（微生物学专业论文）被孢霉△12脂肪酸脱氢酶基因表达的研究.pdf

南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文 中文摘要 中文摘要 亚油酸( l i n o l e i ca c i d ，l a ) 作为花生四烯酸、前列腺素和白三烯等生理活性物 质的前体，对人体的激素调节及脂肪酸代谢起重要的作用。由于人体缺乏合成亚油 酸的能力，所以亚油酸为人体必需脂肪酸。同时，亚油酸还是植物和微生物中膜脂 的重要组成成分并且是多种生物信号物质的前体。 ”一脂肪酸脱氢酶( d e l t a - 1 2f a t t yd e s a t u r a s e ，d 1 2 d ) 是形成l a 的限速酶。本 研究以产脂肪酸的丝状真菌被孢霉属的m 口加i n aa t c c l 6 2 6 6 和m i s a b e l l i n am 6 2 2 为出发菌株，在其e d n a 中分别克隆到”脂肪酸脱氢酶基因，在大肠杆菌和酿酒 酵母两种模式生物中进行了表达，建立了原核表达的体外活性检测系统，并对真核 表达的最适条件进行了探索。同时对其功能与温度的调控关系进行了初步研究。 从含有高山被孢霉和深黄被孢霉”一脂肪酸脱氢酶基因的重组质粒p t m a c l l 2 和p t m i c l l 2 中酶切出12 k b 的特异性片段。亚克隆到大肠杆菌表达载体p e t 2 1 a 中，在大肠杆菌d h 5o 中筛选到含有目的片段的重组质粒p m a c l l 2 和p m i c l l 2 。 用经典氯化钙方法转化到大肠杆菌b l 2 1 e 3 ) 中。通过超速离心的方法得到大肠杆 菌的细胞膜蛋白，加入外源底物油酸，在体外表达体系中催化产生目的产物亚油 酸。通过g c m s 对体外表达体系中的脂肪酸进行分析表明：分别有1 7 8 7 6 和 1 7 6 0 4 的油酸转化为亚油酸。这也是深黄被孢霉d 1 2 d 基因在大肠杆菌中得到表达 的首次报道。 在不同的碳源、诱导物浓度、诱导温度、诱导时间下对含有重组质粒p y m a l 2 和p y m i l 2 的酿酒酵母进行诱导培养，发现在3 半乳糖为诱导物，1 5 诱导3 6 小 时后，亚油酸在总脂肪酸中含量最高，分别达到2 05 9 8 和15 9 1 9 ，从而支持了生 物体中低温下“一脂肪酸脱氢酶表达活性增加的理论。通过提取不同温度诱导后的 酵母中总r n 丸以a ”一脂肪酸脱氢酶的p c r 产物为探针进行n o r t h e r n 杂交，发现随 着温度降低，转基因酵母中该基因的m r n a 水平并无明显变化。 关键词：高山被孢霉，深黄被孢霉，亚油酸，”脂肪酸脱氢酶基因，基因表 达，脂肪酸g c 分析，n o r t h e r n 杂交 堕墅查兰婴主竺窒生兰些! 兰堡! 堕苎2 坚! ! ! 兰 a b s t r a c t l i n o l e i ca c i d ( 1 8 ：2 6 9 ”，l a ) ，ap o l y u n s a t u r a s e df a t t ya c i d ，p l a y sa ni m p o r t a n tr o l e i nh o r m o n e r e g u l a t i o na n df a t t ya c i dm e t a b o l i z a t i o n i th a s b e e ns h o w na st h eb i o l o g i c a l p r e c u r s o r s o fa g r o u p o f m o l e c u l e s ，i n c l u d i n gp r o s t a g l a n d i n s ，i e u k o t r i e n e s a n d t h r o m b o x a n e ss i n c et h e r ei sn o a b i l i t y o fh u m a nb o d yt o p r o d u c e ，l ai s c a l l e d “n e c e s s a r yf a t t y a c i d ”l ai sa ne s s e n t i a l c o m p o n e n ti n m e m b r a n eo fp l a n ta n d m i c r o b e s ，a l s op r e c u r s o ro f b i o l o g i c a ls i g n a lm o l e c u l e s ”一f a t t ya c i dd e s a t u r a s e 巾1 2 d ) i s t h er a t e - l i m i t i n ge n z y m ei nt h ep r o d u c t i o no f l ad 1 2 d g e n e sw e r e c l o n e df r o mc d n af r o mt w of i l a m e n t o u sf u n g