（生物化学与分子生物学专业论文）关于蛋白质组学的几种方法学研究.pdf

摘要 蛋白质鉴定技术的发展与基因组测序计划的实施与相继完成，使 得“蛋白质组学”这全新的研究领域得以诞生和发展。蛋白质组学 是在基因组学的基础上研究蛋白质的表达与功能的科学，是建立在从 c d n a 阵列m r n a 表达谱的基因功能分析，基因组范围的酵母双杂交， 蛋白质与蛋白质相互作用分析到蛋白质表达、测序和结构分析等诸多 不同实验方法相互融合基础上的科学。它旨在阐明生物体内全部蛋白 质的表达模式及功能模式，其内容包括鉴定蛋白质的表达，存在方式 ( 修饰方式) ，结构，功能及相互作用等。蛋白质组是指一个基因组 所编码的所有蛋白质的总合。 蛋白质组学现在是一个发展非常迅速的学科。新的研究方法，技 术不断出现，大大推动了蛋白质组学这门新兴学科的发展。本文也主 要是在几种方法学上进行探索，并取得了有意义的研究结果，初步建 立了几种有关蛋白质组学的技术平台。 1 m a l d i t o f p s d 序列测定方法的建立 由于具有高灵敏度，高通量等优点，p m f 方法成为种很好的鉴 定2 d g e l 蛋白质点的方法，但也会经常碰到候选蛋白有多个和有时 排在第一的冠军蛋白不是目标蛋白等问题。为了提高我们对那些p m f 方法不能确定的蛋白质点的鉴定，我们通过p s d 测定肽片段的序列来 增加鉴定的准确性。并且探索用几种化学试剂对肽片段进行修饰，协 助肽片段断裂，从而大大有利于图谱的解析。为蛋白质测序提供了一 种好的快速的方法，也提高了蛋白点的鉴定准确性。 2 表面等离子共振技术在蛋白质组学研究中的应用 生物分子相互作用分析质谱方法( b i a m s ) 整合了表面等离子共 振技术( s p r ) 与基质辅助激光解吸时间飞行质谱技术，能对蛋白质相 互作用实时分析并直接鉴定。这种方法在蛋白质组学研究中是一种非 常有应用前景的鉴定蛋白质分子相互作用的方法。本文利用这种方法 对微球蛋白和其抗体这对相互作用蛋白质进行分析和鉴定。另外本文 也利用表面等离子共振技术在测定毒素活性方面进行了一些探索，取 得了一些结果。 3 i c a t 试剂定量方法的建立 为了解决蛋白质组学中的定量的难题，同位素亲和标记技术 ( i s o t o p e - c o d ea f f i n i t yt a g ，i c a t ) 被应用在蛋白质组研究中。首 先，使用氢和氘标记的i c a t 试剂对标准肽和标准蛋白质进行方法学 的研究。用i c a t 标记的蛋白质酶解后，使用二维色谱和质谱连用技 术对其分析和鉴定。结果表明，这种非凝胶的定量方法大大提高了蛋 白质定量速度和精确度。 关键词：蛋白质组学；p m f 方法；p s d 测序；s p r ；b i a m s ：生物芯 片：i c a t ： ! 堕：兰! a b s t r a c t r e c e n t d e v e l o p m e n t si na n a l y t i c a lm e t h o d sf o rp r o t e i n c h a r a c t e r i z a t i o n ，a n dt h eg r o w i n gr a t ea tw h i c hw h o l eg e n o m e s e q u e n c l n gp r o j e c t sa r e b e i n gc o m p l e t e d ，h a v ec o m b i n e dt o s u p p o r tt h e e m e r g e n c ea n dd e v e l o p m e n to ft h en e wf i e l d o f p r o t e o m i c s p r o t e o m i c s ，t h es t u d yo fp r o t e i ne x p r e s s i o n a n df u n c t i o no na g e n o m es c a l e ，i st h ea m a l g a m a t i o no f v e r ym a n y d i f f e r e n te x p e r i m e n t a la p p r o a c h e sr a n g i n g f r o mt h ea n a l y s i so f p r o t e i ni n t e r a c t i o n s b yg e n o m e w i d et w oh y b r i d s c r e e n i n g ，t o m o r ed i r e c t a n a l y s i s o f p r o t e i n e x p r e s s i o n ，s e q u e n c e a n d s t r u c t u r e p r o t e o m ei n d i c a t e st h e p r o t e i n s e x p r e s s e db y a g e n o m e t h et e c h n o l o g yo fp