（物理化学专业论文）单壁碳纳米管电极的制作、表征及应用.pdf

中文摘要 中文摘要 本论文较系统、深入地研究了单壁碳纳米管( s c n t ) 修饰电极的制作方法 和电化学特性，以细胞色素c 为代表。研究了血红素类蛋白质在s c n t 上的固定 及直接电化学性能；研究了s c n t 上基于氧化酶的生物电化学传感器的制作及性 能。主要内容如下： 1 研究了s c n t 修饰玻碳( s c 卜玎g c ) 电极的制备方法。用扫描电镜、 拉曼光谱、红外光谱等技术对s c n t 进行了表征，考察了s c n t g c 电极的交流 阻抗特性。实验结果表明，与裸g c 电极相比，s c n t g c 电极的电化学反应电 阻显著降低，表明s c n t g c 修饰电极表面的电子转移速率较快。 2 研究了细胞色素c ( c y t oc ) 在s c n t 表面的固定及直接电化学。运用 吸附方法将c y t oc 固定在s c n t 表面；红外光谱( 取) 显示被固定的c y t oc 能 保持原有的空间结构，没有发生变性；循环伏安测试表明，c y t oc 在s c n t 表面 能发生稳定的直接电子转移，其f e 曲线上出现一对良好的、几乎对称的氧化 还原峰；式量电位矿基本不随扫速的增加而变化( 在2 0 1 2 0m w s 的扫速范 围内，矿平均值为0 1 6 54 - 0 0 0 1 v ) 。进一步的实验结果表明，吸附在s c n t 表 面的c y t oc 仍能保持其对h 2 0 2 电化学还原的生物电催化活性。 3 研究了s c n t 上基于葡萄糖氧化酶( g o x ) 生物电化学传感器的制作及 性能。用n a t i o n 将o o x 固定在s c n t 表面形成n a f i o n - c , 0 ) 【s c n t g c 酶电极， 用a f m 和红外光谱对g o x 在s c n t 表面的状态进行了表征；考查了 n a f i o n - g o x s c n t g c 电极对伊d ( + ) 葡萄糖的生物电催化活性。实验结果表明， 吸附在s c n t 表面上的g o x 没有发生变性，仍保持其对葡萄糖氧化良好的生物 电催化活性。在p h = 8 和3 1 3k 时g o x 具有最佳的催化氧化效果。进一步实验 结果表明n a f i o n - g o x s c n t g c 电极可用来作为葡萄糖氧化酶的生物传感器， 在o 5m m o l l 5 5m m o l l 范围阻催化电流随浓度呈线性。 关键词：碳纳米管，化学修饰电极，生物电催化，细胞色素c 。葡萄糖氧化 英文摘要 f a b r i c a t i o n ，c h a r a c t e r i z a t i o na n da p p l i c a t i o n so fa s i n g l e - w a l l e dc a r b o n n a n o t u b ee l e c t r o d e a b s t r a c t t h i st h e s i si n v e s t i g a t e dt h ef a b r i c a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no fs i n g l e d w a l l e d c a r b o nn a n o t u b em o d i f i e de l e c t r o d e ( s c n t g c ) e l e c t r o d e e x t e n s i v es t u d i e sw e r e m a d eo nt h e a p p l i c a t i o n s o ft h ee l e c t r o d e st oi m m o b i l i z a t i o na n dd i r e c t e l e c t r o c h e m i s t r yo fh e i n e c o n t a i n e dp r o t e i n ( c y t oc ) o nt h es u r f a c eo fs c n t t h e m e t h o dp r e s e n t e dh e r ec a nb ee a s i l ye x t