（微生物学专业论文）真菌多糖复合制剂制备及抗衰老作用研究.pdf

摘要 摘要 真菌多糖是从真菌子实体、菌丝体、发酵液中分离出的活性多糖物质，是一类重要 的保健食品功能因子。复合多糖的作用并非是单味多糖成分的简单相加，各成分间存在 着相辅相成、相互为用的关系。 本实验确定了灵芝的最佳浸提方法为加压浸提法，提取条件为：料水比1 ：2 0 ，浸提 次数为4 次，压力0 1 m p a ，浸提时间1 h ，多糖提取率可达到9 5 1 8 。确定了香菇柄的 最佳浸提方法为加压浸提法，提取条件为：料水比1 ：2 0 ，浸提次数为2 次，压力0 1 m p a ， 浸提时间1 h ，香菇多糖提取率约可达9 3 。 对灵芝和香菇不同添加量在发酵过程中p f i 、生物量、溶氧量、还原糖浓度和多糖 浓度进行了测定，确定了灵芝和香菇最佳添加方式为直投式，最佳添加量为6 。 确定了真菌多糖复合制剂发酵液多糖提取最佳方法为加压提取法，提取条件为菌丝 破壁处理3 m i n ，浸提压力0 1 m p a ，浸提时间2 5 h ，自然p h ，加水量为l 倍，浸提1 次。 真菌多糖复合制剂的矫味实验中以大枣、甘草和糖浆进行配伍。确定真菌复合多糖 发酵液为7 0 ，大枣、糖浆和甘草添加量共占3 0 ，剂型i 三者添加体积比为1 0 ：1 5 ：2 ； 剂型i i 三者添加体积比为5 ：1 5 ：2 。 根据以上结论，确定了真菌多糖复合制剂的生产工艺流程。并根据稳定性老化实验， 确定稳定剂选用复合稳定剂为宜，用量为o 2 。灭菌条件选择巴氏消毒灭菌法( 7 1 6 ，1 5 分钟) 。获得的两种剂型真菌多糖复合制剂多糖含量均6 ，可溶性固形物含量 均1 0 。 将受试物以相同的多糖添加量加入果蝇培养基中饲喂果蝇，五种受试物分别将果蝇 的平均寿命延长了2 4 ，5 3 ，1 1 6 ，2 4 4 和3 9 2 ，发酵法制备的真菌多糖复合 制剂表现出更好的抗衰老功能。发酵法制备的真菌多糖复合制剂5 9 k g d 、1 0 9 k g d 的 剂量能使小鼠肝m d a 水平明显降低，且表现为随剂量的增加而增强，因此真菌多糖复 合制剂具有一定的抗脂质过氧化的作用。 关键词真菌多糖复合制剂多糖提取率大枣甘草稳定剂抗衰老 i a b s t r a c t - -皇-_ 皇曼鼻! 詈鼍曼皇量一 a b s t r a c t t h ef u n g u sp o l y s a c c h a r i d e s ，ak i n do fi m p o r t a n tf u n c t i o n a lf a c t o ro fh e a l t h - c a r ef o o d ，i s a l la c t i v i t ya m y l o s es e p a r a t e df r o mt h ef u n g u se n t i t y , t h eh y p h aa n df e r m e n tl i q u i d t h ee f f e c t o fc o m p o u n dp o l y s a c c h a r i d ei sn o tas i m p l es u m m a t i o no fa l lc o m p o n e n t so fp o l y s a c c h a r i d e t h e r ee x i s t sar e l a t i o ni nw h i c ht h e s ec o m p o n e n t sc o m p l e m e n ta n dr e i n f o r c ee a c ho t h e r t h ee x p e r i m e n th a sa s c e r t a i n e dt h eb e s tm e t h o do fe x t r a c t i n gg a n o d e r r n as p p - - t h e e x t r a c tm e t h o do fa d d m gp r e s s u r e ，a n dt h ee x t r a c t i n gc o n d i t i o n sa r e ：t h er a t i ob e t w e e n m a t e r i a la n dw a t e ri s1t o2 0 ，t h ed e g r e eo fe x t r a c t i n gi s4 ，t h ep r e s s u r ei so 1m p a , t i m ef o r e x t r a c t i n gi s1h o u r ，a n dt h er a t eo fe x t r a c t i o ni s9 5 18 t h ee x p e r i m e n th a sa l s oa s c e r t a i n e d t h eb e s tm e t h o do f e x t r a c t i n gt h el e n t i n u l ae d o d e sa m y l o s ei st h es a m