（微生物学专业论文）有机磷农药降解菌的分离、鉴定及固定化研究.pdf

中文摘要 中文摘要 农药在环境中降解主要是通过生物降解完成，其中以微生物降解占主导地位。 本研究从哈尔滨农药厂有机磷农药生产车间内采集土样，筛选获得多株能彻 底降解氧化乐果的菌株。其中菌株h d m j 2 和h d m j 2 3 具有较好的降解性能。通 过形态学分析、生理生化分析和1 6 sr d n a 同源性分析发现，这两株菌与假单胞菌 属和气球菌属极其相似，将h d m j 一2 暂定为假单胞菌属，命名为 p z 砌肌d 刀船 s p h d m j 2 ，将h d m j 2 3 将h d m j 2 3 鉴定为气球菌属彳p ，d c c 淞s p h d m j 2 3 。 经试验研究发现，这两株菌均可以较好的降解氧化乐果和其他有机磷农药， 氧化乐果浓度为1 0 0 m l 时，两株菌在l d 内可完成降解，氧化乐果浓度为4 0 0 m l 时，两株菌在3 d 内可完成降解，浓度在1 0 0 0 m g l 时7 d 内可完成降解，浓度达 2 0 0 0 m g ，l 时7 d 内降解率可分别达到7 5 2 8 和7 2 4 2 ，在对高于3 0 0 0 m l 的氧 化乐果降解实验中，由于菌体生长明显受到抑制，降解率并不理想 菌株的微生物特性研究结果表明，菌株对有机磷农药的降解具有广谱性，尤 其是能较好地降解氧化乐果，该菌株能够耐受8 0 0 0 i l l g l 的氧化乐果，降解氧化乐 果的过程呈现动态变化，并且与菌体的生长趋势有一定的相关性。 在生物学特性研究中，还可确定两株菌的最适生长碳源分别为蔗糖和d 甘露 糖，最适生长氮源为牛肉膏，两株菌均能在2 5 一4 0 和p h 5 8 的范围内良好生长， 并且通过菌株的生长曲线实验可知，两株菌在氧化乐果浓度不高于1 0 0 0 m g 几时生 长良好。 通过研究菌株的固定化方法。采用医用注射器滴定的方法对菌株进行了固定 化，并对海藻酸钠、聚乙烯醇、卡拉胶、脱乙酰壳多糖四种包埋材料进行了筛选 比较；确定以海藻酸钠和聚乙烯醇分别作为包埋剂：对包埋剂的浓度、包埋粒径 等进行了研究试验。试验结果表明，以3 5 海藻酸钠作为包埋剂，使用四号 针头进行固定化菌株，生产的固定化颗粒能够满足试验和应用的要求。 菌株及固定菌对土壤中氧化乐果污染物的生物修复应用表明，通过在安达和 1 黑龙江大学硕士学位论文 植物园两种土壤中应用菌株和固定菌，试验结果表明：菌株及固定菌能够有效地 去除土壤中的氧化乐果残留。 在试验处理的第7 天，两种土壤中氧化乐果的降解率都接近6 0 。在植物园 土样中菌株和固定菌对氧化乐果的降解效果要高于在安达土样中的降解效果，分 析探讨主要的原因是植物园土样中有机质含量较高，有机质能够为降解细菌提供 营养物质，促进细菌的生长，从而有利于对氧化乐果的降解；同时，土壤中的有 机质和腐殖质也容易吸附氧化乐果。 菌株及固定化菌在受氧化乐果污染水处理中的应用的试验结果表明，菌株及 固定化菌在受氧化乐果污染水处理中降解率可达到l o o 。但相比较实验室条件下 氧化乐果的降解，这种降解效果不理想。缺乏营养条件和氧气条件是出现这种情 况的主要原因。1 5 0 m g 几时，菌株对氧化乐果的降解要高于固定化菌对氧化乐果的 降解，而5 0 0 m l 时，固定菌对氧化乐果的降解率与菌株降解率相差较小，说明 在高浓度时，固定菌的降解率与菌株的降解水平趋于一致，可能是固定化菌对于 外界环境的变化的适应性较好。 关键词：假单胞菌，气球菌，有机磷农药，氧化乐果，降解 黑龙江大学硕士学位论文 a b s t r a c t p e s t i c i d e sp l a ya ni n l p o r t a n tr o l ei nt h ec o n t r o lo fp l a n td i s e a s e sa n di n s e c tp e s t s b u tt h e ya l s od e s t r o yt h ee n v i r o n m e n ts e r i o u s l ya n dl e a v eg r e a tt o x i c i t yt oh u m a nh e a t h b i o d e g r a d a t i o n ，e s p e c i a l t h ed e g r a d a t i o nb y m i c r o o r g a m s m ， c a ne a s et h i sk i n d d i s a d v a n t a g e i nt h i s r e s e a r c h ， s e v e r a ls t r a i n sw i t h p o t e n t i a la b i l i t yo fd e g r a d a t i o n f o r o 唱a n o p h o s p h o l l j sp e s t i c i d e s w e r ei s o l a t e df r o mt h ea c t i v a t e ds i u d g e p o l l u t e db y o r g a n o p h o s p