e n d e dt oi m m o b i l i z ea n do b t a i nt h ed i r e c t e l e c t r o c h e m i s t r yo fo t h e rr e d o x 廿l z y m e so rp r o t e i n s t h ee l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o r b a s e do ni m m o b i l i z a t i o no f o x i d a s e ( g l u c o s eo x i d a s e ，o o x ) o ns c n tw a sf a b r i c a t i o n a n di t sp e r f o r m a n c e sw e r ea l s oc h a r a c t e r i z e d t h em a i nr e s u l t so ft h i sr e s e a r c hw e r e x p r e s s e da sf o l l o w s ： 1 as i n g l e - w a l l e dc a r b o nn a n o m b em o t t l e de l e c t r o d e ( s c n t g c ) w a sf a b r i c a t e d a n dc h a r a c t e r i z e db yt e c h n i q u e so fs c a ne l e c t r o nm i c r o s c o p y ( s e v o ，r a m a ns p e c t r u m ， f t - i p , s p e c t r o s c o p ya n de l e c t r o c h e m i c a li m p e d a n c es p e c t r o s c o p y 凹s ) 1 kr e s u l t s s h o w e dt h a tt h ee l e c t r o c h e m i c a lr e a c t i o nr e s i s t a n c eo fs c n t g ce l e c t r o d ew a sm u c h l o w e rt h a nt h a to fb a r eg ce l e c t r o d e ( i nt h es y s t e no f5m m o l lf e ( c n ) 6 撕+ 0 1 m o l lk c i ) ，i n d i c a t i n gt h a tt h er a t eo f t h ee l e c t r o c h e m i c a lr e a c t i o no f f e ( c n ) 6 3 4 4 w a s r a p i da ts c n t i nc o m p a r i s o nw i t ht h a ta tb a r eg ce l e c t r o d e 2 c ”o c h r o m ec ( c y t o 力w a si m m o b i l i z e do nt h es u r f a c eo ft h es i n g l e - w a l lc a r b o n 。n a n o t u b e ( s e n t ) b yt h em e t h o do fa d s o r p t i o n i n f r a r e ds p e c t r o s c o p yi n d i c a t e dt h a t c 如cr e m a i n e di ni t so r i g i n a ls t r u c t u r ea n dd i dn o tu n d e r g os t r u c t u r a lc h a n g ea f t e ri t s i m m o b i l i z a t i o no nt h es c n t t h ed i “斌e l e c t r o c h e m i s t r yo fc y t oc w h i c hw a s a d s o r b e do nt h es m