（无机化学专业论文）新型双功能螯合剂中间体的合成与表征.pdf

摘要 时间分辨荧光免疫分析法是2 0 世纪8 0 年代以来发展起来的一项新的免疫分析技 术，除了具有分析灵敏度高、测量范围宽、精密度好等优点外，在免疫分析方面更具 有独特的优势。它通过使用稀土配合物作为标记物，通过延迟测量时间的方法，能有 效地消除背景荧光的干扰。 时间分辨荧光免疫分析法中重要的是双功能螫合剂的合成，体系中使用的双功能 螯合剂不仅要具有与蛋白连接、与稀土离子螯合的功能；同时，其与稀土离子形成配 合物后，要能够通过分子内能量传递，向稀土离子高效的传递能量，顺利地实现荧光 增强的作用，从而实现直接固相检测的目的。因此，理想的双功能螯合剂是实现直接 固相镧系体系的关键。 本论文从直接固相时间分辨荧光免疫分析双功能螯合剂合成需要出发，参考有关 文献，设计、合成和表征了n ，n ，n ，n - 2 ，6 一二( 3 一氨甲基一1 一吡唑基) - 4 - 溴吡啶 四( 乙酸乙酯) 及几种重要的中间体。实验以2 ，6 一二溴吡啶为起始原料，经过氧化、 硝化、还原、亲核取代、重氮化、自由基溴化等反应进行合成，利用差热分析、红外 光谱、1 h 核磁、气相一质谱、元素分析等测试手段对各步产物进行了表征以证明产物结 构和合成方法的可靠性。 关键词双功能螯合剂中间体合成表征 a b s t r a c t t i m e ，r e s o l v e df l u o r o i m m u n o a s s a yi san e wi m m u n o a s s a yt e c h n o l o g ye s t a b l i s h e di n 1 9 8 0 s ，i na d d i t i o nt oa n a l y s i sw i t hh i g hs e n s i t i v i t y , w i d er a n g e ，g o o dp r e c i s i o n ，a n do t h e r a d v a n t a g e s ，i nt h ei m m u n o a s s a yh a v em o r eu n i q u ea d v a n t a g e s t h r o u g ht h eu s e o fr a r ee a r t h c o m p l e x e sa sam a r k e r ，b yt h em e t h o do fm e a s u r i n gt i m ed e l a y ，c a l le f f e c t i v e l ye l i m i n a t e t h ei n t e r f e r e n c eo fb a c k g r o u n df l u o r e s c e n c e t h es y n t h e s i so fb i f u n c t i o n a lc h e l a t o rw a st h ek e yo ft i m e r e s o l v e df l u o r e s c e n c e i m m u n o a s s a y t h ec h e l a t o rs h o u l dn o to n l yh a v et h eb i f u n c t i o n a lp r o p e r t i e s ：c o n j u n c t e dw i t h p r o t e i na n dc h e l a t e dw i t ht a r e - e a r t hi o n ，b u ta l s ot r a n s f e rt h ee n e r g yt or a r e e a r t hi o n a n i d e a lc h e l a t o ri st h ek e yt e c h n o l o g yo fd s l f i a i nt h i sp a p e r , t e t r a ( e t h y l ) n ，n ，n ，n - 【2 ，6 - b i s ( 3 一a m i n o m e t h y l p y r a z o l - 1 - y 1 ) 一4 一( 4 一n i t r o p h e n y l e t h y n y l ) p y r i d i n e 】t e t r a k i s ( a c e t a t e ) a n ds e v e r a li m p o r t a n ti n t e r m e d i a t e sw e r ed e s i g n e d ， p r e p a r e da n dc h a r a c t e r i z e da c c o r d i n gt oc o r r e l a t i v el i t e r a t u r ew i t ht h ea i mt os a t i s f i e dt h e n e e do fb i f u n c i o n a lc h i e l a t o r e sf o rd i r e c ts o l i dl a n t h a n i d et i m e - r e s o l v e df l u o r e s c e n c e i m m u n o a s s a y ( d s l t r f i a ) t h e s ei n t e r m e d i a t e sw e r ep r e p a r e df r o m2 ，6 - d i b r o m o p y r i d i n e b yo x i d a t i o n 。