（药物化学专业论文）氨基荧光素及其衍生物的合成与表征.pdf

中文摘要 氨基荧光素是荧光素类染料中重要的荧光探针之一，其活性氨基基团能与生 物分子中羧基相结合，结合后荧光强度大大增强，因而广泛的应用于蛋白质分析 和免疫学研究。 本文以4 硝基邻苯二甲酸，间苯二酚为原料在z n c h 催化下通过缩合、还原， 在6 盐酸中重结晶分离制备了5 氨基荧光素和6 氨基荧光素。该方法与传统 5 氨基荧光素制备方法相比较，反应步骤缩短，5 氨基荧光素的总收率由1 8 提 高至4 0 。 5 氨基荧光素虽能与羧基反应，但是由于其氨基与芳基相连，大大降低其衍 生化的能力，且其为水溶性荧光染料，亲脂性差，限制了其在生物分析中的应用。 为改善其荧光性能，提高氨基的反应能力，我们又设计合成一系列5 氨基荧光素 的衍生物。分别以5 氨基荧光素和2 ，7 二氯氨基荧光素为原料进行异硫氰酸化 制备了5 异硫氰酸酯荧光素和2 ，7 二氯异硫氰酸酯荧光素；通过酰化制各了 5 。( 2 氯乙酰胺基) 荧光素以及5 丁二酰亚胺基荧光素；与三聚氯氰反应制备了 5 2 ( 4 ，6 二氯三嗪基) 氨基】荧光素：所得衍生物的化学结构由i r ，m s ，n m r 确 证，并测定了衍生物的荧光性能，发现所合成的氨基荧光素衍生物与5 氨基荧光 素相比其荧光强度、最大激发波长和最大吸收波长均有明显变化，显示了较优越 的荧光性能。 多芳环氧镥盐本身也是无机离子显色和荧光分析的具有较高灵敏度的荧光 探针。本文制各了一系列带有不同取代基团的毗喃鳐盐，使之与5 氨基荧光素反 应，得到了双发色团荧光染料1 ( 5 荧光素) 吡啶绘盐，其中1 ( 5 一荧光素) 2 ，4 ，6 三甲基吡啶黠盐显示了良好的荧光性能。 关键词：氨基荧光素，氨基荧光素衍生物，荧光探针，荧光性能 a b s t r a c t a m i n o f l u o r e s c o i ni so n eo ft h em o s ti m p o r t a n tf l u o r e s c e n tp r o b e s t h e f l u o r e s c e n ti n t e n s i t yo fa m i n o f l u o r e s c e i nd e r i v a t i v e si se n h a n c e da f t e rt h ea m i n e g r o u pi sb o n d e dt oc a r b o x y lg r o u po f t h eb i o m o l e c u l e s s oa m i n o f l u o r e s c e i nh a sb e e n w i d e l ya p p l i e di nt h ep r o t e i na n a l y s i sa n di m m u n o l o g y i nt h i s p a p e r , a m i n o f l u o r e s c e i n w a so b t a i n e df r o m 4 - n i t r o p h t h a l i ca c i d ， r e s o r e i n o li nt h ep r e s e n c eo fz i n cc h l o r i d et h r o u g hc o n d e n s a t i o na n dr e d u c t i o n , a n d 5 - a m i n o f l u o r e s c e i na n d6 - a m i n o f l u o r e s c e i nw e r e s u c c e s s f u l l y i s o l a t e d b y r e e r y s t a l l i z a t i o no ft h eo b t a i n e dm i x t u r eo f5 - a n d6 - a m i n o f l u o r e s c e i ni n 概 h y d r o c h l o r i ca c i d c o m p a r e d 、v i mt h et r a d i t i o n a lm e t h o d t h i ss y n t h e t i cr o u t ei sm o r e c o n v e n i e n ta n dt h et o t a ly i e l do f5 一a m i n o f l u o r e s c e i nw a si n c r e a s e df r o m18 t o4 0 t h ea b i l i t yo fa m i n o f l u o r e s c e i nl i n k i n gw i mc a r b o x y lg r o u pw a sr e d u c e dd u et o t h e c o n j u g a t i o no fa m i n eg r o u pw i t