（动物学专业论文）水体镉对中华绒螯蟹（eriocheir+sinensis）亲体毒性作用研究.pdf

华东师范大学2 0 0 7 届硕士学位论文水体镉对中华绒螯蟹亲体毒性作用的研究 水体镉对中华绒螯蟹亲体毒性作用的研究 中文摘要 本论文以我国重要经济甲壳动物中华绒螯蟹亲体为研究对象，运用酶学分析 法及精子质量评价指标研究了不同浓度水体c a 2 + 暴露，对中华绒螯蟹亲体生殖 毒性，肝胰腺中消化酶、代谢酶和抗氧化酶系统活性的影响。以期弄清镉对中华 绒螯蟹亲体消化、代谢、抗氧化和生殖毒性的短期影响。其实验结果显示： 一、水体c d 2 + 对中华绒螯蟹亲体肝胰腺消化酶活性的影响 在水体中通过添加不同浓度的c d 2 + ，分别在第2 4 h 、4 8 h 、7 2 h 和9 6 h 取中 华绒螯蟹亲体肝胰腺，研究了c e + 对中华绒螯蟹亲体肝胰腺中的胃蛋白酶、类 胰蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶活性的影响。结果表明，水体c a 2 + 对中华绒螯蟹 亲体肝胰腺中的胃蛋白酶、类胰蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶活性均有不同程度的 抑制作用，且c d 2 + 浓度越高，抑制作用越明显；各浓度c a 2 + 处理组中华绒螯蟹 亲体肝胰腺中的胃蛋白酶、类胰蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶活性随暴露时间的延 长，其被抑制程度不断增强。上述结果表明，水体c d 2 + 对中华绒螯蟹亲体肝胰 腺中四种消化酶表现为抑制作用，且有明显的浓度效应关系和时间效应关系。 二、水体c d 2 + 对中华绒螯蟹亲体代谢酶活性的影响 研究了不同浓度c d 2 + 和不同时间取样点c d ”对中华绒螯蟹亲体鳃钠钾三磷 酸腺营酶( n a + k + a t p a s e ) 和钙镁三磷酸腺苷酶( c a 2 + m 矿+ a t p a s e ) 、肝胰腺 碱性磷酸酶( a k p ) 和酸性磷酸酶( a c p ) 、血淋巴谷草转氨酶( a s t g o t ) 和 谷丙转氨酶( a l t g f t ) 。结果表明，鳃n a k a t p a s e 和c a - m g a t p a s e 活力随 取样时间的变化显著( p o 0 5 ) ，其影响程度与重金属离子浓度呈正相关，并且 一直呈现被抑制状态。肝胰腺a k p 活性一直呈现被抑制状态，并随c d 2 + 浓度的 增加，被抑制程度不断增强。1 m g l c d 2 + 处理组4 8 h 后随取样时间的变化显著 ( p o 0 5 ) ，其他c d 2 + 处理组a k p 活性随取样时间的变化显著( p 0 0 5 ) ；暴露于4 m g lc d 2 + 溶液后，随暴露时 间的延长，精巢和副性腺l d h 活性在7 2 h 和9 6 h 显著性降低( p 0 0 5 ) ，对精子 活力和顶体反应率有显著性影响( p 0 0 5 ) 。因此，水体c d 2 + 对中华绒螯蟹亲体 具有一定的生殖毒性。 关键词：镉( c d 2 + ) ；中华绒螯蟹；肝胰腺；消化酶：代谢酶：抗氧化酶 乳酸脱氢酶；毒性 华东师范大学2 0 0 7 届硕士学位论文 水体镉对中华绒螯蟹亲体毒性作用的研究 - p p “ m u d i e s0 nt o x i ce l i e c t so iw a t e r - d 0 r n e c a d m i u mo nm a t u r e dc h i n e s e m i t t e n h a n d e dc r a b ，e r i o c h e i rs i n e n s i s a b s t r a c t i nt h i sp a p e r , w es t u d yt h em a t u r e dc h i n e s em i t t e n - h a n d e dc r a b ，e r i o c h e i r s i n e n s i s - - ae c o n o m i cc r u s t a c e a