（微生物学专业论文）杆状病毒splt97和ac108基因的研究.pdf

山大学博卜学位睑文 杆状病毒s p l t 9 7 和a c l 0 8 基因的研究 陈维春 摘要 最近发现的杆状病毒l l k 基因家族( i m e r p md a t a b a s e a c c e s s i o nn u m b e r ： i p r 0 0 9 3 1 3 ) 存在于至少1 6 种以鳞翅目昆虫为宿主的杆状病毒中，功能未知。本 文选取1 l k 基因家族中的斜纹夜蛾核多角体病毒( s p o d o p t e r al i t u r am u l t i c a p s i d n u e l e o p o l y h e d r o v i r u s ，s p l t m n p v ) 开放阅读框9 7 ( o p e nr e a d i n gf r a m e9 7 ，o r f 9 7 ) ( 命名为s p t t 9 7 基因) 和苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒 a u t o g r a p h ac a l i f o r n i c a ( a c ) m n p v lo r f l 0 8 ( 命名为a c l 0 8 基因) 为研究对象，对这两个同源基因的转录、 翻译、在病毒结构中的定位以及基因缺失对病毒在感染细胞中产生情况等进行了 初步研究。 s p l t 9 7 基因位于s p l t m n p v 基因组9 4 4 6 6 n t 9 4 8 0 4 m 之问，阅读框全长 3 3 9 b p ，编码11 2 个氨基酸，预计分子量为1 3 2k d a ：a c l 0 8 基因位于a c m n p v 基因组9 4 3 9 2 n t 9 4 7 0 9 n t 之问，全长3 1 8 b p ，编码的蛋白包含1 0 5 个氨基酸，预 讣分子量为1 1 8k d a 。序列分析表明s p l t 9 7 和a c l 0 8 为两个同源蛋白，氨基酸 序列相似性为2 1 ，其所有的同源蛋白仅存在于以鳞翅目昆虫为宿主的杆状病毒 中，氨基酸序列相似性介于8 - 5 0 之问。这些同源蛋白氨基酸序列的中问都存在 一个由2 1 个氨基酸残基组成的强疏水性跨膜螺旋结构域。 本文首先根据印，r 9 拜叫c 基因序列设计两对引物，分别以s p l t m n p v 年t l a c m n p v 基因组d n a 为模板进行p c r 扩增，将得到的这两个基因克隆至原核表达 载体p q e 3 0 ，在原核细胞中实现了基因的融合表达。纯化的蛋白免疫新西兰大白 兔，制备了两种蛋白的多克隆抗体。s p l t 9 7 多克隆抗血清与s p l t m n p v 感染的 s p l i - 2 2 1 细胞总蛋白进行的杂交，显示一条1 3 k d a 的特异杂交带，而a c l 0 8 蛋白在 a c m n p v 感染的s f - 9 细胞中多克隆抗体显示带的大小约为2 7 k d a ，表明a c l 0 8 蛋 白可能以复合体或与其它蛋白相连的形式存在。 r t - p c r 分析结果表明，s p l t 9 7 和a c l 0 8 基因在病毒感染细胞中的转录均从 6h 开始就可以检测到，一直持续到感染后9 6h 。5 r a c e 分析发现，s p h 9 7 基因 的转录起始于a t g 上游一1 2 n t 的杆状病毒早期启动子a c a t t 中的嘌呤碱基c ， 陈维存杆状病毒s p # 9 7 干ua c l 0 8 牡囡的研究 a c l 0 8 基因的转录起始于a t g 上游9 n t 的卡1 状病毒晚期启动子t t a a g 中的第一 个嘌呤碱基a 。与基因从病毒感染后6 h 丌始转录不同的是，s p | t 9 7 和a c i 0 8 蛋 白的表达均是从感染后4 8 h 力丌始检测到。w e s t e r n b l o t 实验证明，s p i t 9 7 和a c l 0 8 蛋白均定位于包涵体束源型病毒粒子( o c c l u s i o n - d e r i v e dv i r u s ，o d v ) 的囊膜上， 是o d v 囊膜相关蛋白。核质分离实验表明在病毒感染的晚期a c l 0 8 蛋白在细胞 质和细胞核中均有分布。 本文第二部分内容是采用e t - 克隆的方法，在大肠杆菌d h i o b 细胞中成功 实现了从a c m n p vb a c m i d 基因组中敲除a c l 0 8 t h 基因片段，并同时在该位点 插入了氯霉素基因c m 。将经过转座带有绿色荧光蛋白基因( g r e e nf l u c r e s c e n c e p r o t e i n ，f f p ) 和多角体基因( p o l h ) 的重组b a c m i d 转染s f - 9 细胞，2 4 h 后荧光显 微观察发现细胞中能够产生绿色荧光，出现荧光的绍胞分布比较均匀，从转染后 2 4 - 9 6 h 有荧光的细胞数量基本不变。转染4 8 h 后能够看到多角体，比较均匀地分 南在少量细胞中，到9 6 h 有多角体出现的细胞数量没有增加。空斑测定结果显示 转染细胞不能形成空斑，荧光分布呈单细胞状态，边缘细胞没有被感染现象。重 组b a c m i d 转染s f - 9 细胞，病毒上清的滴度测定结果全部为零。这些结果充分表 明a c l 0 8 缺失导致芽生型病毒粒孑( b u d d e dv i r u s , ，b v ) f ；能产生，或者是产生的 b v 完全没有感染性。 s d s p a g e 和间接免疫荧光分析发现，缺失 ：a c l 0 8 基因的重组瘸毒影q 向了 g p 6 4 的积累，从转染后4 8 h 细胞中可以检测到g p 6 4 蛋白，一一直至_ l j 9 6 hg p 6 4 蛋白在 最上没有明显的变化，这与对照在这个过程中有了成倍的增加，并能够出现一条 小分子降解带不同。