h a r o m a t i c r i n g a m i n o f l u o r e s c e i n w a s w a t e r - s o l u b l ef l u o r e s c e n tp r o b e ，w h i c hr e s t r i c t e di t sa p p l i c a t i o ni nb i o l o g i c a la n a l y s i s i ns e a r c ho f n e wb e t t e rf l u o r e s c e n tp r o b e s ，as e r i e so fd e r i v a t i v e so fa m i n o f l u o r e s c e n t w e r ed e s i g n e da n ds y n t h e s i z e ds u c ha sf l u o r e s c e i ni s o t h i o c y a n a t e ，2 ，7 - d i c h l o r o f l u o r e s c e i n - 5 ( 6 ) - i s o t h i o c y a n a t e ，5 - ( 4 ，6 - d i c h l o m t r i a z i n 一2 一y 1 ) a m i n o f l u o r e s c e i n ，f l u o r e - s c e i n - 5 c h l o m a c e t a m i d e ，5 - s u c c i n i m i d y l f l u o r e s e e i n t h es t r u c t u r e so ft h ed e r i v a t i v e s w e r ec o n f i r m e db yi r ，m sa n dn m r , a n dt h e i rf l u o r e s c e n tp r o p e r t i e sw e r e d e t e r m i n e d t h ef l u o r e s c e n t i n t e n s i t y , m a x i m u m e x c i t a t i o nw a v e n u m b e ra n d m a x i m u me m i s s i o nw a v e n u m b e ro ft h ed e r i v a t i v e sw e r ec h a n g e dc o m p a r e dw i t h a m i n o f l u o r e s c e i n ，w h i c hi n d i c a t e db e r e rf l u o r e s c e n tp r o p e r t i e s b e s i d e s ，t h ec o m p o u n d so f2 , 4 ，6 一t r i a r y l p y r y l i u ms a l t sw e r es e n s i t i v ef l u o r e s c e n t p r o b e si nt h ed y e i n go fi n o r g a n i ci o n sa n d f l u o r e s c e n fa n a l y s i s p y r y l i u mp e r c h o r a t e s w e r ep r e p a r e d t h ed y e s 、“md o u b l ef l u o r o p h o r e1 - ( f l u o r e s c e i n - 5 一y 1 ) p y r i d i n i u m s a l t sw e r ey i e l d e db yt h et r e a t m e n to fp y r y l i u ms a l t sw i t h5 - a m i n o f l u o r e s c e i n i - ( f l u o r e s c e i n - 5 一y 1 ) 一2 ，4 ，6 一t r i m e t h y l p y r i d i n i u mp e r e h l o r a t es h o w e dg o o df l u o r e s c e n t p r o p e r c i e s k e yw o r d s ：a m i n o f l u o r e s c e i n , a m i n o f l u o r e s c e i nd e r i v a t i v e s ，f l u o r e s c e n tp r o b e ， f l u o r e s c e n tp r o p e r t y 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得：叁鲞盘茔或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：诒毒苏签字日期：矿年，工月如日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解苤鲞盘鲎有关保留、使用学位论文的规定。 