n se r i o c h e i ri no u rc o u n t r y u s i n ge n z y m ea n a l y s i s a n ds p e r mq u a l i t ye v a l u a t i o nm e t h o dt os t u d yt h ee f f e c t i o no fd i f f e r e n tw a t e r e x p o s e dc d 2 + c o n c e n t r a t i o n st ot h em a t u r e dc h i n e s em i t t e n h a n d e dc r a b ，e r i o c h e i r s i n e n s i s 、sr e p r o d u c t i v et o x i c i t y ，l i v e rp a n c r e a sd i g e s t i v ea l z y l n e s ，m e t a b o l i c e n z y m e sa n da n t i o x i d a n te n z y m es y s t e m sa c t i v i t y w i t ha v i e wt od i s c o v e r yt h e e f f e c t i o no fc d 2 + t ot h em a t u r e dc h i n e s em i t t e n - h a n d e dc r a b ，e r i o c h e i rs i n e n s i s s d i g e s t i o n , m e t a b o l i s m ，a n t i o x i d a n ta n dr e p r o d u c t i v et o x i c i t yo f t h e s h o r t - t e r mi m p a c t t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o w ： 1 、e f f e c t so fw a t e r - b o r n ec a d m i u m ( c d z + ) o na c t i v i t yo fd i g e s t i v ee n z y m ei n m a t u r e de r i o c h e i r s i n e n s i s e f f e c t so fw a t e r - b o r n ec a d m i u m ( c d 2 + ) i nd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n s ( 1 m g l ，2 m e t e a n d4 m e t e ) a n dd i f f e r e n tt i m e ( 2 4 h ，4 8 h ，7 2 ha n d9 6 h ) o na c t i v i t i e so fp e p s i n , t y p a s e a m y l a s ea n dc e l l u l a s ci nh e p a t o p a n c r e a so fm a t u r e de r i o c h e i rs i n e n s i sw e r es t u d i e d t h er e s u l t ss h o w e dt h ed i f f e r e n ti n h i b i t i o ne f f e c to fc d ”i na c t i v i t i e so fp e p s i n , t y p a s ea m y l a s ea n dc e l l u l o s ei nt h eh e p a t o p a n c r e a si nv a r i e de x t e n t s ，a n dt h ee x t e n to f i n h i b i t i o ni sm o r ea n dm o r eo b v i o u sw