ew i t ht h ef o r m e r , a n d t h ee x t r a c t i n gc o n d i t i o n sa l e ：t h er a t i ob e t w e e nm a t e r i a la n dw a t e ri s1t o2 0 ，t h ed e g r e eo f e x t r a c t i n gi s2 ，t h ep r e s s u r ei so 1m p a , t i m ef o re x t r a c t i n gi s1h o u la n dt h er a t eo fe x t r a c t i o n i s a b o u t 9 3 p h ，b i o m a s s ，m g l ，r e d u c i n gs u g a rc o n c e n t r a t i o na n da m y l a s ec o n c e n t r a t i o na r et e s t e di n d i f f e r e n tq u a n t i t i e si nt h ep r o c e s so ff e r m e n t i n g ，a n dt h a tc o n f i r m st h eb e s tw a yo fa d d i n g g a n o d e r m as p p a n dl e n t i n u l ae d o d e s m p u t t i n gi nd i r e c t l ya n dt h eb e s ta d d i n ga m o u n t - - 6 t h eb e s tw a yo fe x t r a c t i n gt h ec o m p o u n dp r e p a r a t i o no ff u n g u sp o l y s a c c h a r i d e sl i q u i d f e r m e n t i n ga m y l a s e - - t h ee x t r a c tm e t h o do fa d d i n gp r e s s u r ei sa s c e r t a i n e d ，a n dt h ec o n d i t i o n s a r e ：3m i n u t e s m y c e l i ac o m m i n u t i o n , o 1m p a , 2 5h o u r s t i m e ，m t u r a lp h ，d o u b l et h ew a t e r y i e l d , o n et i m eo fe x t r a c t i n g t h e ，t a s t ee x p e r i m e n to ft h ec o m p o u n dp r e p a r a t i o no ff u n g u sp o l y s a c c h a r i d e si sb a s e do n t h em i x t u r eo fc h i n e s e - d a t e ，l i q u o r i c er o o ta n d s y r u p ，a n d t h ec o m p o u n df u n g u s p o l y s a c c h a r i d e sl i q u i df e r m e n t i n ga c c o u n t sf o r7 0 ，t h em i x t u r e3 0 a c c o r d i n g l y , t h ep r o c e s s o f p r o d u c i n g t h e c o m p o u n dp r e p a r a t i o n o ff u n g u s p o l y s a c c h a r i d e si sa s c e r t a i n e d t h es t a b i l i t ye x p e r i m e n ts h o w s t h a tc o m p o u n ds t a b i l i z e r i s as u i t a b l eo n e ，w i t ht h ed o s a g eo f 0 2 ，a n dg e r m - k i l l i n gc o n d i t i o ni s7 1 6 ，1 5m i n u t e s a b s t r a c t 量鲁毫量皇皇曼皇詈喜暑一i a t i 量詈晕! 