（物理化学专业论文）氧化还原蛋白质基于微纳结构材料的生物电化学研究.pdf

上海师范大学硕士学位论文摘要 中文摘要 氧化还原蛋白质的直接电化学在生物学和生物电化学领域引起了广泛关注。 蛋白膜伏安法是一种新的有效的方法研究氧化还原蛋白质的直接电化学，可以给 蛋白质的氧化还原反应提供重要的动力学和热力学数据，另外，研究固载蛋白质 和电极间的直接电子传递可以为制备新型的无媒介传感器提供理论基础。本论文 中分别采用天然的胞外多糖结冷胶( g g ) ，聚乙二醇接枝的多壁碳纳米管 ( p e g g - m w c n t s ) ，晶化的有序介孔c - t i 0 2 ( m c t ) 复合材料和新型的蠕虫状二 氧化钛等新型高聚物和纳米结构材料为载体固定蛋白质，并研究它们的生物电化 学性质。本论文的主要研究工作如下： 1 、一种新型的细胞外多糖结冷胶和室温离子液体的复合膜首次作为基底去包埋 蛋白质分子，并且研究了它的生物电化学性质。选择血红蛋白( h b ) 作为一种 模型蛋白去研究结冷胶和离子液体复合体系。采用紫外可见分光光度法、循 环伏安法和电化学交流阻抗技术表征了膜的性质。结果表明h b 在膜中能够 很好的保持天然结构和显示良好的电化学行为。在p h 7 0 的磷酸缓冲溶液 ( p b s ) 中，出现了一对清晰的准可逆的氧化还原峰，其势量电位( f ) 为0 3 6 8 v ( v s s c e ) ，与典型的血红素f e ( i i i ) f e ( i i ) 氧化还原对电位一致。h b i l g g 修 饰电极对过氧化氢( h 2 0 2 ) 表现出良好的电催化还原能力。 2 、采用共价接枝法制备了聚乙二醇( p e g ) 修饰的多壁碳纳米管( p e g g - m w c n t s ) ，合成的材料具有良好的水溶性和生物相容性。用傅立叶红外光谱， 透射电子显微镜，热重分析法表征p e g g m w c n t s ，证明p e g 嫁接到了 m w c n t s 表面上。并以p e g g m w c n t s 为生物载体来固载h b ，研究其生 物电化学行为。采用电化学交流阻抗技术证明了h b 有效吸附到p e g g m w c n t s 修饰电极表面。h b p e g g m w c n t 修饰电极在p h 7 0 的磷酸缓冲 溶液( p b s ) q b 的循环伏安结果显示了一对清晰的准可逆的氧化还原峰，其峰电 位为o 3 4v ( v s s c e ) ，与典型的血红素f e ( i i i ) f e ( i i ) 氧化还原对电位一致。 h b 固载到p e g g m w c n t s 显示出对亚硝酸盐良好的生物电催化还原活性。 3 、以酚醛树脂和“酸碱对” r i c h 和t i ( o c 4 h 7 ) 4 分别为碳源和钛源，通过三嵌段共 聚物直接模板法合成了有序介孔c t i 0 2 ( m c t ) 纳米材料，通过无定型的碳将 上海师范大学硕士学位论文 摘要 纳米晶锐钛矿很好的“粘连”堆砌在一起组成晶化墙壁，具有有序的介孔结构， 高的比表面积( 2 0 0m 2 g ) ，大的孔体积( o 1 5c m 3 g ) 。其9 - 氧化钛的含量高达 8 7w t 。将有序介孔c t i 0 2 用于蛋白质固定和生物电化学研究，循环伏安结 果表明，m c t 修饰电极在p h 7 0 的磷酸缓冲溶液( p b s ) 中的显示了一对清晰 的准可逆的氧化还原峰，其峰电位为0 3 3 6 v ( v s s c e ) ，与典型的血红素f e ( i i i ) f e ( i i ) 氧化还原对电位一致。m 固载到m c t 上对h 2 0 2 显示出良好的物 电催化活性。 4 、以新型的蠕虫状二氧化钛和室温离子液体复合膜为载体，首次用于辣根过氧 化物酶( h r p ) 的固载及其生物电化学性质研究。采用紫外光谱( u v ) 和电化 学交流阻抗( e i s ) 研究了h r p w t i 0 2 i l 膜的性质，结果表明w t i 0 2 和i l 膜提供了一个很好的微环境保持h r p 的生物活性。通过循环伏安法研究了 w t i 0 2 和i l 对h r p 的直接电子转移反应，h r p w t i 0 2 i l 修饰电极在p h 7 0 的磷酸缓冲溶液中显示出一对良好的、对称的氧化还原峰，峰电位为 0 3 4 9 v ( v s s c e ) 。实验结果还表明该修饰电极对过氧化氢具有良好的生物电 催化作用。 