i t hi n c r e a s i n gl e v e lo f w a t e r - b o m ec d 2 + e a c h c o n c e n t r a t i o ng r o u po fc a 2 + a c t i v i t i e so fp e p s i n ，t y p a s e ，a m y l a s ea n dc e l l u l o s e i n h e p a t o p a n c r e a so fm a t u r e de r i o c h e i rs i n e n s i s a r em o r ea n dm o r er e m a r k a b l y i n h i b i t e dw i t ht h ep r o l o n g a t i o ne x p o s i n gt i m ei nc d 2 + s o l u t i o n a l lt h er e s u l t ss h o wt h e i n h i b i t e dd e g r e eo f f o u rd i g e s t i v ee n z y m e si nh e p a t o p a n c r e a so f m a t u r e de r i o c h e i rs i n e n s i s i sd e p e n d e n to nt h ec o n c e n t r a t i o ma n da c t i n gt i m eo f p o l l u t a n t s 2 、e f f e c t so fw a t e r - b o r n ec a d m i u m ( c d 2 + ) o na c t i v i t yo fm e t a b o l i ce n z y m ei n m a t u r e de r o c h e 扣s i n e n m s e f f e c t so f w a t e r - b o m ec a d m i u m ( c d 2 + ) i nd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n s ( 1 m g l ，2 m g l 华东师范大学2 0 0 7 届硕士学位论文水体镉对中华缄螯蟹亲体毒性作用的研究 a n d4 m g l ) a n dd i f f e r e n tt i m e ( 2 4 h ，4 8 h , 7 2 ha n d9 6 h ) o na c t i v i t i e so f n a + 一k + - a t p a s e a n dc a z + _ m 9 2 + _ a t p a s ei ng i l l ，a k pa n da c pi nh e p a t o p a n c r e a s ，a s t g o ta n d a l t g p ti n h a e m o l y m p ho fm a t u r e d c h i n e s em i t t e n - h a n d e dc r a b s ( e r i o c h e i r s i n e n s i s ) w e r es t u d i e d t h er e s u l t ss h o w e d t h ea c t i v i t i e so fn a * 一k + 一a t p a s ea n d c a 2 + _ m 9 2 + _ a t p a s ei ng i l li si n h i b i t e da l lt h et i m e ，a n dt h e r ei sp o s i t i v ec o r r e l a t i o n b e t w e e nt h ei n h i b i t e dd e g r e ea n dt h ec o n c e n t r a t i o no fc d 2 + a tt h es a m et i m et h e a c t i v i t i e sn a + - k + a t p a s ea n dc a 2 + m 9 2 + a t p a s ei ng i l lc h a n g eo b v i o u s l y 伊 o 0 5 ) 、】l ，i 也t h ep r o l o n g a t i o no fe x p o s i n gt i m e t h ea c t i v i t i e so fa k pi nh e p a t o p a n c r e a si s i n h i b i t e da l lt h et i m ea n dt h ee x t e n to fi n h i b i t i o ni sm o r ea n dm o r eo b v i o u sw i t h i n c r e a s i n gt h el e v e lo fw a t e r - b o r n ec d 2 + ，t h e r ei s r e m a r k a b l ec h a n g eo fd e c l i n e ( p o 0 5 ) e x p o s i n g i nc d 2 + s o l u t i o no fl m g la f t e r4 8 h ，t h ea k pa c t i v i t yi n h e p a t o p a n c r e a si nc d 2 + s o l u t i o no f2 m g la n d4 m g lc h a n g er e m a r k a b l y ( p o 0 5 ) c o m p a r e dw i t hc o n t r o lg r o u pe x p o s i n gi nc d ”s o l u t i o no f l m p g la n d2 m e g le i t h e r a f t e re x p o s i n gi nc + s o l u t i o no f4 m g l t h ea c t i v i t i e so fl d hw a s d e c r e a s e dr e m a r k a b l y ( p c u 2 + z n 2 + 。d a k s n amd h a v a l e 等 ( d a k s n a md h a v a l e ，1 9 8 8 ) 的研究结果显示，当镉浓度为o 3 1 0 3 m g l 时，锯缘 青蟹的肝胰腺与鳃n a + - k + _ a t p a s e 在十天内出现暂时的激活现象，后随着时间 延长和镉浓度的升高酶活性被抑制，其中对鳃的抑制强于对肝胰腺的活性抑制作 用。赵维信等( 赵维信，1 9 9 5 ) 研究了镉对罗氏沼虾心脏、触角腺、肝胰腺、鳃、 肌肉和卵巢六种组织中谷丙转氨酶( o p t ) 和谷草转氨酶( o o t ) 活性的影响，表明 心脏、鳃和肝胰腺g p t 和g o t 活性受到显著抑制而触角腺g p t 和g o t 活性则 受到诱导显著升高。李少菁等( 李少菁，1 9 9 8 ) 研究了铜、锌、镉对日本对虾仔 虾a k p 、a c p 、g p t 、g o t 的活性的影响，结果表明三种重金属毒性大小依次 为c d 2 + c u 2 + z n ：+ ，三种重金属均对a k p 、g p t 、g o t 具有不同程度的抑制作 用，且随着浓度的增高，抑制作用越明显，但是对a c p 具有激活作用，随着浓 度的升高，激活作用也越明显。刘存歧等( 刘存歧，2 0 0 1 ) 研究了c u 2 + 、c 0 2 + 、 m n 2 + 三种金属离子对中国对虾幼体碱性磷酸酶和a t p a s e 的活力表明，三种离子 分别为4 0 9 9 l 、4 0 “g l 、2 0 肛g l 时明显激活日本对虾糠虾幼体碱性磷酸酶和 a t p a s e 的活力，但是大于此浓度时活力降低。t h a d e r ( 1 1 1 a l 【e r a ，1 9 8 9 ) 报道， 在o 1 0 8 m g l c d 2 + 浓度范围内，虾乙酰胆碱酯酶( a c l l e ) 活性随着c d 2 + 浓度 的增加而升高；r c d d y 等( r e d d y ，1 9 9 3 ) 将蟹暴露于o 6 m g l 镉溶液中，4 d 以 后a c h e 的活性增加，但在1 5 天后开始下降。