h o m sp e s t i c i d e ss 锄p l e df b mo n ep e s t i c i d ef a c t o 口i nh 孙i nc i 吼 a m o n g t h e m ，h d m j - 2a n dh d m j - 2 3w e r es c r e e n e da n ds e l e c t e da st h eh i 曲e 娲c i e n c y d e g r j 出i n gi s o i a t e s t h e yw e r ei d e n t i f i e da s p “( 幻m d ，2 口ss p h d m j - 2a n d 彳e ，d c d c c 甜s s p h d m j 一2 3 b a s e do nt h e i r m o 叩h o l o g i c a lc t l a r a c h a t e r i s t i c s ，p h y s i o l o g i c a l a n d b i o c h e m i c a lp r o p e n i e sa n dt h es e q u e n c ea n a l y s i so ft h e i r l6 s r d n a ，s 印m t e l y 。 t h er e s e a r c hr e s u l ts h o w e dm a tt 、v os t t a i n sd i d 、v e l li nb i o d e g r a d a t i o no m e t h o a t e a n do t h e ro 唱a u l o p h o s p h a t ep e s t i c i d e s t h eo m e t l l o a t ea tt h ec o n c e n t r a t i o no flo o m l c o u l db ed e g m d ea b s o l u t e l yi nldw i mt h et 、os 仃a i n s ，w h i l et h ec o n c e n t m t i o no f 4 0 0 m g 皿c o u l db ed e 伊a d ea b s o l u t e l yi n3 d w h e nt h ec o n c e n t r a t i o no fo m e m o a t ew e r e u pt o10 0 0 m g l ，i tc o u l db ed e g r a d e di n7 d t h ed e g r a d a t i o nr a t ew a s7 5 2 8 a n d 7 2 4 2 ，r e s p e c t i v e i y ，w h i l et h eo m e t h o a t ea tt h ec o n c e n 柏t i o no f2 0 0 0 m g l n l e 咖d yo nt 1 1 eb i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so ft h et 、os t r a j i l sf o rt h e i rg r o w t l la i l d d e g r a d a t i n go 唱a n o p h o s p h o m sp e s t i c i d es h o w e d t l l a t t h e y h a db r o a d s p e c t n l n l d e g r a d a b i l i t ) ，e s p e c i a l l yf o rd e 目a d a t i n go m e t h o a t e 1 1 1 es t m i n sc o u l dt o l e r a t eh i 曲 c o n c e n t m t i o no f 8 0 0 0 m l o m e t h o a t e埘t h i n o 唱a n o p h o s p h a t e m e d i 岫1 1 1 e d e g r a d a t i n gp r o c e s so fi s o c a r l ) o p h o st o o ko nn u c t u a t i n ga n dt h et i e n d 、v a sr e l a t e dt ot h e g r o w t hc u r v eo ft h es t r a i n s i nt h es t u d yo nt h eb i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so ft h es t r a i n ss h o wt h a tt h eo p t i m 啪 c 孤b o ns o u r c ef o rt h et 、v os t r a i n sw a sc a n es u g a r 甜l dd c a l l j b i n o s e m eo p t i m 啪 n i t r