关键词：氧化还原蛋白质， 直接电化学，生物电催化，微纳结构材料 i l 上海师范大学硕士学位论文摘要 a b s t r a c t d i r e c te l e c t r o c h e m i s t r yo fr e d o xp r o t e i n sh a sa r o u s e dg r e a ti n t e r e s ti nb i o l o g i c a l a n db i o e l e c t r o c h e m i c a lf i e l d s p r o t e i nf i l mv o l t a m m e t r y ( p f v ) i san e w l ye f f e c t i v e m e t h o di ns t u d y i n gt h ed i r e c te l e c t r o c h e m i s t r yo fr e d o xp r o t e i n s ，w h i c hc a no f f e r e s s e n t i a lp h y s i c o c h e m i c a ld a t ac o n c e m i n gt h ek i n e t i c sa n de n e r g e t i c so fp r o t e i nr e d o x r e a c t i o n s m o r e o v e r , d i r e c te l e c t r o nt r a n s f e r b e t w e e ni m m o b i l i z e dp r o t e i na n d e l e c t r o d ec a l le s t a b l i s haf o u n d a t i o nf o rf a b r i c a t i n gn e wk i n d so fm e d i a t o r - f r e e b i o s e n s o r s i nt h i sw o r k ，m i c r o b i a le x o c e l l u i a rp o l y s a c c h a r i d e - g e l l a ng u m ( g g ) ，p o l y ( e t h y l e n eg l y c 0 1 ) ( p e g ) g r a f t e dm u l t i - w a l l e dc a r b o nn a n o t u b e s ( p e g - g - m w c n t s ) ， o r d e r e dm e s o p o r o u sc r y s t a l l i n ec - t i 0 2 ( m c t ) c o m p o s i t e s ，a n dt h en o v e lw o r m l i k e t i t a n i u mo x i d e ( w t i 0 2 ) w e r eu s e dt oi m m o b i l i z et h ep r o t e i na n dt h eo b t a i n e dr e s u l t s a r ea sf o l l o w s ： 1 an e wc o m p o s i t ef i l mo fm i c r o b i a le x o c e l l u l a rp o l y s a c c h a r i d e g e l l a ng u m ( g o ) a n dr o o m t e m p e r a t u r e i o n i c l i q u i d ( i l )1 - b u t y l 一3 一m e t h y l - i m i d a z o l i u m h e x a f l u o r o p h o s p h a t e ( b m i m p f 6 ) w a sf i r s t l yu s e da sa l li m m o b i l i z a t i o nm a t r i xt o e n t r a pp r o t e i n sa n di t sb i o e l e c t r o c h e m i c a lp r o p e r t i e sw e r es t u d i e d h e m o g l o b i n ( h b ) w a sc h o s e na sam o d e lp r o t e i nt oi n v e s t i g a t et h ec o m p o s i t es y s t e m u v - v i s s p e c t r o s c o p y ，c y c l i cv o l t a m m e t r y ( c v ) a n d e l e c t r o c h e m i c a l i m p e d a n c e s p e c t r o s c o p y ( e i s ) w e r eu s e dt oc h a r a c t e r i z et h ec o m p o s i t ef i l m t h eo b t a i n e d r e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a tt h eh bm o l e c u l ei nt h ef i l mk e p ti t sn a t i v es t r u c t u r ea n d s h o w e di t s g o o d e l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o r a p a i r o fw e l l - d e f i n e d ， q u a s i - r e v e r s i b l ec y c l i cv o l t a m m e t r i cp e a k sa p p e a r e di np h 7 0p h o s p h a t eb u f f e r s o l u t i o n s ( p b s ，o 1m ) ，晰t l lt h ef o r m a lp o t e n t i a l ( e o ) o f - 0 3 6 8 v ( v s s c e ) ， w h i c hw a st h ec h a r a c t e r i s t i co fl i bf e ( i i i ) f e ( i i ) r e d o xc o u p l e s t h eh b - i l - g g m o d i f i e de l e c t r o d ea l s os h o w e da ne x c e l l e n te l e c t r o c a t a l y t i cb e h a v i o rt ot h e r e d u c t i o no fh y d r o g e np e r o x i d e ( h 2 0 2 ) 2 t h en o v e lp o l y ( e t h y l e n eg l y c 0 1 ) ( p e g ) g r a f t e dm u l t i w a l l e dc a r b o nn a n o t u b e s ( p e g - g - m w c n t s ) w e r es y n t h e s i z e db y t h ec o v a l e n tf u n c t i o n a l i z a t i o no f i l l 上海师范大学硕士学位论文摘要 m w c n t s谢mh y d r o x y l - t e r m i n a t e dp e gc h a i n s ，e x h i b i t e de x c e l l e n t h y d r o p h i l i c i t ya n db i o c o m p a t i b i l i t y 1 1 1 ep e g g - m w c n t sw e r ec h a r a c t e r i z e db y f o u r i e rt r a n s f o r mi n f r a r e d s p e c t r a , t r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p y ，a n d t h e r m o g r a v i m e t r i ca n a l y s i s ，w h i c hv e r i f i e dt h a tp e gc h a i n sw e r eg r a f t e do n t ot h e s u r f a c eo ft h em w c n t s 1 1 1 ep e g - g m w c n t sw e r et h e nu s e d 嬲s u b s t r a t e sf o r t h ei m m o b i l i z a t i o no fh e m o g l o b i n ( i - i b ) a n dt h e i rb i o e l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o r s w e r es t u d i e d e l e c t r o c h e m i c a li m p e d a n c es p e c t r o s c o p yw a su s e dt oc o n f i r mt h e a d s o r p t i o no fl i bo n t ot h es u r f a c eo fp e g - g m w c n t s 1 1 1 ec y c l i cv o l t a m m e t r y r e s u l t so fh b p e g - g m w c n t - m o d i f i e de l e c t r o d es h o w e da p a i ro fw e l l - d e f i n e d a n dq u a s ir e v e r s i b l er e d o xp e a k sc e n t e r e da ta p p r o x i m a t e - o 3 4v ( v s s a t u r a t e d c a l o m e le l e c t r o d e ) ，w h i c hw a st h ec h a r a c t e r i s t i cp e a k so fl i bf e ( i i i ) f e ( i i ) ，i np h 7 0 p h o s p h a t e b u f f e rs o l u