皇曼毫曼鼍暑曹 f i v es a m p l e sw i t hs a m ea m y l a s eq u a n t i t ya r ea d d e dt ot h ed r o s o p h i l am e l a n o g a s t e r c u l t i v a t i o nm e d i u mt of e e dd r o s o p h i l a s ，a n dt h e yp r o l o n g st h ed r o s o p h i l a sl i f ee x p e c t a n c y s e p a r a t e l yw i t ht h ef o l l o w i n gr a t e ：2 4 ，5 3 ，11 6 ，2 4 4 a n d3 9 2 t h ec o m p o u n d p r e p a r a t i o no ff u n g u sp o l y s a c c h a r i d e sm a d eb yz y m o t e c h n i c ss h o w sab e t t e rf u n c t i o no f r e s i s t i n gs e n i l i t y , a n dt h ed o s a g eo f5 9 k g 。da n dlo g k g dc a no b v i o u s l yr e d u c et h em d a l e v e l o ft h er a t t h em o r ed o s a g e ，t h el o w e rt h el e v e l t h e r e f o r e ，t h ec o m p o u n dp r e p a r a t i o no f f u n g u sp o l y s a c c h a r i d e sh a st h ef u n c t i o no f r e s i s t i n gs e n i l i t y , t os o m ee x t e n t k e yw o r d s ：t h ef u n g u sp o l y s a c c h a r i d c s ；t h ec o m p o u n dp r e p a r a t i o n ；t h er a t eo fe x t r a c t i o n ； z i z i p h u s j u j u b a ；r a d i xg l y c y r r h i z a e ；s t a b i l i z e r ；r e s i s t i n gs e n i l i t y 河北大学 学位论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得河北大学或其他教育机构的学位或证书 所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示了致谢。 作者签名： 本右， 学位论文使用授权声明 本人完全了解河北大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布 论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 本学位论文属于 l 、保密，在丝2 2 年亟月! 璺日解密后适用本授权声明。 2 、不保密口。 ( 请在以上相应方格内打“寸) 作者签名： 导师签名： 日期：丝z 年臣月壁日 日期：丝! z 年月丑日 第1 章文献综述 1 1 食药用真菌发展历史 第1 章文献综述 人类开始食用和栽培食药用真菌的历史可以追溯到数千年以前。食药用真菌是指能 治疗疾病，具有药用价值的一类真菌，即对人体有保健作用，对疾病有预防、抑制或治 疗作用的真菌【l 】。据考证，在古埃及、古罗马和古希腊时代，人们就食用野生的蘑菇并 视味美的菇类为“神之物 。墨西哥的出土文物及现在保留在民间的传统习惯表明，3 0 0 0 年前的印第安人便有食用毒蘑菇的习俗，他们借助毒蘑菇的毒素产生的致幻作用，进行 节日祭典活动圆。据郭沫若先生在中国史稿中的记述，我们的祖先早在6 0 0 0 - 7 0 0 0 年前的仰韶文化时期便采食蘑菇了。据出土文物和文字考证，食药用真菌用来象征祈福 余荫的吉祥之意可追溯至1 1 4 0 0 0 年前【3 】。东汉时期的药物专著神农本草经及明代李时 珍的本草纲目中就有茯苓、猪苓、灵芝、马勃、雷丸、银耳的记载。 从人工栽培的历史看，中国在世界上也是最早的。从历代本草农书中可以看到有关 食药用真菌栽培技术的许多片段，如中药“八珍之一的茯苓，其栽培起源于南北朝， 而在南宋周密所著葵辛杂识中就已记载了用菌核作“肉引”培植茯苓的较完整的内 容。对于灵芝、黑木耳等食药用真菌的栽培在这些著作中也都有记载。这些都是华夏祖 先对人类的贡献。西方国家最早栽培的食用菌是双孢蘑菇，第一次记载的有组织生产是 在法国巴黎的地下室内，时间是1 6 3 9 年；最早论述菇类栽培的文章是在1 6 5 0 年；蘑菇栽 培在英国推广的时间是1 7 7 9 年【4 l 。 1 2 食药用真菌研究意义 全世界已知真菌有2 0 多万种，我国至少有1 0 万余种，已报道8 0 0 0 种左右，其中传统 药用及实验具有药效的真菌多达4 0 0 余种【5 1 。目前已知我国传统的食药用真菌达5 1 科3 8 7 种，主要分属于担子菌和子囊菌两大类，其中担子菌4 4 科3 4 5 种；子囊菌类食药用真菌7 科2 8 种【研。