缺失一c ，基因同时能导致v p 3 9 蛋白合成的阻断，重组 b a c m i d - 转染的细胞中没有检测n v p 3 91 噩白的存在。证明基因的缺失还能够影响 到核衣壳蛋白的合成。 采用b a c t o - b a c 表达系统将包含启动子和p o i y ( a ) 加尾信号的爿c 1 0 8 f f l s p l t 9 7 基因大片段转座至重组b a c i t l i d 中进行r e p a i r 和r e p l a c e 实验，结果表明r e p a i r 和 m p h c e 均没有使病毒功能得到恢复。是否基因片段的敲除影响了相邻基因的转录 和表达需要进一步的实验来验证。 关键词：杆状病毒，s p l t m n p v ，a c m n p v ，i l k 基因家族，e t _ 克隆 1 1 尘生查兰堕! ：堂篁堕兰 s t u d i e so ns p i t 9 7a n da c l 0 8g e n e so fb a c u l o v i r u s c h e nw e i c h u n s p e c i a l i t y ：m i c r o b i o l o g y s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rp a n g y i a b s t r a c t r e c e n t l y , m e m b e r so f t h e1 1 kg e n ef a m i l y ( i n t e w r od a t a b a s ea c c e s s i o nn u m b e r ： i p r 0 0 9 313 ) w e r ek n o w nf r o ma tl e a s t16b a c u l o v i r u sg e n o m e sw h i c hw e r ea l lf r o m i n s e c t so ft h eo r d e rl e p i d o p t e r a t h ef u n c t i o n so ft h e s eg e n e sw e r en o td e t e r m i n e d s p l t 9 7 a n da c l 0 8 ，f r o ms p o d o p t e r al i t u r a m u l t i c a p s i dn u c l e o p o l y h e d r o v i r u s ( s p l t m n p v ) o p e nr e a d i n gf r a m e ( o r f ) 9 7a n da u t o g r a p h ac a l i f o r n i c a ( a c ) m n p v o r f l 0 8r e s p e c t i v e l y , w e r em e m b e r so f11 kg e n ef a m i l ya n dw e r ec h a r a c t e r i z e di n t h i sp a p e ri n c l u d i n gt r a n s c r i p t i o n ，t r a n s l a t i o n , l o c a l i z a t i o ni nt h ev i r u ss t r u c t u r ea n d t h ev i r u sf o r m a t i o ni ni n f e c t e dc e l l sa f t e ra c l 刀了w a sk n o c k e do u tf i - o mt h e a c m n p v g e n o m e s p l t 9 7o r fi sl o e a t e db e t w e e nn t 9 4 4 6 6a n dn t 9 4 8 0 4o ft h eg e n o m e ，c o n t a i n m g 3 3 9 b pa n dc o d i n g 11 2 a aw i t hp r e d i c t e dm o l e c u l a rw e i g h t1 3 2k d a a c l 0 8g e n e ， b e t w e e nn t 9 4 3 9 2a n dn t 9 4 7 0 9o ft h eg e n o m e ，c o n t a i n s318 b pa n dc o d e s10 5 a aw i t h p r e d i c t e dm o l e c u l a rw e i g h t 11 8 k d a s e q u e n c ea n a l y s i si n d i c a t e dt h a ts p l t 9 7h a s 2 1 a m i n oa c i di d e n t i t yw i t ha c l 0 8r a n g i n gf r o m8 t o5 0 w i t ho t h e rh o m o l o g u e s o fb a e u l o v i r u s ，w h i c hw e r eo n l yf o u n di nl e p i d o p t e r ah o s t s ，ac o n s e r v e ds t r o n g h y d r o p h o b i ct r a n s m e m b r a n eh e l i xd o m a i nw a sl o c a t e di nt h em i d d l er e g i o no fa l l h o m o l o g u e s 。 