t i o n h bi m m o b i l i z e do n t ot h es u r f a c eo f p e g - g - m w c n t s d e m o n s t r a t e d g o o db i o e l e c t r o c a t a l y t i c a c t i v i t i e sf o r t h e r e d u c t i o no fn i t r i t e 3 ad i r e c t - t r i b l o c k - c o p o l y m e rt e m p l a t i n gm e t h o di sd e m o n s t r a t e dt os y n t h e s i z e o r d e r e dm e s o p o r o u sc r y s t a l l i n ec t i 0 2 ( m e t ) c o m p o s i t e su s i n gp h e n o l i cr e s i n s a n da c i d - b a s ep a i r s a c i d i ct i c l 4a n db a s i cc o u n t e r p a r tt i ( o c 4 h 7 ) 4 】a sc a r b o n a n dt i t a n i u ms o u r c e s ，r e s p e c t i v e l y t h ec o m p o s i t e sp o s s e s sh i g h l yc r y s t a l l i n e a n a t a s ep o r ew a l l st h a ta r e “g l u e d b ya m o r p h o u sc a r b o n ，o r d e r e dm e s o s t r u c t u r e ， h i g hs u r f a c ea r e a s ( 2 0 0m 堍) ，a n dl a r g ep o r ev o l u m e s ( o 15c m 魂) 1 kt i t a n i a c o n t e n ti sa sh i g l l 硒8 7 州t h em e t c o m p o s i t e sw e r et h e nu s e da ss u b s t r a t e s f o rt h ei m m o b i l i z a t i o no fh e m o g l o b i n ( h b ) a n dt h e i rb i o e l e c t r o c h e m i c a l b e h a v i o r sw e r es t u d i e d n ec y c l i cv o l t a m m e t r yr e s u l t so fm c tm o d i f i e dg c e l e c t r o d es h o w e dap a i ro fw e l l d e f i n e da n dq u a s ir e v e r s i b l er e d o xp e a k sc e n t e r e d a ta p p r o x i m a t e 一0 3 3 6v ( v s s e e ) ，w h i c hw a st h ec h a r a c t e r i s t i cp e a k so fh b f e ( i i i ) f e ( i i ) ，i np h7 0p h o s p h a t eb u f f e rs o l u t i o n h bi m m o b i l i z e do n t ot h e s u r f a c eo fm c td e m o n s t r a t e dg o o db i o e l e c t r o c a t a l y t i ca c t i v i t i e sf o rt h er e d u c t i o n o f h 2 0 2 4 an o v e lc o m p o s i t ef i l mo fw o r m - l i k et i t a n i u mo x i d e ( w t i 0 2 ) c o m b i n e d 、杭t l l i o n i cl i q u i dw a sf i r s t l yu s e df o rh o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ( h r p ) ) i m m o b i l i z a t i o n n ， 上海师范大学硕士学位论文 摘要 a n di t sb i o e l e c t r o c h e m i c a l p r o p e r t i e sw e r es t u d i e d 。