r o t e o m i c sr e q u i r e st h es e p a r a t i o n i d e n t i f i c a t i o no f l a r g e n u m b e ro f p r o t e i n s i nd r o t e o m e p r o j e c t s ，w h i c ha i mt oi d e n t i f ya n dc h a r a c t e r i z ea l lp r o t e i n s e x p r e s s e db ya n o r g a n i s mo rt i s s u e ，t h ei d e n t i d f i c a t i o no f p r o t e i n si sc r i t i c a l t h er e l a t e dt e c h n i q u e sa n d m e t h o d sw e r e d e v e l o p i n gq u i c k l y 。b u t c o n s i d e r i n gt h e c o m p l e x i t y o f p r o t e o m i c sa n dt h e1 i m i to fc u r r e n tt e c h n i q u e s ，t h e r ea r es t i l l l o t so f p r o b l e m sn e e d e dt ob er e s o l v e d t h r e em e t h o d s w a s s t u d i e di nt h i s p a p e r ，s o m er e s u l t sa r ea sf o l l o w s 1 m a d l i t o f p s dm e t h o d d u et oi t sv e r ys h o r ta n a l y s i st i m e ，i t sh i g hs e n s i t i v i t y a n de a s yo fa u t o m a t i o n ，m a l d i p e p t i d em a s sf i n g e r p r i n t i n g ( p m f ) h a sb e c o m et h e p r e f e r r e dm e t h o df o ri d e n t i f y i n gp r o t e i n so f w h i c ht h es e q u e n c e sa r ea v a il a b l ei nd a t a b a s e u n f o r t u n a t e l y ， p m fc a na l s ol e a dt oa m b i g u o u sp r o t e i n i d e n t i f i c a t i o nb e c a u s e o fi n s u f f i c i e n tp r o t e i ns e q u e n c e c o v e r a g e ，c o m p l e xm i x t u r e so f t r y p t i cp e p t i d e sf r o mc o m i g r a t i n gp r o t e i n sa n dn o v e lp r o t e i n o fn om a t c hi n d a t a b a s e t oa v o i dt h is p r o b l e m ，p o s t s o u r c e v a b s t r a c t d e c a y ( p s d ) m a l d im a s ss p e c t r o m e t r yw a sd e v e l o p e d f o rh i g h s e n s i t i v i t yp e p t i d es e q u e n c i n g m o r e o v e r ，t w o n t e r m i n a l c h e m i c a lm o d i f l e d r e a g e n t w a ss t u d i e d t h i sm o d i f i c a t i o n s i g n i f i c a n t l y f a c i l i t a t e s s e q u e n c ei n t e r p r e t a t i o nb y p r o v i d i n gs t r o n gi n t e n s i t yc t e r m i n a lp r o d u c ti o n s ( y t y p ei o n s ) i nt h em a t r i x a s s is t e dl a s e r d e s o r p t i o n i o n i z a t i o n p o s t s o u r c ed e c a y ( m a l d i p s d ) _ m s w e c a n e a s y t or e a dt h e s e q u e n c e i n f o r m a t i o n b y d i s t i n c td i f f e r e n c eb e t w e e nt h e a d j a c e n ty - t y p ei o np e a k s 。 