t w o p a i r so f p r i m e r sw e r ed e s i g n e da st h es p l t 9 7a n da c l 0 8g e n es e q u e n c e sa n d u s e df o rp c ra m p l i f i c a t i o n p c rp r o d u c t sw e r ec l o n e di n t op q e 3 0v e c t o ra n dt h e 堕丝壹堑鉴生圭竺丝! 型坐! 竺兰堕! 塑竺壅一 s p i t 9 7a n da c l 0 8p r o t e i nw e r ee x p r e s s e da s t h s i o np r o t e i ni nec o l im 1 5 ，t w o p u r i f i e df u s i o np r o t e i n sw e r ei n j e c t e d i n t on e wz e a l a n dw h i t er a b b i t st oh a r v e s t p o l y c l o n a la n t i b o d i e s w e s t e r nb l o ta n a l y s i so fe x t r a c t s f r o ms p l t m n p v - i n f e c t e d s p l i - 2 2 1c e l l sr e v e a l e das p e c i f i cp o l y p e p t i d ew i t ha na p p a r e n ts i z eo f1 3k d a w h e n u s i n gt h es p k 9 7a n t i s e r u m h o w e v e r ab a n da b o u t2 7 k d aw a sf o u n di nt h e a c m n p v - i n f e c t e ds f - 9c e l l sh y b r i d i z e dw i t ht h ea c l 0 8a n t i b o d y p r o t e i nm o r et h a n p r e d i c t e ds i z em a yb ed u et oa c l 0 8e x i s t i n ga sac o m p l e xo rc o m p o s e dw i t ho t h e r p r o t e i n s r t - p c rr e s u l t ss h o w e dt h a ts p l t 9 7 a n da c l 0 8g e n e st r a n s c r i b e di nt h ei n f e c t e d c e l l sf r o m6 hp o s ti n f e c t i o n ( p i ) t o9 6 hp i m a p p i n go f s p l t 9 7a n da c l 0 8t r a n s c r i p t s b y5 - r a c ei n d i c a t e dt h a ts p h 9 7t r a n s c r i p t i o ni n i t i a t e da tt h eci nt h eb a c u l o v i r u s c o n s e n s u s e a r l yp r o m o t em o t i fa c a t t , 一1 2 n tu p s t r e a mo fa t ga n da c l 0 8 t r a n s c r i p t i o ni n i t i a t e da tt h ef i r s ta i nt h eb a c u l o v i r u sc o n s e n s u sl a t ep r o m o t em o t i f t t a a g - 9 mu p s t r e a mo fa t g w e s t e mb l o ta n a l y s i ss h o w e dt h a t b o t ls p i t 9 7a n d a c l 0 8w e r ed e t e c t e di ni n f e c t e dc e l l sf r o m4 8t o9 6 hp i w h i c hw a sd i f f e r e n tf r o m t h e i rt r a n s c r i p t i o nt i m ec o u r s e t h el o c a l i z a t i o ni nt h eo c c l u s i o n d e r i v e dv i r u s ( o d v ) e n v e l o p es h o w e dt h a ts p l t 9 7a n da c l 0 8w e r eo d ve n v e l o p e a s s o c i a t e dp r o t e i n s w e s t e r nb l o ta n a l y s i so fn u c l e i ca n dc y t o p l a s m i ce x t r a c t sf r o ma c m n p v - i n f e c t e d s f - 9c e u sr e v e a l e dt h a ta c l 0 8d i s t r i b u t e d 访b o t ht h et w oa r e a so f c e u s a c l 0 8d e l e t i o nb a c m i dw a sg e n e r a t e db ye t - r e c o m b i n a t i o ni nec o l id h l 0 b a na c l 0 8 t hg e n ef