u v v i sa b s o r p t i o n a n d e l e c t r o c h e m i c a li m p e d a n c es p e c t r o s c o p y ( e i s ) w e r eu s e dt oc h a r a c t e r i z et h e c o m p o s i t ef i l m t h er e s u l t ss h o w e dt h ew t i 0 2a n di lc o m p o s i t ef i l mp r o v i d e da f r i e n d l ym i c r o e n v i r o n m e n tt or e t a i nt h eb i o a c t i v i t yo ft h ei m m o b i l i z e dh r p t h e r e s u l t i n ge l e c t r o d e ( h r p w t i 0 2 i l ) g a v eap a i ro fw e l l d e f i n e d ，q u a s ir e v e r s i b l e r e d o xp e a k sc e n t e r e da ta p p r o x i m a t e 0 3 4 9 v ( v s s c e ) i np h7 0p h o s p h a t e b u f f e rs o l u t i o n i tr e f l e c t st h ec h a r a c t e r i s t i co fh r ph e i n ef e ( i i i ) f e ( i i ) r e d o x c o u p l ew i t hf a s th e t e r o g e n e o u se l e c t r o nt r a n s f e rr a t e t h ei m m o b i l i z e dh r p a l s o d i s p l a y e de x c e l l e n te l e c t r o c a t a l y t i c a lr e s p o n s e s t ot h er e d u c t i o no fh y d r o g e n p e r o x i d e k e y w o r d s ： r e d o xp r o t e i n ，d i r e ae l e c t r o c h e m i s t r y ， b i o e l e c t r o c a t a l y s i s ， m i c r o n a n o s t r u c t u r em a t e r i a l s v 论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除 了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或机构已经发表或撰写过的研究 成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均己在论文中做了明确的声明并表 示了谢意。 作者签名：两联蛹日期：殳 论文使用授权声明 本人完全了解上海师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅：学校可以公布论文的全部或部 分内容，可以采用影印、缩印或其它手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此 规定。 作者签名：棚导师签名： 日期：卅o ) y 上海师范大学硕士学位论文 前言 1 1 生物电化学概述 第一章前言 生物电化学是研究生物体系电荷能量传输运动规律及其对生物体活性功能 的影响。m i l a z z o 1 认为，所谓生物电化学是研究那些涉及生物系统的荷电粒子 的过程所引起的电化学现象的科学分支，即运用电化学的技术、原理和理论来研 究生物学事件。因而，生物电化学具有学科间的交叉性和相互作用。生物电化学 的发展所体现的学科交叉性表现为既有科学概念、原理的渗透，又有技术、方法 的移植。建立在物理学、化学和电子学基础上的电化学为认识生命体系细胞水平 上的运动规律提供了强有力的工具。 电化学理论对生物学研究的作用是显而易见的。组成生命体的许多生物物质 是荷电的微粒或分子，电子传递在生命过程中所起的作用是极其重要的。从生物 体内新胨代谢的氧化还原反应到生物膜的跨膜电位差对细胞内外物质运输的谓 节作用，都与电子传递密切相关。从某种意义上讲，研究生命过程实质上就是研 究生物体中的电子传递过程【1 3 】。 蛋白质和酶是都是生物体中重要的生物大分 子，参与完成生命体中新陈代谢等许多生理过程。同时，蛋白质和酶都是带电荷 的两性分子，在生命过程中需要经历电子转移的过程，在其氧化态和还原态之间 转化。生命体中许多涉及氧化还原蛋白质的化学反应都在带电荷的生物膜或其附 近发生，因而电子的传递必然受到电场的作用和影响。这种电场的作用和影响与 电化学研究中的工作电极表面或附近的情况十分相似 4 】。因此，采用电化学方 法研究氧化还原蛋白质和酶等生物大分子的直接电子转移过程是生物电化学领 域中备受关注的研究问题【5 1 4 。