特授权鑫望盘茎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名：褊高、苁导师签名： 签字日期：矿年p 月p 日 修劫 签字日期! 少夕5 年。月歹日 天津大学硕士学位论文第一章文献综述 第一章文献综述 某些物质的分子吸收可见一紫外光后，它的能级跃迁到激发态，激发态分子 在返回基态时以辐射的方式全部或部分地释放出所吸收的能量，其发射光的波长 与所吸收的光的波长相同或者更长，这种现象称为光致发光，荧光是最常见的光 致发光之一。其实自然界有许多荧光物质存在。早在1 6 世纪，人们就在矿物和 植物提取液中观察到荧光现象。随着科学研究和生产实践的进一步深入，荧光的 本质逐步为人们所认识，有关荧光的理论和应用也得到长足发展。近年来在荧光 分析方法和技术也取得重要的进展，其应用领域也正在不断拓宽，如阴离子荧光 光谱法。荧光检测与色谱法联用，提供了高灵敏度，高分辨率和高选择性的分析 方法，微分或导数荧光法、多维荧光光谱法、同步荧光法、同步导数荧光法“) 、 偏振荧光法、相分辨与时间分辨荧光光谱法、免疫荧光监测、固体表面检测、催 化和非催化动力学荧光、激光诱导荧光光谱法等新兴复合联用方法和技术的出现 又为荧光光谱法的发展注入了新的动力。现在荧光光谱法可以通过荧光法鉴定和 测定的有机物、无机物、生物物质、医药、农药、污染毒物等的数量与日俱增， 已广泛应用于化学、化工、生物、医药、卫生、农业、轻工、冶金、地质以及环 境保护等各个领域中m 。 荧光光谱法具有灵敏度高、选择性高、方法简便快速、试样量少等优点m ， 但也有其不足之处，许多物质本身是不会发荧光的，使荧光分析技术的应用受到 了限制。为解决此问题随后发展起荧光探针技术。所谓荧光探针技术是一种利用 探针化合物的光物理和光化学特征，在分子水平上研究某些体系的物理、化学过 程和检测某种特殊环境材料的结构及物理性质的方法。由于大多数生物分子本身 无荧光或荧光较弱，检测灵敏度较低，人们用强荧光的标记试剂或荧光生成试剂 与待测物进行标记或衍生，即利用某些试剂与非荧光或弱荧光化合物以共价键或 其它形式结合形成发荧光的络合物或聚集体进行测定。其基本特点是具备高度 灵敏性和极宽的动态响应时间。荧光探针技术可以使研究人员高灵敏和高选择性 地检测复杂生物分子，包括活细胞中的特定成分。尤其近年来发展起来的荧光化 学传感器和分子信号系统更是使荧光探针技术的应用有了很大程度的提高和拓 宽，如今它的应用已深入到药物学、生理学、环境科学、信息科学等多个领域”。 随着生命科学的飞速发展，对活性高、特异选择性好、灵敏度高的新型荧光探针 的需求就越来越迫切了。 目前用于标记或衍生的荧光探针主要有荧光素类、罗丹明类、邻苯二甲醛类 等化合物。其中荧光素类化合物可以呈现强烈的荧光，至今一百年来一直是化学 天津大学硕士学位论文第一章文献综述 及生物分析领域中研究的热点删，对荧光素类化合物的合成与荧光性能展开了 广泛而深入的研究。氨基荧光素是荧光素类化合物中重要的荧光探针之一，含有 一n h 2 活性基团能与其他分子形成共价键结合，使荧光性能发生改变，在生物分 子光谱学研究中起到重要的作用。但对氨基荧光素的报道主要集中在生物分析中 的简单应用方面“”，对氨基荧光素进行改进和修饰以及在生物分析中应用的系 统性报道较少。本文着重论述氨基荧光素的修饰与改进，及其在生物分析中应用 状况，为设计高灵敏性、适合生物检测的氨基荧光素衍生物提供重要的理论支持。 1 1 荧光探针 当紫外或可见光照射到某物质上时，这些物质就发射出波长和强度各不相同 的光线，停止照射光照射时，这种光线马上或逐渐消失，这就是荧光。 荧光现象的发现最早可追溯到1 6 世纪，但是对荧光的产生原理和条件直到1 9 世纪中期才清楚。s t o k e s 在1 8 5 2 年详细考察了奎宁和叶绿素的荧光后，发现它们 的荧光波长比照射光的波长要长，认定是物质吸收光后重新发射出的光，并且波 长不同，荧光是发射光就这样被证实了。“荧光”这一名称就是来源于“萤石” 发射荧光的特性。此) p s t o k e s 还对物质的荧光强度与浓度间的关系进行了研究。 n 2 0 世纪初，人们已经知道包括荧光素、稠环芳烃及曙红等在内的6 0 0 余种化合 物有荧光。随后w a w w i l l o u s 在1 9 2 4 年进行了荧光产率的测定，1 9 2 6 年g a v i l a 对荧 光寿命进行了测定。时至今日，由于荧光的高灵敏度和高选择性，荧光分析及荧 光检测已经成为分析化学中的一重要的研究领域“4 。 1 i 1 荧光的发光原理 图1 1 为荧光的发射过程【2 】。激发态分子的激发单重态直接或者再经过振动 弛豫达到激发态的最低振动能级后，如果以发射光量子方式跃迁到基态的各个不 同振动能级( 包括最低能态) ，又经振动弛豫回到最低基态，这个过程称为荧光 发射。