r a g m e n tw a sk n o c k e do u tf r o mt h ea c m n p vb a c m i da n dac m g e n ew a si n s e r t e di n t ot h es a m es i t e t h eg 加a n dp o l hg e n e sw e r et r a n s p o s e di n t ot h e r e c o m b i n a n tb a c m i dt h a tw a su s e dt oi n f e c ts f - 9c e l l s g r e e nf l u c r e s c e n c ec a nb es e e n i n2 4 hp i s f - 9c e l l st r a n s f e c t e db yr e c o m b i n a n tb a c m i da n dt h ec e l l sw i t hg r e e n f l u c r e s c e n c es c a t t e r e de q u a l l yi nt h ev i s i o na n dr e m a i n e df e wt 9 6 hp i j u s ta st h e s a m ea m o u n to f 2 4hp i c e l l s p o l y h e d r aw e r ep r o d u c e di nv e r yf e w4 8 h p i c e i l sa n d d i dn o ti n c r e a s eu n t i l9 6 hp i n op l a q u ef o r m e di nr e c o m b i n a n tb a c m i dt r a n s f e c t i n g c e l l sa n dg r e e nf l u c r e s c e n c eo n l ye x i t e di ns i n g l ec e l l ，n o n e i g h b o rc e l l sb e i n g i n f b c t e d t h el e v e lo fb vp r o d u c t i o nw a sd e t e c t e dt ob ez e r oi nr e c o m b i n a n tb a c m i d t r a n s f e c t i n gc e l l s t h e s er e s u l t ss u g g e s t e dt h a tt h ed e l e t i o no fa c l 0 8r e s u l t e di nn o i v 山大学博十学位渔文 p r o g e n yb u d d e dv i r u s ( b v ) o rn oi n f e c t i o u sp r o g e n yb v s d s p a g ea n di m m u n o f l u o r e s c e n c e a n a l y s i s i n d i c a t e dt h a tg p 6 4d i dn o t i n c r e a s ea n ym o r ew i t ht h et i m ec o u r s ei nt h ea c l 0 8d e l e t i o nv i r u si n f e c t e dc e l l sa n d k e p tt h es a m el e v e lf r o m4 8t o9 6 hp i ，b u ti nt h ec o n t r o lg p 6 4d r a m a t i c a l l yi n c r e a s e d a n das m a l lb a n dc a nb ed e t e c t e di nt h e9 6 hp i c e l l s n op r o d u c t i o no fv p 3 9w a s l b u n di nt h ec e l l si n f e c t e db yr e c o m b i n a n tv i r u sw h i c hi m p l i e dt h a td e l e t i o nr e s u k e d i nn oe x p r e s s i o no f t h en u c l e o c a p s i dp r o t e i n t h ea c l 0 8a n ds p l t 9 7 g e n ef r a g m e n t si n c l u d i n gt h e i rp r o m o t e r sa n dt h e p o l y a d e n y l a t i o ns i g n a l sw e r et r a n s p o s e di n t o t h er e c o m b i n a n tb a c m i db yu s i n g b a c - t o b a cs y s t e m t h er e p a i ra n dr e p l a c ea s s a y sd i dn o tr e c o v e rt h ef u n c t i o no f r e c o m b i n a n tv i r u s m o r ee x p e r i m e n t sn e e dt oh ed o n et op r o v ew h e t h e ro t h e rg e n e s w e r ea f f e c t e dd u et ot h ea c ，d 8d e l e t i o n k e yw o r d s ：b a c u l o v i r u s ，s p l t m n