o g e ns o u r c ef o rb o t hs t r a i n sw a sb e e fe x t r a c t ，t h et w os t r a i n sc o u l dg r o w 、v e l lw h e n t h et e m p e r a t u r ec h a j l g e sb e t 、v e e n2 5 4 0 a n dp hc h a n g e sb e t w e e n5 8 m o r e o v e r 1 i i a b s t r a c t t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h e yc o u l dg r o 、v t hw e l la tt h ec o n c e n t r a t i o no fo m e t h o a t el o w e r t h a n1 0 0 0 m l i nt l l i sd i s s e n a t i o n ，t h em e t h o do fh i 曲一e 陌c i e n c yb i o d e g r a d a t i o nb a c t e r i u m h d m j 一2a n dh d m j 一2 3 si m m o b i i i z a t i o nw e r es t u d i e d p r o c e s s e db yi a t r i c a ls 蜘n g e t i t r a t i o nm e t h o d ，a n df i l t e rf o u rk i n d se m b e d d i n gm a t e r i a l ：s o d i u ma l g i n a t e ，p o l yv i n y l a l c o h o l ，c 鲫阻g e e n a na n dc h i t o s a n t h er e s u i t so ft h ee x p e r i m e n ti n d i c a t e dt h a tt h e p a n i c i em a n u f a c t u r e db y3 4 s o d i 啪a l g i n a t ew i t l l4 撑i a t r i c a ls y r i n g ep i n h e a dc a n b es a t i s 6 e dt h er e q u i r e m e n to ft h ed i s s e r t a t i o n t ，1 1 eb i o d e 伊a d a t i o no fo m e t h o a t ei n s o i lw i t hs t r a i n sa n di m m o b i l i z e d 蛐m i n sw 弱 r e s e a r c h e db yt h ea p p l i c a t i o no fs 砌n sa n di m m o b i l i z e ds t r a i n si na n d aa n db o t a 血c m g a r d e ns o i l nh a r b i n ，t h er e s u h so f t h ee x p e r i m e n ts h o w e dt h a tt h et 、v os 仃a i n sa n d i m m o b i l i z e ds t r a i n sc o u l db i o d e g r a d et h eo m e t h o a t ee f f i c i e n t l y t h eb i o d e 铲a d a t i o nm t e o fo m e t l l o a t eb yt i l et 、v os t r a i n sa i l di m m o b i l i z e ds t m i n sw a l sh i 曲e ri nb o t a l l i c a jg a r d e n s o i ls 锄叩l et h 锄i na n d as o i ls 锄p l e t h i sr e s u l tm a y b ec a u s e db yag r e a td e a jo f o r g 觚i cm a t e r i a lmb o 协i c a lg 州e ns o i ls a m p l ew h i c hc o u l dp r o v i d et h en 嘶t i o nf o r t h et 、v os 1 b a i n sa n dc o u l dd b s o r b e do m e t l l o a t e t h eb i o d e 孕a d a t i o no fo m e t l l o a t ei ns e w e r a g eb ym et 、v os 缸i a i n sa n dm n o b i l i z e d s 仃a i l 峪w e r es t u d i e d t h ee