u sw i t hh i g hf a t t y a c i d - p r o d u c i n ga c t i v i t yo f m o r t i e r e l l as p p w ee s t a b l i s h e dt h eg e n ee x p r e s s i o ns y s t e m s i ne s c h e r i c h i ac o l ia n ds a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ，e s t a b l i s h e dt h e s y s t e m o ft h e a c t i v i t y d e t e c t i o na f t e re x p r e s s i o ni ne s c h e r i c h i ac o l ia n df i n dt h eb e s tc o n d i t i o n s f o r e x p r e s s i o n i ns a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e a tt h es a m et i m e ，t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e n e x p r e s s e dd 1 2 d a n dt h et e m p r a t u r ei sa l s oa n a l y s e d u s i n gp l a s m i dp t m a g l l 2 a n dp t m i c l l 2c o n t a i n i n g a “一f a t t ya c i dd e s a t u r a s e g e n e f r o mm o r t i e r a l l a a l p i n a a n dm o r t i e r a l l ai s a b e l l i n aa s s u b s t r a t e , 12 k bd n a f r a g m e n tw a sg o tb ye n z y m e - c u t t h ef r a g m e n tw a ss u b c l o n e di n t ot h ev e c t o rp e t 2la ， t h e nt w or e c o m b i n a n t e x p r e s s i o np l a s m i d sp p m a l 2 a n dp p m l l 2w e r ec o n s t r u c t e dt h e t w op l a s m i d sw a st r a n s f o r m e di n t oe s c h e r i c h i ac o i lf o re x p r e s s i o nb yc a c l 2 i tw a s f o u n dt oe x h i b i t a ”f a t t y a c i dd e s a t u r a s ea c t i v i t yi nt h er e c o m b i n a n t e s c h e r i c h i ac o l i p p m a l 2a n dp p m l l 2i nt h ep r e s e n c eo f e x o g e n o u sf a t t ya c i ds u b s t r a t eo l e i ca c i da f t e r i n t r o d u c t i o no fi p t g e x p r e s s i o n o ft h e “f a t t y 。a c i dd e s a t u r a s e g e n e s u n d e r a p p r o p r i a t et e m p e r a t u r e a n dm e d i ac o n d i t i o n sl e dt ot h e p r o d u c t i o n o fa c t i v e “- f a t t y a c i dd e s a t u r a s e i nv i t r at h ed e s a t u r a s e sh a v i n ga c t i v i t yc a nt r a n s f o r m17 8 7 6 a n d l 7 6 0 4 o l e i ca c i dt ol i n o l e i ca c i db yg c m sd e t e c t i o n ，r e s p e c t i v e l y i ti st h ef i r s t r e p o r ta b o u te x p r e s s i o no f m ：i s a b e l l i n ad 1 2 dg o n ei ne s c h