f a c eo ft h es c n t , w a ss t u d i e db yc y c l i cv o l t a m m e t r y t h e v o l t a m m e t r i cr e s u l t sf r o md e m o n s t r a t e dt h a tt h es c n th a dp r o m o t i o n a le f f e c t so nt h e d i r e c te l e c t r o nt r a n s f e ro fc y t oca n da l s oi n d i c a t e dt h a tt h ei m m o b i l i z e dc y t oc r e t a i n e di t sb i o e l e c t r o c a t a l y t i ca c t i v i t yt ot h er e d u c t i o no fh 2 0 2 t h i sm o d i f i m e l e c t r o d em i g h tb eu s e di nd e v e l o p m e n to f n e wb i o s e n s o r sa n dt h eb i o f u e lc e l l s i i 英文摘要 3 ，g o xw a si m m o b i l i z e do i lt h es u r f a c eo fs c n tw i t hn a t i o n 船b i l l d e rf o r m i n g n a t i o n g o x - s c n t g ce l e c t r o d e i tw a sc h a r a c t e r i z e d b ya f ma n df t - i r s p e c t r o s c o p y t h ep e r f o r m a n c eo ft h ee l e c t r o d ea n dt h e d e p e n d e n c e o fi t s e l e c t r o c a t a l y t i ca c f i v i t yo ns o l u t i o np ha n dt e m p e r a t u r ew e r es t u d i e d t h er e s u l t s d e m o n s t r a t e d 也a tt h ei m m o b i l i z e dg o xr e t a i n e di t sb i o e l e c t r o e a t a l y t i ca c t i v i t yt ot h e o x i d a t i o no fg l u c o s e ，a n dt h ee l e c t r o c a t a l y t i cc u r r e n th a da l i n e a r i t yr e l a t i o n s h i pw i t h t h ec o n c e n t r a t i o no f g l u c o s ei nt h er a n g eo f 0 5m m o l i p 5 5m m o l l k e y w o r d s ：c a r b o nn a n o t u b e ，c h e m i c a l l ym o d i f i e de l e c t r o d e ，b i o e l e c t r o c a t a l y s i s ， c y t o c l l r o m ec ，g l u c o s eo x i d a s e i i i 学位论文独创性声明 本人郑重声明： 1 坚持以“求实、创新”的科学精神从事研究工作。 2 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果。 3 本论文中除引文外，所有实验、数据和有关材料均是真实的。 4 本论文中除引文和致谢的内容外，不包含其他人或其它机构已经发表或 撰写过的研究成果。 5 其他同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了声明并表示了谢意。 