对于氧化还原蛋白质和酶在电极表面的电子传 递过程的研究有助于理解生物体电子传递过程的机制，同时也可以揭示生物大分 子与电极表面达到快速、可逆的电子传递所需的适宜条件，对于开发新型的生物 电化学传感器等电子器件均具有重要的的理论和指导意义 1 5 ，1 6 。 上海师范大学硕士学位论文 前言 1 2 电化学生物传感器研究 生物传感器是利用生物特异性识别过程来实现检测的传感器件，是一类特殊 的化学传感器。生物敏感元件包括生物体、组织、细胞、细胞器、细胞膜、酶、 抗体、核酸等，而生物传感器是利用这些从微观到宏观多个层次相关物质的特异 性识别能力的器件总称。 第一个商业化的生物传感器于1 9 7 2 年由y e l l o ws p r i n g s 仪器公司制造，之 后又由l e e d s ，n o r t h r u p 和b e c k m a n 仪器公司相继推出，这些传感器均用于血糖 和尿糖检测的电化学传感器。8 0 年代新型的生物传感器在实验室取得了科研进 展，商家对生物传感器种类进一步扩展，相继出现了离子选择电极血气和血电介 质传感器、有毒气体和易燃气体传感器i s f e t - p h 计，其中电化学传感器占多数； 9 0 年代以来，微机电系统( m e m s ) 加工技术使该类传感器及其生化分析仪器进 一步向小型化、数字化和高可靠性发展。电化学传感器在生化传感器研发及其商 业化领域中处于重要地位，该传感器种类繁多，可广泛应用于医疗保健、食品工 业、农业、环境等领域【1 7 】。 1 2 1 电化学生物传感器原理 电化学生物传感器主要由识别待测物的敏感膜和将生物量转化为电信号的 电化学转换器两部分组成。被分析物质扩散进入固定化生物敏感层，经分子识别， 发生生物学反应，产生一次信息继而被相应的物理换能器、化学换能器转变成可 定量和可处理的电信号，再经二次放大输出，从而测得待测物的浓度。根据产生 的电信号类别，可将其分为电流型和电位型两大类。电流型传感器主要基于探 测生物识别或化学反应中的电活性物质，通过固定工作电极的电位给电活性的电 子转移反应提供驱动力，探测电流随时间的变化，该电流直接测量了电子转移反 应的速度，反映了生物分子识别的速度，即该电流正比于待测物质的浓度。电 位型传感器将生物识别反应转换为电信号，该信号与生物识别反应过程中产生 或消耗的活性物质浓度对数成正比，从而与待测物质浓度的对数成正比。 2 上海师范大学硕士学位论文 前言 1 2 2 电化学生物传感器研究 电化学生物传感器是生物传感器中研究最早，种类最多，也较为成熟的一个 分支，由各种生物分子( 酶、抗体、受体或全细胞) 与电化学转换器( 电流型或电位 型的电极) 组合可构成多种类型的电化学生物传感器，其中生物分子识别的专一 性决定了该传感器具有高度选择性。由于它与其它电化学传感器相比具有专一、 高效、简便、快速的特点，很快就开辟了种类繁多的研究与应用领域。 酶电极是最早研发的生物传感器，将酶固定在电极表面，探测电流型或电位 型催化反应信号。尽管氧化还原蛋白质在生命体内能进行可逆的氧化还原反应， 但是在裸露的电极如铂电极、金电极、玻碳电极上很难实现直接电子传递，其电 化学反应通常是不可逆的或者无活性的 1 8 2 0 】。这主要是由于( 1 ) 大多数酶和蛋 白质具有庞大的三位空间立体结构，其电活性基团被深埋在其多肽链的内部，与 电极表面距离较远。酶在电极表面的取向不利于其电活性基团与电极之间的电 子交换，阻碍了电子传递【2 1 】；( 2 ) 绝大多数氧化还原蛋白质都能强烈地吸附在固体 电极表面，并伴随着蛋白质的变性，蛋白质的吸附变性导致电极反应经常是不可 逆的，并且阻碍它们与电极之间的电子传递 1 9 1 。为了研究氧化还原蛋白质，常 通过在溶液中加入或者电极表面修饰一层媒介物( m e d i a t o r ) 2 2 2 7 来加速氧化还 原蛋白质与电极之间的电子转移。媒介体本身是有活性的，故可以通过它们在电 极上的氧化还原反应来催化蛋白质的氧化还原，从而间接研究蛋白质的电子传递 过程。或者加入促进剂( p r o m o t e r ) 来加快蛋白质与电极表面的直接电子传递，促 进剂本身在所研究的电化学范围内是没有电化学活性的，它是通过改善蛋白质在 电极表面的取向及其与界面的相容性，阻止杂质吸附，相当于“导线”的作用，从 而达到加速蛋白质与电极之间的直接电子传递的目的【2 8 】。因此，蛋白质在媒介 体作用下的电化学研究被称为间接电化学，而在促进剂作用下的电化学研究则被 称为蛋白质的直接电化学 2 9 】。根据酶或者蛋白质与电极之间的电子传递机理可 以将酶电极生物传感器分为三代( 如图1 ) ：( 1 ) 以氧为受体的第一代生物传感器： ( 2 ) 基于媒介体( 如二茂铁、铁氰化钾等) 的第二代生物传感器；( 3 ) 在无介体存在下， 生物活性酶或者蛋白质与电极间的直接电子传递形成的第三代生物传感器。 e 海帅n 学碗学位论文 1 3 蛋白质直接电化学研究综述 研究氧化还原蛋白质的直接电化学不仅可| 三【提供能量转换和代谢过程的生命 信息，而且为第三代生物传感器的制各奠定了理论基础。目前，蛋白质直接电 化学主要研究一些简单的，结构和功能比较清楚的氧化还原蛋白质，如细胞色素 c 、血红蛋白、肌红蛋白、辣根过氧化物酶等。