n i t r a t i o n ，r e d u c t i o n ，n u c l e o p h i l i cs u b s t i t u t i o n ，d i a z o t i z a t i o n s a n d m e y e ra n d n b sr e a c t i o n sa n ds oo i l d u r i n gt h ee x p e r i m e n t a t i o n ，t h es t r u c t u r eo ft h ep r o d u c t sw e r e d e t e r m i n e db yd s c ，i r ，1 h - n m r ，m s ，e l e m e n ta n a l y s i sa n ds oo nt op r o v et h er e l i a b i l i t yo f t h e s es t r u c t u r e sa n ds y n t h e t i cm e t h o d s k e yw o r d s ：b i f u n c t i o n a lc h e l a t o r i n t e r m e d i a t e s y n t h e s i s c h a r a c t e r i z a t i o n i i 长春理工大学硕士学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的硕士学位论文，新型双功能螯合剂中间体的合成 与表征是本人在指导教师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中 已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的 作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标 明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 作者签名；箍鑫五幽年立月堕日 长春理工大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解“长春理工大学硕士、博士学位论文版 权使用规定”，同意长春理工大学保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的 复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权长春理工大学可以将本学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，也可采用影印、缩印或扫描等 复制手段保存和汇编学位论文。 作者签名： 指导导师签名： 第一章绪论弟一早珀化 1 1 引言 1 1 1 标记免疫分析法的发展历程 标记免疫学是一门集基础医学、实验医学及临床医学于一体的综合性边缘学科。 近年来，标记免疫分析技术是在检测技术中发展最快的一个领域之一。其基本原理是 利用抗原抗体结合反应的特异性，加上各种标记物的易检测性和放大作用来检测各种 微量物质，它常用于医学、农业、食品卫生等多个行业，它检测的物质包括分子量较 小的半抗原，比如叶酸、雌二醇、孕酮、吗啡及雌三醇等，也包括分子量较大的蛋白 质、多肽、核酸、受体、细胞表面抗原、肿瘤标记物及妊娠相关血浆蛋白等完全抗原。 在临床上，既有完全手工操作、廉价的商品化试剂，也有全自动操作、重复性较好的 进口试剂。但它们还是有各自的一些优缺点，是一门不断发展、需要不断完善的学科n 。4 ：。 根据标记物不同，临床常用方法可分为：荧光免疫分析( f l u o r e s c e n c e i m m u n o a s s a y , f i a ) ，放射免疫分析( r a d i o i m m u n o a s s a y , r i a ) ，酶免疫分析( e n z v m a t i c i m m u n e o a s s a y 。e i a ) ，胶体金免疫分析( c o l l o i d a lg o l di m m u n o c h r o m a t o g r a p h i ca s s a y ， g i c a ) ，化学发光免疫分析( c h e m i l u m i n e s c e n c ei m m u n o a s s a y ，c l i a ) 及新兴的时间 分辨荧光免疫分析( t i m e r e s o l v e df l u o r o i m m u n o a s s a y , t r f l a ) 。