e r i c h i ac o l i s c e r e v i s i a ec o n t a i n i n gr e c o m b i n a n t v e c t o r s ：p y m a l 2 a n dp y m l l 2w e r ec u l t u r e d ， r e s p e c t i v e l y a f t e ri n d u c e dw i t hd i f f e r e n te v o c a t o r ，d i f i e r e n tt e m p e r a t u r e ，d i f f e r e n t i n d u c i n gt i m e ，d i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o no fe v e c a t o r ，w ef o u n dt h a ti n d u c i n gb y3 g a l a c t o s ea t 15 a n du s i n gg l y c e r o l a sh y d r o c a r b o nm a d et h el a r g e s tc o n t e n to f l i n o l e i ca c i di nt o t a lf a t t ya c i d ，2 05 9 8 a n d1 59 1 9 ，r e s p e c t i v e l y t h i sr e s u l ts u p p o r t t h eh y p o t h e s i st h a tt h ea c t i v i t yo f t h e e x p r e s s i o no f ”一f a t t y a c i dd e s a t u r a s ew o u l d i n c r e a s ei nc o l ds i t u a t i o nt o t a lr n a o f s c e r e v i s i a ew a se x t r a c t e da f t e ri n d u c t i o na t i i 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文 英文摘要 d i f f e r e n tt e m p e r a t u r en o r t h e r nb l o t t i n ga n a l y s i si n d i c a t e dt h a tm r n a l e v e l so f t h e g e n ei nt r a n s g e n i cx c e r e v 时i a e h a v en od i f f e r e n c e si nd i f f e r e n tt e m p e r a t u r e sw h i l e i n d u c i n g k e yw o r d s ：m o r t i e r a l l aa i n a ，m o r t i e r a l l ai s a b e l l i n a ，l i n o l e i ca c i d ，a ”f a t t y a c i d d e s a t u r a s eg e n e ，e x p r e s s i o no f g e n e ，g ca n a l y s i so f f a t t ya c i d ，n o r t h e r nb l o t t i n g i i i 堕堑茎兰堡圭竺茎兰兰些! 兰竺! 丝茎! i ：奠 第一章绪论 第一节多不饱和脂肪酸的研究概况 多不饱和脂肪酸( p o l y u n s a t u r a t e df a t t ya c i d ，p u f a ) 是指含有两个以上双键且碳 原子数为1 6 至2 2 的直链脂肪酸。动物、植物和微生物等的膜脂中含有特定的不 饱和脂肪酸，其不饱和程度就是由催化脱饱和反应的脱氢酶所调节嘲。 一、多不饱和脂肪酸的生物合成及生理功能 ( - - ) p u f a s 的生物合成途径 多不饱和脂肪酸生物合成中所涉及的主要脂肪酸的种类列于表1 1 中。 表l + l ：主要的不饱和脂肪酸 t a b l e1 - 1 ：m a i nu n s a t u r a t e df a t i ya c i d 名称种类 s t e a r i ca c i d 硬脂酸 18 ：0 o i e i ca c i d 油酸 1 8 ：1 l i n o l e i ca c i d 亚油酸 l8 ：2 n - l i n o l e n i ca c i da 亚麻酸 y 1 i n o l e n i ca c i dy 亚麻酸 a r a c h i d o m ca c i d 花生四烯酸 e i c o s a p e n t a e n i ca c i d 二十碳五烯酸 d o c o s a h c x a e n o i ca c i d 二十二碳六烯酸 1 8 ：3 ( 一3 ) i83 ( u 一6 ) 2 0 ：4 ( u - 6 、 2 0 ：5 ( u - 3 、 2 2 ：6 ( ( i ) 一3 ) 在真核微生物中，多不饱和脂肪酸的生物合成是以长链的饱和脂肪酸硬脂 酸( 十八烷酸) 为底物，经碳链延长( 增加两个碳原子) 和脱饱和( 引入一个双 键) 两个主要反应而完成的】。