作者签名：耳至聱 日期：坦：皇。 王 学位论文使用授权声明 本人完全了解南京师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版；有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆被查阅；有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索；有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在 解密后适用本规定。 作者签名：啐囊鸷 日期： ! 趔。= i 乏 第一章绪论 第一章绪论 1 1 引言 酶电化学在相当短的时间内得到了很大的发展。生物传感器的发展过程也使 我们对电极和生物大分子间相互电子转移的过程有了深入的了解。在3 0 年前， 电极和小分子蛋白质间的直接电子转移几乎是不可能实现的。但是如今已经能实 现电极和酶活性中心间的直接电化学，而且在这领域出现了许多基础和应用方面 的研究。基于酶催化的生物传感器在家庭 1 和医院 2 4 、环境毒物学 5 、食 物、饮料工业 6 ，7 、制药 8 等各方面均有着广泛的应用。 1 2 基本原理 1 2 1 电化学 酶电化学有两种基本类型：一种是酶在电极上发生直接电子转移；另一种是 引入电子媒介体催化酶的电子转移。 1 2 2 酶动力学 一般酵素学中，稳态假设【9 】是建立酶催化电化学等式的关键。氧化酶脱 氢酶( e n ) 催化底物s 转化成产物p 的简单机理如下： 置- ， ， 酞年s 亭le n g - i e r 。s k & 年p 。 f i g u r e1 1as i m p l em e c h a n i s mf o ra l lo x i d a s e d e h y d r o g e n a s e 正n ) t h a tc o n v e r t ss u b s t m t esi n t o product p 稳态假设中认为各种形式的e n 总浓度是一个常数。从而出现了 m i c h a e l i s - m e n t e n 式( 式( 1 ) ) ，该式表明反应速率( y ) 的变化与底物和酶总量 ( 砌) 浓度有关： 第一章绪论 矿：1 2 1 竺堑翌 k 列 = 半 ( 1a ) ( 1 b ) 其中k u 是m i c h a e l i s 常数，当i s ”k # t ( 饱和时) 可达到最大反应速率 ( v m a x ) 。 对于氧化还原酶催化，2 - e 或4 e 反应是常见的。它需要( 具有氧化还原活 性的) 辅助底物0 v i ) 来保持酶的催化活性。图1 2 展示了氧化酶脱氢酶催化氧 化底物2 - e 反应产生产物( p ) 的机理，该机理同样也适用于还原酶。( 在这种情况 下) 辅助底物( m ) 是单电子传递，如血红素或单核c u 蛋白质，它们都能与酶发 生持续的单电子反应。而在生物体系中两电子氧化还原对是常见的，如 n a d ( p ) h n a d ( p ) + 和醌类。这两种情况下，e n 和m 都是典型的非化学计量一级 反应。还原半反应包括与底物键合和氧化相关的步骤( 包括速率常数k d k i 和赶) ， 而氧化半反应包括酶和辅助底物间持续的电子转移。如图1 2 ： f i g u r e1 2t h eg e n e r a l ( p i n g - p o n g ) m e c h a n i s mf o r 缸o x i d a s e d e h y d r o g e n a s ee n z y m e t h a t c a t a l y s e st h e2 - c h a r o no x i d a t i o no f s u b s t r a t et op r o d u c ec 尸) 显然，图1 2 不是一个闭合圈，为了保持催化没有发生再氧化m r e d 的反应。 从电化学角度考虑，催化氧化还原反应发生所需的能量除了由参加反应的水释放 或接受质子提供外，也可由工作电极通过电子的减少或增加来提供。在电化学促 进酶催化体系中，反应速率与测量的电流值是一致的。当s 和m 的浓度适量， 2 谢 脯 玩n 叫一励 寸励 孙 赫 第一章绪论 酶过量时，体系处于稳态，此时各种形式的酶的浓度与时间无关，出现了稳定的 电流。 