d a v i ( d e v im ，1 9 9 5 ) 将小龙虾 暴露在镉亚致死浓度中，脑和腹神经索中a c l 】e 的活性被抑制。 总之，重金属对酶活性毒性的大小，与许多因素有关，如与重金属自身物理 和化学性质、重金属离子浓度，与暴露于重金属中的时间等有关，另外，许多实 验因子，如实验温度、培养动物容器的大小等也有一定的关系。 2 3 重金属对甲壳动物生殖毒性的影响 现己证明重金属可对生物生殖产生毒性，其生殖毒性在哺乳类动物中研究较 多，镉可对雄性生殖腺睾丸产生损害，如诱导睾丸退化、体积缩小、重量下降、 质地变硬、充血、出血、生精上皮被破坏，从而引起睾丸组织坏死( j o n e s ，1 9 9 7 ； w a a l k e s ，1 9 9 7 ；f o o t e ，1 9 9 9 ；d a m e k ，2 0 0 3 ；x u ，2 0 0 1 ) 。另外，镉能使精子 数、精子密度及其精子活动率下降，以至影响生殖能力，镉对卵巢影响虽不如睾 丸敏感，但镉可引起卵巢组织学改变，造成卵泡发育障碍，干扰排卵、转运和受 精过程，弓1 起暂时性不育( 吴思英，2 0 0 2 ) 。镉严重危害着生物的性功能、生殖 功能和后代的健康水平。 在甲壳动物中重金属对生殖的毒性作用亦有相关研究，但相对较少。王兰等 ( 王兰，2 0 0 1 ) 研究发现，镉在河蟹组织器官的积累量以肝胰腺中最多，而卵巢 6 华东师范大学2 0 0 7 届硕卜学位论文水体镉对中华绒螯蟹亲体毒性作用的研究 中几乎没有积累。王茜等( 王茜，2 0 0 3 ) 在研究镉对长江华溪蟹的急性毒性与积 累中发现，镉在长江华溪蟹外壳、鳃、肝胰脏、触角腺和卵巢五种组织器官中卵 巢内镉积累量最低。王兰等( 王兰，2 0 0 2 ) 研究发现，镉可对长江华溪蟹精子发 生产生毒害作用，镉注射o 5 h 后，各级生精细胞开始出现超微结构的变化，主 要表现为线粒体肿胀与空泡化，高尔基体变形，内质网扩张和膜结构损伤等，其 中线粒体损伤出现最早，是最易受损伤的一个敏感细胞器。张彰等( 张彰，2 0 0 3 ) 研究发现，镉可影响长江华溪蟹生精细胞的细胞核，首先影响细胞核形状，从正 常的圆形或卵圆形核变化为形状多样：先肿胀膨大，进而破裂，核孔增多。同时 核内染色质也受到影响，分布不均匀或聚集成块，核仁有或无。 重金属对甲壳动物生殖毒性研究相对薄弱，有待进一步研究，以搞清楚重金 属对甲壳动物生殖毒性作用的机理，为防止经济甲壳动物养殖重金属污染，重金 属对甲壳动物性功能、生殖功能影响，提高后代的健康水平提供基础参考资料。 2 4 重金属对甲壳动物d n a 的影响 重金属可引起遗传物质d n a 的损伤，即重金属的遗传毒性，其损伤包括： 单链或双链d n a 裂解、d n a d n a 交联、d n a 蛋白质交联和碱基改变等。重金 属镉对d n a 的损伤主要表现为单链d n a 损伤( s s ) 、d n a 蛋白质交联和d n a 修复抑制( 吕中明，1 9 9 5 ) 。目前国内外重金属对甲壳动物的d n a 影响研究相 对较少。王宏伟等( 王宏伟，2 0 0 1 ) 研究了z i l ”对日本沼虾肝胰腺细胞培养及其 r n a ，d n a 比率的影响。g ib e u mk i m ( 2 0 0 4 ) 和s h a r o ne h o o k ( 2 0 0 4 ) 以草 虾( p a l e o m o n e t e s p u g i o ) 的胚胎为实验材料，发现在镉的作用下，胚胎的d n a 受到损伤。开展重金属对甲壳动物遗传毒性作用将有助于认清重金属对甲壳动物 毒性作用分子机理，为甲壳动物分子毒理学提供基础理论依据。 2 5 重金属对甲壳动物细胞和组织器官的影响 重金属离子被甲壳动物吸收后，随着血液循环到达各组织器官。重金属首先 对甲壳动物各组织器官的生物大分子( 如d n a 、r n a 、各种酶) 产生毒害作用， 但随着重金属浓度的增加和暴露时间的延长，其毒害作用逐步在细胞、组织器官 等各个水平上反映出来，妨碍组织细胞代谢过程而出现组织学或细胞学的损伤 ( 张毓琪，1 9 9 3 ：孔繁祥，2 0 0 0 ) 。 