随着研究的深入，现在已经发现 了许多新型的屯极材料和构筑了许多适宜的蛋白质电极界面来实现氧化还原蛋 白质的直接电化学。 最0 笛撬。，磊龆甍篇盆背 图1 酶电极的电子传递示意图 1 3 1 模型蛋白质血红蛋白的结构与功能 血红蛋白、肌红蛋白、细胞色素c 等血红素蚩白都是生物学和化学研究中重 要的模型蛋白，对于这些蛋白的结构和功能研究比较深入。我们主要以血红蛋白 为研究的模型蛋白。 血红蛋i 刍( h b ，m 。6 4 5 0 0 ) 近似球形，分子尺寸为64 n m x 55 n m x 50 n m 。h b 的 主要功能是在血液中结合并转运氧，它存在于血液的红细胞中。血红蛋白以高浓 度( 约为质量的3 4 ) 溶解于红细胞溶胶中。在从肺部经心脏到达外周组织的动脉 血中h b 约为9 6 0 o 氧饱和浓度。在回到心脏的静脉血中h b 仅为6 4 的氧饱和浓 度。脊椎动物的血红蛋白由4 个多肽亚基组成，即a 2 1 3 2 ，每个弧基都有一个血红 素基和氧结合部位f 3 0 ，其结构见图2 。血红蛋白的品体衍射图也已经被解析出 来。由于血红蛋白的分子结构研究的比较清楚，因而血红蛋白是研究血红索蛋白 和电极之间的电子传递反应咀及生物传感和电催化的理想模型。 上海师范大学硕士学位论文前言 锣i n 喜9 矿。 i 图2 氧结合血红蛋白，f e ( i i ) 一血红素与h i s 和氧配位结构。 引自r e f 3 1 】 1 3 2 蛋白质直接电化学实现的途径蛋白膜技术 由于蛋白质在电极表面易于吸附，可能造成构象变化和活性丧失，这样就抑 制了蛋白质在电极上的电子传递能力。人们在实现和加快蛋白质的直接电子传递 方面开展了很多工作，例如寻找不同的电极反应促进剂、使用不同的修饰电极以 及特殊的电极材料等，这些工作使人们对蛋白质在不同界面上的电子传递机制 有了更深刻的认识和理解。其中，使用蛋白质膜技术形成适宜的蛋白质电极界 面是一种最主要的方法 3 2 1 。 蛋白膜伏安法主要使用伏安法研究吸附在电极表面的一层蛋白质分子形成的 膜。这种方法对于研究和揭示蛋白质( 酶) 电子传递的机制是非常有效的【3 3 】。蛋 白膜伏安法的主要优点是【3 4 】：避免了蛋白质扩散带来的影响；蛋白质用量少，而 且由于酶的特异性对于溶液中的微量试剂也能有很高的灵敏度；可以在一个比较 宽的范围内对蛋白质的电活性中心快速精确地施加电压控制；电流与催化速率之 间有直接的定量关系；整个实验过程是“交互式”的，即反应可以同时被驱动和检 测。在理想条件下，我们可以很方便地观察发生在蛋白质( 酶) 氧化还原中心的电 子传递过程( 在无底物状态下) ：在引入底物后，我们又可以从催化峰中得出酶催 化的动力学过程。 上海师范大学硕士学位论文 前言 蛋白膜伏安法技术引起了许多研究者的兴趣，比如蛋白质生物模拟膜界面、 蛋白质纳米粒子界面、蛋白质聚合物膜界面等 3 5 3 9 。这些界面不仅能为蛋白 质提供一个类似于其生物膜的微环境，保持其自然结构和生物活性，而且能阻止 杂质以及蛋白变性吸附引起的电极钝化，加速蛋白质与电极之间直接、可逆的电 子交换反应 4 0 1 。这里按界面材料的不同对蛋白质( 酶) 在这些电极界面上的直接 电化学进行简要综述。 1 、模拟生物界面 在生命体内，类脂和蛋白质共同组成了生物膜。由类脂构成的双分子层是生 物细胞膜的基本构成单元，而蛋白质分子吸附在双层生物膜表面或嵌入其内部。 类脂属于一种表面活性剂，它具有典型的两亲结构，既有疏水的碳氢长链，又有 亲水的极性基团。将某些表面活性剂或磷脂通过吸附、滴涂、共价键合、自组装 或l b 膜转移等方法引入到电极表面，可在表面形成有序排列的双分子层结构， 类似于生物膜，因而称为模拟生物膜。 用于构建稳定的蛋白质模拟生物膜电极界面的多是一些难溶于水的双链或 多链表面活性剂，如溴化双十二烷基二甲基铵( d d a b ) 、双十四酰基磷酯酰胆碱 ( d m p c ) 和双十六烷基磷酸( d h p ) 等【4 l - 4 5 】。通常有两种方法形成这种蛋白质 模拟生物膜电极界面：( 1 ) 在电极表面滴涂含表面活性剂的氯仿溶液，待氯仿挥 发后，形成的表面活性剂膜修饰电极可从蛋白质溶液中直接吸附蛋白质；( 2 ) 将 蛋白质溶液与表面活性分散液均匀混合，取该溶液滴涂于电极表面，空气干燥后 即可得到蛋白质模拟生物膜电极界面【4 6 】。r u s l i n g 等 4 7 】将d d a b 水分散液与 h b 溶液混合滴涂于石墨电极表面得到了h b d d a b 电极界面，并且h b 在界面上 表现出一对峰形可逆的氧化还原峰。i q u 4 8 1 等探讨了h b 在d m p c 石墨界面上的 直接电化学行为。其他表面活性剂形成的模拟生物膜h b 界面也实现了h b 的直 接电化学 4 9 。5 1 。 2 、高分子聚合物以及溶胶凝胶界面 聚合物形成的水溶胶由于具有较好的生物亲和性，常用作蛋白质的固定材料 和界面设计材料。用于蛋白质界面设计的聚合物材料包括合成高分子聚合物和天 然高分子聚合物 5 2 - s 7 ，如聚二烯丙基二甲基氯化铵( p d d a ) 、聚乙烯磺酸盐( p v s ) 等合成高分子聚合物，以及壳聚糖、琼脂糖、纤维素等天然高分子聚合物。 