1 。3 理论 1 3 1 酶间接电化学 任何一个间接的氧化，还原酶催化反应都要求电子媒介体和酶能够通过反应 的外环境迅速地交换电子。对酶和天然或合成的电子对在内环境中的电子转移已 进行了研究。m a r c u s 理论认为：双分子电子传递的速率常数与动力学推动力及 反应各组分间的结合能有关这一理论也适用于小分子和蛋白质分予。根据酶催 化氧化还原的观点，电极必须能够通过电子媒介体提供不断循环的电子。 图1 3 是电化学促进间接2 - e 酶催化底物的氧化反应的一般示意图。扩散控制条 件下，电子媒介体( 不是酶) 与工作电极进行快速异相电子转移；与酶发生持续 的、双分子均相电子转移。如果酶电子媒介体反应是一级反应，而且电子媒介 体是单电子传递，那么半还原型酶就是内部的电子媒介体。许多情况下，单个 电子还原型的内部电子媒介体出现在速控步或者抑制作用中 1 0 】。 e l 二身 2 拟0 ，t r e a c t i o nl a y e r f i g u r e1 3ag e n e r a li l l u s t r a t i o no f a ne l e c t r o c h e m i c a l l yd r i v e nm e d i a t e d2 - e l e c t r o n ，g m z y n l c e a t a l y s e do x i d a t i o no f as u b s t r a t e 人们希望推导出接近实验测得的电流一电势曲线的分析表达式。该式中含有 浓度、酶催、均相电子传递速率常数和氧化还原电势等变量。不过，由于描述电 极表面上电子媒介体流的等式是典型的非线性二次偏微分方程，得不到精确的分 3 第一章绪论 析解答。如果对该式进行某些极限假设就可简化代数表达式，从而得到精确的分 析结果 1 1 ，1 2 】。 或者应用数字模拟技术将溶液分成有限的组分，离电极不同距离处相应反应 物种的浓度不同。引入模拟参数( 速率和平衡常数) ，对时间电势下的电化学反 应的结合效果和不同浓度组分间的物质传递进行模拟，从而产生预期的伏安图。 绝大多数情况下都是以稳态伏安来研究 1 3 1 5 。商业上，模拟伏安计的可行性项 目d i g i s i m 1 6 】已用于酶催化反应 1 7 】。 有几种方法实现酶间接电化学。这主要与e n 和或m 是扩散在溶液中还是 固定在电极表面上有关。下面分别讨论各种情况及相关的理论。但是所有情况下， 底物都在溶液中。 一、酶和电子媒介体都在溶液中 由于三种物种都是扩散的，理论上这种情况是相当复杂的。这里详细列举了 s a v e a n t 及其合作者 i s ，1 9 提出的理论方法，此外还有更复杂的机理 1 0 ，2 0 1 。假 设扫速很慢，反应层中m o x 的浓度由含时间的n c r n s t 等式决定。m o x 从电极扩 散到酶活性位补充其被e n 同消耗的量，从而产生稳态。理想的波形是s 形与 扫速无关( 式2 a ) ，星号表示每个物种的总浓度。 i ，| f 馒 ( 2 a ) 2 b ) 口= 陆丰矧拶t ， 参= 寺( 时) ( 2 d ) 在高过电位( f o 。) 时可得到稳态电流f ，的等式( 式2 b ) 。参数o ( 式2 e ) 4 第一章绪论 代表电子媒介体酶和底物酶这两个反应对控制催化速度的竞争程度。当0 很小 时( 低介质浓度) e n 删m o x ( 图1 3 ) 是速控步，与底物浓度无关。在这些条 件下，式( 2 b ) 简化成式( 3 a ) 。相反，当m 为高浓度时，l n ( 1 + o ) ，o 项消失，得到 式( 3 b ) 。 i v = f a m i 。2 。1 q 。d 。u 。i 。e 。n 。l 。 = 2 f a 3 妨 ( 3 b ) 二、酶固定在电极上、电子媒介体在溶液中 采用图1 3 展示的机理，同时假设e n 是以单层膜的形式牢固地固定在电极 表面，其浓度用表面覆盖量( 厂眈单位t o o le m - 2 ) 表示。电子媒介体、底物和 产物可以在固定膜上自由进出。式( 4 a ) 的首项出现了电势( f ) 与电流( 如国的关系 2 1 , 2 2 1 1 fl + e x 两嘞。1 ， 一= = 一l 一十1 1 p 02 f a f bl 镌【材l如 上：l fj l + 1 1 + 丘 一：一l 一叶t o 。