从荧光的发射过程明显地看到：荧光是从激发单重态的最低振动能级开始 发射的，与分子被激发至哪一个能级无关，因此荧光发射光谱的形状与激发光的 波长无关( 个别化合物例外) 【3 1 3 l ，所以利用这一特性，可以检测化合物的纯度； 其次，荧光发射前后都有振动驰豫过程，因此荧光发射的能量比分子所吸收的辐 射能量低，所以溶液中分子的荧光光谱的波长与它的吸收光谱的波长比较，荧光 的波长总是要长一些。 天津大学硕士学位论文第一章文献综述 单重态 三重态 ) ，v “ l ，、，厂i s c ，n 久。 ( ， l 让 a t s 1 一- 、j 7 a ，弧争 yii 7 ， l ， 2 1 3 v r 4 a _吸收：蝴光： p h 磷光；t _ 一三重态； j s o 一系间跨越； s 单重基态； i o 一内转换； s 一单重激发态；v r 振动驰豫 图1 1 荧光发射过程 f i g u r e1 - 1 e m i s s i o no f f l u o r e s c e n t 单重激发态的平均寿命是1 0 9 1 0 4s ，因而荧光的寿命也在同一数量级。如 果在此时问内没有其他去活过程与荧光过程相竞争，那么在这段时间内没有其他 能量转移，激发态分子全都以发射荧光的方式回到基态。如果全部激发态分子都 是以发射荧光回到基态，就可以认为该体系的荧光发射量子效率( 或称量子产额) 为1 ，但显然其数值在0 与1 之间。 1 1 2 荧光探针的性质 1 1 2 1 荧光激发波长和荧光发射波长 电子跃迁时吸收或发射的能量并不是任意的，而是受到电子能级的制约，只 能吸收或发射一定波长范围内的光。荧光通常是发生于具有刚性结构和平面结构 的n 一电子共轭体系的分子中，随着舻电子共轭度和分子平面度的增大，荧光效 率也将增大，它们的荧光光谱也将向长波方向移动“。荧光物质的激发波长大多 天津大学硕士学位论文第一章文献综述 处于近紫外区或可见光区，发射波长多处于可见光区。荧光探针的发射波长总是 大于其激发波长，两者的差值叫做斯托克斯( s t o k e s ) 位移。荧光染料的斯托克 斯位移越大，其激发光谱和发射光谱的重叠就越少，就越有利于提高其分辨率。 1 1 2 。2 荧光强度 荧光强度决定了荧光染料检测的灵敏度，它取决于染料的摩尔吸光系数和荧 光量子产率有关。摩尔吸光系数反映了染料吸收激发光的能力，而荧光量子产率 反映了染料将吸收的辐射能转化为荧光的效率，是衡量物质发射荧光能力的尺度 n 铂 o 1 1 2 3 荧光寿命 荧光寿命( 即激发态寿命) ，是指分子在激发态的平均停留时间。若分子受激 后迅速驰豫，则可实现多次激发，所以荧光寿命短时可提高灵敏度。大多数荧光 探针的荧光寿命在1 0 1 0 s ，如荧光素为4m 。特别长的荧光寿命对于高灵敏度 检测也是很有意义的。例如利用稀土离子配合物的长荧光寿命而建立的时间分辨 荧光测量技术，可极大的提高检测的灵敏度嗍。 1 1 2 4 光稳定性 提高激发光的强度固然可以提高荧光强度，但激发光的强度不是可以无限提 高的。因为激发光的强度超过一定限度后，光吸收就趋于饱和，并不可逆的破坏 激发态分子，这就是光漂白现象。解决光漂白问题最直接的方法就是提高测量的 灵敏度，以降低光照的强度。 1 1 3 荧光的影晌因素 荧光分析信号的产生涉及对光子的吸收和再发射两个过程，这两个过程都是 瞬间的，而在两个过程之间存在一相当短的时间间隔，一般为1 0 s ，在这一时间 内处于激发态的分子发射荧光而回到基态的去活过程与各种无辐射( 非发光) 过 程是相互竞争的。因此荧光的强度取决于分子结构及其所处的环境因素 2 1 。 1 1 3 1 荧光与物质结构的关系 发光物质的分子吸收辐射后，由激发单重态最低振动能级降到基态发射出荧 光。所以物质能否发生荧光取决于其分子结构：它必须具有吸收光量子的分子结 构和有一定的荧光量子效率。由于能强烈发射荧光的物质几乎都是通过兀川跃 迁过程吸收辐射，因此具有共轭双健，尤其是刚性结构、平面结构和稠环结构的 天津大学硕士学位论文 第一章文献综述 舻电子共轭体系的分子有利于发射荧光。分子共平面性越大，其有效的舻电子的 共轭度越大，荧光的量子效率也越大。荧光光谱的波长也将向长波方向移动。 任何有利于提高冗电子共轭度的结构因素，都能提高荧光效率，或使荧光波 长向长波方向移动。例如芳香化合物的芳香环上进行不同的基团的取代，对荧光 强度和荧光光谱都将产生影响。通常有如下一些经验性规律o ： 1 、增强荧光的基团：如一n 也，一o h ，一0 c 地，一n h r ，- - e n ，- - n r 2 ，- - o r 。 2 、减弱荧光甚至破坏荧光的基团：一c o o h ，一c = 0 ，一n 0 2 ，一n = n 一，- - s h ， - - f ，一c 1 ，一b r ，一i 。 3 、对分子荧光影响不明显的基团：一s 0 3 i ，一n 1 3 + ，一r 等。 立体异构现象对荧光强度也有显著的影响。以1 ，2 二苯乙烯为例，顺式不发 生荧光，反式有强烈的荧光。