碳链延长是由膜结合的延长酶( e l o n g a s e ，e l ) 催化 完成，脱饱和作用是由膜结合的细胞色素b5 ( c y t b 5 ) 、n a d h c y t b 5 还原酶和脂肪 酸脱氢酶( f a t t ya c i dd e s a t u r a s e ，d s ) 组成的酶系完成的。整个合成途径中在油酸 ( 1 8 ：1 9 ) 和亚油酸( 1 8 ：2 9 ”) 位点各有一个分支点，按照代谢方式不同分为n 6 和n - 3 两个途径。l a 是共同前体，在此基础上经一系列的碳链延长和脱氢反 应，合成a a 、d h a 和e p a 等具有生物活性的长链p u f a 。生物合成路线如图1 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文绪论 1 4 1 。其中：实心箭头代表反应在高等植物中很普遍：空心箭头代表反应之在一些植 物中出现；虚线箭头代表仅在较低等生物中出现。 l a l 7 _ c j 。s n ”乏。，。 1 g 砂 2 n 6 、：未三虿3 博：而( g l a j t 8 ：4 r 1 3 ：巾 ， c l t 鐾a s # 。 v 2 0 ：3 n 6 d h g i a ) i ：t 矿，船s 抓“椰e a l a o t a ) ，： v 2 0 ：4 n 3f f r a ， - v a ”m m ；。v 2 0 ；4 n 6 ( a a - - - - - - _ 卜2 0 ：5 】1 3 ( e p a n 6 k “) f 洲! v 2 2 ；5 n 3f d p a l a 4 。d 。# “t n ： v 2 2 ：6 n 3 ( 1 ) f a n 3 圈1 - 1 多不饱和脂肪酸的生物台成途径 f i g 卜1t h eg e n e r a lb i o c h e m i c a lp a t h w a yo f i nv i v os y n t h e s i s o f p u f ai nv a r i o u so r g a n i s m s p u f a 合成过程中脂肪酸链的延长和脱饱和作用随着对哺乳动物的系统研究以及 在真核微生物线粒体中活性酶的发现，表明此类反应有可能在细胞质的内质网中发 生。 ( 二) p u f a s 的生理功能 在多不饱和脂肪酸中，亚油酸( 1 i n o l e i ca c i dl a ) 、y 亚麻酸( y 1 i n o l e n i c a c i d ，g l a ) 和花生四烯酸( a m c h i d o n i ca c i da r a ) 被称为必需脂肪酸( e s s e n t i a l f a t t y a c i d ，e f a s ) 1 5 1 亚油酸是u 一6 和u 3 两类p u f a 的母体，在生物体中经过一 堕墅查兰堡圭里窒生兰些! 兰垡! 堡兰堕堕一 系列脱氢酶催化和碳链延长而衍生成其它p u f a 。由于哺乳动物缺乏在脂肪酸的第九 位碳原予以上的位置引入不饱和双键的脱氢酶，所以人体不能合成亚油酸以及其后 的y 亚麻酸和花生四烯酸，必需从食物中获取。因此，l a 、g l a 和a r a 被称为必 需脂肪酸。 必需脂肪酸至少有四种主要的生理功能： 1 调整膜的结构与功能【6 】。 它们对生物膜结构、功能、相转变、通透性的调节及膜相关过程的控制有重要 作用，在体内所有膜的流动性和柔韧性都受必需脂肪酸含量的影响。生物膜上磷脂 分子中缺少不饱和脂肪酸时，细胞膜的完整性与流动性降低，细胞功能减退。必需 脂肪酸的膜效应可能是它们最重要的功能。必需脂肪酸对膜的流动性的影响取决于 它在膜中的浓度及其所含双键的个数。具有同样双键的u 一3 系列的多不饱和脂肪酸 不能改变或逆转因缺乏u 6 e f a 造成的缺乏症，因而必需脂肪酸双键的构型也是重 要的。另外，膜中脂肪酸的构型不仅对膜本身很重要，而且也影响膜内许多蛋白的 结构和功能，例如离子通道、受体蛋白和a t p 水解酶等，因为这些蛋白完全游离在 脂膜中，它们的功能依赖于膜的行为。必需脂肪酸还能控制细胞膜的通透性。机体 缺乏必需脂肪酸皮肤就会失去防水性，亚油酸和y 亚麻酸能很好地回复正常的水不 通透性，而其它脂肪酸可能不具有这种作用。 2 可以转化成一些重要的生理活性物质的前体物【7 1 。 如y 一亚麻酸是合成前列腺素( p g ) 、白三烯、过氧羟基脂肪酸等的前体物，尤 其是y - 亚麻酸的氧化衍生物具有蚵控癌细胞分化的功能。 3 调控胆固醇的运输和代谢。 必需脂肪酸的胆固醇酯比饱和脂肪酸酯和单一不饱和的油酸易溶且容易运输。 