2 t h ea p p l i c a t i o no fs u r f a c ep l a s m o nr e s o n a n c et e c h n o l o g yi n p r o t e o m i c ss t u d y b i o m o l e c u l a ri n t e r a c t i o na n a l y s i sm a s ss p e c t r o m e t r y ( b i a m s ) i sa n a p p r o a c hc o m b i n i n g t h es u r f a c ep l a s m o n r e s o n a n c e ( s p r ) t e c h n o l o g y a n dm a s ss p e c t r o m e t r y f o rt h e r e a l t i m ea n a l y s i sa n di d e n t i f i c a t i o no fi n t e r a c t i o nm o l e c u l e s t h a ti n t e r a c t s p e c i f i c a l l yw i t h ak n o w ni m m o b i l i z e d1 i g a n d b i a m si sav e r yp r o m i s i n gm e t h o da p p l i e di np r o t e o m i c sf o rt h e c h a r a c t e r i z a t i o no fp r o t e i n p r o t e i ni n t e r a c t i o n s i nt h i s s t u d y ，b yu s i n g t h eb i a c o r e xi n s t r u m e n t ，t h e m e t h o dw a s s u c c e s s f u l l ya p p l i e d t ot h em o d e l p r o t e i nm i c r o g l o b u l i n i n t e r a c t i n gw i t h i t sa n t i b o d y ，au n a m b i g u o u si d e n t i f i c a t i o n w a so b t a i n e da tf m o il e v e l i na d d i t i o n ，w es t u d i e dt h ef u n c t i o n o fs o m et o x i nb yu s i n gt h es p rt e c h n o l o g y 3 t h em e t h o do fq u a n t i t a t i v ev i ai s o t o p e c o d ea f f i n i t yt a g i no r d e rt or e a c ht h eg o a l o f q u a n t i t a t i v e p r o t e o m i c s ，i s o t o p e c o d e da f f i n i t yt a g s ( i c a t s ) w e r e e m p l o y e d t o i d e n t i f y a n d q u a n t i t a t ec h a n g e s i n p r o t e i ne x p r e s s i o n f i r s t l y ，t h em e t h o d w a sa p p l i e dt oa n a l y z et h es t a n d a r dp e p t i d e a n dp r o t e i nt oo p t i m i z et h ep r o c e d u r eo fi c a t a f t e rt h ep r o t e i n w a s l a b l e d ，t r y p s i n w a s a p p l i e d ，t w o d i m e n s i o n a l 1 i q u i d ! ! ! ! 