食药用真菌包括大型真菌和目测不到的小型真菌，大型真菌的子实体和菌核 是传统食药用真菌的药用部位。而利用真菌的菌丝体及其代谢产物制成各种制剂药用的 一类真菌，称作制药工业用真菌。据统计，目前已发现能产生抗细菌、抗病毒产物的一 类真菌达2 0 0 余种；抗肿瘤的真菌有2 0 0 多种【7 1 。许多真菌与我们的日常生活关系密切， 1 河北大学理学硕士学位论文 但目前大量用于医疗临床的仅有少数几十种。 1 2 1 食药用真菌在我国传统医药中的应用 早在2 5 0 0 年前，我们的祖先虽还未能解释一些真菌治病的机理，但已知道用神曲治 疗消化不良、饮食停滞、胸膈满闷等疾病，用霉菌治疗疮痈等疾患。在传统的中医中药 中，应用最多的还是一些大型真菌，如灵芝( c a n o d e r m a ) 、茯苓( p o r i ac o c 0 8 ) 、猪苓( g r i f o t a u m b e l l a t a ) 等。 一些食药用真菌，除对某种疾病有特殊的治疗效果外，它的作用往往是综合性的。 不少食药用真菌都有滋补强壮作用，如灵芝、冬虫夏草、香菇等。我国历代医药学家都 认为灵芝具有滋补强壮、扶正固本的作用【8 】，灵芝在传统中医中被广泛用于治疗肝病、 慢性肝炎、肾炎、高血压、高血脂、关节炎、神经衰弱、失眠、支气管炎、气喘病、胃 溃疡、动脉硬化、白细胞减少症、糖尿病、厌食、蘑菇中毒、病后体虚等症【9 】。 这些被历代药物学家推崇的大型真菌，是我国传统的真菌药物，迄今仍被广泛应用 于医疗临床，并不断有所发现、有所发展，成为我国医药宝库中不可分割的重要组成部 分。 1 2 2 食药用真菌在现代医疗保健事业中的作用 1 2 2 1 食药用真菌在医疗临床中的作用 近代医药临床上，灵芝在治疗慢性支气管炎、消化不良、神经衰弱、冠心病、肝炎、 高血脂症、高血压、白细胞减少症等疾病中均有效果，近来随着对灵芝的肿瘤抑制作用、 降血糖作用等药用效果的认识逐渐深入，对灵芝多糖的分子结构也已经有所了解、对灵 芝的富硒【1 0 1 、富锗【1 1 1 培养也已获得成功，开发的产品有治疗缩性肌强直的“肌生 ( 孢 子粉注射液) ；减少血栓形成，治疗心血管疾病，白细胞减少症的“灵芝片：利用薄 盖灵芝( g c a p e n s e ) f 厅1 成的用于治疗女性更年期综合症、神经衰弱的“7 4 3 片 ；抗衰老 保健品“复方灵芝饮料”和j 中华灵芝茶 以及固态发酵法生产的灵芝面粉等【1 2 】。韩国 生产有“灵芝片 、“灵芝袋泡茶 、“灵芝易拉罐饮料”。日本生产有“灵芝胶囊 、 “锗全元口服液 ，甚至把灵芝经过加工后加入到药膳、饼干、挂面和啤酒、饮料中去， 甚至洗发、护发香波和美容制品中也有灵芝的影子，日本消费群也很喜欢使用这一类的 产品和食品。美国华商企业把中国灵芝引进到了药品和食品中去，生产的“灵芝片一、 2 第1 章文献综述 “灵芝胶囊”、“灵芝银杏胶囊 、“灵芝生脉片 等都获得了美国f d a 证书，作为 食品和中草药补充剂而面市，据了解由于这类产品质量上乘和价格不高而流行全美，畅 销不衰【1 3 1 。药理实验也证明，灵芝具有免疫调节作用、抗过敏作用、抗肿瘤作用、抗衰 老作用、提高肌体耐缺氧作用、降血糖、降压作用【1 4 1 。 报道的其他食药用真菌应用于医疗临床的还有：利用树舌( c a n o d e r m a a p p a l a n a t u m ) 研制成的用于治疗乙型肝炎的“树舌制剂、“肝必复t g a t l 5 】；利用云芝( c o r i u l o s v e r s i c o l o r ) 研制的用于辅助治疗乙型肝炎的“云芝肝泰”；利用蜜环茵( a r m i l l a r i a m e l l e a ) 研制的用于治疗慢性气管炎、乙型肝炎的“蜜环菌片，【1 叼；利用亮菌( a r m i l l a r i a t a b e s c e n s ) 研制的用于治疗急性胆囊炎的“亮菌甲素 ! 切；利用安络小皮伞( m a r a s m i u s a n d r o s a c e u s ) 制成的用于治疗三叉神经痛、偏头痛等症的“安络痛”【1 8 】：利用猪苓( p d 妇o r u 8u m b e i i a t a ) 制成的用于辅助治疗原发性肺癌的“猪苓多糖以及利用槐耳( t r a m e t e sr o b h q i o p h i l a ) 制 成的用于扶正抑散，治疗原发性肝癌的“槐耳冲剂 等众多产品【1 9 1 。 7 据统计，1 9 8 5 2 0 0 0 年已批准的8 5 1 种中药新药中，含菌类的中药达：至u 1 2 4 种。 1 2 2 2 食药用真菌的保健作用 食药用真菌是一种高蛋白、低脂肪的保健食品，它的营养成分介于肉类和果蔬之间。 其蛋白质的含量不及牛肉高，但有些食药用真菌如猴头菌干品中蛋白质含量达2 6 3 ， 金针菇达1 6 2 ，它比猪肉( 9 5 ) 、面粉( 9 9 ) 、米( 7 8 ) 中蛋白质含量高出l 倍 多。按鲜重计算，一般菇类蛋白质含量约为4 左右，是白菜、番茄、白萝卜等一些蔬 菜的3 , - 6 倍。 