1 9 4 1 年c o n s _ 乖n k a p l a n 建立了世界上第一种免疫标记技术f i a ，其基本原理是：用荧光素作标记物，在荧光显 微镜下直接观察呈现特异性的抗原抗体复合物及其存在的部位，但是用普通荧光分子 作为标记物容易受到散射光、样品的背景荧光和荧光猝灭等多种因素的干扰晡艰，导致分 析的本底高、灵敏度低，很难适应微量物质检测的需要，现临床上多用于检测灵敏度 不高，不需要精确定量的免疫组化等领域。自1 9 5 9 年由美国科学家b e r s o n 和y a l l o w 陋1 0 j 创建r i a 以来，由于灵敏度较高，设备简单，此技术得到了空前发展和广泛应用，使得 标记免疫分析检测的灵敏度大幅度提高，然而放射性元素如佗。i 作为标记物也为r i a 带来 了一些不可避免的缺陷：( 1 ) r i a 试剂的生产、运输和使用必须采用相应的射线防护措 施，废物的处理也必须经过特殊的方式完成；( 2 ) 由于放射性同位素的自身衰变较快， 因此r i a 试剂的有效期较短，重复性较差：( 3 ) 1 2 5 i 较快的衰变速度影响7 r i a 有限的可 检测性；( 4 ) 在超微量物质的检测中，要求标记物具有较高的比活性和较长的有效期 但现在常用的放射性标记物如1 2 5 i 、1 3 1 i 、3 h 、5 7 c o 等都不能很好的满足这两个条件。7 0 年代后，又产生了e i a ，其基本原理和r i a 相同，只是使用各种酶作为标记物，由于酶 的高效催化作用是一个强大的信号放大系统，因此一度认为e i a 是代替r 1 a 的新方法， 但是随着e i a 的大量应用人们发现存在以下缺陷：( 1 ) 通过测量酶反应物的0 d 值对酶 活性定量是一种不够灵活的定量方式，至多为半定量检测；( 2 ) 酶反应物的0 。d 值仅 在低浓度范围内与酶活性呈线性关系，对于血清中高浓度待测物的h o o k 效应严重也 降低了待测物测量值的准确性；( 3 ) 酶的活性易受异常血清等多种因素的干扰( 如保 存温度不当致酶失活导致假阴性，溶血标本常导致假阳性) ，导致e i a 的灵敏度、准确 性不高；( 4 ) e i a 的分子标记容易影响被标记物的空间结构，使得e i a 的灵敏度进步 提高受到限制，因此现临床中常用定性检测如乙肝两对半的阴阳性判断n 卜1 3 1 。与此同时 化学发光免疫分析( c l i a ) 在方法学研究和仪器研制方面取得了很大成功，直接以化 学发光物质( 如：鲁米诺) 为标记物，虽然具有灵敏度高、特异性强、检测范围宽、 自动化程度高的特点，但是影响因素较多，化学反应后，样品只可一次检测，无法重 复测量0 4 1 们。新型的电化学发光免疫分析( e l e c t r o c h e m il u m i n e s c e n c ei m m u n o a s s a y ， e c l i a ) 是利用三联吡啶钌 r u ( b p y ) 3 3 + 和三丙胺在电场触发下产生的光学发光反应， 灵敏度高，检测程序简单、快捷，易于用做均相免疫测定，但是目前e c l i a 还是非开放 性试剂系统，受到专利保护，不能用于科研，并且试剂价格过高，现临床应用较少n 7 刊。 1 9 7 9 年芬兰的s o i n i 和h e m m i l a 提出时间分辨荧光免疫分析理论，1 9 8 3 年s o i n i 和k o j o l a 等首先报道以镧系元素标记和时间分辨荧光测量相结合，建立t t r f i a 。该法具有灵敏 度高( 可达1 0 _ 8 m o l l ，较r i a 高出3 个数量级) ，无放射性污染，可重复检测，设备简单， 系统开放，而且还可以实现多标记测量，自动化程度提高，已经成为标记免疫分析技 术的优秀代表渺2 2 1 ，从2 0 世纪9 0 年代以来，国内也开始对t r f i a 进行研究，并发表了一 些关于t r f i a 的论著瞳3 啪3 。目前临床上使用p e 公司的d e l f i a 系统较多，研究国产的t r f i a 系统具有广阔的前景。 1 1 2 时间分辨荧光免疫分析的原理 时间分辨荧光免疫分析利用了具有独特荧光特性的镧系元素( e u 3 + 、t b 争、s m p 、d y 3 + ) 及其螯合物代替传统的荧光物质、放射性同位素、酶、胶体金、化学发光物质等作为 示踪物乜7 哪3 ，利用时间分辨荧光免疫分析检测系统，测定反应产物中的荧光强度，用于 检测蛋白质、多肽、激素、生长因子、标志物、肿瘤特异性抗原、核酸、神经递质、 受体、细胞表面、药物浓度及传染源等各种微量物质。t r f i a 作为一种新的灵敏的检测 方法，主要因为镧系元素具有独特的荧光特点和检测中采用的波长分辨和时间延迟技 术。 时间分辨荧光免疫分析f t r f n ) 是以三价稀土离子如e u ( i i i ) 、t b ( i i i ) 等通过具有双 功能基团结构的螯合剂，在水溶液中容易与抗原分子以共价双键结合，形成稀土离子 螯合剂抗原螯合物。当标记抗原、待测抗原共同竞争抗体，引起免疫反应后，免疫复 合物中抗原抗体结合部分，就含有稀土离子，采取一些办法将结合部分与游离部分分 开，利用时间分辨荧光仪，测定复合物中稀土离子发射的荧光强度，从而确定待测抗 原的量。 