璺坠 c h r o m a t o g r a p h y m a s s s p e c t r o m e t r yc o u p l e dw i t h s t r a t e g y w a s u s e di n a n a l y s i s t h er e s u l tr e v e a l e d t h a tt h is s t r a t e g y f a c i l i t a t e dt h ef a s ta n da c c u r a t eq u a n t i t a t i o nb yo n e s t e pa n d o n l i n e d e s a l t i n g ，i s o l a t i o na n di d e n t i f i c a t i o no fl a b e l e d p e p t i d e s k e y w o r d ：p r o t e o m i c s ；p m fm e t h o d ；p s ds e q u e n c i n g ；b i a m s ；s p r ； b i o s e n s o r c h i p ：i c , a t ： v 缩写表 a c n a p s b i s b s a c c a c h a p s c i d d d h 2 0 2 一d e d t t e d t a e s i m s i a a i p g l c l c m n p 一4 0 p a g e p m f p m s f p s d p v d f s d s t b p 缩写表( 中英文对照) 乙腈( a c e t o n i t r i l e ) 过硫酸铵( a m i n o n i u mp e r s u l f a t e ) 甲叉双丙烯酰胺 n ，n 乞m e t h y l e n e b is 一( a c r y l a m i d e ) 牛血清白蛋白( b o v i n es e r u ma l b u m i n ) q 一氰基以一羟基肉桂酸( - c y a n o - 4 - h y d o x y c i n n a m i ca c i d ) 3 一 ( 胆酰胺丙基) 一二乙胺 _ 丙磺酸 碰撞诱导解离( c o l l i s i o n i n d u c e dd i s s o c i a t i o n ) 双蒸水( d o u b l ed i s t i l l e dw a t e r ) 双向电泳( t w o d i m e n s i o n a le l e c t r o p h o r e s i s ) 二硫苏糖醇( d i t h i o t h r e i t 0 1 ) 乙二胺四乙酸( e t h y l e n ed i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d ，e d i t i ca c i d ) 电喷雾质谱( e l e c t r o s p r a yi o n i z a t i o n ) 碘乙酰胺( i o d o a c e t a m i d e ) 固相p h 梯度( i m m o b i l i z e dp hg r a d i e n t ) 液卡目质谱( 1i q u i dc h r o m o t o g r a p h y ) 激光捕获微量切割( 1 a s e rc a p t u r em i c r o d i s s e c t i o n ) 非离子去垢剂( n o n i d e tp 4 0 ) 聚丙烯酰6 ；掇胶电泳( p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s ) 肽质量指纹图( p e p t i d e m a s sf i n g e r p r i n t ) 蛋白酶抑制剂( p h e n y l m e t h a n s u l f o n y l f l u o r i d e ) 源后裂解( p o s t s o u r c ed e c a y ) 聚偏二氟乙烯( p o l y v i n y l i d e n e d i f l u o r i d ) 十二烷基硫酸钠( s o d i u md o d e c y l s u l f a t e ) 三丁基磷( t r i b u t y lp h o s p h i n e ) j ! i ! ! j ! 一 - - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ - - _ _ _ _ _ _ _ - _ - _ - _ _ _ _ - j - _ _ _ _ - _ _ _ 一 t e m e d t f a j r l s c i d f t i c r i c a t i e f q t o f m d l c i e x s p r b i a s e l d i 四甲基z 二胺( n ，n ，n 。