x p e r i m e mr e s u l t ss h o w e dt h a tt h eb i o d e 孕a 妇i o nr a t eo f o m e m o a t ea p p r o a c hl0 0 1 1 1 j sr e s u l tw a sn o ti d e a lc o m p a r e d 、i t l lt h er e 砌t si 1 1 m e d i u m s a b s e n c eo fr 嘣t i o n 锄do x y g e nw a l st h em a i nr e a s o no ft t l i ss i t u a t i o n t h e d e 掣幽i o nr a t eo fo m e t h o a t eb yt h et 、v os 昀i n sw a sh i 曲e rt 1 1 a nb yi m m o b i l i z e ds t r a i n s u n d e rl5 0 m g l ，b u ti tw a sa l m o s tt h es 锄ea su n d e r5 0 0 m g l t h ee x p e r i m e n tr e s u l t s i n d i c a t e dt l l a tt h ea b i l i t yo ft o l e r a i l c eo fa d v e r s i t yo ft h ei m m o b i i i z e ds 臼r a i n sm a y b e e n h 甜l c e d ，a st h et i m es l i p sb y ，m eo s m o s i so fi m m o b i l i z e ds t r a i n su p g r a d e s k e y w o r d s ：风p 如川o ，z 傩s p h d m j 2 ，爿p 厂o c d 埘s p h d m j 一2 3 ，o r g a n o p h o s p h a t e p e s t i c i d e ，o m e t h o a t e ，d e g r a d a t e i v 独创性声明 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。掘我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得黑龙江大学或其他教育机构的 学位或证书而使用过的材料。 论文作者签名：卉匆诳签字日期：粕年月1 尹日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解黑龙江大学有关保留、使用学位论文的规定，有权 保留并向国家有关部门或机构交送论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权黑龙江大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 学位论文作者签名：栩遮 导师签名：奄粕鸯 签字日期：w g 年易月f 乒日 签字日期：h 年易月f 严日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 电话： 通讯地址： 第1 章绪论 第1 章绪论 农药在农业生产中起着重要的作用，根据联合国粮农组织统计，如不使用农 药全世界每年平均因病、虫、草害造成的损失约占农作物产量的3 7 ，年损失高 达1 2 6 0 亿美元。而在农药应用中，由于有机磷农药( o r g a n o p h o s p h o n l s p e s t i c i d e s ，o p s ) 具有高效、快速、广谱等特点，其用量占全部农药用量的8 0 肛9 0 i 引。 各类农药所占的比例是衡量一个国家农药生产水平和污染状况的重要指标。在发 达国家，除草剂：杀虫剂：杀菌剂的比例通常为4 ：2 ：2 ，而我国则为2 6 ：1 2 6 ： 2 。目前我国农药原药产量达万吨以上的品种1 2 个，杀虫剂1 1 个，除草剂1 个。 因此，我国有机磷农药污染面积大，影响范围广。 1 1 有机磷农药的危害 自1 9 4 4 年德国拜耳公司生产的世界上第一种有机磷杀虫剂“对硫磷( 1 6 0 5 ) 至今已有7 0 多年的历史。随着有机磷农药大规模使用之后，o p s 的危害成为人类 急待解决的问题。一是o p s 对土壤、水体、大气环境造成了严重污染，o p s 真正 用于毒杀虫害的量通常仅占使用总量的很少部分，约1 0 2 0 左右，8 0 9 0 将 最终进入土壤1 3 j ，大部分都直接进入了环境。国家环保总局检测了1 0 0 多份地下水 样。在某省甘蔗地2 叫o 米的地下水中仍有甲拌磷等农药检出1 4 】；二是o p s 破坏 了生态系统的平衡，使鸟类、鱼类、昆虫等的多样性和种群大大降低，同时使害 虫产生抗药性，迫使农民提高用药量，而且使土壤微生物的群落发生显著变化， 影响了土壤的肥力，使生产力下降；三是造成农产品农药残留严重，直接危害人 类身体健康，残留的农药进入有机体，大部分对生物体内胆碱酯酶有抑制作用， 抑制胆碱酯酶使其失去分解乙酰胆碱的能力，造成乙酰胆碱积累，引起神经功能 紊乱，从而导致肌体的损害。