p v ，a c m n p v ，11 k g e n eg r o u p ，e t - r e c o m b i n a n t v t 1 、山大学博十学位论文 缩略词 1 病毒 a c m n p v a u t o g r a p h ac a l i f o m i c am u l t i c a p s i dn u c l e o p o l y h e d r o v i r u s 苜蓿丫纹夜蛾多粒包埋型核多角体病毒 a p n p v a n t h e r a e ap e r n y in u c l e o p o l y h e d r o v i r u s 柞蚕核多角体病毒 b m m n p v b o m b y xm o r im u l t i c a p s i dn u c l e o p o l y h e d r o v i r u s 家蚕核多角体病毒 c t m n p v c h o r i s t o n e u r a f u m i f e r a n am u l t i c a p s i dn u c l e o p o l y h e d r o v i r u s 枞色卷蛾核多角体病毒 e p p o m n p ve p i p h y a s p o s t v i t t a n am u l t i c a p s i dn u c l e o p o l y h e d r o v i r u s 苹浅褐卷蛾核多角体病毒 h a s n p v h e l i c o v e r p aa r m i g e r as i n g l e n u c l e o c a p s i dn u c l e o p o l y h e d r o v i r u s 棉铃虫核多角体病毒 h z s n p v h e l i c o v e r p az e as i n g l e n u c l e o c a p s i dn u c l e o p o l y h e d r o v i r u s 谷实夜蛾单粒核多角体病毒 l d m n p v l y m a n t r i ad i s p a rm u k i c a p s i dn u c l e o p o l y h e d r o v i r u s 舞毒蛾核多角体病毒 l s n p vl e u c a n i as e p a r a t en u c l e o p o l y h e d r o v i r u s 粘虫核多角体病毒 m a c o n p vm a m e s t r ac o n f i g u r a t an u c l e o p o l y h e d r o v i r u s 披肩粘虫核多角体病毒 o p m n p vo r g y i ap s e u d o t s u g a t am u k i c a p s mn u c l e o p o l y h e d r o v i r u s 黄杉毒蛾核多角体病毒 r a o u m n p v r a c h i p l u s i ao “m u l t i p l cn u c l e o c a p s i dn u c l e o p o l y h e d r o v k u s 薄荷灰夜蛾多粒包埋型核多角体病毒 s e m n p v s p o d o p t e r ae x i g u am u l t i c a p s i dn u c l e o p o l y h e d r o v k u s 甜菜夜蛾核多角体病毒 s f m n p v s p o d o p t e r a f r u g i p e r d am u l t i c a p s i dn u c l e o p o l y h e d r o v i r u s 草地贪夜蛾核多角体病毒 s p l i m n p v s p o d o p t e r al i t t o l a l i sm u l t i c a p s i dn u c l e o p o l y h e d r o v i r u s 海灰翅夜蛾核多角体病毒 s p l t m n p vs p o d o p t e r al i t u r am u l t i c a p s i dn u c l e o p o l y h e d r o v i r u s 斜纹夜蛾核多角体病毒 陈维春杆状病雌s p l t 9 7 f u a c l 0 8 幕鹏i i ，j o f 宄 2 昆虫 s f s p i t t n 3 其它 8 一m e a m p a m v b a c b b m v b c i p b l a s t b o b v d d h ，0 d m s o d t t ec o l i e e d l i a j ? b s g f p g v h p i i p t g k b k d a n u n m o i n b t n c n p v n 【 s p o d o p t e r a f r u g i p e r d a 草地贪夜蛾 s p o d o p t e r al i t u r a 斜纹夜蛾 t r i c h o p l u s i an i 粉纹夜蛾 d m e r c a p t o e h t a n o lp 一巯基乙醇 a m p i c i l l i n 氨苄青霉素 a v i a nm y e l o b l a s t o s i sv i r u sr e v e r s et r a n s c r i p t a s e 禽类成髓细胞性白血病病毒反转录酶 b a c t e r i a la r t i f i c i a lc h r o m o s o m e 细菌人工染色体 b r u s h - b o r d e rm