当食物中多不饱和脂肪酸含量高时，形成的多不饱和脂肪酸胆固醇酯熔点较低，易 于乳化、输送和代谢，因此不易诱发动脉硬化症及冠心病。g l a 、e p a 具有降血 脂、降血糖、抗血栓、抗炎、抑制血小板凝聚的功能，而d h a 则具有健脑、促进大 脑发育，防止老年性痴呆及抗心血管疾病的作用 9 1 。同时保护大脑和神经系统( 1 0 l 。 由于p u f a 在机体物质代谢和功能上发挥重要作用，近年来受到医学界的普遍 关注和重视，对机体抵抗疾病和抗衰老等方面取得了显著效果。基于p u f a 在治疗 和保健方面的功能，使得具有生物活性的多不饱和脂肪酸的生产成为科研和商业关 注的焦点。 堕墅奎堂堡圭笪塞生里些! 兰垡! 堡兰望韭! 一 二、多不饱和脂肪酸的生物资源 自然界中的p u f a 广泛分布于动物、植物和微生物中。p u f a 主要存在于植 物、动物和微生物中。存在方式主要有两种，一是以多磷脂的形式存在脂膜上，另 外是以三酰甘油的形式存在t - r 孙j t ”l 。 ( 一) 动物资源 动物油脂中多为饱和脂肪酸，必需脂肪酸含量较少，但在鱼、虾类中含有一定 量的p u f a ，以e p a 、d h a 含量最多1 1 3 p u f a 的组成和含量随鱼的种类、季节、生长 环境等不同而变化。目前全世界鱼油产量约为1 0 0 万吨，其中e p a 和d h a 的吉量 约占1 0 2 5 万吨，是一个非常可观的数字。遗憾的是，在加工过程中由于被氧化和 掺入人造黄油或起酥油，而使p u f a 被破坏，另外鱼油多被氢化处理而使p u f a 加 氢饱和，从而使p u f a 部分被破坏或降低了含量。因为大部分的动物只含有5 、 6 、9 等脂肪酸脱氢酶【1 4 l ，自身不能合成l a 、a l a 、g l a 或更长的p u f a ，所以 必需从微生物和植物中获取p u f a ，以满足其生长发育的需要。 ( 二) 植物资源 植物中的脂肪酸合成出现在叶绿体和其它质体。脂脱氢基本上包括两条主要的 途径【l ”。一条被称为原核途径，1 8 ：0 - a c p 在叶绿体中脱氢为1 8 ：1n 一9 ，然后脂化 在三磷酸甘油s n - 1 位上，1 6 ：0 - a c p 在s n 一2 上形成磷脂。磷脂是叶绿体磷脂( 甘油 磷脂) 的前体。另一条途径成为真核途径，1 8 ：0 在脂体合成，在胞质中以油酰辅酶 a 出现并脂化到内质网上以形成双乙酰甘油( d a g ) 、磷脂酸、和主要的甘油磷脂、 卵磷脂( p c ) 、磷脂酰氨基乙醇( p e ) 、磷脂酰丝氨酸( p s ) 、磷脂酰纤维醇 ( p i ) 。脱氢发生在内质网上，主要以卵磷脂的形式1 8 ：ln 一9 脱氢成1 8 ：2n 一 6 i l 。两种途径都出现在光合作用的组织，而只有真核途径出现在无光合作用的组 织，如油料种子。在含有1 6 ：3 植物( 蓝细菌、菠菜、拟南芥等) 中这种情况很复 杂，两种途径可以平行进行，c 1 8 的s n l 位和c 1 6 的s n 一2 位连接在m g d g ( 单半乳 糖双乙酰甘油) 上，而在c 1 8 ：3 植物( 豌豆、香菜等) 中真核途径占主导地位，具 有双1 8 ：3 的m g d g ”1 。 在植物资源中，p u f a 主要存在于植物种子中，尤以胚芽含量最高。近年来，人 们分析了豆油、花生油、棉籽油、芝麻油、玉米油、米糠油、向日葵油等植物油， 其中p u f a 含量约在2 0 5 0 之间，其中亚油酸含量最为丰富。月见草( o e n o t h e m b i e n n i s l ) 又称夜来香( e v e n i n gp r i m r o s e ) 和山芝麻( w i l ds e s a m es e e d s ) ，是一 种重要的产p u f a 植物。原产于北美洲，后传播至世界各地，目前世界上至少有1 6 堕要查兰堡主塑窒兰兰些! 兰焦! 堡茎曼里一 个国家种植这种植物。我国月见草主要分布于东北南部及东部山区的向阳山坡、荒 地、河岸等地。月见草种子含油率在2 3 3 0 之间，这种油含有丰富的g l a ，含量 约为7 1 0 ，为所有食用植物油之冠，另外，还含有7 0 8 0 的亚油酸，其不饱 和脂肪酸总量高达9 0 以上 t 9 , 2 0 1 。 除月见草外，p u f a 还存在于其它某些含油的植物种子中，如紫草科 ( b o r a g i n e a s e ) 中的琉璃苣( b o r a g eo f f i c m a l i s ) 、柳叶菜科( o n a g r a c e a e ) 的月见 草( o e n o t h e r ab i e n n i s ) 、玄参科( s c r o p h u l a r i a c e a e ) 及虎耳草科( s a x i f r a g a c e a e ) 的黑加仑( b l a c k c u r r a n t ) 、红加仑( r e d c u r r a n t ) 和醋粟( g o o s e d e r r y ) 等植物的种 子中 2 1 。z , 2 3 , 2 4 l 。 