我国食用蔬菜引发的中毒事件也时有发生，其中9 8 是有机磷农药残留引起的1 5 j 。 1 2 有机磷农药的降解 有机磷农药本身具有自然降解的特性1 6 7 l ，但是由于使用量大，时间长，自然 1 黑龙江大学硕士学位论文 降解需要的周期k 。因此o p s 在自然界中的累积和危害已经成为人类急待解决的 问题。目前研究最多的方法主要有两大类：理化降解和微生物降解。 1 2 1 有机磷农药的理化降解 目前常用理化降解法主要有氧化降解、光催化降解、碱解法、超声波法，电 离辐射法等。氧化降解包括臭氧降解、双氧水降解、次氯酸钙降解，都是通过强 氧化剂与o p s 反应，使农药分子双键断裂、苯环打开。但是利用氧化降解法往往 会产生毒性更高的降解产物l 剐。同其他农药相比，o p s 对光更敏感，o p s 分子能 在太阳光的作用下，形成激发态分子，导致有机磷农药分子中键的断裂，如辛硫磷在 2 5 3 7 舢的紫外光下照射8 0 h 以后逐渐光解消失l q i ，另外o p s 可在土壤中催化剂和 氧化剂如t i 0 2 ，f e o ，f e + 2 等的作用下发生光催化降解。但是深层土壤及水体中的 有机磷农药无法被光降解，所以此方法很难有效祛除大量的有机磷农药残留。另 外，超声波法、电离辐射法、碱解法等，都是将难降解的有机污染物分解为环境 可以接受的小分子物质的方法。超临界水氧化法就是利用超临界水良好的溶剂性 能和传递性能，使o p s 在超临界水中迅速、有效地氧化降解。 理化方法降解有机磷农药虽然效果不错，但是成本高、易造成二次污染等缺 点限制了其发展和应用。生物修复( b i o r e m e d i “o n ) 是近年来兴起的清除有机污染物 的生物技术，其根本是利用微生物对环境中的污染物进行彻底、快速的降解l l0 1 。 1 2 2 微生物降解 1 2 2 1 微生物降解有机磷农药的研究概况 微生物降解农药的研究，晟早是a u d u s 报道了关于土壤微生物对有机氯农药 2 ，4 一滴的分解研究l 。1 9 7 3 年，s e t h u n a t h a n 和y o s h i d a 从含有o p s 的土壤中分离 出第1 株有二嗪磷和对硫磷降解活性的黄杆菌( 砌v d 6 口c f p ，f 甜所) 。在不到4 0 年的时 间里国内外在微生物降解o p s 一领域取得了巨大成果。在研究的初级阶段，研究 者把重点放在o p s 高效降解菌的筛选上，比如1 9 7 4 年，m 咖e c k e 等分离到一株 具有降解对硫磷作用的假单胞菌( n p 甜如m d 刀傩) 。随后研究重点由高效降解菌株的 筛选逐渐转移到降解机理相关方面，j m p e m b e r t o n 等从1 9 7 7 年开始，先后几次 第1 章绪论 报导了农药降解质粒的存在和性质。随着埘降解机理的深入探索，研究重点也慢 慢转移到了酶研究方面，2 0 世纪7 0 年代初黄杆菌( 胁v d 6 口d p ，甜所印) a t c c2 7 5 5 1 被分离出来，证明有降解乙基对硫磷的生物活性1 1 = ；l 。1 9 8 9 年，m u l b r y l l 4 i 和d u m a 孓 分别从黄杆菌和假单胞菌( 风p 如聊d ，7 甜d i m i n u t am g ) 中首次分离纯化出了有 机磷水解酶o p h ( 又称磷酸三酯酶p t e ) 。m u 加e c k e l l l 卜1 8 1 ：从混合菌荧光假单胞茵 ( 月“d 阳5 c p ，? ，芦p z ，如聊d 以娜) 、短杆菌属( 肌1 ，6 口c ，p ，f 甜脚) 、固氮单胞菌属口z d f o 册d 刀傩) 、 黄单胞杆菌c 杨胛，矗d m d 门鲫) 提取了对硫磷水解酶。m u 彻e c k e 将对硫磷水解酶固定于 多孔玻璃微粒制成固定化酶，固定化酶对对硫磷的净化率达9 5 以上。8 0 年代中 期之后，对微生物降解有机磷农药的研究重点主要集中在酶和基因的领域，1 9 8 5 年s e r d a r & g i b s o n 克隆表达了缺陷假单胞菌( p 甜如研d 刀砌”f 玎甜，口) 的对硫磷水 解酶基因。d u m a s & c a l d w e l l ( 1 9 8 9 ) 等人对来自缺陷假单胞茵的具有降解农药能 力的磷酸三酯酶进行了纯化及性质研究。我国近年来也取得了很大的进步。如王 永杰等人i l9 1 ，从污泥中分离到降解敌敌畏、对硫磷、乐果的不动菌属菌株。闰艳 春等i ! o 】将抗性尖音库蚊五带亚种的抗有机磷农药基因克隆到质粒p r l 4 3 9 中，重 组质粒中的酯酶基因已得到表达。王永杰等1 2 1 j 利用原生质体转化技术构建有机磷 农药降解工程菌j p z ，对甲胺磷、敌敌畏和对硫磷降解率比供体菌株明显提高。 1 2 2 2 降解有机磷农药的微生物种类 自然环境中的部分细菌，真菌，放线菌，藻类等对有机磷农药具有降解作用 ( 表1 1 ) 1 2 2 彩】。目前对细菌和真菌研究的比较深入1 2 4 猫】，细菌包括假单胞菌属 ( p 甜咖聊d ，? 