2 5 1 重金属对甲壳动物鳃的影响 鳃是甲壳动物的呼吸器官，也是虾蟹等甲壳动物进行吸收、生物转化和排泄 的重要器官，当水体受到重金属污染时，鳃首先与重金属离子接触，并能迅速的 积累这些化合物，重金属对甲壳动物组织器官的损伤首先从鳃开始，同时鳃丝也 是甲壳动物最易受污染的靶组织。杨志彪( 杨志彪，2 0 0 5 b ) 研究了c u 2 + 对中华 华东师范大学2 0 0 7 届硕士学位论文水体镉对中华绒螯蟹亲体毒性作用的研究 绒鳌蟹鳃的影响，通过研究表明随着铜处理时间的延长和处理浓度的增大，鳃上 皮细胞微绒毛结构与基膜脱离，基膜呈现波纹状拱起，基膜下方呈较大的空腔， 上皮细胞线粒体空泡化，细胞核变形甚至核膜破裂，核物质游离，细胞结构破坏。 卢敬让等( 卢敬让，1 9 9 1 ) 研究发现c d 2 + 能对中华绒螯蟹的鳃造成严重的伤害， 主要病理变化是整个鳃叶出现不规则增厚，血腔增大，血细胞增多，上皮层破坏 直至解体：鳃的超微结构也发生了较为明显的变化：角质膜电子密度变得不均一， 上皮细胞受到明显破坏，有的血细胞异染色质化，细胞核变形。鳃的损伤必然会 导致甲壳动物的呼吸作用、渗透调节作用及物质吸收等受阻。 2 5 2 重金属对甲壳动物肝胰腺的影响 肝胰腺是甲壳动物体内重要的消化和解毒器官，可以合成和分泌消化酶以及 吸收营养物质。当甲壳动物受到重金属离子胁迫时，肝胰腺为重金属主要积累场 所，因此，重金属会对肝胰腺的结构和功能造成损害。 王兰研究( 王兰，2 0 0 3 ) 发现镉能使长江华溪蟹( s i n o p o t a m o n , y a n g t s e k i e n s e ) 肝胰腺细胞内大多数细胞器受到损害，最终细胞的解体，影响肝胰腺的生理功能， 如核膜溶解，核物质外溢；粗面内质网小泡上的核糖体脱落并出现空泡化；线粒 体膨大，内嵴减少或消失，出现空泡化；与此相适应的，参与自噬作用的溶酶体 的数量增多并与空泡化的小泡或线粒体结合形成自噬体，肝细胞严重受损。成永 绪等( 成永绪，2 0 0 0 ) 研究发现，z n 2 + 浓度超过2 0 0pg l 时便对中华绒螯蟹渣 状幼体肝胰腺结构造成严重损伤，表现为肝胰腺成熟或正在形成的b 细胞的空 泡内有含金属的电子致密颗粒，b 细胞空泡中的电子致密颗粒与环境中的z n 2 + 浓度高低呈正相关。r 细胞解体形成较大的空泡，被破坏程度比较严重。e 细胞 质也出现很多空泡，与正常e 细胞相比，其结构明显受损伤。当z n 2 + 浓度超过 1 0 0 0 肛g l 时，肝胰腺遭到严重破坏，正常细胞结构几乎不复存在。重金属铅可 损伤日本沼虾肝胰腺超微结构，急性前处理后对r 细胞和f 细胞的毒害作用最 大，0 9 m g , l 的铅处理后r 细胞和f 细胞内质网严重水肿、扩张、囊泡化，片层 结构水中，开始破裂；线粒体内嵴局部瓦解；细胞内分泌小泡或空泡增多；核膜 破裂，最终细胞解体、死亡( 卢建平，1 9 9 9 ) 。 总之，重金属可对甲壳动物主要解毒器官肝胰腺造成结构和功能的损伤，如 破坏肝胰腺细胞的细胞核、线粒体、内质网等主要细胞器结构与功能的完整性， 从而影响肝胰腺正常的生理功能。 2 6 重金属对甲壳动物个体存活和生长的影响 重金属可对甲壳动物个体存活和生长产生影响。杨志彪( 杨志彪，2 0 0 5 b ) 研究发现，水环境中的c u 2 + 在较低浓度( o 0 5 m g l ) 时就对中华绒螯蟹的蜕皮、 生长和存活产生显著抑制，且随着c u 2 + 浓度的增高，产生的抑制作用呈上升趋 8 华东师范大学2 0 0 7 届硕十学位论文 水体镉对中华绒螯蟹亲体毒件作用的研究 势；当c u 2 + 浓度增加到o 5 m g l 时会对中华绒螯蟹扣蟹的存活率、增重率和蜕皮 率产生显著抑制。于丰军( 于丰军，2 0 0 5 ) 研究了镉和铅两种重金属对中华绒螯 蟹生长和存活的影响，发现单一添加镉或铅的不同浓度组相比较，低浓度组的生 长率大于高浓度组的生长率，镉和铅混合浓度组的生长率低于单一浓度组的生长 率。对于死亡率来说，各处理组的死亡率均大于对照组的死亡率。单一添加镉或 铅的不同浓度组组相比较，都是低浓度组的死亡率低于高浓度组的死亡率。