谷物是我国人民的主食，但谷物中氨基酸的配比不能满足人的需要，尤其缺乏赖氨 酸；禾谷类作物种子中则常缺乏其中的1 以种氨基酸；而食药用真菌中含有种类齐全的 氨基酸，特别是含有一些人体不能合成，只能由外界食物提供的人体必需的八类氨基酸： 苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、蛋氨酸和色氨酸。如黑木耳中赖氨酸 含量达4 6 ，是面包( 2 o ) 中含量的2 3 倍，同时食药用真菌中所含氨基酸主要是l 型氨 基酸，其7 0 可以被人体吸收利用。 人类食物中，不可缺少的脂类包括脂肪、胆固醇和磷脂，而影响较大的主要是前两 种。脂肪一般占全部食物用量的3 0 左右为宜，动物性脂肪中主要含饱和脂肪酸；植物 油中主要含不饱和双烯脂肪酸，也称亚油酸，是人体必需的脂肪酸。食药用真菌中所含 河北大学理学硕士学位论文 脂肪酸以不饱和脂肪酸为主，与植物油近似。如香菇、黑木耳、银耳中不饱和脂肪酸分 别占所含脂肪的7 5 、7 3 1 、6 9 2 ，而牛油中人体必需的脂肪酸仅占2 1 4 。动物 脂类中含有较高的胆固醇，会引起人体动脉硬化症和心肌梗塞，食药用真菌中不但不含 胆固醇，且含有丰富的类甾醇，可降低血液中胆固醇的含量。因此，真菌被誉为“健康 食品 、“植物性食品的顶峰 是名副其实。 多数食药用真菌中维生素的含量比蔬菜高2 8 倍，特别是香菇、黑木耳、竹荪中含 有较多的维生素和人体所必需的微量元素。人体中较易缺乏的维生素b 1 ，在香菇中含量 很高，1 克干香菇中含维生素b l 达1 2 8 - - 4 0 0 国际单位，而大豆中仅含6 国际单位；蜜环菌 中含有较多的胡萝卜素；我国膳食构成一般缺铁，而香菇、木耳中铁含量较多；银耳含 磷量较高；香菇灰分中钾占6 4 ，可中和肉食所产生的“酸”。纤维素是人体不可缺少 的营养物质，食药用真菌和蔬菜中都含有较多的可溶性纤维素，可被人体吸收利用，并 可把人体肠道中不能消化的一些物质带出体外，如对常与空气中棉絮接触的纺织工人， 黑木耳是他们保健的必需食品1 2 0 。 在国内，迄今为止，菌类功能性食品的开发工作主要集中在营养、益智、抗衰老和 增强机体免疫力等方面，主要产品可划分为老年食品、儿童食品、美容食品、疗效食品、 运动员食品和休闲食品等1 2 1 1 。 国际上，研究比较活跃的功能性食品基料有：膳食纤维、活性多糖、低聚糖、糖醇、 蛋白质、多肽、多不饱和脂肪酸、类脂、醇及植物固醇、糖苷、酚、黄酮类、乳酸类、 维生素、矿物营养素、蒜素等。其中的很多物质都可以以食药用真菌为原料生产吲。 1 3 国内外食药用真菌多糖研究概述 真菌多糖是从真菌子实体、菌丝体、发酵液中分离出的一类可以控制细胞分裂分化、 调节细胞生长和衰老的活性多糖物质，一般都是由l o 个分子以上的单糖通过糖苷键连接 而成的高分子多聚物。真菌多糖是一类重要的保健食品功能因子，是当今医药和食品工 业共同关注的焦点。国内外已从高等担子菌筛选至u 2 0 0 余种有生物活性的多糖物质，我 国发现的有重要价值的真菌多糖近3 0 种 2 3 2 4 1 。 多糖作为药物始于1 9 4 3 年，但是，在较长时间内没有得到足够的重视。2 0 世纪5 0 年 代，随着化学和生物学的发展和分离技术的提高，人们才开始认识到多糖的结构是非常 复杂多样的，其生物学功能也决非仅仅是能量和结构上的功能。6 0 年代前后，多糖作为 4 第1 章文献综述 广谱免疫促进剂引起人们极大的兴趣，人们逐渐发现多糖具有复杂的、多方面的生物活 性和功能。7 0 年代以来，随着免疫物质、生物膜和各种生物活性物质的研究，人们发现 糖类在体内具有各种关键的生物功能。8 0 年代以后，人们得到了有关糖的结构和功能的 越来越多的信息，特别是近十年来人们对糖的认识有了质的飞跃，认识到糖是除核酸和 蛋白质之外另一重要的生命物质嘲，涉及到特别是多细胞生命的全部时间和空间，如受 精、着床、分化、发育、免疫、感染、癌变、衰老等等 2 6 - 2 町。因此，对糖类的研究再次 成为人们关注的焦点，各国学者竟相从各种生物材料中寻找和提取具有生物活性的多糖 物质，从而使糖类的研究有了空前的发展。 1 3 1 真菌多糖的生物活性 1 3 1 1 抗肿瘤、提高免疫功能 高等真菌已有5 0 个属1 7 8 种的提取物都具有抑制小鼠s 1 8 0 肉瘤及艾氏腹水瘤等细 胞生长的生物学效应，明显促进肝脏蛋白质及核酸的合成及骨髓造血功能，促进体细胞 免疫和体液免疫功能。如香菇、银耳、竹荪、鸡纵、灰树花、姬松茸、柳松菇、灵芝、 云芝、裂褶菌、双孢蘑菇、裂蹄木层菌等 2 9 3 0 1 。香菇多糖是研究得较透彻的多糖之一， 它的抗肿瘤作用主要是活化t - 淋巴细胞，还可激活补体系统的经典和替代途径，导致巨 噬细胞的非特异细胞毒性提高和中性白细胞对肿瘤组织的侵润，是目前已知最强免疫增 强剂之一。真菌多糖特别是在结合放疗、化疗过程使用可以显著提高疗效【3 1 1 。 1 3 1 2 降血压、血脂 冬虫夏草多糖对心律失常、房性早搏有疗效；灵芝多糖对心血管系统具调节作用， 可强心、降血压、降胆固醇、降血糖等；姬松茸多糖能降血脂、提高耐氧能力。真菌多 糖还可增强冠体流量与心肌供氧，降低血脂，预防动脉粥样硬化斑的形成【3 2 】。 