珊) 、芽孢杆菌属( 肋c c f ，船) 、节细菌属0 厂，枷6 口c f p 力、棒状杆菌属 ( c d 缈d 6 口f ，p 厂f “聊) 、黄杆菌属( 砌v d 6 口“i 甜脚) 、黄单胞杆菌属行，办臼研d 行埘、固 瘤细菌属( 彳肋，d 聊d 刀甜s ) 、硫杆菌属( 砌面6 口c f 刀淞) 等。降解有机磷农药的真菌有曲霉 属( 爿印p 曙f ，甜s ) 、青霉属( 尸加把肼z f 聊) 、木霉属( 开f c 办d 出删口) 、酵母茵( 勋c c 向口厂。厅c 岱) 等。此外藻类对有机磷也有降解作用，如小球绿藻属( c 矗d 厂d 砌) 可降解甲拌磷、对 硫磷等。 黑龙江大学硕士学位论文 1 2 2 3 有机磷农药微生物降解的机理 进入土壤中的有机磷农药在土壤微生物的作用下，能被彻底分解成c 0 2 等简 单化合物，降解主要分为两大类，一类是微生物直接利用有机磷农药，其本质为 酶促反应h 川，由于微生物本身含有该有机磷农药降解酶的基因而合成出其降解酶， 这种情况下，选育降解菌株比较容易，选育过程也比较短。或是微生物本身无有 机磷农药降解酶基因，但是经过环境因素的诱导而发生了基因重排而产生了新的 酶。酶促降解是微生物对有机磷农药降解的主要形式。胞外酶与胞内酶在有机磷 降解过程中有一定差异，当降解酶为胞内酶时1 2 叽引儿，其前期的降解反应相对迟缓， 这是因为其降解过程为有机磷农药在细胞表面的吸附、渗入、发生酶促反应。吸 附过程是导致降解初期的降解速度相对迟缓的原因，但是进入渗入过程后降解过 程十分迅速。有机磷农药的降解酶主要有氧化、脱氢、水解、还原等酶促类型 。 在相应降解酶的作用下，有机磷的p s ，p n ，p o 等键打开，通过酶促反应生成 简单的无机物。大肠杆菌的磷酸三酯酶能断开甲胺磷的p s 键，氯代过氧化物酶 也可以切断有机磷农药p s 键0 3 2 邯】。阮少江等推测甲胺磷的微生物降解是从甲 胺脱氢酶打断p - n 键开始的。有机磷农药对土壤中的酶活性也存在抑制作用，抑 制程度的大小随着外界环境的变化而变化，如p h 值、氧含量、温度等，而且不同 种类的有机磷农药对酶的影响也是不同的，但反过来，有机磷农药对酶的活性也具 有一定的激活作用。朱南文等【3 5 j 发现在施用甲胺磷的初期，甲胺磷对土壤中酸性 磷酸酶、中性磷酸酶和碱性磷酸酶呈一定的抑制作用，而在4 d 后抑制作用消失， 并出现了激活作用。郭明1 6 j 等发现，在7 d 内氧化乐果和久效磷对土壤中的脱氢酶 产生抑制作用，9 d 后对脱氢酶的抑制作用消失，反而出现了激活作用。这是因为 微生物对外界环境的o p s 浓度适应后，细胞内部趋于稳定，细胞内的酶含量也与 o p s 浓度相适应，因此对o p s 降解率成上升趋势。 第1 章绪论 表1 1 部分有机磷农药降解菌及其能降解的农药 t a b l e1 1m i c r o o r 2 a n i s mt h a tc a nd e 2 r a d eo r g a n o p h o s p h o u sp e s t i c i d e s ( p a n i a l ) 有机磷农药种类高效降解菌 马拉硫磷 甲拌磷 对硫磷 甲基对硫磷 苯硫磷 敌敌畏 甲胺磷 地虫磷 敌百虫 蝇毒磷 久效磷 二嗪磷 乐果 氧化乐果 异硫磷 毒死蜱 杀螟硫磷 丙线磷 水胺硫磷 杀螟松 杀螟腈 苯硫磷 假单胞菌属、黄杆菌属、木霉属、节杆菌属、根瘤菌属、 黄曲霉、聚多曲霉、微球菌、绿色木霉、米曲霉 假单胞菌属、硫杆菌属、小球绿藻属 芽孢杆菌属、黄单胞菌属、固氮菌属、短杆菌属、假单 胞菌属、黄杆菌属、根瘤菌属、木霉属、青霉属、节杆 菌属、不动杆菌属、分枝菌属、农杆菌属、固氮极毛杆 菌属、小球绿藻属 短杆菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属、黄杆菌属、邻单 胞菌属、产碱菌属、分枝菌属、农杆菌属、节杆菌属 芽孢杆菌属 假单胞菌属、木霉属、芽孢杆菌属 黄杆菌属、酵母属、曲霉属、假单胞菌属、芽孢杆菌属、 不动杆菌属 青霉属、根霉属 青霉属、曲霉属、镰刀菌属 放射形土壤杆菌、诺卡氏菌、假单胞菌属 假单胞菌属、节杆菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属 黄杆菌属、假单胞菌属、链霉菌、节杆菌属 不动菌属、黑曲霉、假单胞菌属、黄曲霉、曲霉属、假 单胞菌属 巨大芽孢杆菌、芽孢杆菌属、曲霉、光合细菌、毛霉 假单胞菌属、节杆菌属 微球菌、固氮极毛杆菌属、黄杆菌属 伯克霍尔德菌 恶臭假单胞菌 动性球菌属、侧孢芽孢杆菌 黄单胞菌属、芽孢杆菌属 黄单胞菌属 芽孢杆菌属 5 黑龙江大学硕士学位论文 共代谢降解是指微生物不能直接利用有机磷农药，但在其生长过程中产生了 既能消耗生长基质又能降解有机磷农药的非专一性酶。如艾涛等p ，分离出一株 曲霉( 彳s 胪留w 船) ，是以共代谢方式降解乐果的对乐果的降解率达2 9 2 。石利利 等【3 8 j 在研究假单胞菌d l l 一1 ( 风p 甜如聊d 臼s ) 在水溶液介质中降解甲基对硫磷的性能 及降解机理中发现，d l l 1 菌可以将甲基对硫磷完全降解为n 0 2 。和n 0 3 。自然界 中广泛存在着大量的具有共代谢功能的微生物，它们可以降解多种类型的化合物。 