稀土配合物发射的荧光寿命高的可达l 2 m s ，比普通荧光寿命高出5 个数量级。根 据荧光物质的荧光寿命不同采用时间分辨荧光测定技术在采集荧光前，引入一个延 迟时间( d e l a yt i m e ) ，待短寿命的背景荧光完垒淬灭后再测定稀土配合物的长寿命荧 光信号强度，这样就可以有效地消防来自蛘晶、试剂、及其它非特异性荧光的干扰， 极大地提高了荧光免疫分析法的灵敏度( 图11 1 。 脚澜 图l _ 1 时间分辨荧光免疫分折原理示意图 11 3 时间分辨荧光免疫分析的特点 1 镧系元素的荧光特点 荧光物质的光谱分为两个部分：激发光谱和发射光谱。但普通荧光物质它们之间的 s t o k e s 位移较小( 仅为2 0 3 0 h m ) 且荧光寿命较短。激发光谱和发射光谱有部分重叠( 图 l 2 ) ，而且易于猝灭。凼此用普通荧光物质标记，检测灵敏度和特异性受到极大限制， 使得荧光免疫分析不能用于超微量物质的分析。镧系元素位丁元素剧期表的第六周期， 共有1 5 种元素，在物理和化学性质上较为相似。荧光光谱也包括激发光谱和发射光谱 主要有以下特点：( 1 ) 荧光寿命长( i 0 一1 0 0 0 9 s ，常用的e u ”的荧光寿命为1 4 p s ) 高 出普通荧光物质( 卜l o o n s ) 5 - 6 个数量级( 表卜1 ) i ( 2 ) 镧系元索荧光光谱中发射 光谱( 如铕6 1 3 r i m ) 和激发光谱( 如铕3 4 0 r w n ) 不熏叠，之间具有巨大的s t o k e s 位移( 如 铕有2 7 3 n m 位移) ( 图13 ) ，而普通荧光位移仅有几十纳米：( 3 ) 不同镧系元素其 发射光谱不同，具有不同的最大发射波长( 图l4 ) ，是多标记技术的检测基础；( 4 ) 激发光光谱较宽，最大波鲢在3 0 0 5 0 0 n m ，利r 增高激发能，提高标记物的比活性；发 射光光谱较窄，小于1 0 姗，检测时利于降低本底，提高分辨率：( 5 ) 虽然标记物发光效 率小高，但通过解离一增强技术，可以使得荧光信号显著增强。 图12 异硫氟荧光素荧光光谱 3 最 r _ 一 磊萼【匿 + 图l3 镧杀元素巨大的s t o k e s 位移 表卜1 常见荧光物质和铕及其蟹合物的荧光寿命 荧光物质荧光寿命( n s ) 人血清蛋白 球蛋白 乙醇水溶液 5 氟尿嘧啶化合物 荫维因农药 细胞色素c 荧光素一异硫氰酸 蚪磺酰氯 非特异性背景荧光 铕及其螫台物 2 检测方法的特点 在检测方法上，同时利用了波长分辨和时间延迟检测技术。由于不同的镧系元素 离子，有不同的最大发射光谱( 图14 ) 。当进行寥标记时，检测不同波长，就可咀测 虽出不同镧系元素的含鼍，另外由于背景荧光发光时间较短，镧系元素发光时间较长 ( 图l5 ) ，延迟检测能排出背景荧光的干扰。综合这两种技术的应用，时间分辨具有 多标记检测和抗干扰能力强等特点。 汕 ， ：= m 州 图14 四种镧系元素不问的发射光波长 罔1 5 锢系元素标记物的衰变时间 1 2 时间分辨荧光免疫分析法的研究进展 自1 9 7 9 年s o i n i 和f l e m m i l a 提出t r f i a 理论，众多学者致力于此项研究。国外从2 0 世 纪8 0 年代初开始，对t r f i a 开展了大量的临床试验，并推卅了商品化的t r f i a 分析仪和 i j 己套的试剂盒，己任临床疾病检测巾得到广泛应用。国内对t r f i a 的研宄开始，一2 0 世纪 8 0 年代末期。至上个世纪末，已在方法学研究、整台剂合成、测量仪器生产r 取得r 初步成果t 并卜1 9 9 2 年和1 9 9 4 年召开了两届全国性医用时间分辨荧光学术研讨会，受 到多学科研宄领域工作者的重视。目前，时间分辨荧光免疫分析技术大致有以一f 四种 分析系统和技术方法。 121 解离一增强镧系荧光免疫分析体系( e l f l ) d e l f i a 体系主要是由芬兰w a l l a e 生化实验室( 现p e r k i n e l m e rl i f es c i e 1 e e s 公司1 研究并开发出来的。首先用一种与镧系离子配位且没有荧光的化合物参加免疫反应， 这样镧系离子被定量地与螯合剂相连，反应结束后，通过加入p h 值为3 2 的荧光增强 溶液( b n t a 和t o p o - + - t r i t o nx 1 0 0 ) 减少螯合剂与镧系离子的亲和性，使镧系离子从 非荧光螯合物中解离出来，在荧光增强溶液中形成荧光配合物，从而进行时间分辨荧 光测定。测定原理如图1 6 所示。 m 曲枷渊o n 7 、 一i n 一删o n “ 占o o o o 粤譬眵o m o l l n _ 。r e 眦e 幻o 号罗：笋伊 f l u o r 拳雠e _ 鬻i n e n m li 附m e l l t f e “- n t a 汀( p ob m i c e l b r s o l u t k p n s w o n gn u o r e s c q l c e b n t a + t np f ) 4 - t r 加nx 1 鲫 朋= 3 2 b u f f e r i m m t m o m m c t i o n 图1 6d e l f i a 体系的测定原理 ( b 一萘酰三氟丙酮( b n t a ) 、三辛基氧化膦( t o p o ) ) d e l f i a 系统较为成熟，已有几十种试剂盒投放市场，由于使用了荧光增强液，故 具有高分析灵敏度( 1 0 。