，n 一t e t r a m e t h y l e t h l e n ed i a m i n e ) 三三氟乙酸( t r i f l u o r o a c e t i c a c i d ) 三羟基甲墨鸶l c 基甲烷 t r i s 一( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e j 碰撞诱导的解离( c 0 1 1 i s i o n i n d u c e d d i s s o c i a t i o n ) 傅里叶一变换离子回旋加速器共振( f o u r i e r t r a n s f o r m i o nc y c l o t r o nr e s o n a n c e ) 同位素标记亲和标签( i s o t o p e c o d e d a f f i n i t yt a g s ) 等电聚焦( i s o e l e c t r i c f o c u s i n g ) 四级杆飞行时间( q u a d r u p o l e t o f ) 多维色谱( m u l t i d i m e n s i o n a l l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ) 离子交换色谱( i o ne x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y ) 表面等离子共振( s u r f a c ep l a s m o nr e s o n a n c e ) 生物分子相互作用分析( b i o m o l e c u l a r i n t e r a c t i o n a n a l y s i s ) 表面增强激光解吸离子化( s u r f a c e e n h a n c el a s e r d e s o r p t i o ni o n i z a t i o n ) c a f化学协助裂解( c h e m i c a l l ya s s i s t e d f r a g m e n t a t i o n ) m a l d i t o f m s 基质辅助激光解吸飞行时间质谱( m a t r i x a s s i s t e d l a s e r - d e s o r p t i o n i o n i z a t i o n t i m e o f f l i g h t m a s s s p e c t r o m e t r y ) 第一章前言i i i j 质纰学方法学研究最新进展 第一章前言蛋白质组学方法学研究最新进展 1 蛋白质组学研究的意义和背景 随着人类基因组计划的完成，生命科学研究己进入了后基因组时 代“j 。在这个时代，生命科学的主要研究对象是功能基因组学，包括 结构基因组研究和蛋白质组研究等”3 。尽管现在已有多个物种的基因 组被测序，但在这些基因组中通常有一半以上基因的功能是未知的。 目前功能基因组中所采用的策略，如基因芯片、基因表达序列分析 ( s e r i a la n a l y s i so fg e n ee x p r e s s i o n ，s a g e ) 等，都是从细胞中 m r n a 的角度来考虑的，其前提是细胞中m r n a 的水平反映了蛋白质表 达的水平。但事实并不完全如此，从d n a 到蛋白质，存在三个层次的 调控，即转录水平调控( t r a n s c r i p t i o n a lc o n t r 0 1 ) ，翻译水平调控 ( t r a n s l a t i o n a lc o n t r 0 1 ) ，翻译后水平调控( p o s t t r a n s f a t i o n a l c o n t r 0 1 ) 。从m r n a 角度考虑，实际上仅包括了转录水平调控，并不 能全面代表蛋白质表达水平。实验也证明，组织中m r n a 丰度与蛋白 质丰度的相关性并不好，尤其对于低丰度蛋白质来说，相关性更差。“。 更重要的是，蛋白质复杂的翻译后修饰、蛋白质的亚细胞定位或迁移、 蛋白质一蛋白质相互作用等几乎无法从m r n a 水平来判断。毋庸置疑， 蛋白质是生理功能的执行者，是生命现象的直接体现者，对蛋白质结 构和功能的研究将直接阐明生命在生理或病理条件下的变化机制。蛋 白质本身的存在形式和活动规律，如翻译后修饰、蛋白质问相互作用 以及蛋白质构象等问题，仍依赖于直接对蛋白质的研究来解决。虽然 蛋白质的可变性和多样性等特殊性质导致了蛋白质研究技术远远比 核酸技术要复杂和困难得多，但正是这些特性参与和影响着整个生命 过程。传统的对单个蛋白质进行研究的方式已无法满足后基因组时代 的要求。这是因为：( 1 ) 生命现象的发生往往是多因素影响的，必然 涉及到多个蛋白质。( 2 ) 多个蛋白质的参与是交织成网络的，或平行 发生，或呈级联因果。( 3 ) 在执行生理功能时蛋白质的表现是多样的、 第一市前高生i 1 质纰学方法学川究最新进腱 白质组研究组织( h u m a np r o t e o m eo r g a niz a ti o n ，h u p o ) ，随后欧洲、 亚太地区都成立了区域性蛋白质组研究组织，试图通过合作的方式， 融合各方面的力量，完成人类蛋白质组计划( h u m a np r o t e o m e p r o j e c t ) 。 