镉和 铅混合浓度组的死亡率大于单浓度组的死亡率，高浓度的两种重金属混合组河 蟹死亡率最高。 9 华东师范大学2 0 0 7 届硕学位论文水体镉对中华绒整蟹亲体毒性作用的研究 第二节本研究的背景、目的和意义 1 研究背景 随着工、农业生产的发展，重金属对环境的污染越来越严重。由于受到工业、 农业和生活污水的影响，我国养殖用水的重金属污染也在不断加剧( 刘恩生， 1 9 9 7 ) ，其中镉是重要的重金属污染物之一。据农业部和国家环保总局联合发布 2 0 0 5 年度的中国渔业生态环境状况公报显示：海洋重要渔业水域沉积物中， 主要受到镉、砷和石油类的污染，镉污染以东海区( 长江口、杭州湾及舟山近海) 部分渔业水域和黄海区( 胶州湾) 个别渔业水域相对较重，砷和石油类的污染以 南海区部分渔业水域相对较重。与2 0 0 4 年相比，镉、铜、石油类的超标比例均 有不同程度上升。 目前，因水体重金属污染而造成对水生生物的毒害作用日益严重，成为诱导 水生生物病害的重要因素，严重威胁我国水产养殖业，已成为近年养殖渔业环境 污染的公害之一。而重金属镉污染引起虾、蟹中毒的情况多有发生，因此虾蟹镉 中毒方面的研究也越来越受到重视( 于丰军，2 0 0 5 ) 。 近些年来，我国的虾蟹养殖业发展迅速，中华绒螯蟹、锯缘青蟹、罗氏沼虾、 日本对虾等品种已相继形成了规模化，中华绒螯蟹的年产量也已突破5 0 万吨大 关，因此，虾蟹养殖业已成为我国农民脱贫致富的重要产业( 杨志彪，2 0 0 5 a ) 。 但由于养殖水体重金属污染的加剧，势必会对养殖虾蟹造成毒害影响。不少学者 作了相关研究。杨志彪等( 杨志彪，2 0 0 5 a ) 研究发现，不同浓度的c u 2 + 对肝胰 腺类胰蛋白酶、胃蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶活性均有不同程度的抑制，且c u 2 + 浓度越高，抑制作用越明显。于丰军( 于丰军，2 0 0 5 ) 在研究镉对中华绒螯蟹幼 体消化酶活性影响时发现，镉对胃蛋白酶、胰蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶4 种酶 活性均有不同程度的抑制。刘晓玲等( 刘晓玲，2 0 0 3 ) 发现镉可对中华绒螯蟹幼 蟹抗氧化酶活性产生影响。汤鸿等( 汤鸿，2 0 0 0 ) 研究发现，c d 2 + 在高浓度时 对锯缘青蟹仔蟹碱性磷酸酶( a k p ) 、谷丙转氨酶( g p t ) 、谷草转氨酶( g o t ) 的酶活性产生明显的抑制作用。c d 2 + 对中华绒螯蟹幼蟹鳃丝n a + k + - a t p a s e 的活 性随取样时间变化显著，一直呈现被抑制状态，其影响程度与重金属离子的浓度 呈正相关，表现出明显的剂量、时间效应关系( 任加云，2 0 0 4 ) 。王兰等( 王兰， 2 0 0 2 ) 研究发现，镉可对长江华溪蟹精子发生产生毒害作用。 本研究基于以上重金属对虾蟹毒性的基础上开展了水体c d 2 + 对中华绒螯蟹 亲体消化、抗氧化、机体代谢和生殖等毒性作用的研究。 华东师范大学2 0 0 7 届硕十学位论文水体镉对中牛绒螫蟹亲体毒性作用的研究 2 研究的目的和意义 在本研究中，我们以中华绒螯蟹成蟹( 亲体) 作为研究对象，以镉作为重金 属污染物，主要利用生化酶学分析方法，辅以精子质量检测方法，研究了镉对中 华绒螯蟹亲体消化、抗氧化、机体代谢和生殖毒性。较为彻底地弄清楚水体重金 属c d 2 + 对中华绒螯蟹亲体消化、抗氧化、机体代谢和生殖毒性作用的影响及机 理。丰富重金属对甲壳动物毒性作用研究的资料，为防治河蟹养殖重金属污染、 无公害养殖提供基础参考资料和理论依据，建立套较为科学的水体镉对经济河 蟹亲体污染的危险评价指标，为更有效地保护天然资源提出合理对策。 华东师范大学2 0 0 7 届硕士学位论文水体镉对中华绒螯蟹亲体毒性作用的研究 第二章水体镉对中华绒螯蟹亲体肝胰腺消化酶活性的影响 中华绒螯蟹肉味鲜美，是我国重要的水产养殖经济甲壳动物种类。近些年来， 我国南方沿海诸省中华绒螯蟹的育苗和养成也在不断扩大。但随着工业生产的迅 速发展，工业排放物污染水体，重金属占有相当的比重，且重金属污染物已给养 殖业造成了严重危害，特别是直接影响到中华绒螯蟹繁殖、人工育苗的进行。