗l 进样。 ( 五) 分析方法确证 1 、方法专属性 专属性( s e l e c t i v i t y ) ：是指样品中存在干扰成份的情况下，分析方法能够准确、 专一地测定待测物的能力。 取5 份宅白血浆各o 1 m l ，不加内标物溶液，按血浆样品自仃处理方式处理后， 8 进样1 毗i 检测，色谱图见图4 ；再将1 毗l 且浓度为2 0 0 嵋r n l 的灭多威标准溶液 加入到5 份0 1 m l 空白血浆中，按血浆样品前处理方式处理后，进样1 吮l 检测， 色谱图见图5 ；取大鼠灌胃后0 6 7 h 的血浆样品，按血浆样品前处理方式处理后， 进样1 叽l 检测，色谱图见图6 ；由色谱图可见，血浆中内源性杂质对检测没有干 扰。灭多威和安定的保留时间分别为4 8 m i n 和5 4 m i n ，全程测量时间约1 0 m i n 。 2 、标准曲线、线性范围和检测限 标准曲线( c a l i b r a t i o nc u r v e ) ：反映了所测物质的浓度与仪器响应值之间的关 系，一般用回归分析法( 如加权最d - 乘法) 所得的回归方程来评价。标准曲线的高 低浓度范围为线性范围，在线性范围内浓度测定结果应可以达到实验要求的精密 度和准确度，不允许将线性范围外推求算未知样品的浓度。检测限( l i m i to f d e t e c t i o n ，l o d ) ：也称灵敏度，表示测定样品中符合准确度和精密度要求的最低 药物浓度。 取0 1 m l 空白血浆8 份，分别置于试管中，加入1 毗l 灭多威系列标准品溶液， 并加入1 跏l 内标物溶液，配制成浓度为o 1 g m l 、0 2 z g m l 、0 5 比g m l 、1 卫g m l 、 2 p g m l 、5 比g m l 、l o 堪g m l 、2 0 i g m l 的标准灭多威血浆样品，按血浆样品前处理 方式处理后，以灭多威峰浓度( x ) 为横坐标，以灭多威与内标物峰面积比值为 纵坐标，用加权( w = l x2 ) 最d , - 乘法进行回归分析，绘制标准曲线。得到血浆样 品中灭多威浓度的回归方程，即y = i 6 5 1 + 4 6 0 9 x ，其r = 0 9 9 93 ，p o 0 0 1 ，线性 范围为o 1 m l 2 雌g m l ，检测限为0 0 3 m g m l 。典型标准曲线见图2 。 3 、方法精密度与准确度 精密度( p r e c i s i o n ) ：是指在确定的分析条件下，相同介质中相同浓度样品的一 系列测量值的分散程度，通常用质量控$ i j ( q u a l i t yc o n t r o l ，q c ) 样品的日内和日间 的相对标准差( r e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n ，r s d ) 来考察，一般r s d 1 5 ，在l o q 附近r s d 2 0 。准确度( a c c u r a c y ) ：是指在确定的分析条件下，测得的生物样品 浓度与真实浓度的接近程度，即q c 样品的实测浓度与真实浓度的偏差，由重复 测定己知浓度分析样品可获得，一般应在8 5 1 1 5 范围内，在l o d 附近应在 8 0 1 2 0 范围内。 配制浓度为0 1 9 9 m l ，2 z g m l ，2 0 _ g m l 的3 个标准灭多威血浆样品，按血浆 9 样品前处理方式处理后，分别于同一同内5 个不同时i h j 点及不同日内连续测定5 日，由测得浓度计算标准偏差( s d ) 、相对标准偏差( r s d ) 、准确度( a c c u r a c y ) ，获 得日内、日间精密度值及同内、日间准确度值，各次测量结果的r s d 值分别在 8 3 3 与1 1 1 1 以内，各次测量结果的准确度值分别在9 0 与1 2 0 之间( 见表1 ) 。 