1 3 1 3 健胃保肝 香菇多糖、树舌提取物有保肝并增强排毒能力，刺激切除了肝的老鼠部分肝的再生， 以及增强了洋地黄毒素毒性的抵抗能力1 3 3 1 。猴头菌多糖可增加骨液分泌、稀释胃酸、保 护溃疡面、促进粘膜再生，对胃癌、慢性萎缩性胃炎、食道癌、十二指肠溃疡有显著疗 效【3 4 1 。云芝多糖对慢性肝炎、乙型肝炎皆有防治作用。茯苓多糖含有茯苓酸、层孔酸等 1 6 种具有药理作用的物质，具有增强机体免疫能力，有护肝解毒作用。 1 3 1 4 其他 s 河北大学理学硕士学位论文 真菌多糖的药用功效多样，除上述外，还具有抗衰老、抗感染、抗辐射、抗毒物损 伤、抗水肿、抗晕、祛痰镇咳等方面的功效【3 1 1 。 1 3 2 真菌多糖的结构层次 多糖的结构分为4 级，其中一级结构包括主链性质( 糖单元组成、连接顺序及连接 方式) 和支链性质( 有无分支及分支类型、位置、长短) 。真菌多糖的一级结构主链主 要有：葡聚糖：以t 3 ( 1 3 ) 糖苷键连接为主链，并兼有少量1 3 ( 1 4 ) 或其它糖苷键连 接的侧链，如香菇多糖、茯苓多糖、裂褶菌多糖、云芝多糖的一级结构都属于这种连接； 甘露聚糖：主要由a 糖苷键连接为主链，如冬虫夏草多糖为a ( 1 2 ) 糖苷键连接，银 耳多糖和黑木耳多糖为a ( 1 3 ) 糖苷键连接，灵芝多糖是由a ( 1 ，4 ) 糖苷键连接。真菌 多糖的侧链有很多种，不同的真菌多糖其侧链也不同。二级结构指多糖主链间以氢键为 主要次级键而形成的有规则的构象，真菌多糖的二级结构只关系到其分子主链的构象， 而不涉及侧链的空间排布。以二级结构为基础，由糖单位间的非共价键相互作用而导致 有序且粗大的构象，即为多糖的三、四级结构。真菌多糖的三级结构是由多糖中糖残基 的羟基、羧基、氨基及其它官能团间通过非共价作用而导致的有序、规则而粗大的空间 构象。真菌多糖的四级结构是多糖多聚链间以非共价作用力而结合形成的聚集体。真菌 多糖的构型有：可拉伸带状、卷曲螺旋状、皱纹状和不规则卷曲状。 1 3 3 真菌多糖的构效关系 多糖构效关系是指多糖一级结构和高级结构与其生物活性之间的关系【3 5 1 。 1 3 3 1 分支度和分子大小对生物活性的影响 具有生物活性的食药用真菌多糖的分支度( d b ) 变化较大，一般为0 0 2 , - , 0 7 5 。研 究结果表n t 3 6 1 ，只有分支度在0 2 o 3 3 的那些1 3 ( 1 3 ) d 葡聚糖才具有较强的生物活性。 真菌多糖的生物活性还取决于它的分子的大d , , t 3 r l ，分子量为1 0 1 0 ， 2 0 1 0 ，的高分子 组分呈现较强的活性。高分子量的1 3 ( 1 3 ) d 葡聚糖的高度有序结构( 三股螺旋) 对于 调节免疫活性至关重要，而只有分子量大于9 0 1 0 的分子才能形成三股螺旋。 1 3 3 2 主链连接方式对生物活性的影响 研究表明，只有c 6 上的基团被d 葡聚糖基、d 阿拉伯糖基所取代的真菌多糖才具有 很强的抗肿瘤活性b 6 - 3 s l 。含有d 阿拉伯糖基和d 甘露糖基分支的改性1 3 ( 1 - - 3 ) - d 葡聚糖 6 第1 章文献综述 具有较强的抗肿瘤活性，而类似的改性1 3 ( 1 4 ) d 葡聚糖则无抗肿瘤活性。这些结果表 明，9 ( 1 3 ) 连接的骨架对于抗肿瘤活性是必需的，同时也证明了b ( 1 3 ) 主链在抗肿 瘤活性上的重要性。为了增加1 3 ( 1 3 ) d 葡聚糖的溶解性，可在增加或维持其抗肿瘤活 性的基础上，对1 3 ( 1 3 ) d 葡聚糖进行磺酰化、硫酸化、磷酸化和羧甲基化等。 1 3 3 3 侧链基团的性质对生物活性的影响 葡聚糖的抗肿瘤活性与它们的侧链基团的种类和含量有直接关系1 3 6 - 3 8 。多元醇侧链 完全去除会导致其抗肿瘤活性的丧失。3 ，6 脱氢1 3 d 葡聚糖基的存在不仅会导致原始 抗肿瘤活性的丧失，而且在某些情况下，还会刺激肉瘤s 1 8 0 的生长。因此，d 葡聚糖 侧链的去除或改性会导致抗肿瘤活性的丧失。将分支转化成多元醇使得抗肿瘤活性的升 高的原因可能是增加了葡聚糖的水溶性。此外，在螺旋结构的外周，许多羟基化基团的 存在可能增加葡聚糖的潜在免疫活性。 1 3 3 4 子实体多糖与菌丝体多糖对生物活性的影晌 根据来源不同，高等真菌多糖可分为子实体多糖和菌丝体多糖。灰树花子实体多糖 由岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖等组成，而其菌丝体多糖由鼠李 糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖等组成【3 9 】。人工栽培的猴头菌 子实体多糖的单糖组成为阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖，而菌丝体多糖的单糖组 成为阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖【4 0 】。美味牛肝菌营养菌丝体与野生子实 体品质分析表明，美味牛肝菌液体培养茵丝体和野生子实体中均含有蛋白质、多糖、氨 基酸、脂肪、纤维、矿物质等多种营养成分，其组成基本一致，但菌丝体在多种成分的 质量分数上均高于野生子实体【4 1 1 。 