一 2 f a f 庙l k , m j 如五2 【s 】 矧 ) ( 4 a ) ( 4 b ) 在高过电位下，极限稳态电流( 功与底物、电子媒介体浓度及它们相应的动 力学常数有关。一旦酶面积已知，利用扩1 俗口咽d ( 固定 s 】) 或【s 】。1 ( 固定 m 】) 的双 倒数( l i n e w e a v e r - b u r k e ) 关系可算出幻、k u 和b 的值。但是，由于酶各层叠加， 催化电流会直线下降 2 3 1 。 式( 4 a ) d o 各项分离可用来确定相应的速控步。第一项反应了酶一电子媒介体的 反应速率，在低电位( f e 1 ，e 2 c 日乙1 ) g 值包括异相电子转移速率常数：前期( 置酣f ) 和后期( 置) ，这些值随电势的变 化而变化，可由b u t l e r - v o l m e r 或m a r c u s 关系式【3 5 】计算。如果电极和酶之间的 电子对很少，那么g 就会变得很大( 不考虑电势) ，则观察不到电流( 在实际酶 电化学中常遇到这种情况) 。假设电子对是足量的，在高过电位( h - f ) 下，g 值从式7 ( a ) 、7 ( d ) 、7 ( e ) 中消失；项q 是在电极表面的底物s 和本体浓度( s k 脏) 的比值，是测量底物物质传递效率的量，和式4 ( e ) 中电极转速( m ) 和运动速度( 护) 一样都是旋转圆盘伏安计中l e v i c h 等式的变量。高转速时，当e e b e 2 时， 和q 接近相等。总之，在高过电位及s 不是速控物质传递的情况下，极限电流 表达式是常见m i e h a e l i s m e n t e n 关系式的简单形式( 8 ) 。 8 第一章绪论 铲脚西器 ( 8 ) t 4 实验方面 1 4 1 电子媒介体 蛋白质氧化还原电势分析法 2 9 】一直依赖人造电子媒介体促进电子快速交 换，电子媒介体还能作为一种“缓冲液”( 同时存在氧化还原对组分) 使溶液保 持稳定的电势，类似于p h 测量中的缓冲液。苯、萘并和葸醌是常见的2 - e 有机 接受体。一些吩嗪类和芳香重氮类则是能发生单电子转移反应的罕见有机物。已 有关于常见有机电子媒介体氧化，还原电势 3 0 ，3 1 1 的论文，其中报导了几种测定 氧化还原电势的技术，如：氧化还原电势分析法、微库仑检测计、光谱电化学。 过渡金属化合物是典型的单电子媒介体，含金属的电子媒介体主要有各种取代二 茂铁、六聚高铁盐，它们与蛋白质之间的电子转移反应都表现良好的伏安图。现 在使用广泛的洲 o s ( b i p y ) 2 ( p y ) c 1 2 + ，它即能自由扩散又不与聚乙烯吡 啶作用，但可与聚合物的毗啶基作用产生0 s 3 2 】。o s m ”氧化还原对是一些酶氧 化还原反应的有效电子媒介体。 。 1 4 2 电极修饰 直接电化学领域的重要任务是实现电极表面修饰，从而促进异相电子转移。 “促进剂”是完全非活性的( 或者成为电子媒介体) ，用来稳定电极- 蛋白质相互 作用，防止蛋白质变性。传统的金属电极如h g 和p t 等就存在这样的问题。促进 剂还可以通过氢键作用提供蛋白质及其氧化还原活性辅基与电极间的理想位置。 已有促进剂促进氧化胚原活性蛋白质直接电化学方面的综述，这类促进剂包括 氨基苷 3 3 1 、聚胺酸【3 4 】、金属阳离子 3 5 1 、脂肪族化合物和杂环有机物【3 6 】。热 解石墨的亲水性( 被氧化) 为氧化还原蛋白质表面直接吸附正电荷提供了理想 界面【3 5 ，3 7 】，常用于预修饰。导电金属氧化物用类似的方法提供了能和蛋白质 表面作用的亲水表面。碳纳米管【3 8 】是蛋白质电子传递的有效导体。生物聚合物 脱乙酰壳多糖是石墨和金属电极常见的促进剂 3 9 - 4 2 。表面活性剂 4 3 】已成功应 用于工作电极上，它参与形成稳定的具有电活性的膜。利用炕基链硫羟基可以在 9 第一章绪论 a u 电极上形成自组装单分子层( s a m s ) ，检验蛋白质直接氧化还原反应【4 4 】。 渗透膜将酶固定在电极表面，同时允许底物和产物通过 4 5 】。石墨上的羧基和蛋 白质上的氨基通过酰胺偶联作用实现蛋白质的共价结合 4 6 1 。蛋白质在特定位置 发生变构能使表面引入半胱氨酸残基，从而与a u 电极通过a u - s ( c y s ) 键实现直接 共价结合。由于蛋白质的结构、亲水性、电荷和稳定性的不同，目前还没有发现 能对所有蛋白质起作用的促进剂。 