7 m o l ：f l ) ，在临床诊断和d n a 杂交分析中得到了应用，适合多 肽、激素、药物等大小分子的测定。但此体系也有它的局限性，由于增强液易受到测 定环境、测定中样品及测定用溶液e u 3 + 的干扰，因此对测定环境及所用试剂要求很严格， 试剂昂贵，与一些生物介质不相容，无法进行原位测定等，故不适用于荧光成像，免 疫组化、定位杂交、d n a 芯片或在线检测等方面，使应用范围受到限制。 1 2 2 直接固相镧系荧光免疫分析体系( d s l fia ) 为了克服液相t r f i a 体系的不足，1 9 8 8 年e v a n g e l i s t a 合成口扣一种可以与镧系离 子配位并发出荧光的化合物4 ，7 一二氯磺基苯- 1 ，1 0 - 菲罗啉一2 ，9 一二羧酸( b c p d a ) 。 d i a m a n d i s 等人首先应用于免疫分析中建立了固相t r f i a 体系。它以b c p d a 为螯合剂 标记抗原或抗体，免疫分析检测限( p s a ) 可达1 0 1 8 m o l a s s y ( 0 0 0 1ug i i l l ) ，展示了 该体系的潜在优势。测定原理如图1 7 所示。 t i m 卜r t s r 1 w e di i 帅r 忭c f n c f n l e 蚪u t m 芒- 1 1 1 一i m m “憎 r - 1 j o h图1 7 直接固相镧系荧光免疫分析原理图 由于d s l f i a 体系具有较高的分析灵敏度和直接固相测量的优势，早已经引起了 生物医学界的广泛重视。应用领域不断扩大。最早建立d e l f i a 体系的芬兰w a l l a c 公 司近年采己转同“直接固相镧系荧光体系”研究，曾有一系列文章发表，关于螯合剂 标记核苷酸研究，已经申请了专利。日本、芬兰、加拿大、法国、美国、荷兰等关于 此方面的研究也越来越多。但由于该体系尚待完善，商品化进程受到了影响。 1 2 3 均相时间分辨荧光免疫分析体系( h t r fla ) 均相时间分辨荧光免疫分析体系是由m a t h i s 于1 9 9 3 年最早开发出来的，主要基 于两种原理，即荧光共振能量传递聆副和荧光淬灭。前者是免疫反应使荧光信号增强， 而后者则是免疫反应使荧光信号减弱。 共荧光效应系指能量从种增强离子螯合物传递到荧光离子螯合物分子引起的荧 光增强现象。大多数的稀土离子螯合物的发光是因能量从配基的三重态到稀土离子的 共振光能级的分子内能量传递所引起的。在溶液中，这种分子间能量传递是受分子扩 散所控制的，所以十分微弱。而在悬浮态溶液中，从增强离子螯合物到荧光离子螯合 物分子间能量传递比较容易发生，这就是所谓的共荧光效应。在共荧光效应中，增强 离子螯合物的分子数大大超过了荧光离子螯合物分子数，通过能量传递，荧光离子获 得的激发光能增加了很多倍，从而增加了荧光强度。 t r a c e ( t i m er e s o l v e da m p l i f i e dc r y p t a t ee m i s s i o n ) 体系就是基于荧光共振能 量传递的均相时间分辨荧光免疫分析体系m 1 ，也是目前最为成功的分析体系之一。该 体系使用铕荧光配合物t r i s ( b i p y r i d i n e ) c r y p t a t e - e u 3 + ( t b p - e u 3 + ) 作为荧光能量传递 的能量给予体，荧光色素a l l o p h y c o e y a n i n ( e r o s s 一1 i n k e d a l l o p h y c o c y a n i n ，也称别藻 篮蛋白，分子量为1 0 4 k d 的色素蛋白，最大荧光发光波长6 6 5 n m ，量子收率约o 7 ，t r a c e 体系中称之为x l 6 6 5 ) 作为荧光能量传递的能量接受体。 该体系的测定原理如图1 8 所示。当两种荧光标记物标记的单克隆抗体与抗原形 成夹心型免疫复合体后，两种荧光标记物间的距离变短，使t b p - e u 3 + 的长寿命荧光发光 能量可有效地传递给x l 6 6 5 ，导致x l 6 6 5 在6 6 5 n m 发出特异的长寿命荧光，使其可进 行时间分辨荧光测定。 这种方法同时测量供体和受体的荧光强度，由于系统中游离的供体的量远远大于 结合体中供体的量，所以受体和供体的比值只和样品中被分析物的浓度呈比例关系， 克服了杂散光和样品噪音对分析结果的影响。并且该法不需要使用固相材料，无结合 型游离型分离( b f 分离) 操作及洗涤步骤，操作简单且易自动化，缺点是方法的信 噪比较低且试剂价格昂贵。 翟乏嘉：陡 i 鬻丈而t ” 图1 8t b p - e u “的结构与t r a c e 体系的测定原理 7 w a l l a c 实验室的h e m m i l a 等人建立了基于免疫反应引起的稀土离子配合物荧光淬 灭现象的h t r f i a 体系。