e m b r a n ev e s i c l e s刷状缘膜囊泡 5 - b r o m o 一4 e h l o r o 一3 一i n d o l y l p h o s p h a t e 5 - 溴一4 - 氯一3 一吲哚一磷酸 b a s i cl o c a la l i g n m e n ts e a r c ht o o l b a s ep a i r 碱基对 b u d d e dv i r u s 芽生型病毒 d o u b l ed i s t i l l e dw a t e r双蕉水 d i m e t h y ls u l f o x i d e 二甲基亚砜 d i t h i o t h r e i t o l 二硫苏糖醇 e s c h e r i c h i ac o l i 火肠杆菌 e n v e l o p e 囊膜 e t h y l e n ed i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d 乙二胺四乙酸 f e t a lb o v i n es e r u m 胎牛血清 g r e e nf l u o r e s c e n c ep r o t e i n 绿色荧光蛋白 g r a n t d o s i sv i r u s 颗粒体病毒 h o u r sp o s t i n f e c t i o n 感染后小时 i s o p r o p h y lt h i o - 1 3 - d g a l a c t o s i d e 异丙基硫代一b d 一半乳糖苷 k i l o b a s e 干碱基对 k i l o d a l t o n 千道尔顿 m i n u t e 分钟 m u l t i p l i c i t yo f i n f e c t i o n 感染复数 n i t r o b l u et e t r a z o l i u m 氮蓝四唑 n u c l e o c a p s i d 核衣壳 n u c l e o p o l y h e d r o v i r u s核多角体病毒 n u c l e o t i d e 核苷酸 山大学蹲 j 学忙沦文 0 b so c c l u s i o nb o d i e s包涵体 o d v o c c l u s i o n d e r i v e dv i r u s 包涵体来源型病毒 o r f o p e nr e a d i n gf l a m e 开放阅读框 o r i o r i g i no f r e p l i c a t i o n 复制原点 d i p o s t i n f e c t i o n 感染后 p b s p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e 磷酸盐缓冲液 p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 聚合酶链式反应 p d v p o l y h e d r a - d e r i v e dv i r u s 多角体衍生型病毒 p f u p l a q u ef o r m i n gu n i t 空斑形成单位 p o l hp o l y h e d r i n 多角体蛋白基因 r a c e r a p i da m p l i f i c a t i o no f c d n ae n d s ，c d n a 米端快速扩增 r p m r e v o l u t i o np e rm i n u t e 每分钟转数 r t - p c rr e v e r s et r a n s c r i p t i o n p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 反转录聚合酶链式反应 s d ss o d i u md o d e c y ls u l p a t e 十二烷基硫酸钠 s d s p a g e s d s p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s s d s 一聚丙烯酰胺凝胶电泳 t c i i ) 5 0 5 0 t i s s u ec u r u r ei n f e c t i o nd o s e 半数组织培养物发生感染的病毒剂量 t e t r i s e d t a ( b u f f e r ) ，t r i s e d t a ( 缓冲液) n i s t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e 三( 羟甲基) 氨基甲烷 v v v o l u m e v o l u m e 体积体积 w w w e i g h t w e i g h t 重量重量 w t w i l d t y p e 野生型 x g a l 5 - b r o m o 一4 - c h l o r o 一3 一i n d o l y l b d g a l a c t o s e 5 溴一4 氯一3 一吲哚6 一d 一半乳糖苷 助、维春杆状痈毒勋1 t 9 7 羊ua c l 0 8 坫圳的研究 前言 杆状病毒( b a c u l o v i r u s ) 是特异性感染节肢动物的病原微生物，病毒粒子呈 杆状、有囊膜包被的病毒，其基因组为双链环状d n a ，大小介于8 0 1 8 0 k b 之 间。依据在感染细胞中包涵体的形态，杆状病毒科( b a c u l o v i r i d a e ) 可以分成两 个属，核多角体病毒属( n u c t e o p o l y h e d r o v i r u s ，n p v ) 和颗粒体病毒t 禹( g r a n u l o v i r u s ， g v ) 。