其原因为反式异构体的原子都在同一平面上，苯基 虽然能平面外振动，但其电子振荡完全在该平面上，不能激发起平面外的振动， 因此就有很强的吸光和发射荧光的能力。顺式异构体的原子不处在同一平面上， 电子振荡的一个分力和苯基的振动在同一方向，可能因为发生偶合作用将其能量 损失于振动中，所以不发生荧光。 刚性结构可以增加荧光强度。当弘电子共轭体系分子是刚性平面结构，分子 就不至于发生变形，而保持大的平面结构，即保持了大的静电子共轭度。此外刚 性的增加还可以减少分子的一部分相对于分子其他部分做低频率振动与转动，减 少了系闻跨越跃迁以及碰撞去活化等的无辐射过程的可能。现以结构相似的荧光 素和酚酞为例进行说明：荧光素通过氧桥环形闭合具有了刚性结构，在溶液中有 强的荧光，在一定条件下其荧光效率可达到1 。结构极相似的酚酞却是非荧光物 质，由于没有氧桥，是非刚性结构，不易保持平面性，因而不发生荧光。 可见荧光特性与物质结构的关系是令人感兴趣的问题，认识到荧光和结构的 关系，不仅可以知道哪些是荧光物质，哪些是非荧光物质，还可以把非荧光物质 转化成吸光能力强和荧光效率高的结构，对于指导荧光素类衍生物的设计与合成 有重要的意义。 1 1 3 2 荧光探针浓度的影响 浓度对荧光强度的影响很明显。在稀溶液中的荧光强度与荧光探针的浓度呈 线性关系；浓度增加到一定程度时，荧光强度保持恒定，即使再增加浓度，荧光 强度也不发生变化，若浓度再增加，超过一定限度，荧光强度将随着浓度的增加 而减弱。荧光探针液的应用浓度一般为1 0 - 3 1 0 弓m o l l 。 天津大学硕士学位论文 第一章文献综述 1 1 3 3p h 值对荧光的影响 环境微不足道的变化可能对荧光产生巨大的影响。荧光素类化合物带有酸性 或碱性取代基，对p h 的变化甚为敏感。荧光物质的酸式或碱式的光谱也会有明 显的差别。如荧光素处于酸式结构时无荧光，处于碱式结构才能发射黄绿色荧光。 1 1 3 4 温度 荧光探针的荧光量子产率和荧光强度通常随溶液温度的降低而增加。反之， 则减弱。温度升高，分子热运动加大，分子碰撞概率增加，使处于激发态的疗电 子难以维持稳定的时间，导致荧光的淬灭。一般在2 0 c 时，温度引起的荧光淬灭 作用就有表现，随着温度的升高，淬灭作用加剧。在2 0 c 以下荧光量子产率随温 度变化稍不明显，因此进行荧光染色过程中，为获得良好的荧光效果，应注意温 度的控制。 1 1 3 5 溶剂效应 荧光光谱的位置和荧光强度在不同溶剂中显著的改变。一般来说荧光强度随 着溶剂极性的增强而增大，荧光峰的波长随着溶剂介电常数增大而增大。如果荧 光探针在溶剂中发生离解或是与溶剂形成化合物，则荧光强度和荧光峰的波长都 会发生很大变化。例如在苯胺或萘胺的稀溶液中加入少许盐酸，由于形成盐酸盐， 其荧光消失。此外，混合溶剂对荧光产生重要影响。如果一种荧光物质分别在两 种不同的溶剂中均不发生荧光，但是在这两种溶剂的混合物中，有可能发出很强 的荧光。 1 1 3 6 荧光淬灭 各种原因使荧光探针的荧光强度降低，以致荧光探针的荧光强度与浓度不呈 线性关系，这种现象称为荧光淬灭。这些会引起荧光淬灭的物质称为淬灭剂。荧 光淬灭导致荧光物质的荧光效率降低或激发态寿命缩短，导致荧光强度的降低。 荧光淬灭主要有碰撞淬灭、能量转移、氧的媳灭作用、荧光物质的自淬灭等。 1 1 4 荧光光谱法的应用 荧光光谱法是最灵敏的分析技术之一，并且具有选择性高、取样量少、简便 快速的特点。随着荧光分析技术的发展，其在无机物分析和有机分析中得到广泛 的应用。尤其在有机分析中，荧光光谱法的高灵敏度和高选择性使它在食物“”、 药品分析m 1 ”、生物化学分析“”“、生理医学研究和临床分析乜羽以及环境样品中 微量有机物“的测定等领域有特别的意义，国内外关于荧光分析法在各领域中 天津大学硕士学位论文第一章文献综述 的应用报道众多。荧光光谱法已成为研究生物活性物质和核酸的作用以及研究蛋 白质的结构和机能极有价值的研究工具。 1 2 氨基荧光素概述 由于大多数生物分子本身无荧光或荧光较弱，检测灵敏度较差，人们用强荧 光的标记试剂或荧光生成试剂对待测物进行标记或衍生，生成具有高荧光强度的 共价或非共价结合的物质，使检出限大大降低，这就是荧光探针技术。 作为探针的试剂必须具备：( 1 ) 探针与被研究分子的某一微区必须有特异 性结合，且结合的比较牢固。( 2 ) 结合的探针必须对环境条件灵敏。( 3 ) 结合 的探针不影响生物大分子的结构和生物功能。( 4 ) 背景荧光干扰小。常用荧光 探针主要有无机盐类；有机试剂一生物物质的聚合体；有机小分子化合物探针和 抗体一抗原免疫探针。此外，荧光偏振、峰位及谱带宽度、荧光寿命等荧光参数 能提供有关被测化合物的重要信息，也是探针技术的基础。 1 2 1 荧光素概述 荧光素及其衍生物是重要的荧光探针材料，属于咕吨染料。荧光素1 ( f l u o r e s c e i n ) 又称荧光黄，化学名称为3 ，6 二羟基螺 异苯并呋喃1 ( 3 啪，9 - ( 9 h ) 咕吨3 酮 或9 ( 邻羧苯基) 6 羟基3 h 咕吨3 酮。由于氧桥键把两个苯环固定在 一个平面上，使分子具有刚性共平面结构，在激发光的作用下能产生强烈的荧光。 