因而，共代谢作用在o p s 的微生物降解过程中发挥着主要的作用i n 9 1 。微生物降解 有机磷农药的重要作用位点和酶的种类如表所示，磷酸酯水解酶是一类广谱降解 酶，是有机磷农药微生物降解的主要酶。 表1 2 微生物降解有机磷农药的主要作用位点和酶的种类h o 】 酶作用位点酶种类酶催化作用 微生物降解农药的主要生化反应有1 4 l 4 2 j ：( 1 ) 氧化反应，微生物体内的氧化反 应包括：羟化反应( 芳香族羟化、脂肪族羟化、n 羟化) 、环氧化、n 一氧化、p - 氧化、 s 一氧化、氧化性脱烷基、脱卤、脱胺；( 2 ) 还原反应，还原反应包括硝基还原、还 原性脱卤、醌类还原等：( 3 ) 水解反应，一些酯、酰胺和硫酸酯类农药都有可以被 微生物水解的酯键，如对硫磷等，( 4 ) 缩合和共轭形成，缩合包括将有毒分子或一 6 第1 章绪论 部分与另有机化合物相结合，从而使农药或其衍生物物失去活性。微生物降解 农药，通常为多个反应协同作用共同完成对农药的降解。 另类是由于微生物的代谢改变了周围环境而间接作用于有机磷农药。主要 包括矿化作用和种间协同代谢作用。矿化作用是指微生物直接利用有机磷农药作 为其生长基质，把有机磷农药代谢产生c 0 2 ，h 2 0 等物质。种间协同代谢指的是 生存在同一环境中的微生物共同代谢一种有机磷农药的作用形式，其中某种微生 物可使有机磷农药化学键断开，但没有使其彻底降解成无机物的能力，所以需要 其他菌株配合进行进一步降解，多菌株的混合培养是一种可行的方法f 4 引。 1 2 2 4 影响微生物降解o p s 的因素 1 2 2 4 1 微生物的自身特性 微生物种类不同，代谢活性不一样，适应性也存在差别，并且同一种类的不 同菌株对同一有机底物的反应都不同1 4 4 书l 。此外，微生物适应环境的能力较强， 比较容易被驯化，通过适应过程，新的化合物能诱导微生物产生相应的酶系来降 解它，或通过基因突变等建立新的酶系来降解它1 4 6 1 。有时单一菌株在o p s 中驯化 的时间不足以进化出完整的代谢途径，不能彻底将o p s 降解成c 0 2 、h 2 0 等无毒 物质，而在生物降解过程中会产生毒性中间物质积累因而彻底矿化，所以有时需 要两种或两种以上的菌株协同降解，一种微生物降解一部分，经过数种微生物的 接力作用和协同作用，通过多步反应将有毒化合物完全矿化，这种群体作用更能 抵抗生物降解中产生的有毒物质1 4 。 1 2 2 4 2o p s 结构( 种类) 不同的0 p s ，其成分不同，毒性不同。对于毒性大的o p s ，一般微生物耐受性 差，因而生物降解性差。虞云龙等1 4 引等报导了农药疏水性决定其降解速度，疏水 性大，降解速度慢。王永杰等”4 l 在对一株具有广谱性o p s 降解菌地衣芽孢杆菌j 1 ( 觑川淞舷居阴咖册括) 对甲胺磷、敌敌畏、对硫磷的降解活性研究中证实了这一点。 其中亲水性大的甲胺磷易被降解。低水溶性的o p s 易形成独立的非水相，该相中 因o p s 密度大，所以毒性强，很难被微生物降解。一些易吸附在土壤上的o p s ， 7 黑龙江大学硕士学位论文 因减少了与微生物的接触，而使生物降解活性降低。采用表曲活性剂u 丁疏散农药， 对提高微生物降解效率非常有效。 1 2 2 4 3 底物浓度 农药浓度越高，对微生物的毒性越大，微生物不能适应而死亡，使微生物的 数量下降。农药浓度过低，微生物生长的碳、氮源不足，将抑制微生物的生长， 从而抑制有机磷农药的微生物降解。刘玉焕等1 4 9 1 证实乐果浓度在o 1 2 时其实验 菌株降解效果最好，而在0 1 1 和o 1 5 则呈下降趋势。 1 2 2 4 4 环境因素 影响微生物活性的主要因素有温度、p h 值、氧气量、营养程度等，不同种类 的微生物将对这些因素作出不同的反应。温度对微生物的影响突出，温度过高使 微生物无法生存，温度过低则使微生物的活性受到抑制，p h 值也会对微生物造成 类似的影响。朱南文等陋习从受有机磷农药长期污染的土壤中通过富集培养，分离 筛选到一株降解乐果活性较高的曲霉z 5 8 ( 么印昭舭) 菌株，在主要作用底物为 有机磷农药时，该菌株的最适培养温度3 0 ，培养起始p h 7 ，培养时间9 6 h ；酶 反应的最适温度和p h 值分别为4 5 和p h 7 2 ，在4 0 以下及p h 乱9 范围内稳定。 根据微生物种类的不同氧气量对降解o p s 的影响也不同，好氧微生物在好氧条件 下能够降解农药，而在厌氧条件下降解效果不好；对于厌氧微生物，情况可能正 相反。营养对于以共代谢作用降解农药的微生物更加重要，因为微生物在以共代 谢的方式降解农药时，并不产生能量，需其他的碳源和能源物质补充能量。对于 p h 值、营养度、氧气量，可以用添加石灰、营养物质和氧源来调节，但是适于 微生物的温度一般难以控制。 1 2 2 5 微生物降解有机磷农药的应用 近年来，随着微生物降解农药机理的阐明和分子生物学的兴起，越来越多的科 研工作者把研究的方向转向农药微生物降解的应用性研究陋o 】。由于农药对环境的 污染不仅在于其在农田的使用产生的残留上，农药厂排出的废水也对环境造成严 重污染和危害。对o p s 生产废水的微生物处理是这一领域的重点。 