以 往重金属对甲壳动物的研究多着眼于估算重金属半致死浓度、安全浓度( l i a o ， c ta l ，1 9 9 0 ；p a w i n ae ta l ，1 9 9 1 ；n a t a r a j a ne ta l ，1 9 9 2 ；b a m b a n gy ，1 9 9 5 ；杨志彪， 2 0 0 5 a ) ，而重金属对甲壳动物亲体研究较少。重金属会对蛋白和生物酶产生毒害， 且这些危害可以反映在生物体、细胞或分子水平上( b r o u w e rm ，2 0 0 2 ) 。镉作 为常见的重金属污染物，可能会对中华绒螯蟹亲体体内某些酶产生毒害作用，从 而使繁殖期亲体整体质量下降，影响其繁殖及育苗质量。本实验研究了镉对中华 绒螯蟹亲体消化酶活性的影响，以期为中华绒螯蟹亲体的重金属毒理学研究和养 殖水环境的保护提供基础资料，提高中华绒螯蟹亲体的繁殖及育苗质量。 1 材料和方法 1 1 实验材料 实验药品为分析纯c d c l 2 2 5 h ：0 ，上海亭新化工试剂厂产品。实验所用中华 绒螯蟹购于上海长风集贸市场，属长江水系。选择附肢完整、大小基本一致、处 于蜕皮间期的健康中华绒螯蟹个体用于试验。个体平均湿重为1 5 1 2 6 7 8 9 。 1 2 实验条件 于2 0 0 6 年l o 月在华东师范大学生物系生物站进行试验动物养殖。试验前驯 养一周。驯养期间投喂螺蛳。试验用水为曝气2 - 3 天后的城市自来水，p h 7 2 0 2 ，自然水温，自然光照，溶解氧为7 8 + 0 3 m g 1 ，连续充气增氧。每天换水 l 3 。 1 3 染毒 实验设置一个未添加c a 2 + 的空白对照组和3 个c d ”浓度处理组：l i n g t , 、 2 m g l 、4 m g l 。将实验用蟹置于6 7 c m x5 0 c m x3 7 c m 的聚乙烯水族箱中，每箱 放入4 只，共计2 4 个水族箱。加入8 0 l 含有不同c d 2 + 浓度的水。箱放置一些洗 净的瓦片，以供蟹躲藏。每个c a 2 + 浓度处理组均设3 个平行组。实验期间每天 6 ：0 0 和1 8 ：0 0 按体重的的5 投喂成蟹饲料。下午投喂饲料前吸净残饵，更换少 量饲养用水，所换c d 2 + 浓度与试验组浓度相同。水质与上述相同。实验期间中 华绒螯蟹无死亡现象。 华东师范大学2 0 0 7 届硕十学位论文水体镉对中华绒螯蟹亲体毒性作用的研究 1 4 取样 试验开始后分别在第0 、2 4 、4 8 、7 2 、9 6 小时取样，每次对照组取中华绒螯 蟹3 只，各浓度c a 2 + 染毒组每个平行组各去2 只中华绒螯蟹，即每次每浓度染 毒组共取中华绒螯蟹6 只，蒸馏水冲洗后取肝胰腺。各组样品用预冷的生理盐水 冲洗后，以洁净的吸水纸吸去表面水分，置7 0 0 c 冰箱保存备用。 1 5 消化酶测定 测定方法参考潘鲁青等( 潘鲁青，1 9 9 7 ) ，在此基础上加以改进。取上述冷 冻的中华绒螯蟹肝胰腺约1 9 ，冰浴融化，加入4 m l 预冷的o 8 6 生理盐水，冰 浴匀浆后经冷冻高速离心机离心( 4 0 c ，9 0 0 0 r m i n ，1 5 r a i n ) ，取上清液加生理盐 水至6 m l 测定胃蛋白酶、类胰蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶活力。 胃蛋白酶：取上述制备的上清液o 4 m l ，加入0 5 干酪素溶液2 m l ( o 5 9 干酪素溶于1 0 0 m l 柠檬酸缓冲液) ，0 0 4 me d t a - n a 2o 1 m l ，o 2 m 柠檬酸缓冲 液( p h 3 0 ) 0 4 m l ，加重蒸水，使总体积为3 5 m l ，混匀，置于3 7 水浴中， 反应1 5 m i n 。然后加入3 0 三氯醋酸1 m l ( 3 0 9 溶于1 0 0 m l 重蒸水中) ，离心， 取上清液，用福林酚试剂在5 4 0 n m 处比色测定酪氨酸的生成的含量。在3 7 c 下， 每分钟水解于酪素所产生l u g 酪氨酸作为一个酶活力单位u ( u g r a i n o ) 。 胰蛋白酶：测定所用缓冲液为0 0 5 m 硼