荧光素具有高的消光系数，激发和发射波长都在可见光区，在水中具有较高 的荧光量子产率，无毒，成本低等优点【2 6 】。自1 8 7 1 年b a y e r 首次合成出荧光素 1 至今一百多年的时间仍然被广泛的应用于研究蛋白质的结构特性，但其所具有的 特定属性也限制了它在许多研究领域中的进一步应用。( 1 ) 较小的斯托克斯位移， 使碍样品背景对荧光的干扰相对较大 2 7 】；( 2 ) 荧光量子产率对p h 值敏感 2 8 1 ，在 生物体内的生理环境下荧光量子产率降低：( 3 ) 具有对光敏感的基团，在强光检 测下容易分解 2 9 , 3 0 1 ；( 4 ) 亲脂性差，不宜渗入细胞，因而用于细胞的研究效果差； ( 5 ) 特异选择性差。为了改善荧光素的性能，人们研制开发出许多的荧光素衍 天津大学硕士学位论文第一章文献综述 生物，在很多方面弥补了荧光素的缺陷，使其更有利于对生物体的分析检测。 合适的荧光标记必须是不能阻碍配体与受体的结合，即必须保持配体的专一 性和选择性。由于荧光素自身不含特异性的活性基团，已不能满足不断发展的生 物分析要求，为此，国内外许多化学及生物学家通过引入不同功能的化学基团对 荧光素的结构进行修饰，研制开发出许多活性基荧光素衍生物o ”。由于含活性基 的荧光素衍生物能与其它分子发生某些特异反应而更适合对不同的生物体进行 标记，如今开发特异选择性好的具有活性基的荧光素衍生物已成为生物分析领域 中研究的热点m 一。氨基荧光素( a f ) 就是在荧光素9 位碳原予所连接的芳环( 简 称底环) 上引入氨基，由于氨基可与待标记分子中的羧基发生反应形成共价键结 合，所以可用于蛋白质、核酸的标记。进一步对氨基荧光素进行结构修饰与改造， 引入不同的取代基团，可迸一步提高氨基荧光素的荧光性能。 1 2 2 氨基荧光素的结构修饰及在生物分析中的应用 5 氨基荧光素( 5 - a m i n o f l u o r e s e e i n ) 2 ，化学名称为3 ，6 二羟基5 氨基螺 异 苯并呋喃1 ( 3 田，9 - ( 9 1 - i ) 咕吨3 酮 或9 ( 4 氨基邻羧苯基) - 6 羟基3 h 咕吨3 酮 是荧光素类染料中重要的荧光探针之一，发微弱荧光，尽管其荧光强度仅为荧光 2 素的一百五十分之一，但氨基荧光素本身通过适宜的缩合试剂，如3 ( 3 二甲氨 基丙基) 乙基碳二亚胺，二环己基碳二亚胺( d c c ) 等，与羧基结合，结合产物 荧光强度却明显增强，可用于免疫学研究和蛋白质标记。例如a k i mo g a m o t 嘲 等人用5 氨基荧光素与粘多糖的糖醛酸残基结合形成粘多糖的荧光衍生物，其荧 光性能与荧光素的荧光特征等同。此外m k i b l e r 等m 1 以d c c 为缩合试剂，5 氨基荧光素通过相转移反应与短链脂肪族羧酸共价键结合，这样就解决了在短链 脂肪族羧酸分析缺乏合适染色团和荧光团的问题，而且其衍生物可用于利用激光 诱导荧光毛细管电泳技术对大气中臭氧氧化和形成过程的检测。 目前氨基荧光素通过与特异基团共价键结合形成衍生物在生物分析中已得 到了广泛的应用，但由于其荧光强度低，衍生条件苛刻，限制了其迸一步应用。 为了克服此缺点，氨基通过异硫氰酸化，烃化，酰化，酯化，马来酰化后，衍生 天津大学硕士学位论文第一章文献综述 物的荧光性能得到改善，能与n h 2 、一s h 、- - - c o o h 等发生反应形成共价键， 所得标记物具有更高选择性、稳定性和灵敏度的优点，在生物分析中也已得到广 泛应用。 l - 2 2 1 氨基荧光素酰化衍生物及其应用 特定细胞内部属性一直为科学家们所关注，荧光探针标记活细胞技术研究细 胞的属性一直是此领域的前沿研究课题。但作为活细胞标记试剂必须满足以下条 件：( 1 ) 探针不损伤和抑制细胞进一步克隆和再生；( 2 ) 探针特异性的与细胞内 特定底物反应；( 3 ) 标记产物信号足够强，以区别与未标记细胞；( 4 ) 在分析过 程中，测定产物不从细胞内渗漏出。氨基荧光素、异硫氰酸酯荧光素和异硫氰酸 酯罗丹明等曾用于活细胞标记，但特异性反应底物和荧光产物的渗漏问题尚未得 到解决。氨基荧光素为水溶性荧光染料，不易通过细胞的亲脂性膜，氨基荧光素 酰化衍生物3 为亲脂性荧光探针，易进入细胞内。随着烷基碳链长度变化，荧光 产物在细胞内的保留时间也有所不同，当碳原子数为1 1 1 7 时，荧光产物更易 保留在细胞内；当碳原子数为2 8 时，荧光产物能暂时被保留在细胞内。这 些亲脂性的氨基荧光素衍生物可用于研究膜和蛋白质动力学“。，细胞的功能和结 构。 3 4 当酰胺的取代基团为2 联苯基，4 联苯基，1 萘基4 ，显示和氨基荧光素不 同的荧光性能，尤其5 n ( 4 联苯基羰基) 】氨基荧光素，显示出优良的荧光性能 咖，其荧光强度为母体的1 0 0 多倍。直接染色性好：且背景对其的非特异吸收小， 可直接用于膜结合d n a 的染色，最低检出限可达2 0 龟嘲。