但由于植物天然资源有限，同时植物种子资源受气候、产地等诸多因素的影 响，加之生产周期长等原因，远远不能满足社会的广泛需求，因此人们把视线转入 自然界最为丰富的资源微生物。 ( 三) 微生物资源 在自然界中，微生物，特别是在一些藻类、真菌和细菌中p u f a 含量丰富【2 ”。 藻类、真菌和细菌具有一系列的脱氢酶和延长酶等活性物质，因此能够从简单的化 合物合成p u f a 2 6 1 。真核微生物中的p u f a 以两种形式存在，一是以多磷脂的形式 存在于原生质膜中，其次是以三酰甘油油滴的形式作为积累油的形式存在于胞内， 其中由三磷酸甘油通过酯化作用合成三酰甘油的反应也与内质网相关【2 7 1 。 蓝细菌在脂肪酸脱氢酶的研究中占有重要地位。这是不同于植物与细菌的一类 生物，但由于它们有光合作用的能力，通常把它们当作经典的植物模型。同时，蓝细 菌又具有许多原核生物的特征，如没有显著的核等等。 由于蓝细菌和叶绿体类囊体的结构和脂成分很类似，并且脂肪酸脱氢依赖氧而 不像其它的原核生物，所以蓝细菌成为高等植物脂代谢的良好模型。现已证明，兰 细菌s y n e c h o c y s t i ss p p c c 6 8 0 3 的类囊体膜能对m g d g 中的1 8 ：0 和1 8 ：1 进行脱 氢，此反应需要还原态的铁合蛋白连接的电子供体系统1 2 s 。 p u f a 广泛存在于真菌、单细胞藻类及某些细菌的细胞中，但是不同种类，甚至 同种而不同菌株的p u f a 的含量及组成也不相同。真菌中的大多数脂肪酸都是含有一 到三个双键的不饱和脂肪酸。以1 6 ：0 和1 8 ：0 为最初底物的9 、”、1 5 脱氢 酶。与动物类似，真菌细胞中单不饱和脂肪酸的生成是氧依赖性的过程，微体膜结 合的三组分系统包括：细胞色素b 5 ，n a d h 一依赖性细胞色素b 5 还原酶和9 脂肪酸脱 堕茎查兰堡主盟塞生望些! 兰焦! 笙塞一堂 氢酶。许多品系的酿酒酵母和其他真菌在实验室培养条件下只产生1 6 ：l 和1 8 ：l ， 只有a9 脱氢酶。此外，酿酒酵母和粗糙脉胞酶的9 缺陷性不能催化饱和脂肪酸脱 氢。这种高回复突变的品系依赖外源1 8 ：1 来生存m 1 。真菌中的硬脂酰9 脱氢酶得 到了广泛的研究 3 1 1 。 1 9 4 8 年b e r n h a r d 和a l b e r c h t 首先从布拉克须霉( p h y c o m y o e s 6 a 开口s ，p p a 口u s ) 的菌丝体油脂中鉴定出真菌的( ；【a ，含量高达菌体脂肪酸的1 6 ， 其后n u g t e r n 证明了其结构与月见草种子油的g l a 是一样的。1 9 6 4 年s h a w 从藻状菌 纲( p h y c o m y c e t e s ) 的4 个目、子囊菌纲( d s c o m y c e t e s ) 的7 个目，担子菌纲 ( b a s i d i o m y e e t e s ) 的5 个目中挑选出若干菌株进行脂肪酸分析，发现只有藻状菌 纲( 目前为接合菌纲z y g o m y c e t e s ) 的菌株含有g l a 且不含a 一亚麻酸。破囊壶菌是 海洋真核生物，其分类学一直存在争议，虽然有科学家把它们归为异鞭毛海藻，但大多 数人仍然把它们归为藻菌植物( 类似于海藻的真菌) 1 3 2 1 。破囊壶菌中的 t h r a u s t o c h y t r i u ms p 和s c h i z o c h y t r i u ms p 中出人意料的产生大量2 2 碳6 烯酸， 占总脂肪酸的5 0 左右1 3 2 , 3 3 】。被孢霉属可像“和”一样表达5 和6 脱氢酶活性 l 3 4 。1 9 8 0 年w e e t e 在他的l i p i db i o c h e m i s t r y o f f u r g i a n do t k e r o r g a n i s m s ) ) 一书中指出，低等真菌脂肪酸组成的一个最显著的特征是含有g l a 及其 同系物，如c 2 0 ：3 a 8 “，c 2 0 ：4 a6 “”“等，而高等真菌如子囊菌纲、担子菌纲、半 知菌纲只含有a 一亚麻酸。其后的许多资料报道了低等真菌中脂肪酸的研究报告。 目前，p u f a 的主要来源包括：在植物中通过筛选植物种子来提取l a 、g l a 和a l a ，但受季节和气候影响，导致p u f a 产量和质量的不稳定：从海洋鱼油中提 取e p a 和d h a ，需对低品质的油进行精炼，大大增加了p u f a 的生产成本，而且 往往造成给不饱和脂肪酸加氢生成饱和脂肪酸【3 5 j 。 由于微生物本身具有成本低、生产不受季节和原料的限制、繁殖快、生产周期 短及可以规模化生产等优点，因而具有非常广阔的前景，正在成为p u f a 的替代来 源。某些真核微生物的确可以在胞内大量积累p u f a ，因而利用微生物发酵生产 p u f a ，可以做为p u f a 的替代来源，这对生物：【程学家来说无疑是一项具有诱人前 景的研究领域。 鉴于p u f a 的供应量不能满足其需求量及用于生物药品所需纯度，有必要寻求 其它新的生物来源。