4 、血浆样品的提取回收率 提取回收率( r e c o v e r y ) ：从生物样本基质中回收得到的分析物的响应值除以纯 标准品产生的响应值即为分析物的提取回收率，也可以说是将供试生物样品中分 析物提取出来分析的比例，应考察高、中、低3 个浓度的提取回收率，其结果应 该精密可重现。 配制浓度为o 1 p g m l ，2 比g m l ，2 0 , u g m l 的3 个标准灭多威血浆样品，按血浆 样品前处理方式处理后，分别测试( n = 5 ) ，获得相应峰面积s 。；同时另取1 叻l 的3 个相同浓度的灭多威标准溶液，用甲醇稀释至1 0 吮l 后，分别测试( n - 5 ) ，获得相 应峰面积s 2 。以同一浓度两种处理方法的峰面积比值( s 。s ：x 1 0 0 ) 计算提取回收 率。经计算，灭多威在皿浆样品中的回收率在8 8 + 4 4 与9 2 2 9 之间l 见表 2 ) ，回收率符合定量分析的要求，测定方法可靠。 5 、血浆样品的稳定性 稳定性( s t a b i l i t y ) ：根据具体情况，对含药生物样品在室温、冰冻或冻融条件 下以及不同存放时间进行浓度考察，以确定生物样品的存放条件和时间，同时还 应考察储备液以及样品处理后的溶液中分析物的浓度，以保证检测结果的准确性 和重现性。 取o 1 m l 空白血浆，配制浓度分别为0 1 , u g m l 、2 p g m l 、2 0 p g m l 的标准血浆 样品，2 0 冷冻，样品经3 次反复冻融实验后，按血浆样品前处理方式处理后， 测定( n = 5 ) ，结果表明浓度没有明显改变( r s d 1 0 ) 。另配制相同的血浆样品，分 别于室温放置2 4 h ( n = 5 ) 和4 8 h ( n = 5 ) ，按血浆样品前处理方式处理后，测定，其浓 度无明显改变( r s d 肺 肾 心 脑。氨基甲酸酯类农药 的代谢与排泄迅速，一般在体内无蓄积，在体内的代谢形式主要有氧化、水解、 结合三种。动物经口服给药后，脏器内含量在1 5 m i n 左右达到高峰，4 h 后几乎测 不出，在2 4 小时内即以解毒产物葡萄糖醛酸酯的形式排出摄入量的7 0 - - 一9 0 ， 主要经尿液排出。在氨基甲酸酯进入机体后以其整个分子形式与胆碱酯酶结合， 使乙酰胆碱酯酶活性中心一卜的丝氨酸的羟基被氨基甲酰化，从而阻止了乙酰胆碱 2 0 与月日碱酯酶的结合，由于胆碱酯酶失去了酶解乙酰胆碱的能力而致乙酰胆碱在体 内蓄积而中毒1 。 在水、土壤、水果、蔬菜以及其它农作物方面，已经建立了很多氨基甲酸酯 类农药的检测方法p 。本文将着重介绍s p e h p l c 法对氨基甲酸酯类农药的分析 的应用及进展，并对现有的各种检测方法做简单回顾，并与s p e h p l c 法相比较， 指出s p e h p l c 法在氨基甲酸酯类农药分析中的应用优势及意义。 二、氨基甲酸酯类农药的前处理方法 目前对于氨基甲酸酯类农药的生物检材的前处理方法主要有液液萃取法 ( l l e ) 、固相萃取法( s p e ) 、固相微萃取技术( s p m e ) 、超临界流体提取( s e e ) 、加速 溶剂萃取( a s e ) 、免疫亲和色谱技术( i a c ) 、基质固相分散萃取技术( m s p d e ) 、分 子印迹技术( m i t ) 等。 ( 一) 液液萃取法( l l e ) 最早使用的一种提取净化方法，利用待测农药与干扰杂质在2 种互不相溶的 溶剂中溶解度( 分配系数) 的差异而达到分离的目的，该方法不需要昂贵的设备和试 剂，方法简单，易于操作。