1 3 4 真菌多糖的分离纯化与定量检测 ( 1 ) 直接测定多糖含量：多采用高效毛细管电泳法、高效液相色谱法和酶法等进行 多糖含量的测定。 ( 2 ) 利用组成多糖的单糖的性质进行测定，其中利用单糖缩合反应而建立的方法最 多。 显色剂一酸法：多糖在酸作用下水解、脱水生成糖醛类化合物，与酚类、芳胺类等 缩合成有色化合物。根据所用强酸和显色剂的不同，这类方法主要有9 种：2 蒽酮硫 酸溶液、硫酸；二苯胺醋酸溶液、盐酸；间苯二酚乙醇溶液、盐酸；地衣酚乙醇溶液、 7 河北大学理学硕士学位论文 盐酸；8 0 苯酚水溶液、硫酸；2 a 萘酚乙醇溶液、硫酸；色氨酸、硫酸；3 水合l 半胱氨酸盐酸盐溶液、硫酸；咔唑、硫酸。也有采用苯酚硫酸法加酶联免疫测定仪快 速测定多糖含量的。 滴定法：取多糖水解液，加入指标剂，滴定经标定过的溶液，根据样品水解液消耗 体积，计算其含量。常用的滴定方法有斐林氏滴定法、间接碘量滴定法、氧化还原滴定 法等。如用还原滴定法测香菇多糖、灵芝多糖、螺旋多糖等【4 2 】。 ( 3 ) d n s 法( 3 ，5 二硝基水杨酸比色法) ：利用d n s 与多糖水解产物还原糖共热 后还原成棕红色氨基化合物的特性，于5 4 0 r i m 处有特征吸收。 ( 4 ) 重量测定法：先用8 0 的乙醇提取以除去单糖、低聚糖、生物碱等干扰性成分， 然后用水提取其中所含的多糖类成分。 ( 5 ) 生化分析法：将多糖水解，再用自动生化分析仪测定多糖含量，具有灵敏快速、 样品用量少、精密等优点。 ( 6 ) 石墨炉原子吸收光谱法( g f a a s ) ：如采用阿利新蓝( a l c i a nb l u e ) 与尿样中氨基 多糖( g a o ) 在p h = 5 8 的醋酸钠溶液中，发生沉淀反应生成g a g 铜复合物。离心，分离 沉淀物，以石墨炉原子吸收光谱法测定沉淀物中铜含量，间接计算g a g 含量m 】。 目前在食药用真菌提取物中多糖含量测定方面主要采用的方法是苯酚一硫酸法m 。 1 4 食药用真菌应用发展展望 食药用真菌的医疗价值和保健作用，已引起世界各国的广泛重视。当今，随着人类 生活水平的不断提高，因膳食结构不平衡或营养过剩而造成的文明病已经大量出现，免 疫力低下、肥胖症、高血脂、冠心病、糖尿病等症己成为危害人体健康的主要疾病【4 5 1 。 此外，在世界范围内，至l j 2 0 0 0 年止，已有6 0 多个国家或地区进入老龄化社会，仅我国6 0 岁以上人口就占一亿多，老年病将成为一个不可忽视的社会问题。因此，提高机体免疫 力、延长人类寿命、提高生存质量、满足老年人营养保健“四足四低 ( 即足量的蛋白 质、膳食纤维、维生素与矿质元素，低能量、脂肪、糖和钠盐) 的要求渐成时尚。人们 开始崇尚“反璞归真 、“回归自然 、渴求天然绿色食品、追求素食主义，作为“植 物性食品顶峰 的食药用真菌类及其保健品正是廉价而不引起并发症的安全有效的治病 途径之一，其研究、开发与应用正满足了当今社会这一需求f 4 曰。 目前，国内外对食药用真菌的开发利用发展很快，其热点主要集中在：高产菌株的 8 第1 章文献综述 筛选和选育；深层发酵生产工艺的优化；研究多糖活性与构效的关系；真菌多糖药理机 制及真菌多糖药品临床应用的有效性和安全性的研究等方面。 液体深层发酵技术属于现代生物技术之一，这一概念是2 0 世纪4 0 年代由当时的美国 弗吉尼亚大学生物工程专家e l m e r l g a d e n 设计出培养微生物系统的生物反应器，成为 该项技术的权威。据资料报道，最早将这一技术应用于食药用真菌方面的是美国的 h h u m f e l d 等对蘑菇进行的深层发酵研究。1 9 5 8 年j s z u e c s 第一个用发酵罐来培养羊肚 菌。日本的杉恒武等分别于1 9 7 5 、1 9 7 7 年用1 的有机酸和0 5 的酵母膏组成液体培养 基取得了大量的香菇菌丝体。国内较早的报道是上海植物生理研究所的陈美聿等人于 1 9 6 0 年进行的香菇深层发酵研究。1 9 7 9 年杨庆尧等开始研究香菇等的深层发酵，并研究 了液体培养基的粘度与菌球的关系。2 0 世纪8 0 年代后，国内外纷纷开展了这一技术的研 究与应用探讨1 4 7 】。 化学成分的分析和药理临床观察表明，某些食药用真菌的菌丝体与子实体有同样的 医疗和保健效果。近3 0 年来，随着发酵工业的兴起和发展，利用液体发酵、固体培养方 式生产食药用真菌菌丝体的制药行业有了很大发展。菌丝体的培养周期短，适合于大规 模工厂化生产。目前猴头菌、蜜环茵、亮菌、云芝、树舌、安络小皮伞、槐耳、麦角茵、 冬虫夏草等食药用真菌已有较完整的发酵生产工艺，其产品广泛应用于临床，如蜜环茵 片、云芝肝泰、槐耳的液体和固体发酵茵质生产的药品、冬虫夏草深层液体发酵开发生 产出的“金水宝胶囊等。“金水宝 胶囊于1 9 8 7 年由卫生部国家新药评审委员会批准， 作为全国第一个中药一类新药生产。这些都是真菌药物生产发展的新方向，有很强的生 命力。 