2 蛋白质组学研究的策略和范围 蛋白质组学一经出现，就有两种研究策略。一种采用高通量的蛋 白质组研究技术分析生物体内尽可能多乃至接近所有的蛋白质，这种 观点从大规模、系统性的角度来看待蛋白质组学，也更符合蛋白质组 学的本质。但是，由于蛋白质表达随空间和时间不断变化，要分析生 物体内所有的蛋白质是个难以实现的目标。所以很多人提出了另一 种策略：功能蛋白质组学”。即研究不同时期细胞蛋白质组成的变 化，如蛋白质在不同环境下的差异表达，以发现有差异的蛋白质种类 为主要目标。这种观点更倾向于把蛋白质组学作为研究生命现象的手 段和方法。 、 总体上看，蛋白质组研究可分为四个方面“o3 ：( 1 ) 对细胞或组织内 蛋白质的表达模式及修饰( 表达蛋白质组学) 的研究。( 2 ) 建立在x 一 射线单晶衍射分析( 晶体结构分析) 、多维核磁共振波谱分析、电镜 二维晶体三维重构术( 电子晶体学) 技术基础之上地蛋白质的序列和 高级结构( 结构蛋白质组学) 的研究。( 3 ) 对蛋白质的胞内分布及移 位( 细胞图谱蛋白质组学) 的研究：确定蛋白质在亚细胞结构中的位 置，通过纯化细胞器或用质潜仪牲定蛋白复合物组成等。( 4 ) 蛋白质 的功能模式( 功能蛋白质组学) ：目前主要集中在蛋白质与蛋白质及 其与其他分子的相互作用网络关系的研究。对蛋白质组组成的分析鉴 定是蛋白质组学中的与基因组学相对应的主要内容。它要求对蛋白质 组进行表征，即所有蛋白质的分离与鉴定及其图谱化。随着学科的发 展，蛋白质组学的研究范围也在不断完善和扩充。蛋白质翻译后修饰 研究已成为蛋白质组研究中的晕要部分和巨大挑战。 第一章前吉盘n 质纽学方法学川究五圭新进艘 3 蛋白质组学研究技术的最新进展 可以说，蛋白质组学的发展既是技术所推动的也是受技术限制 的。蛋白质组学研究成功与否，很大程度上取决于其技术方法水平的 高低。蛋白质研究技术远比基因技术复杂和困难。不仅氨基酸残基种 类远多于核苷酸残基( 2 0 4 ) ，而且蛋白质有着复杂的翻译后修饰， 如磷酸化和糖基化等，给分离和分析蛋白质带来很多困难。此外，通 过表达载体进行蛋白质的体外扩增和纯化也并非易事，从而难以制各 大量的蛋白质。蛋白质组学的兴起对技术有了新的需求和挑战。蛋白 质组的研究实质上是在细胞水平上对蛋白质进行大规模的平行分离 和分析，往往要同时处理成千上万种蛋白质。因此，发展高通量、高 灵敏度、高准确性的研究技术平台是现在乃至相当一段t i , 1 f 日g 内蛋白质 组学研究中的主要任务。当前在国际蛋白质组研究技术平台的技术基 础和发展趋势有以下几个方面： 3 1 蛋白质组研究中的样品制备 大家越来越清楚地认识到样品制备在蛋白质组学研究的重要性。 这一步直接影响后期研究结果，且样品制备中的失败很难通过后续的 工作来完善和补偿。如何尽可能高保真地获得一个基因组在个组织 中所表达的全部蛋白，这是一个急需解决的问题。样品来源不同，处 理方法也会有所不同。尽管处理方法多种多样，但都需遵循以下几个 基本原则：。“：( 1 ) 尽可能地提高样品的溶解度，并保持在整个电泳 过程中蛋白质的溶解状态：( 2 ) 防止溶液介质中对蛋白质的人为修饰， 首先在样品溶解之前要使所有能使蛋白质发生修饰的酶迅速失活，其 次不能把多肽置于化学修饰易发生的环境中；( 3 ) 破坏蛋白质与其他 生物大分子之间的相互作用以产生独立的多肽链，并使蛋白质处于完 令变性状态：( 4 ) 去除非蛋白杂质。为了提高样品制备的效率和质量， 现在许多新的试剂和方法被广泛地使用。 3 1 1 亚细胞器蛋白质的分离提取和蛋白质分步抽提技术 尽管各种高灵敏度的检测器相继问世，但分析低丰度的蛋白质仍 是一项挑战。不同蛋白质的溶解度及丰度常常存在较大的差异，为了 第一章前苦出 j 质纽学方法学 j | _ 究最新进艟 对那些低丰度和疏水性强的蛋白质进行研究，我们可以进行样品预分 级，即采用各种方法将细胞或组织中的全体蛋白质分成几部分，分别 进行蛋白质组研究“”。样品预分级的主要方法包括根据蛋白质溶解 性和蛋白质在细胞中不同的细胞器定位进行分级，如对那些定位于细 胞核、线粒体或高尔基体等细胞器的蛋白质成分，我们可以应用超速 离心的方法富集亚细胞；对那疏水性强的蛋白质进行研究，我们通常 采用分级提取的方法1 。 样品预分级不仅可以提高低丰度蛋白质的上样量和检测率，还可 以针对某一细胞器的蛋白质组进行研究。 3 1 2 激光捕获显微切割( 1 a s e r c a p t u r c m c r o d i s 一$ 6 c t i o n ，l c m ) 对临床组织样本进行研究，寻找疾病标记，是蛋白质组研究的重 要方向之一。但临床样本都是各种细胞或组织混杂，而且状态不一。 如肿瘤组织中，发生癌变的往往是上皮类细胞，而这类细胞在肿瘤中 总是与血管、基质细胞等混杂。所以，常规采用的癌和癌旁组织或肿 瘤与正常组织进行差异比较，实际上是多种细胞甚至组织蛋白质组混 合物的比较。而蛋白质组研究需要的通常是单一的细胞类型。为r 解 决这个问题，最近在组织水平上的蛋白质组样品制各方面也有新的进 展，种称为激光捕获微解剖( l a s e rc a p t u r em i c r o d i s s e c t i o n ，l c m ) 方法被应用_ 丁分离癌变上皮类细胞，得到很好的效果“”。 