6 上海师范大学硕士学位论文 前言 h e 等【5 2 】用p d d a 和h b 层层组装，实现了h b 的直接电化学。h u 5 3 等采 用层层组装的技术将h b 固定于p v s 膜内得到了 p v s h b 。界面，随着层数的增 加，电极界面上的电活性h b 的量随之增加，最多可得至u p v s h b 8 界面，电活性 h b 所占的比例可达4 6 ，远高于其他固定方法。 天然高分子聚合物，由于具有广泛的来源和良好的生物相容性以及能够很好 地保持蛋白质的生物活性，其作为蛋白质的界面设计材料从而实现蛋白质直接电 化学的研究已引起了人们的广泛关注。壳聚糖( c s ) 是一种常见的天然高分子聚合 物，因其对生物分子的良好亲和性，常被用作药物或者蛋白质的载体。l u 等 5 4 】 用壳聚糖作为h b 的载体，实现了h b 的直接电化学，并且对氧气和三氯乙酸都有 很好的生物催化活性。琼脂是一种碳水化合物，属于天然植物多糖类，含有丰富 的水溶性食物纤维，广泛使用于食用、医药、化工、纺织、国防等领域，具有很 好的生物相容性，也经常用做蛋白质载体。w a n g 5 5 ，5 6 等采用琼脂糖凝胶和离 子液体复合膜包埋h b ，实现了h b 的直接电化学。l i u 等【5 7 】用羟基纤维素包埋涂 布h b 、m b 和h r p 于石墨电极表面，得到了这三种血红素蛋白质在电极上的准可 逆氧化还原反应。同时，这三种蛋白质在羟基纤维素膜中都保持了良好的生物活 性，可用来催化还原h 2 0 2 。 溶胶凝胶的多孔网状结构使其能作为生物大分子合适的固定载体。与其他 固定材料相比，溶胶凝胶包埋固定的优势表现在它可适用于任何类型的生物分 子，可以较好地保持蛋白质表面微观结构的整体性、方向性和自然性，从而对活 性组分的活性和稳定性损失较少 4 0 】。y u 5 8 等采用气相沉积的方法在玻碳表面 得到 t i 0 2 的凝胶膜，并用其固定h b 得到m 厂r i 0 2 凝胶界面，h b 在此膜内可以有效 保持自身结构和生物活性，实现了直接电子传递，并对h 2 0 2 表现出良好的催化性 能。x u 等【5 9 】实现了h b 在h b - a g 溶胶膜中的直接电化学，并且对h 2 0 2 也有很好的 催化活性。 3 、纳米材料界面 利用纳米材料具有比表面积大，催化活性高，亲和力强，较好生物相溶性等 特点，能够很好地保持蛋白质与酶等生物分子的生物活性、促进氧化还原蛋白质 的直接电子传递并且对蛋白质或酶与底物间的电子传递具有重要作用，近年来在 生物电化学领域中的研究倍受关注。常用作固定和促进蛋白质直接电子传递的纳 7 上海师范大学硕士学位论文前言 米粒子有金溶胶纳米粒子、碳纳米管、无机纳米粒子等。c h e n 等 6 0 1 采用自组装 膜的方式吸附纳米金粒子，再吸附固定h b ，实现了h b 的直接电子传递。h b 在电 极界面上的覆盖量与纳米金的大小有关，粒径越小，吸附的蛋白质分子越多。j u 等 6 1 1 利用金溶胶修饰碳糊电极，包埋m 成功得至u t h b 的直接电子传递l a i 等 6 2 】 制备了基于h b 固定在磁性壳聚糖微球的过氧化氢传感器，同时实现了h b 的直接 电子传递。碳纳米管( c n t s ) 自从1 9 9 1 年被发现以来，由于其独特的结构、机械 性能、电性质等，也广泛应用于生物学和电化学领域 6 3 6 6 】。 4 、介孔材料界面 介孔材料是指孔径分布在2 5 0 n m ，具有较大的孔容、高的比表面积、有序 且可调的孔道结构的材料。介孔材料因具有均一可调的孔径、高的比表面积和规 整的孔道结构以及易于表面功能化等优点，广泛用于生物大分子分离、酶固定化 等方面。介孔材料给蛋白质或者酶的负载和底物的扩散提供了一个友好的微环 境，从而使酶具有高的灵敏度和长期的稳定性【6 7 】。 介孔材料中蛋白质或者酶固定化方法主要有：共价键结合法、包埋法和吸附 法。1 9 9 6 年，b a l k u s 等 6 8 1 首先报道了有序介孔材料对酶的固定化研究。他们通 过物理吸附法成功地将球蛋白酶、细胞色素c 、木瓜蛋白酶和胰岛素固定于平均 孔径为4 n m 的m c m 4 1 分子筛孔道中，而分子直径较大( 4 8 n m ) 的辣根过氧化物酶 未能有效地被固定于介孔当中。实验表明，酶的固定化过程受很多因素的影响。 介孔材料的孔径、孔道结构、表面特性及形态结构等都对酶的固定化都影响很大。 酶的固定化首先要求介孔材料的孔径要与酶分子大小相适应。当介孔材料的孔径 太小，酶分子不能完全进人孔道内，且附着在孔道外表面的酶又很容易泄漏，造 成催化效率降低。但是介孔材料的孔径太大，会造成酶分子在孔道内堆积，形成 多层排列，使得其活性部位不能完全暴露出来；虽然酶的固定量较大，但是酶分 子的活性部位被包埋，催化效率同样也不会很高【6 9 】。负载量受到介孔材料的结 构特征和比表面积的影响，如细胞色素c 在高比表面积三维通道的m c m 4 8 上比 在一维孔道和二维孔道载体上呈现出较高的负载量 7 0 l 。使用各种不同的表面活 性剂合成的介孔材料，其表面所带的电荷及其他性质也不相同，可以利用他们的 特性来固定蛋白质和酶。如介孔材料的内表面富含大量的硅羟基，可以通过引入