在该体系中采用一种e u 3 + 荧光标记物( 编号：w 一1 1 7 4 ) 标记 甲状腺激素t 4 ，标记t 4 与样品或标准中的t 4 竞争结合固定量的抗t 4 抗体，由于 e u 3 + - w - 1 1 7 4 一t 4 的荧光信号能被结合抗体有效淬灭，所以荧光强度与样品中的t 4 浓度 成正比，该法的测定曲线范围为5 0 - 3 0 0n m o l l 。 1 2 4 酶增幅时间分辨荧光免疫分析体系( e a t r fla ) 酶增幅时间分辨荧光免疫分析体系是d i c k s o n 于1 9 9 3 年最先开发的m 1 ，是现在最灵 敏的时间分辨荧光免疫分析方法之一。该方法的测定原理旧7 ，是碱性磷酸酶作用于底物 5 一氟水杨酸磷酸酯( f s a ) 脱去磷酸根，得到产物5 一氟水杨酸，后者可以与稀土离子t b 3 + 及e d t a 形成三元配合物。这种三元配合物具有t b 3 + 的特征荧光，并且可使荧光强度增 强，不加增强液即可在时间分辨荧光仪上测量t b 3 + 的特征荧光( 见图1 9 ) 。赵启仁等口剐 建立了核酸杂交的新型的酶放大时间分辨荧光免疫分析，灵敏度达到l o p g 。 ，s u b s t r a t e l = 妒l 州吣业窨船c e n t t n a n 妇e - a n 咄n 越呦o d ) ， - e n z y m e 1 。3 稀土元素螯合物配体的分类及进展 稀土荧光标记物的发光是能量由配体的基态一激发态一三重态一中心离子的激发 振动态一中心离子的基态的过程中发出的延迟荧光，因此一个合适的稀土离子必须满 足以下两个条件： ( 1 ) 激发态的能量必须接近并稍低于配体三重态的能量，这样才有可能使配体三 重态一中心离子的激发振动态的能量传递效率尽量高； ( 2 ) 稀土离子激发振动态的非辐射跃迁与辐射跃迁相比要很小。 在镧系金属离子中，满足上述两个要求的只有e u 孙、t b 3 + 、d y p 、s m p ，因此对于镟 系金属离子的荧光方面的研究主要集中在以上四种元素上。其中又以e u 3 和t b 3 + 的配合 物研究和应用最为广泛。 要产生较强的荧光，选择合适的配体也是非常重要的。适合时间分辨荧光免疫分 析的理想的配体应该符合以下标准h 0 4 13 ： ( 1 ) 与稀土金属离子的结合要稳定； ( 2 ) 与金属离子形成的配合物要有很强的荧光； ( 3 ) 配体的激发波长要高于3 0 01 3 m ( 避免所用塑料器具对激发光的吸收- = ( 4 ) 配体应该很容易与蛋白质共价结合； ( 5 ) 配体应该尽量少地与血清中其他组分发生反应； 目前文献中报道使用的螯合剂主要有以下五种： 1 3 ，1 多胺多羧基类螯合剂 这类螯合剂螯合金属离子标记蛋白研究较早，应用也较多，他们是含有活性基团 的多胺多羧基类化合物的衍生物。最常用的是乙二胺四乙酸( e d t a ) 4 2 - 4 3 、二乙三胺四乙 酸( d t t a ) 嗡3 和二乙三胺五乙酸( d t p a ) “6 4 8 3 等化合物的衍生物，其结构如图1 1 0 所示。 一一掣 厂、 一一n d 、涮 ( d t p a ) 图1 1 0d t t a 、d e t a 、d t p a 衍生物的结构 这类化合物是具有双功能基团的螯合剂，一端可以通过活性基团与蛋白偶联，另 一端可与e u ”、t b 3 + 等离子螯合，所形成的螯合物稳定性高( k 平衡= 1 0 1 0 1 0 1 1 ) ，水溶性好。 s o i n i 、h e m m i l a 、w i e d e r 等人研究了利用此类螯合剂键合稀土离子，用于时间分 辨荧光免疫分析，建立了p h a r m a c i al k b 测定体系即通常所说的洗脱一增强一镧系元素 荧光免疫分析。 1 3 2 菲罗啉类螯合剂 1 9 8 6 年，e v a n g e l i s t a 等人h 蛳3 合成了一系列菲罗啉衍生物，其结构如图1 1 1 所示， 并对e u 3 + 的螯合物的性质进行了初步研究。这类化合物具有这样的特点：( 1 ) 含有菲 罗啉环，能高效地向e u 3 + 传递激发能； ( 2 ) 类似有多胺多羧基的结构，能与e u 3 + 形成稳 定的螯合物； ( 3 ) 有活性基团易与蛋白偶联。 c o o h r = - n h 2 n c s - n h c o - c h ：- c h 一，c o o h c o o h s o ，c i ( b c p d a ) 图1 1 l 菲罗啉衍生物结构式示意巨 从1 9 8 7 年开始，d i a m a n d i s 等人用b c p d a ( 图1 1 1 ，r = 一s 0 ：c 1 ) 与e u ”的螯合物作为 荧光探针，将其直接标记蛋白质作为示踪物用于免疫分析。实现了直接固相测量，避 免了外源性的e u 3 + 的污染。 2 0 0 0 年e p d i a m a n d i s 等发表了将聚乙烯胺用于b c p d a 多标记体系研究驰。5 7 。，使免疫 分析检测限( p s a ) 达到1 0 _ 8 m o l a s s y ( 0 0 0 1ug m l ) ，展示了该体系的潜在优势。