当a r 为五氟苯基时 制备得到5 i n ( 五氟苯基羰基) 】氨基荧光素二p d 葡萄糖苷酸作为酶底物已经用 于活细胞b 葡萄糖苷酸酶活性的定量分析，并可通过流式细胞术分选高表达细胞 【铷 1 2 2 2 异硫氰酸酯荧光素及其衍生物的合成与应用 异硫氰酸酯荧光素( f i t c ) 5 是氨基修饰试剂，而且反应条件温和，易与蛋 天津大学硕士学位论文第一章文献综述 xx n c s s n c s 6 白质和肽结合形成硫脲，是最常用的蛋白质标记试剂之一，除此之外，还广泛用 于免疫荧光技术、d n a 序列分析“。f i t c 在水溶液中稳定，但在p h 为9 0 9 5 的条件下可与氨基进行反应，不适合标记对碱性条件敏感的蛋白质。由于 f i t c 的斯托克斯位移小蜘，易产生浓度淬灭现象。而且还具有光敏感基团， 光照下容易快速分解“7 删，此外其制剂不易储存，也不能重复使用。所以人们以 f i t c 为母体对其结构进行了修饰，主要在3 ，6 位取代羟基的氧杂慈母体上2 ，4 ，5 ，7 位引入卤素取代基呻1 和异硫氰酸基团与伯胺反应得到硫脲衍生物啪1 。例如5 异硫 氰酸酯曙红( e i t c ) ，5 一异硫氰酸酯四碘荧光素( e d t c ) 6 。卤代异硫氰酸酯荧 光素与f i t c 分别作为能量转移的受体和供体，用于c a 2 + - a t p a s e 相互作用的研 究。不同的硫脲衍生物荧光性能不同( 表1 - 1 ) 嘲，某些硫脲衍生物相对荧光强度 高，应用于核酸分析。 表1 - 1 荧光素衍生物的荧光性能 d n a 检漉碾 枣号 纯合物( r )辐对荧光强发 ( f g ) 1 n - ( 丁基) 一5 一硫脲荧光素 l1 04 0 0 2n 一( 环己基) 一5 一硫脲荧光素0 6 74 0 0 3n - ( 金刚烷) 一5 一硫脲荧光素0 5 1 4 0 0 4卜( 4 一氯苯基) - 5 - 硫脲荧光素0 0 2 54 0 0 ， 5 卜( 2 一甲苯基) 一5 一硫脲荧光素 1 1 08 0 6 n “一甲苯基) - 5 一硫脲荧光素0 9 2 8 0 7 n - ( 4 一甲氧基苯基) 一5 一硫脲荧光素 1 1 08 0 8 卜( 2 一联苯基) - 5 一硫脲荧光素 1 1 04 0 0 9 卜( 3 ，5 一二甲基苯基) 一5 一硫脲荧光素 1 2 02 0 1 0 卜( 2 ，4 - 二甲基苯基) 一5 一硫脲荧光素 1 2 04 0 0 1 1n - ( 芘) 一5 一硫脲荧光素0 7 3 8 0 0 1 2 卜( 香豆素) 一5 一硫脲荧光素 1 2 08 0 0 天津大学硕士学位论文 第一章文献综述 1 2 2 3n 。n _ 二( 2 - t t 啶甲基) 一5 一乙二氨基荧光素及其应用 锌是人体内一种重要的二价阳离子，可影响d n a 合成、微管解聚、基因表达、 细胞凋亡、免疫系统功能和酶的活性“”。大多数细胞内z n 2 + 的浓度相当低，多 数与蛋白质或核酸结合，所以合成特异选择性的锌离子荧光探针以用于检测细胞 内锌离子浓度的变化是十分重要的。研究中发现含有环胺和聚胺的化合物对锌离 子有高度的特异性，但存在激发波长短，易损伤细胞等缺点。据此h i r a n o 在氨 基荧光素的基础上衍生出检测z n 2 + 的活性荧光探针z n a f 1 和z n a f - 27 嘲，可 用于高度准确、灵敏的检测活体组织中的z n 2 + 。但乙1 2 + 只有在中性或弱碱性环 境下才能与z n a f ，i ( 2 ) 络合发射稳定的荧光，在p h 3 0 0 。 1 h n m r ( 4 0 0 m h z ，d m s o - d 6 ) j ：6 9 7 ，= 2 0 h z , l h 0 ，6 9 2 ( d ，= 9 4 i - i z , 1h ) ， 6 8 3 d = g 0 h z , 1 功，6 ，6 1 ，= 2 0 h z , 2 i - i ) ，6 5 8 ( d ，d = 8 4 h z ，2 均，6 5 2 ( d d ， 力= 8 8 h z , , 1 2 = 2 4 n z , 2 d ，5 7 1 ( s ，2 i ) ； ”cn m r ( 4 0 0 l v n - l z , d m s o d 6 ) 占：1 6 9 3 6 ( c 0 1 5 9 4 8 ( 1c i ) ，1 5 1 9 9 ( 2c ) ，1 5 0 4 3 ( 2c ) ，1 3 9 2 9 ( 1c ) 1 2 8 9 6 ( 2c ) ，1 2 7 6 7 ( 1c ) ，1 2 4 1 9 ( 1c ) ，1 2 1 5 0 ( 1c ) ，1 1 2 4 9 ( 2 c ) ，1 1 0 7 1 ( 2c ) ，1 0 6 2 4 ( 1c ) ，1 0 2 0 6 ( 2c ) ； i r ( k b r ) v c m “：3 4 3 7 0 ，3 3 6 7 7 ，3 2 2 3 0 ，3 0 6 2 5 ，1 7 4 2 1 ，1 7 2 2 0 ，1 6 0 0 7 ，1 5 0 0 6 ， 1 4 5 7 4 ； m s 饵s i t o f ) ：m z = 3 4 8 2 ( m + 1 ) + ，c a l c d 3 4 7 3 将上述除去5 氨基荧光素的盐酸滤波浓缩至于，再加入盐酸( 1 5 0 0m lw 口c 1 ) = 6 ) 回流，趁热过滤，滤液放置于4 c 冰箱中冷却析出沉淀，过滤。