但由于液液萃取法( l l e _ ) 有消耗溶剂量较大，易形成乳 状液，萃取后杂质较多、回收率低、耗费时间等缺点。m i c h e lm 【4 1 比较了液液萃 取法和固相萃取法并指出了液液萃取法的这一系列缺陷。 ( 二) 固相萃取法( s p e ) 近年来开发的并得到广泛应用的一种新技术，通过使样品在吸附剂与溶剂中 溶解度及功能团的相互作用最佳化来影响样品的滞留与洗脱，从而达到分离目的。 由于其具有操作简便快速、有机溶剂用量少、环境污染小等优点，在农药分析的 样品前处理中得到了广泛的应用。k u m a r y p l 利用s e p p a kc 1 8 固相萃取小柱对水 中残杀威的含量进行了检测，然后液相色谱测定，添加回收率为8 5 3 8 - 9 1 3 5 。 ( 三) 固相微萃取技术( s p m e ) 由加拿大w a t e r l o o 大学的p a w l i s z y n 等人于1 9 9 0 年提出的，在固相萃取的基 础发展起来的新方法。目前s p m e 萃取待测物可与气相色谱、液相色谱等分折分 离技术联用，适用于分析挥发性和难挥发性有机物。由于它是一种无溶剂萃取技 2 1 术，并具有操作时间短、样品用量少、重复性好、精密度高、检出限低等优点，在 农药分析中有很好的应用前景。g o n z a l e z r o d r i g u e z 等p 1 采用固相微萃取和低压气 相色谱质谱联用技术对不同种类牛奶中的4 0 多类农药残留和其代谢产物进行净 化和测定，回收率为8 0 - - 1 1 0 。但与固相萃取柱相比固相微萃取柱价格较贵不易 普及使用。 ( 四) 超临界流体提取( s f e ) 以超临界流体代替各种溶剂来提取样品中待测组分的方法。目前最常用的超 临界流体为c o ，其无毒，分子极性比较小，可用于提取非极性或弱极性农药残 留，同时也可以加入适量极性调节剂如甲醇等，可最大限度地提取不同极性的农 药残留而最低限度地减少杂质的提取。其具有提取效率高、速度快、节省大量的 有机溶剂、容易实现操作自动化等优点。该方法的缺点是所需的超零界流体需特 殊制备，故不如固相萃取法易行。e 1 s a e i dm h 等h 1 利用超临界流体对食品，水果， 蔬菜中的氨基甲酸酯类农药残留进行了测定。 ( 五) 加速溶剂萃取( a s e ) a s e 是一种全新的萃取方法，在较高的温度和压力下用有机溶剂萃取固体或 半固体样品的新颖的样品前处理方法。其突出的优点是有机溶剂用量少、快速、 回收率高，该法已被美国e p a ( 环保局) 选定为用于环境样品中杀虫剂污染物检测 的推荐的标准方法。该方法的缺点是必须在较高的温度和压力下才能进行，故也 不如固相萃取法易行。o k i h a s h im 刚等利用这一方法对食品中氨基甲酸酯类农药 进行了提取分离。 ( 六) 免疫亲和色谱技术( i a c l 一种将免疫反应与色谱分析相结合的分析方法，它是把抗体固定在适当的支 持物上，利用抗体与抗原或半抗原可逆的生物专一性相互作用来净化富集分析物。 该技术的关键是选择合适的支持物，合适的抗体和合适的淋洗缓冲液。它具有高 度的选择性的优点。r u l eg s 等p 1 建立了一种应用亲和柱净化，液相色谱测定生物 样品中呋喃丹含量的方法。目前，这项技术在国内外尚处于研究阶段。该方法的缺 点是技术不成熟、实验条件苛刻。 2 2 ( 七) 基质固相分散萃取技术( m s p d e ) 是将样品与适量的固体基质( 硅胶，弗罗里硅土，c 1 8 ，c 8 等) 研磨，使样品吸 附在固定基质上，混匀制成半固态作为填料装柱，然后选择合适的有机溶剂洗脱固 定相，将各种待测物洗脱下来。其优点样品提取、净化一步完成，不需要进行组 织匀浆、沉淀、离心、p h 调节和样品转移等操作步骤，适用于多残留分析，特别 适合于进行一类化合物的分离或单个化合物的分离。