2 0 世纪九十年代以后，随着分子生物学的发展，关于p u f a 生 物合成途径中关键的脱氢酶的研究有了飞速的发展，生产p u f a 的研究进入了分子 生物学阶段。 曼量奎堂璺主堑塑竺望些! 兰些! 堡兰兰韭! 一 第二节脂肪酸脱氢酶的研究概况 一、概述 多不饱和脂肪酸的形成是通过一系列碳链的脱氢和延长作用来完成的，在这其 中，所有的脱氢作用都是由各种脂肪酸脱氢酶完成的，这些脱氢酶活性的高低直接 影响着p u f a 代谢的进程。因此，对各种脂肪酸脱氢酶的研究日渐成为学术界关注的 热点。 脂肪酸脱氢酶所涉及的是一个酶的超家族，其中包括所有动植物中发现的能为 脂酰链加上双键的酶。虽然都是利用从电子传递链获得的分子氧作还原等价物并且 还原反应的基本机制十分类似，我们仍可以把他们分为三个主要的亚家族p 6 j ： ( 1 ) 酰基a c p 脱氢酶( a c y l a c pd e s a t u r a s e s ) 为脂化在酰基携带蛋白( a c p ) 上的脂肪酸脱氢引入双键，在植物质体的胞浆 中发现。 ( 2 ) 酰基脂脱氢酶( a c y l 1 i p i dd e s a m m s e s ) 内质网、植物叶绿体膜和蓝细菌( 蓝绿藻) 类囊体上的膜结合酶，为脂肪中的 脂肪酸脱氢。此类脂肪酸脱氢酶分布最为广泛。 ( 3 ) 酰基辅酶a 脱氢酶( a c y l c o ad e s a t u m s e s ) 为连接在辅酶a 上的脂肪酸引入双键，结合在动物和真菌的内质网膜上。 脱氢酶可以根据电子供体利用的是细胞色素b 5 还是铁合蛋白，各自的还原酶， n a d h 还是n a d p h 进一步分类。 脂肪酸脱氢酶的分布很广泛，除少量细菌外，动物、植物和微生物中都有脱氢 酶存在 3 7 10 脂肪酸的脱氢酶系统由3 种蛋白质组成：n a d h 细胞色素b 5 还原酶、 细胞色素b 5 和脂肪酸脱氢酶所构成，该酶系统需要氧分子和n a d h 或n a d p h 参 与f 3 ”。脂肪酸脱氢酸的分子生物学研究起步较晚，2 0 世纪八十年代末和九十年代初 开始，一些脂肪酸脱氢酶基因的克隆和表达的才开始报道。由于用常规的生物化学 方法很难分离纯化到这些酶，所以严重限制了对这些酶的研究。近年来，越来越多 的学术工作者开始关注脂肪酸脱氢酶，大大推动了研究的进展。 二、脂肪酸脱氢酶的结构与功能关系 ( 一) 脂肪酸脱氢酶的序列特征 通过对目前已知的各种膜结合蛋白脱氢酶序列进行分析，发现脱氢酶的结构具 有相当的一致性3 9 1 ：n 端和c 端同源性较差；序列中部相对保守，同源性较强：都 塑墅查堂堕主堕窒兰望些! 兰垡! 堡兰 堕堡 有两段长的疏水区，可以形成4 个跨膜区，特别是含有三个极度保守的组氨酸区。 第一个：h x ( 3 “饵h ，第二个：h x ( 2 。r3 ) h h ，第三个：h x ( 2 。，3 ) h h ( a5 、a6 脱氢 酶中第三个组氨酸区变成了q x ：h h ) 。而且三个组氨酸保守区之间的距离也是保 守的，第一和第二个组氨酸区之间的距离具有高度的保守性，表现在其长度为3 1 个 氨基酸。第二个与第三个组氨酸保守区之间的距离在1 3 2 1 7 7 氨基酸之间。膜结合 的脂肪酸脱氢酶保守区结构域的氨基酸序列分析如图1 2 ，空间结构如图1 3 。图1 2 中所示依次为基因序列号、物种名称、基因名称及基因类型。 a z 黼i 轴w r m m i m l 必$ 4 $ 稿口7 o 、o m n m “ d 瀚貅 ，柳4 # 3 “自* 女瞄 g 洲f q ，口 ? 跚# ，- 删蛳，a 蚋 ，i i j ，m “* 0 ”y 辅喀妇5 钟口蝴坤 - t 罐t 蚺瞒舢x # 甜e m “ 1 0o g 托 h w m 柏蛘m 1 ￥r j i 、啪e 越y “】， in “# 坩8 9 w 抖 蛘 d 鹫e = = = e = = = = = c 3 = = = = = c = c c c = ：= = = j = 常= = = c = ) z x = = = = = = t 3 = = = = ：= 茹 i ；：渭删二= 删= j ；崔：崧：= # ：= ：= = 】雠：l ：= ：= = 二= = = e = = = ：= ：= ：o “o x ：= ：* # = ：= = = = * = ：= ：= ：= ：= ：i ，。，- 十- 4 ? ，- 一，”。 ? ! 憨蒸f 蓁 。4 一，o w0 “”0 ：z n 。二- ，” ； 。- ：驸群鼬”j t i ，知鼎x ： p 一：，x 、一十，h ， h ：i 、o ：- ：，甄”日“ 口t 一鼎娟 ，一 - ：一：* ，：、m 一啦w r “ w m 、，“，- 舡“i ”7 t ，2 。、7 一协，嚣e u i “。| ，。；一# v “* - x tn # 一 r 、x 、v ，y px 、，牡+ d g ；日，# j 十， 一+ # o 、女、 w 十4 一，：巾，；川，枷c - # h ：，+ m ￥舞_ p ：+ h p o 自：二t ；。