再用 盐酸( 7 5 0 m l ，w ( h c l ) = 6 ) 重结晶，过滤。固体用氢氧化钠溶液( 7 5 0 m l ，0 5 t o o l l ) 溶解，加入冰醋酸调节p h 值至4 ，析出沉淀，真空干燥，得到土黄色每 氨基荧光素0 5 0 9 ，收率1 5 ，m p 3 0 0 。 2 3 结果与讨论 本文通过两步反应合成氨基荧光素，即硝基荧光素的合成与硝基荧光素的还 原反应。我们分别对这两步反应进行了研究，探讨了反应条件对收率的影响。 天津大学硕士学位论文第二章氨基荧光素的合成研究 2 3 1 硝基荧光素合成 2 3 1 1 反应温度的影响 文献 6 8 报道硝基荧光素的合成是以4 硝基邻苯二甲酸和间苯二酚为原料 直接在1 9 0 2 0 0 高温熔融状态缩合得到。但是由于反应温度过高，在实验过 程中容易出现焦化现象，降低了反应的收率。为了避免焦化现象，我们尝试在缩 合反应中加入氯化锌作为催化剂，有效降低了该反应的温度。为此，我们考察了 反应温度对该反应收率的影响( 如图2 2 所示) 。综合考虑温度对该反应收率的 n ( 4 - n i t r o p h t h a l i c a c i d ) ：n ( r e s o r e i n 0 1 ) ：n ( z i n c c h l o r i d e ) = 1 ：2 2 ：2 2 图2 2 反应温度对收率的影响 f i g u r e2 - 2 e f f e c to f r e a c t i o nt e m p e r a t u r eo nt h ey i e l d 影响，我们采用1 2 0 0 融熔，升温至1 5 0 c 反应，再升温至1 6 0 ( 2 使熔融物固化方 式进行缩合反应，收率达到8 5 ，i - i p l c 分析硝基荧光素的含量为9 9 。 2 3 1 2 反应物摩尔比的影响 为了优化反应条件，在固定反应温度和催化剂氯化锌用量的前提下，本文考 察了间苯二酚与4 硝基邻苯二甲酸摩尔比对反应收率的影响。由图2 3 可以看出， 随着反应体系中间苯二酚用量的增加，收率逐渐增加。由于采用禾硝基邻苯二甲 酸为原料，反应过程中生成的水分蒸发带走部分间苯二酚，导致反应收率降低。 增加间苯二酚的用量，不仅能弥补反应过程中间苯二酚的损失，而且能有效地促 进反应进行，提高反应收率。但与4 硝基邻苯二甲酸用量相比，当间苯二酚的用 量增加到3 ：l 时，反应的收率却有所下降。因此，我们选用间苯二酚：4 - 硝基 寥一里。乒 天津大学硕士学位论文 第二章氨基荧光素的合成研究 邻苯二甲酸= 2 5 ：l 作为较佳的原料配比，此时产品的收率较高，过量的间苯 二酚在反应后可通过盐酸回流过滤除去。 r a 村oo fr t m e t a n t s 图2 3 反应物摩尔比( 间苯二酚：4 硝基邻苯二甲酸) 对收率的影响 f i g u r e2 - 3e f f e c to f m o l a rr a t i oo f r a wm a t e r i a l so nt h ey i e l d 2 3 2 硝基荧光素还原反应 根据相关文献报道，我们分别考查了四种不同的还原剂对产物收率和纯度的 影响。 2 3 2 1 骨架镍催化加氢还原 硝基荧光素加氢还原我们首先采用未经处理的5 ( 6 ) 硝基荧光素，向高压釜 中加入5 ( 6 ) 一硝基荧光素和骨架镍”乙醇悬浮液，通氢气至3 2m p a ，分别在室温 和7 0 搅拌反应6h ，均未观察到明显吸氢现象。可能是由于硝基荧光素合成过 程中原料4 一硝基邻苯二甲酸未完全除去，使催化剂中毒。为此，我们对硝基荧光 素用热水回流，除去未反应的4 硝基邻苯二甲酸，提高了5 ( 6 ) 一硝基荧光素的纯 度( h p l c 分析含量为9 9 ) 。将提纯后5 ( 6 ) 一硝基荧光素相同条件下室温反应7 0 分钟，收率可达9 3 ，通过h p l c 分析5 ( 6 ) 氨基荧光素的含量为9 1 。 2 3 2 2 氯化亚锡还原反应 我们分别尝试用氯化亚锡乙醇溶液嘲和氯化亚锡酸性溶液还原硝基荧光 素。氯化亚锡还原反应转化率高，但所得产物中含有大量的氯化亚锡、氯化锡和 一爨)p弓1人 天津大学硕士学位论文 第二章氨基荧光素的合成研究 锡酸盐，我们尝试用结晶或萃取的方法除去锡类化合物，但很难除尽，从而影响 了产物的纯度。 2 3 2 3 二硫化钠还原反应 用多硫化钠作为还原剂是硝基化合物还原的常见方法之一删。为此，我们采 用二硫化钠水溶液法还原硝基荧光素( 如图2 - 4 ) ，但是反应的收率很低仅为1 7 ，5 ( 0 一氨基荧光素含量为8 2 。 + h ，o 图2 - 4n a 2 s 2 为还原剂合成氨基荧光素 f i g u r e2 - 4s y n t h e s i so f a m i n o f l u o r e s c e i nw i t hr e d u c i n ga g e n t