采用特征基因序列或整个基因组序列信息进行的进化树分析发现，可以将 n p v 划分为组i 和组1 i 两个种群( h e r n i o ue l a l ，2 0 0 1 ；t t e r n i o ue t a l ，2 0 0 3 ) 。组 in p v 包括苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒( a u t o g r a p h ac a l i f o r n i c am u l t i c a p s i d n u c l e o p o l y h e d r o v i r u s ，a c m n p v ) ，家蚕核多角体病毒 b o m b y xm o r i ( b m ) n p v 和黄 杉毒蛾核多角体病毒 o r g y i ap s e u d o t s u g a t a ( o p ) m n p v 等，组i in p v 包括斜纹 夜蛾核多角体病毒 s p o d o p t e r al i t u r a ( s p l t ) m n p v 、棉铃虫核多角体病毒 【h e l i c o v e r p aa r m i g e r as i n g l e ( h a s ) n p v 】、舞毒蛾核多角体病毒【l y m a n t r i a d i s p a r ( l d ) m n p v 、甜菜夜蛾核多角体病毒【s p o d o p t e r ae x i g u a ( s e ) m n p v 等。 朴状病毒具有狭窄的宿主范围，一种病毒只感染同目中有限的几种近缘种 的昆虫甚至单独的一种( a d a m sa n d m c c l i n t o c k ，1 9 9 l ：f e d e r i c ia n d l i c e 1 9 9 7 ) 。 宿主域包括病毒感染组织特异性、种的特异性以及宿主局限在节肢动物门( l u a n dm i l l e r , 1 9 9 6 a ) 。宿主域决定主要是病毒在宿主中复制受到限制，原因在于控 制病毒宿主特异性因子与宿主识别系统间不相容。已经鉴定了的宿主域因子有 h l j ：1 ( t h i e me ta l ，1 9 9 6 ) 、p 1 4 3 ( m a e d ae ta 1 ，1 9 9 3 ) 、矗莎l ( l ua n dm i l l e r , 1 9 9 6 b ) 和 p 3 5 ( h e r s h b e r g e re ta 1 ，1 9 9 2 ) 等。另外，杆状病毒的一些o d v 囊膜结构基因在病 毒粒子进入宿主中肠过程中可能起着决定性作用，包括p 7 4 ( h a a s s t a p t e t o n 甜以 2 0 0 4 ) 、p f ( k i k h n oe ta l ，2 0 0 2 ) 和p i f - 2 ( p i j l m a ne ta 1 ，2 0 0 3 ) 等，这些基因的突变 能直接导致宿主的口服感染性丧失。 杆状病毒的应用主要被用作生物农药来控制农业害虫( 庞义，1 9 9 4 ) 。此外， 还，“泛地用作基因表达载体，在昆虫细胞中表达大量的外源蛋白( l u c k ow i 1 9 9 1 ) 。近年来杆状病毒还被用作高等生物基因治疗的表面展示系统( g h o s hp td 2 0 0 2 ；p i e r o n ia n d l a m o n i c a ，2 0 0 1 ) 。为了提高杆状病毒杀虫剂的效率，发展杆状 病毒基因表达系统和基因治疗的基因传递系统，深入研究病毒的侵染周期和病毒 一宿主细胞相互作用是十分必需的。 山大学蹲+ 学位沦史 i ；1 l u c k o w 等( 1 9 9 3 ) 构建成功a c m n p vb a c m i d 以来，逐步发展起来的e t - 克隆 技术已经实现了a c m n p v 基因组中众多基因的敲除，为研究基因的功能带来了极 大的便利。通过敲除a c m n p ve x o n o 证明了该基因对芽生型病毒粒子( b u d d e d v i r u s ，b v ) 的有效产生是必须的( d a ie l a l ，2 0 0 4 ) 。l i n a n d b l i s s a r d ( 2 0 0 2 ) 构建了 缺失l e f - 6 的重组病毒，发现l e f 6 蛋白为病毒复制非必须，但能够促进晚期基因 的转录。 近年来，通过基因的序列分析和比较，发现杆状病毒中存在一个1 1 k 基因家 族( i n t e r p r od a t a b a s ea c c e s s i o nn u m b e r ：i p r 0 0 9 31 3 ) ，这一家族中的基因编码的蛋白 大小约为l l k d a ，结构域分柝表明所有的同源蛋白中都含有一个强疏水性的跨膜 螺旋。到目前为止这一基因家族在1 6 种杆状病毒中有发现，而且所有病毒的宿主 都是鳞翅目昆虫。表明这一基因家族可能在病毒和宿主之间起着重要作用。 本研究选取了1 1 k 基因家族中的两个同源基 a c l 0 8 和s p l t 9 7 j , 拄_ 行研究，两者 分别属于组i 和组i i n p v 。为进一步确证蛋白的功能，本文通过利用e t - 重- 组的 方法，g 寸a c l 0 8 基因进行敲除，研究了缺失该基因对病毒产生的影响。 际维样杆状瘕毒s p i t 9 7 和a c l o y , 堤f _ _ j 舯叶究 第一章杆状病毒及其o d v 囊膜蛋白研究进展 ( 文献综述) 1 1 杆状病毒及其应用 杆状病毒是杆状、有囊膜包被的病毒，其基因组为双链环状d n a ，大小介 于8 0 1 8 0 k b 之间。依据在感染细胞中包涵体( o c c u s i o nb o d y , o b ) 的形态，杆 状病毒科分类学上可以分成两个属( b l i s s a r de l 靠，2 0 0 0 ) ：核多角