碳纳米管独特的原子结构使其表现出金属性或半导体性4 7 4 9 1 ，利用这种 独特的电子特性，可以将碳纳米管作为电极材料制成碳纳米管电极。近年来的研 究表明，在碳质吸附剂的纳米空间中，会发生不同于宏观平面上的一些物理化学 过程【5 0 。在类石墨微晶无规排列形成的分子尺度的纳米空间( 尤其是孔宽在2 n n l 以下的微孔) 中，由于相对孔壁碳原子的势能叠加效应，可形成强大的分子 场。吸附在其中的分子相互作用大幅增加，具有与体相分子完全不同的物化性质 具有不同的反应活性，可发生很多的在常规条件下不发生或很难发生的化学过 程。同时发现，碳纳米管的中空纳米空间内分子间的相互作用要大于相近尺寸的 狭缝形纳米孔( 微孔碳) 【5 1 】。因而碳纳米管在电催化和电分析化学领域中具有 广阔的应用前景。 碳纳米管在对生物活性物质的活性保持也有明显的优势，为开展蛋白质和酶 的生物电催化行为研究提供了方便。d a v i s 等【5 2 】用高分辨率t e m 研究了蛋白 和酶( z n 2 c d 5 金属球蛋白、细胞色素c 、芦乳酸酶i ) 包埋在m c n t 中的情况： 电弧法制备的碳纳米管用浓硝酸氧化开口，把一定量的纯化开口的碳管和蛋白混 合，室温下用氮气吹拂表面以助蒸发( 不搅拌) ，大部分水分蒸发后放入真空干 燥器中，用p 2 0 5 干燥。结果表明，小分子量的蛋白进入管的内腔，管对包埋的 蛋白在尺寸上有一定的选择性，可以观察到蛋白的单分子、二聚体、四聚体及低 分子量聚合物存在碳管内腔中；包埋在碳纳米管里的芦乳酸酶r 有相当量的保 持了它的催化活性，构象也没有显著性的改变；由于有管的保护，蛋白包埋在管 内比较牢固，不能通过改变p h 及离子强度的办法把蛋白清洗下来。比较了固定 在带羧基的和去羧基的碳纳米管上的酶情况，结果表明酶在带羧基的碳管上能保 持较高的活性。这是因为管表面的羧基基团可以通过氢键与酶分子的极性基团或 残基相互作用，使活性点结构大量的保持下来而去羧基的碳管表面主要是疏水 i o 第一章绪论 性的，它同酶的菲极性部分或残基强烈相互作用导致酶发生严重的结构变化以致 失活。碳管这种内在的导电性、能保持蛋白酶的活性及对蛋白分子在尺寸上的选 择性，使其在研究酶的直接电化学、生物传感器以及生物反应系统上有较大的应 用潜力。 一般认为，碳纳米管电极必须经过活化，在碳纳米管表面引入一些电活性基 团，才能有较好的电化学响应。活化的方法一般分为两类，一类是在制成电极前 对碳纳米管进行活化，这包括在气相中用空气或等离子体氧化 5 3 1 ；用酸( 主 要是浓h n 0 3 ) 氧化【5 3 5 7 。第二类是制成电极后，用电化学的方法进行活化， 即将碳纳米管电极在一定溶液中( 如磷酸盐缓冲溶液) 于一定电位范围内循环扫 描【5 8 ，5 9 ，根据所用介质的不同，可以将含氧、甚至含硫的基团【5 3 】键合到碳 管表面，一般包括羟基、羰基、羧基、酚类和醌类化合物等【5 7 ，6 0 1 。这些电活 性基团可以催化或促进其他物质的电子传递反应。 1 5 一些典型的例子 下面重点介绍成功应用到电化学中的几种酶。 1 5 1 葡萄糖氧化还原酶 在酶催化电化学中，研究最多的是葡萄糖氧化酶( g o ) 。它含f a d 活性中心 能催化d 葡萄糖氧化成葡萄糖内酯 g o “+ g l u c o s e 专g 0 钿+ g l u e o n o l a c t o n e + 2 w ( 9 a ) g o 刚+ 2 w + 0 2 峥g o + h z 0 2( 9 b ) g o r d l + q _ g o 晖+ h q( 9 c ) g o 喇十2 f c + 一g o 麒+ 2 f e( 9 d ) 式( 9 b ) 中，氧气作为电子接受体，用电化学方法能直接或间接地( 通过i 一和 h 2 0 2 反应产生1 2 ) 检测催化产物h 2 0 2 。醌是人造2 - e 接受体，用于早期的葡萄 糖生物传感器 6 1 】。后来采用阳离子f e * f f y 口电子接受体【6 2 】，避免了样品中溶入 不同量的氧气引起错误分析。 第一章绪论 酶电化学反应中，g o 体系是常见的 1 2 1 5 ，1 8 ，6 3 e s 。从研究中我们可以得 到关于物质传递、酶热力学、间接电子转移等重要机理信息。