由于该 体系极高的分析灵敏度和简便的操作是目前理想的一种通用免疫分析法。国外已有试 剂盒出售。 1 3 3 水杨酸类螯合剂 为了克h 艮l k b 体系中无法直接定量和易受环境e u 3 + 污染的缺点，b a il e y 泓巧8 3 等人用 d t p a - p a s - t b 3 + ( p a s ，对苯基水杨酸) 螯合物，作为荧光探针用于时间分辨荧光免疫分 析。这个螯合剂有以下优点：多胺多羧基部分能够保证t b 3 + 与其形成稳定的螯合物， 在螯合比为l ：1 的情况，此螯合物能在1 0 呻m o l l 的溶液中存在；芳环部分能够有效地 把激发能传递给t b 3 + ，使之产生很强的荧光；易与蛋白偶联。 严气 时删 艄 图1 1 2d t p a p a s 的结构式示惫图 1 9 8 9 年，a y a l ac a n f i 等人 舯为进一步提高灵敏度，用此螯合物作为荧光探针 进行了多重标记，采用此多重标记法，h s a ( 人血清白蛋白) 和i g g ( 免疫球蛋白g ) 的 最低检测限分别为6 0n g 和l o o n g ，灵敏度又提高了两个数量级。 t 9 9 2 年d i a m a n d i s 等哺2 刊利用碱性磷酸脂酶水解水杨酸磷酸脂生成水杨酸，然后与 r b 弘，e d t a 等络合生成强荧光物质，用于时间分辨荧光免疫测定。体系利用酶的放大作 用和时间分辨技术结合，使灵敏度达到l o 叫。m o l l 。 1 3 4d 一二酮类螯合剂 b 一二酮类化合物，由于能高效地向稀土离子传递能量，使得其所形成的螫合物发 光效率最高，荧光强度极强。w i e d e r 、f r a n k 等人从7 0 年代后期就曾尝试用b 一二酮类 螯合物作为荧光探针用于免疫分析，但始终没能解决螯合物的稳定性问题。小林映章 用对氨基苯甲酰三氟丙酮螫合n 矿标i 己i g g ，用8 0 0 n m 的光激发，在近红夕b 9 0 0 n m ，1 0 6 0 n m ， 1 3 5 0 h m ，发出n d 的特征荧光，i g g 的检出限为5 n g m l 。 9 0 年代，慈云祥等治倘。合成了氯磺酰噻吩三氟乙酰丙酮( c t t a ) ，并作为标记物对 体系建立了高灵敏度的时间分辨荧光免疫分析法，其中对皮脂醇灵敏度可达1 5 n g m l 。 1 9 9 8 年，y u a n 等1 6 7 】合成了一种新型氯磺酰化的四8 二酮，4 ，4 二 ( 1 ”，1 ”，1 ”，2 ”，2 ”，3 ”，3 ”七氟4 ”，6 ”己二酾6 ”基) 一氯磺酰一邻二联苯基苯 【( 4 ，4 b i s ( 1 ，1 ，1 ，2 2 ，3 ，3 - h e p t a f l u o r o 一4 , 6 - h e x a n e d i o n - 6 - y 1 ) 一c h l o r o s u l f o 一0 一t e r p h e n y l ，b h h c t ，用于t r f i a 中，使其灵敏度大大提高。w ufb 等1 6 出6 9 j 报道了两种新的螯 合物，一种是经过b h h c t 结构修饰的新合成的螯合物b t b c t ，灵敏度为使用b h h c t 的8 倍。另一种是新的螯合物b c t o t ，被用于血清中t 4 的检测，灵敏度达1 0 1 2 t 0 0 1 l 1 。 图1 1 3b h h c t 的结构 1 3 5 以杂联芳基为骨架结构的螯合剂 吡啶、联吡啶、吡啶一吡唑类及一些大环类化合物的衍生物口0 1 由于具有可参与稀 土离子配位的杂原子，为设计制备稀土荧光配合物分子提供了理想的骨架结构单元； 另一方面，多羧酸结构与稀土离子又具有非常高的稳定性n ，因此，这类稀土荧光标 记物具有许多优点：首先，这些化合物中的多环体系及分子本身具有的多羧酸在溶液 中可以与e u p 、t b 弘、d y 3 + 、s m 3 + 等形成结合牢固的穴状化合物，使稳定性增强，溶剂影 响小，且有较强的荧光；其次，这些配合物可以通过氯磺酰基，异硫氰基，活性酯基 或4 ，6 - - - 氯一l ，3 ，5 一三氮唑基等直接标记到蛋白质上；再者，这些化合物较0 一二酮配 位体而言都具有良好的水溶性，非常有利于生物分子的标记。 图i 1 4 为几种最有代表性的含有杂联芳基的稀土配合物的结构图，它们的荧光性质 见表1 2 。 脾钛撇 届牟虱 c r ，o l , c 。! k9 1 隧i 、呀馥i 何 0 p 玲昼 一、乐0 r ，”、 令。喙0 矮：张 粼於 图1 1 4 含杂联芳基的稀配合物的结构 表卜2 几种杂联芳基配合物的荧光性质 从表卜2 可以看出：此类稀土荧光配合物的荧光寿命都在1 毫秒以上，荧光量子收 率大于0 1 。其中铽配合物b p t a t b 3 + ( 图1 1 4d ) 的荧光量子产率甚至可以达到1 o m l ， 配合物f 是2 0 0 4 年新开发出来的，被成功地用作标记物进行时间分辨荧光显微镜分析 口3 1 。t b p - e u 3 吖7 们在t r a c e 体系中作为能量给予体被用于免疫分析、d n a 杂交分析以及p c r 产物的固相测定口町等。