与以往的固体培养相比，食药用真菌的液体培养具有很多优点：它大大缩短了培养 周期，极大地提高了劳动效率，且不受季节、气候和地域的影响，生物转化率高，温度、 酸度、溶氧及原料浓度等培养条件易于控制，规模可大可小，便于自动化工业生产和产 成品质量控制；如果与后提取工艺相配合，更是使得以获取某些菌类药用成份为目的的 制药行业如虎添翼；如果作为液体菌种与传统的栽培技术相配合，则可加快发菌速度、 缩短生产周期。自深层液体培养技术问世以来，食药用真菌品种液体培养的报道就如雨 后春笋般出现了，已被液体培养的食药用真菌品种有云芝、灵芝h 引、金顶侧耳1 4 9 5 0 1 、 金耳、银耳、木耳、金针菇、虫草、竹荪、茯苓、蜜环菌、香菇i s l 】、灰树花【5 2 1 等。 河北大学理学硕士学位论文 目前有关食药用真菌深层液体发酵技术的研究主要集中在发酵培养基的优化、发酵 条件的优化等方面5 3 1 。 我国有1 3 亿人口，是食药用真菌最大的潜在消费市场，由于目前我国的经济还达不 到高等发达国家的水平，食药用真菌年人均消费量只有0 2 千克，是西方发达国家的1 1 1 0 。 随着改革开放和经济条件的改善，我国将会成为食药用真菌最大的消费市场【5 4 1 。我国幅 员辽阔，地形复杂、气候多变，有丰富的自然资源和人力资源，随着世界各国食药用真 菌需求量的日益增长，我国必将会成为世界食药用真菌的生产大国、出口基地和销售市 场。 1 5 本论文的研究目的和意义 本论文的研究目的就在于发扬我国医药文化传统，采用发酵法生产金顶侧耳菌丝 体，以灵芝子实体和香菇柄为配料，附之以大枣和甘草两味药食兼用中药制成一种真菌 多糖复合制剂。并通过动物实验检验其抗衰老活性。 灵芝( g a n o d e r m al u c i d u m ) 隶属于担子菌门、多孔菌科、灵芝属，是我国传统名贵中 药。现代科学研究表明，灵芝的药用成分非常丰富，已分离到的有效成分有数十种之多， 特别是灵芝多糖提取物具有抗肿瘤作用，引起了人们的广泛关注。灵芝多糖还能提高机 体免疫力和耐缺氧能力，消除体内自由基，抗放射，提高肝脏解毒功能，利胆清热，活 血化瘀等。灵芝的药理活性大多和灵芝多糖有关【5 5 1 。大多数食药用真菌不能在夏季出菇， 而灵芝生长喜高温，菌丝生长温度为4 3 9 ，但以2 4 3 0 生长最快，子实体在2 0 以 上才能分化发育，2 4 2 8 发育迅速。本实验以灵芝作为发酵配料制备真菌多糖复合制 剂，该制剂的成功制备为有效利用灵芝提供了一条途径，而灵芝可夏季出芝这一特点则 有利于食药用真菌的周年化生产。 香菇( l e n t i n u l ae d o d e s ) 隶属于担子菌纲、伞菌目、口蘑科、香菇属。不仅是一种美 昧佳肴，也是一种著名的药用菌。现代研究结果表明，香菇中含有能降低血浆胆固醇的 香菇嘌呤，含有诱生干扰素的双链核糖核酸，且含有抗肿瘤活性物质：香菇多糖及香菇 糖肽【5 6 1 。香菇柄与菇盖一样都由香菇菌丝体组成，同样含有丰富的生物活性物质。据分 析香菇柄中含有7 种多糖成分，其中5 种具有b ( 1 3 ) 糖苷键结构的葡聚糖，并证实其 具有抗突变的生物活性，具有明显保护机体免遭肿瘤侵害的生理功能。由于香菇柄是香 菇商品化处理中废弃的下脚料，因其口感不好无法食用，据报道全国每年废弃的香菇柄 1 0 l 第1 章文献综述 有数万吨之多，这部分的资源浪费是极其巨大的【57 1 。本实验以香菇柄作为发酵配料制备 真菌多糖复合制剂，该制剂的成功制备将为有效利用香菇柄提供一条有效的途径。 金顶侧耳( p l e u r o t u sc i t r i n o p i l e a t u ss i n g ) 又称“金顶蘑 、“榆黄蘑 、“玉皇蘑 或“黄 蘑，营养丰富，具有滋补强壮功能，是东北地区著名的食药用真菌，隶属于担子菌门、 伞菌目、口蘑科、侧耳属【5 8 1 。金顶侧耳不仅营养丰富，还具有提高人体免疫功能、抗衰 老等作用，是一种很有发展前途的保健品原料。金顶侧耳多糖具有抗肿瘤活性，可以将 其开发为新型的抗肿瘤药物。但金顶侧耳尚未大规模人工种植，而且金顶侧耳菌盖很脆 极易破碎，不便长途运输，这使大量使用金顶侧耳子实体造成不便，本实验用液体发酵 的方法生产金顶侧耳菌丝体，可以很好的解决这一问题。 食药用真菌是中药的组成部分，以适当的中药为培养基或在培养基中添加适量的中 药，利用它们强大的分解转化能力，不仅可对中药中的纤维、糖类和蛋白等物质加以利 用，而且在代谢过程中可能对中药中的一些成分进行转化，从而提高中药活性成分在复 合制剂中的比例及效价；另外中药中的某些成分亦能促进药用真菌的生长或活性产物的 产生，这样可生产出包含多种活性成分且药效较简单组方配伍更佳的新型发酵制剂【5 9 1 。 真菌多糖复合制剂有显著增强免疫功能与升高白细胞的作用，它不仅仅是几种单一制剂 疗效的简单叠加。 此种真菌多糖复合制剂的制备具有一定的理论与实践意义。 河北大学理学硕士学位论文 第2 章灵芝多糖和香菇多糖提取工艺研究 2 1 实验仪器和材料 2 1 1 主要仪器 电子天平 粉碎机 恒温水浴锅 2 1 2 实验材料 离心机 手提式压力蒸气消毒器 7 2 1 可见光分光光度计等 灵芝由河北大学生命科学院食药用真菌研究所提供，香菇柄由河北省保定市冰花食 品有限公司提供，灵芝和香菇柄都经粉碎机粉碎5 分钟后过6 0 目筛备用。 2 1 3 试剂