激光捕获显微切割是一项在显微镜下从组织切片中分离纯化单 一类型细胞群或单个细胞的技术，使靶细胞群与转运膜在局部紧密粘 合，选择性地捕获目的细胞群。l c m 具有一些传统操作所没有的优点： 它所具有的高激光定位的准确程度可以达到1um ，捕获点范围达到 3 5um ，因而足以捕获单个细胞，并且方法快速、简便，可避免了无 关细胞和碎片的污染。它既能有效保持被分离样品的结构完整性，又 不破坏周围临近组织的完整性。它使细胞内分子结构保持完整，而且 转运膜轻微、短暂的温度变化埘蛋白质无损伤。它成功地解决了组织 中的细胞异质性问题，是分子病理学和肿瘤基因组学研究的一一项革命 性技术。 第一章前苦出 | 质组学方法学 ：| 究最新逃艘 3 2 蛋白质组研究中的样品分离和分析 3 2 1 二维凝胶电泳技术 利用蛋白质的等电点和分子量通过双向凝胶电泳的方法将各种 蛋白质区分开来是一种很有效的手段”j 。它在蛋白质组分离技术中 起到了关键作用。如何提高双向凝胶电泳的上样量、灵敏度和分辨率 以及对蛋白质差异表达的准确检测是目前双向凝胶电泳技术发展的 关键问题。蛋白质组重叠群方法的应用在一定程度上提高r 二维凝胶 电泳的分离能力，主要是利用多块在不同p h 梯度或分子量上相互重 叠的双向电泳图谱，结合图像分析技术拼接成一张完整的双向电泳图 谱，其实质是使每一块凝胶在较窄的p h 梯度和分子量范围内分离蛋 白质，以提高分辨率1 1 。现在国外的主要趋势有第一维电泳采用窄 p h 梯度胶分离以及开发与双向凝胶电泳相结合的高灵敏度蛋白质染 色技术，如新型的荧光染色技术。 3 2 2 二维色谱技术 尽管二维聚丙烯酰胺凝胶电泳技术是目前蛋白质组学研究方法 中分离蛋白质的主要方法，但由于其局限性，人们逐渐提出了以多维 液相分离方法为基础的蛋白质组学研究技术。多维l c m s m s 近几年 发展迅速。蛋白质混合物直接通过液相色谱分离，然后进入m s 系统 获得肽段分子量，再通过串联m s 技术得到部分序列信息，最终通过 计算机联l 冽查询，就可以对蛋白进行鉴定。o p i t e c k 等首次报道多维 色谱l c l c 整合m s m s 技术分析蛋白质混合物。 最近二维色谱( 2 d - l c ) 、二维毛细管电泳( 2 d c e ) 、液相色谱一 毛细管电泳( l c c e ) 等新型分离技术都有补充和取代双向凝胶电泳 之势。另一种策略则是以质谱技术为核心，开发鸟枪法( s h o t g u n ) 、 毛细管电泳一质谱联用( c e - m s ) 等新策略直接鉴定全蛋白质组混合酶 解产物1 。 3 2 2 质谱技术 质谱技术是目前蛋白质组研究中发展最快，也最具活力和潜力的 技术。当前蛋白质组研究的核心技术就是双向凝胶电泳一质谱技术， 第一章前高生“质士u 学方法学究最新进j 诞 即通过双向凝胶电泳将蛋白质分离，然后利用质谱对蛋白质逐一进行 鉴定。对于蛋白质鉴定而言，高通量、高灵敏度和高精度是三个关键 指标。现在许多新的杂交质谱的出现逐渐已经基本上可以同时达到以 j 二三个要求，从而实现对蛋白质准确和大规模的鉴定。 近年来一些具有新构造及高潜能的质谱仪被引入到了蛋白质组 学研究中。k r u t c h i n s k y a 等尝试将m a l d i 离子源和混合q - t o e 偶联 j ，起来“”“。该装置称为m a l d iq q t o f ，包括一个m a l d i 离子源， 个选择四级杆( q ) ，一个碰撞室( q ) ，一个片段离子飞行时间分析器 ( t o f ) 。q - t o e 提供的质量准确性和检测灵敏度提升r 数据库搜寻结 果的准确性并是m s m s 从头测序理想的仪器。m a l d i t o f 构造可以使 样品在一个样品盘上保留以便对不确定的样品进行进一步的研究，这 避免了样品分析后便丢失，不能验证的缺陷，同时也提供了进行自动 化和高通量应用的可能。w a t t e n b e r g 等评述了m a l d iq q t o f 仪器在 从头测序( d en o v os e q u e n c i n g ) 中的超凡能力”“。而m o ll o y 等则用 m a l d iq q t o f 进行了c a u l o b a c t e rc r e s c e n t u s 中的碱性膜蛋白质组 研究“。 m e d z i h r a d s z k y 等”描述了一个不同的混合仪器称之为m a l d i t o ft o f 。此设备享有许多m a l d iq q t o f 的优点，能够进行高能量c i d 分析并具有非常快速的分析速率，样品高通量输出的明娃优势使得每 天进行成百上千个蛋白质点的鉴定成为可能。f r i e d m a n 等用该仪器 对人结肠癌及其相邻的正常结膜组织进行比较蛋白质组学研究获得 了成功，鉴定了5 2 个包括发生了转移后修饰的特异性蛋白圳。r e j t a r 等则将t o f t o e 与高分辨率的毛细管电泳偶联起来评价了它们分析 复杂酶解产物的能力以及在肽片段从头测序( d en o v os e q u e n c i n g ) 中的优势“。 