联三吡啶类化合物t m t h 鲫用于免疫分析矛i d n a 杂交分析也有很高 的灵敏度口引。文献口铂系统地评价t 4 1 种含有杂联芳基配体与铕和铽配合物的荧光性质， 发现由于e u 3 + 和t b 3 + 离子的共振能级能量水平不同，配合物的荧光量子产率主要取决于 配位体的三重态能级水平与中心离子的激发态能级水平的差。 1 4 时间分辨荧光免疫分析的应用 由于时间分辨荧光免疫分析具有独特的优势，其应用范围不断已经发展成为临 床及治疗监测和基础医学研究等方面的重要手段。国外该项技术已经成熟，我国是稀 土资源大国，对于t r f i a 具有先天的优势，近年来检测项目也不断增多，目前已经推 出几十种商品化的试剂盒。 1 4 1t r f i a 在临床检测上的应用 1 4 1 1 内分泌科检查 吴冯波等口8 1 用t r f i a 测定促甲状腺素( t s h ) 年i ：it 4 ，t s h 方法最底检测限0 0 2 8 m i u l ， 检测范围为0 2 1 - 8 0 o o m i u l ；t 4 方法最底检测限4 i n m o l l ，检测范围为 2 0 - 3 0 0 n m o l l 。b a r d 等 引用该法定量测定血清及粘膜分泌物中溶菌酶和乳铁蛋白，线 性范围分别为1 0 2 2 5 m g l 和1 0 2 一l o o m g l ；检测限分别为0 5 m g l 和l m g l 。r o n g 等阳m 用该法测定甲状旁腺激素，灵敏度为0 3 p m o l l 。f r y s t y k 等鹏测定胰岛素样生长 因子( i g f ) i 和i i ，检测下限分别为0 0 0 2 5 m g l 和0 o l o m g l 检测上限分别为2 5 m g l 、 1 0 o m g l 。m a t i n l a u r i 等陴2 3 测定血清及卵泡液中肾素检测限l o n g l ，线性范围 1 0 2 5 0 0 0 n g l 。t a ny k 等测定甲状腺结合球蛋白( t b g ) ，工作范围o l o o m g l ，检测限 o 4 m g l ，批内及批间c v 分别为4 5 和5 4 ，平均回收率1 0 3 。s t r a s b u r g e rc 等报 道生长激素( g h ) t r f i a 测量值比r i a 低，浓度范围为0 3 - 4 0 m g l 。象乙肝表面抗原、 皮质醇等其它方面也有很多报道。 1 2 1 4 1 2 妇产科检查 k a n e k oh 等报道雌二醇和促卵泡刺激素( f s h ) 之间的关系，用铕标记检测抑制素 a ，检测限为3 3 p g m l 。v a nc a s t e r e n 等测定f s h 和绒毛膜促性腺激素( r l h ) 。 m a d e r s b a c h e rs 等测定h f s h ，最低检测限2 n g l ，测量范围2 - 1 6 0 0 0 0 n g l ，在浓度为 1 6 0 ，0 0 0 n g l 时信噪比1 3 0 0 0 ：1 。h e m m i l ai 等测定促黄体激素和f s h ，检测限分别为 0 1 i n t u n i t l 和1 i n t u n i t l y a m a d a 等用该法测定了睾酮。p e t t e r s s o n 等用双标 记i r f i a 测定r l h 。史庭燕等哺列用双功能螯合剂异氰酸苄基二乙烯三胺四乙酸络合e u 3 + 标记t 3 一h c g ，血清p h o g 的t r f i a 检测与c l i a 分析结果一致，相关系数为0 9 7 2 。 1 4 1 3 肿瘤标志物检查 l e i n o n e n 等用e u 3 + 标记前列腺特异抗原( p s a ) ，检测范围为o 0 3 5 0 0 m g l 。k a t j a m i t r u n e n 等，e r i k s s o n 等和b j a r t e l l 等也用该法测定游离及总的p s a 。m a t s u m o t o 等 测定甲胎蛋白( a f p ) 和癌胚抗原( c e a ) ，检测限分别为0 0 7 n g m l 和0 0 3 n g m l 。黄 飚和肖华龙等分别以该法测定c a - 1 9 和c a - 1 2 5 。王桂莲等哺们对甲胎蛋白、癌胚抗原的 测定进行了时间分辨荧光法与化学发光法比较。宋蓉等5 3 对血清标本中甲胎蛋白进行 测定，方法回收率为9 5 8 ，- - 1 0 2 6 。李跃松等阳6 1 建立：微球蛋白( b ：一m ) 时间分辨 荧光免疫分析，批内和批间c v 分别为2 2 5 和2 9 1 ，平均回收率为1 0 1 0 6 ，灵敏 度为0 o b m g l ，可测范围为0 0 6 一- - 1 2 m g l 。 1 4 2t r f l a 用于病原微生物抗原抗体的检测 它已广泛应用于各种传染病的诊断和研究，包括甲肝病毒( h a v ) 、乙肝病毒( h b v ) 、 脑炎病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒、轮状病毒、副粘病毒、风疹病毒、马铃薯病 毒、免疫缺陷病毒、严重急