r 一 第1 罩绪论 目前，国内外对有机磷降解菌在生物修复中的应用已经展开了广泛的研究。 m u l b r y 等从蝇毒磷污染的土壤中分离的菌株制成生物过滤柱，在7 d 1 0 d 内可将污 水中1 5 0 0 m l 驹蝇毒磷降低到o 1 m g l 。华小梅等川利用黄杆菌伊伽d 6 口p ，觑州 和酵母菌的混合菌对甲胺磷废水进行处理中发现，混合菌的降解能力远高于单一 菌株。曹志方等将假单胞菌w b 1 ( p z ，如所d 门口s ) 和瓶形酵母菌w y 2 ( 尸f 9 彻妒d ，姗 d v 口比) 组成混合菌，利用序列批量式反应器( s e q u e n c i n gb a t c hr e a c t a r ，s b r ) 对 甲胺磷生产废水进行处理，在甲胺磷浓度为1 0 0 0 m 叽1 8 0 0 m g l 范围内时，甲胺 磷的去除率达到8 5 以上。刘国斌p 二j 等利用s b r 工艺处理o p s 废水后，废水中有 机磷9 8 以上可转化为无机磷。李顺鹏等将甲基对硫磷的降解菌产碱杆菌 ( 彳砌，袒胛p ss p ) 接种于含有甲基对硫磷的土壤中进行田间试验，农药加菌、农 药加有机肥加菌的处理其稻米中的甲基对硫磷残留均检测不到，而对照( 只施农药 不加菌) ，稻米中的甲基对硫磷含量为0 0 6 5 m g l ( g ，超过国家标准( 0 0 5 m g l ( 酚。此 外，程国锋等用甲胺磷降解菌芽孢杆菌n m j ( b 伽f ，搬s p ) 和乐果降解菌尸s p n m l 的菌制剂进行普通白菜变种矮脚黄残留降解小区试验，结果表明，菌剂对残留的 甲胺磷和乐果有明显的去除效果。在盆栽试验中，稻米与稻壳中甲基对硫磷比对 照下降了8 2 2 l0 0 。陈敏等l ”j 利用聚乙烯醇包埋活性炭固定微生物，对水胺硫 磷的降解进行试验，固定化微生物对该农药的降解能力优于未固定化微生物，经 固定的微生物对温度、酸碱度和水胺硫磷浓度适应范围扩大。当水胺硫磷浓度为 1 3 0 0 2 5 0 0 m g l 时去除率为5 5 7 2 。安徽固源生物工程公司与多家国家级科研单 位合作，筛选出一种高效、广谱的农药降解酶，发明了利用生物工程手段来工业 化生产农药降解酶技术。这种高科技生物酶技术，对我国大量使用的o p s ，如1 6 0 5 、 甲基1 6 0 5 、敌敌畏、二嗪农、毒死蜱等均有很高的降解率。常温下7 1 5 分钟，在 产品推荐的使用量下，在这类农药超过国家允许残留标准4 0 倍左右时，其降解率 能够达到9 0 胁9 8 ，也就是说，可以基本甚至完全清除蔬菜瓜果上残留农药，而 且这种产品可以一年四季在不同地区和不同气候条件下广泛使用。 黑龙江大学硕士学位论文 1 3 微生物降解o p s 的技术方法 1 3 1 降解菌的分离和驯化方法 降解有机磷农药的微生物菌株，可从水体、土壤等污染环境中直接分离筛选 或经富集培养获得。富集培养有分批培养、连续培养、土壤渗滤环流等手段。分 解农药的微生物有细菌、真菌、放线菌及藻类( 见表1 1 ) 在已分离和注释的细菌中， 以假单胞菌( p s p “如m d 玎口s ) 、黄杆菌f = w 倒d 6 订c 把r f “叫为代表的革兰氏阴性菌占多数， 它们借助外壁层脂多糖保护，免受有机磷农药的毒害。m a l l i c 4 l 等从土壤中分离 出一株节杆菌，办厂d 6 口c ，s p ) ，该菌对甲基对硫磷、杀螟硫磷、对硫磷均具有较 强的降解能力，还分离出一株对杀螟硫磷、二嗪磷、甲基对硫磷、对硫磷等均具 有高效降解能力的黄杆菌( 用伽d 6 口f ，p ，f 删s p ) 。19 9 2 年，z b o n i n s l ( n 首次报道分离 出一株桔青霉菌( n 胛f f f ，7 f z f 研c f f ，加”所) 能以有机磷化合物为唯一碳源进行生长； 中山大学刘玉焕等p5 j 从广州农药厂的活性污泥中分离到曲霉l 8 ( 爿印p 枷) ，该菌 株是到目前为止以乐果为唯一碳源和能源的霉菌，降解率可达5 8 。除此之外， 刘玉焕等i 】分离到一株曲霉凹妒p 倒，琊s p ) 对乐果、甲胺磷、马拉硫磷、对硫磷农 药都有一定降解作用。近年来，一些学者的研究认为真菌有丰富的酶系，在有机磷 农药的降解中有非常重要的作用。传统的分离菌株方法只能分离出极少数的微生 物【j ，可以在采集土样后直接驯化活性淤泥，用于o p s 的降解。 鉴定筛选菌株是否为优势菌株，可以在相当长的时问内反复分离获得同一菌 株，然后用显微镜技术鉴定。随着现代生物化学与分子生物学技术的发展，抗体 探针，核酸探针，1 6 s r d n a 序列同源性分析和各种p c r 扩增技术、荧光技术、磷 脂脂肪酸谱图( p h o s p h 0 1 i p i d sf a t t ya c i d ，p l f a ) 分析用于微生物鉴定，获取更加丰富的 微生物多样性信息。r r n a 素有“细菌化石 之称，r d i n a 序列同源性分析在细菌 鉴定上具有不可替代的作用其中以1 6 s r d n a 序列分析较为常用。陈亚丽1 5 7 l 等从农 药污染的土壤中富集分离出甲基对硫磷降解菌w b c 3 ，经过对该菌株1 6 s r d n a 序 列的比较分析，鉴定为假单胞菌( p ”如研d 胛哪)