脚k # ，1 喇# 静v ；g tj 啦f 辫h ，： dv 、o 舢m 脚 h ，* ：辩嚣“ * - i q ? ； q ! 4 _ “ “ 口 一y x ；删t c w 卅辩一静“# i o ；h 嚼) “ 州：l r 一“母时”静“ 女：t * ”母 。静一： 一 o 囊 ，髓“，_ ， “6 ，一o 讲姆“m 扦w h x ，f 咻n 零“暂f h 一露川g 卧， 、d ”，州静”嘞 e 一# o + 哇卧忡 一、船或矗h ， # 州f ，x ：、7 ”钟“擀w n h + ：t ”奈h 瓢忡w 7 十：，r* # * l 黧、。 图l 一2 膜结合的脂肪酸脱氟酶的保守区结构域的比较 f i g1 - 2 d o m a i ns t r u c t u r ea n dc o n s e r v e d s e q u e n c ea l i g n m e n to f r e p r e s e n t a t i v em e m b r a n e - b o u n df a t t ya c i dd e s a t u r a s e a 膜结合脱氢酶基因中可分辨区域的图示灰色区域代表含有超过4 0 个 氨基酸残基的疏水区，此区域可跨膜两次。斑点区域代表质粒上的转移序 列，阴影区域代表与细胞色素b 5 类似的区域。空白区域是保守的组氨酸区。 b 组氨酸保守区的序列排布。保守的组氨酸残基已标出。 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文 圈1 - 3 膜结合脂肪酸脱氢酶的拓扑结构模式图 f i g 1 - 3 m o d e lo ft h ep r o p o s e d t o p o l o g yo ft h em e m b r a n e - b o u n dd e s a t u m s e s c o n s e r v e d h i s t i d i n ec o n t a i n i n gr e g i o n sa l ei n d i c a t e d 从图1 3 膜结合脂肪酸脱氢酶的结构模式中可以看出，脱氢酶的两个疏水区跨 膜4 次，在细胞质一侧有3 个组氨酸保守区与1 个二价铁离子结合，构成脱氢酶催 化的活性中心。三个组氨酸保守区的组成如表1 3 4 0 , 4 1 , 4 2 所示。 表1 - 2 脂肪酸脱氢酶组氨酸保守区的氨基酸组成 t a b l e l 2c o n s e r v a t i v eh i s t i d i n ec l u s t e ri nt h ef a t t ya c i dd c s a t a r a s e s d e s a r u r a s c h i s t i d i n ec l u s t e r o r g a n i s m a 9 a c y l c o a a n i m a i ，y e a s t a9a c y l - l i p i d c y a n o b a c t e r i a h i g h e rp l a n t s a1 2a c y l l i p i d c y a n o b a c t e r i a h i g h e rp l a n t s a “a c y l 1 i p i d c y a n o b a c t e r i a h i g h e rp l a n t s a6a c y l - l i p i d h x x x x h h x x x x h h x x x x h h d c g h h x c g h h d c g h h d c g h h x x h h e x x h x x h h e x x x x h r x h h e x x x x h r x h h h x x x x h x x h h e x x x x h x x h h h x x x x h r t h h h x x x x h r t h h e g w h n n h h e g 啊n n h h h x x h h h x x h h h h x x x x h v a h h h h x x x x h v i h h c y a n o b a c t e r i a h d x n h h x x x h q x x x h h 9 a ”和”脂肪酸脱氢酶都有8 个组氨酸，对于鼠的可溶性9 。脂肪酸脱 氢酶和蓝细菌( s y n e c h o c y s t i s ) a ”脂肪酸脱氢酶基因的突变研究证明，保守区中 的8 个组氨酸对于脱氢酶的催化活性是必需的【4 3 i 。近几年，在一系列关于5 、s 甫开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文 绪论 及8 一脱氢酶的研究中发现，h i s l i i 区组成不同于”、”一脱氢酶，其第一个组氨 酸( h ) 被谷氨酰胺( q ) 取代。这个新的脱氢酶的家族一般在n 端的外延区含有 细胞色素b 5 ( c y t o c h r o m eb 5 ，c y tb 5 ) 的结构”