另外被其它仪器公司最新推出的仪器还有四极杆一离子阱串联质 谱仪( q t r a p ) 。q t r a p 系统基于一种线性离子阱( 2 - di o nt r a p ) 组 合技术，把串联四极杆质潜和离子阱质谱技术组合在。起，这种独特 的串联四极杆质谱和离子阱组合技术具有灵敏度高、样品消耗量少的 第一市前高监 j 质纰学方法学究最新进腱 特点，能够比现有的技术从复杂样品中更容易鉴定出低丰度的蛋白 质。s a n d r a 等利用这个系统进行了蛋白质糖基化位点的研究”。 3 3 定量蛋白质组学 随着蛋白质组学的深入研究和发展，对蛋白质进行高通量的鉴定 和准确的定量已成为研究蛋白质在细胞内功能和细胞代谢过程中变 化重要战略。目前进行定量蛋白质组学研究的主要技术有：蛋白质荧 光显色技术；荧光差异显色技术；稳定同位素标记技术：同位素亲和 标签技术；蛋白质芯片技术。 o d a 等”“在含有自然丰度的同位素氮( 1 l n ，9 9 6 ；”n ，0 4 ) 来定 量，培养基中生长酵母培养物，而另外一个培养物在同样富集1 5 n ( 9 6 ) 的培养基中生长。在合适的生长期过后，收集细胞，通过r p h p l c 以及随后的s d s p a g e 提取和分离兴趣蛋白质。胶内酶解，然后用肽 质量图谱鉴定。很明显，用”n 富集或耗竭的培养基的稳定同位素代 谢蛋白质标记与2 d e 或其它分离技术结合能定量细胞内的蛋白。然 而，此技术有。一些缺点。首先，此技术不允许直接从组织中分析蛋白 质。第二，稳定同位素富集的培养基昂贵，并可能它们本身影响到细 胞生长和蛋白质生成。第三，因为同位素掺入导致质量的微小增加直 到序列确定后才知道。因此，蛋白质鉴定必须在定量之前进行。 近来一个建立在同位索编码的亲和标签( i c a t ) 基础上的新的定 量方法提出了定量蛋白组学的新概念”“州。在此方法中，稳定同位素 在半胱氨酸被一个重( d 8 ) 或轻( d o ) 试剂选择性烷基化后掺入。两个蛋 白质混合物进行混合。在此时一个可选用的亲和分离技术来富集被标 记的肽段，减小混合物的复杂性，而同时严格保持相对量。在分析前， 蛋白质混合物用胰蛋白酶进行消化并通过一个单体亲和素一琼脂糖 柱。i c a t 标记对的共沈脱液的离子强度比率允许定量，而随后的 m s m s 扫描提供了蛋白质识别。i c a t 策略有几个优点。首先，此方法 兼容任何量的从体液、细胞或任何生k 条件下的组织i = f - l 收集的蛋白 质。第二，烷基化反应高度特异，而只在盐、去污剂和稳定剂( 如s d s 、 尿素、盐酸胍) 存在的情况下发生。第三，通过只分离含有半胱氨酸 笫一章前苦篮 j 质组学方法学研究域新进腱 的肽肽混合物的复杂性下降了。第四，i c a t 策略允许几乎任何类型 的生物化学、免疫或物理分级分离，使其兼容低丰度蛋白质的分析。 此方法存在两个缺点。第一，i c a t 标记( 5 0 0 d a ) 的大小是相当大的 修饰，并在整个m s 分析过程中保留在每个肽上。这使得数据库搜索 的算法复杂化，特别是小的肽段( 9 5 r e t e n t i o no ft h e o r i g i n a lb i n d i n g a c t i v i t yt ot h ei m m o b i l i z e dh w t x i ( 3 ) 提取的突触体用上述的b u f f e r 悬浮后用b r a d f o r d 法进行 蛋白定量。 l 一 m ；z 第_ 三节表由等高了共振技术扎出索活性究中的成用 ( 4 ) 以不同的浓度流过芯片让其与毒素相互作用。图3 1 3 是不 同浓度的突触体跟h w t x i 相互作用传感图。 2 3 结果分析 从结果可以看出，h w t x 一1 跟突触体结合非常弱，几乎没有什么结 合，这对进一步试验( 如：竞争试验，动力学的计算等) 带来了很大 的麻烦。这有几种原因：( 1 ) 可能是我们的突触体没有提好，在试验 时已经失活。( 2 ) 我们的b u f f e r 可能不能很好地溶解突触体。( 3 ) 我们的h w t x l 本来就跟突触体结合比较弱。 第四节进一步研究设想 虽然我1 7 在s p r 仪器上进行了些方法学探索，但其潜力还远没 有发挥出来，还有许多重要的功能值得进一步探索。 1 s p r 仪器虽然有许多优点，但其只是种检测的好工具，它是 建立在别的试验之上的。因此我们需要将其与其他的研究手段结合起 来以发挥其优点。如：跟分子生物学方法结合，通过基因克隆表达蛋 白的不同区段，然后通过s p r 检测其活性区域，这样可以进行结构与 功能的研究。 2 生物芯片质谱( b i a m s ) 方法在蛋白质组学研究具有广泛的应 用前景，但还有许多方面需要改进以达到我们的要求。其芯片般为 l 唧2 ，体积太小，结合的蛋白量非常有限，这对下一步的鉴定工作带 来了很大的麻烦。现在有一种最新的全自动b i a c o r e3 0 0 0 的s p r 仪， 它的芯片表面积扩大了1 0 倍，这对生物芯片质谱方法是一大突破。 另外一个重要的不足是其与质谱的兼容性问题，虽然有人尝试跟e s i