g a r c i n u r i or m 等1 0 1 利用硅胶 做为基质固相分散吸附剂，乙腈作为洗脱剂对杏仁中氨基甲酸酯类农药残留进行 提取净化，r p l c d a du v 测定，回收率7 6 8 5 。该方法效果较好，回收率与 固相萃取法相当。 ( 八) 分子印迹技术( m i t ) 分子印迹( m i t ) 是可用于制备合成受体的新技术，其原理是：首先使拟被印迹 的分子与聚合物单体结合，然后将聚合物单体交联，再将印迹分子从聚合物中提 取出来，聚合物内部就留下了印迹分子的印迹，该聚合物与含印迹分子样品相遇 时，对印迹分子具有较强的结合能力、较大的吸附容量，因此可用于样品的提取 净化。与传统方法相比，分子印迹技术可同时实现目的组分的分离与检测，选择 性高，适用范围广，因此应用十分广泛。分子印迹技术可以用于药物、农药、蛋 白质、氨基酸等各种化合物的分离工作。i m m e r 等1 1 1 利用分子印迹聚合物固相萃 取水样和土壤中农药，回收率为8 0 ，最低检测量0 0 5 - 一0 知g l 。但由于大多数 分子印迹聚合物只适合于非极性环境，而且需要合成被印迹分子衍生物，使该项 技术受到限制，故应用不如s p e 广泛。 三、氨基甲酸酯类农药的检测分析方法 目前对于氨基甲酸酯类农药的检测分析方法主要有薄层色谱法( t ic ) 、液相色 谱法( h p l c ) 、气相色谱法( g c ) 、气相色谱一质谱联用( g c m s ) 、超临界流体色谱 ( s f c ) 、柱切换高效液相技术( c s h p l c ) 、液相色谱质谱联用技术( l c m s ) 、毛细 管电泳( c e ) 和毛细管区带电泳( c z e ) 、免疫分析( 认) 、传感器技术( t r a n s d u c e r t e c h n o l o g y ) 等。 ( 一) 薄层色谱法( t h i n l a y e rc h r o m a t o g r a p h y ) 以固体吸附剂( 如硅胶、氧化铝等) 为载体，水为固定相溶剂，流动相一般为有 机溶剂所组合的分配型色谱分离分析方法。其不需要特殊设备，方法简单、快速、 直观，可同时分析多个样品，但灵敏度较低，近年来使用较少，现经常与其他技术联 用，对样品被分离的一种或多种成分进行定性定量分析。s w e t h av p 纠等在不同 的薄层色谱板上利用不同的溶剂对氨基甲酸酯类农药进行检测分离，获得了较高 的回收率。缺点是该方法不如液相色谱法灵敏度高。 ( 二) 液相色谱法( h p l c ) 是农药残留检测中不可缺少的重要方法，具有分离速度快、检测效率高、重 复性好的特点，主要分离检测极性强、相对分子质量大的离子型农药，尤其对不 易气化或受热易分解的农药更能显示出其突出优点。f a r a h a n ig h 1 3 1 等对土壤中的 呋喃丹经高效液相检测回收率，效果较好。 ( 三) 气相色谱法( g c ) g c 具有操作简便、分析速度快、分离效能高、灵敏度高、应用范围广及可以 同时分离分析多种组分等优点，广泛的用于相对分子量较小，易气化，气化后又 不发生分解的农药残留的分析，如有机氯、有机磷、拟除虫菊酯等。k u m a r ib 等 畔1 采用g c 测定了食物中氨基甲酸酯类农药的残留。该方法的缺点是对待分析组 分有限制条件。 ( 四) 气相色谱质谱联用法( c c m s ) 该方法既具有气相色谱高分离效能，又具有质谱准确鉴定化合物结构的特点， 可达到同时定性定量的检测目的。用于农药残留量检测工作，特别是应用于农药代 谢物、降解物的检测和多残留检测等具有突出的特点，适用于挥发和半挥发性有 机杀虫剂、除草剂等农药的残留分析，主要包括有机氯类、有机磷类、有机氮类、 氨基甲酸酯类等