c a s s 等 6 2 】首先报 道了在g o 体系中以二茂铁为电子媒介体的研究，s a r e a n t 及其合作者报道了以 羟甲基二茂铁( 二茂铁甲醇) 为电子媒介体的g o 体系催化研究【1 8 】。在这之前 的研究中，酶在隔离状态下没有任何伏安响应。一旦加入羟甲基二茂铁后，可观 测到一对可逆对称波，并与化学计量的单电子反应一致。加入葡萄糖后，波形变 成s 状。表明这是一个稳态过程，发生了电子媒介体的多次氧化循环过程。 1 5 2 钼含氧转化酶 这一类酶的底物类型不同，但是却有相同的活性部位和官能团，都是在活性 位置由单个m o 离子与一个或两个m p t ( m o l y b d o p t e r i n ) 配体相结合h i l l e 提出 【6 6 根据与金属结合的环境的不同，将这类酶分为三类( 如图1 5 ) 。 毒出名咖恻拇 x a n t h l n ao x l d a s ef a m i l y 鼬嘧协o x | 妇铸f a m 咐 。韵s or 蜘姻釉翔m 印 x 。a 。n 。t h i n 。eo x i d ，o r e d u c t a s e s u l f i t eo x i d 溯e d u c t a s e x 。o 奄群d m m s o o m r e 蛐d u c l a 鞠s e 脚， 哟。删辨 n i t r a t er e d u c t a s e x ；s - c v s n i t r a t er o d l j c t s $ o ( n a p ) x = s e - c y sf o r m a t ed e h y d r o g e n a s e x = o - a s pn i t r a t er e d u c t a s ef n a t ) d m sd e h y d r o g e n a s e x 睾v a c a n ta r s e m t e o x j d a s e f i g u r e1 5a c t i v es i t es t m c t u r c $ o f t h et h r e em o n o n u c l e a rm o 廿i 巧m ef a m i l i e s 它们氧化还原的机理是一致的如式( 1 0 ) 所示。 x o + 2 e + 2 矿- x + h 2 0 ( 1 0 ) 重点介绍硝酸盐还原酶。与二甲亚砜还原酶类似，硝酸盐还原酶有不同的存 在形式。一种是可溶性的形式( n a p ) 【6 7 ，另一种是束膜形式( n a t ) 【6 8 7 0 。 近来已发现n a p 和n a r 这两种酶的晶体结构。这种n a r g h i 体系是硝基对苯二 酚氧化还原束膜，每个基元中都含有一些催化氧化的辅酶。每个n a r g h i 基元就 是一个束膜，其中包括两个血红素分予，能够从对苯二酚中夺取两个电子。但是 这种基元能够从酶中脱离形成一个催化基元和可溶的n a r g h 二聚体。n a r g 基元 1 2 第一章绪论 包括m o 辅基和f e s 柬，而n a r h 基元则包括一些f e s 束。b u t t 以及他的合作 者已经报告了从p a r a c o c c u s p a n a t o t r o p h u s 7 1 ，7 2 d p 得到的可溶性n a r g h 酶催化， 存在底物时可看到( n 0 3 _ n o z ) 催化还原波。低底物浓度时，催化波上产生 一个峰，这是由于底物与m o v 型键合速度比与m o “型键合速度快( h e f f r o n 等 对d m s o 还原酶提出了类似的质子化作用模型) 。不过，如果酶中有其他氧化还 原中心，也有可能由于在低电位下发生不同的氧化过程引起催化电流衰减。对 n a r g h 酶进行研究 7 3 1 发现在低、高电位下同时出现催化波的复杂行为。硝酸盐 浓度为微摩尔时，在高电位处可观察到催化峰，与p h 有关；当底物浓度为毫 摩尔时，在低电位处出现催化峰，与口h 无关。这一结论再次表明m o v 型作为有 效的l e w i s 酸比m o w 型更能够迅速牢固地键合硝酸盐。直到出现四价氧化态时 催化循环中止。不过当体系是速率极限时会出现底物键合。 相对来说，n a p 引起的关注少一点，它们和n a r 硝酸盐还原酶的活性中心( 与 m o 结合的不是天冬氨酸盐而是硫基丙氨酸) 和辅基均有不同，n a p a 基元包括 m o 活性中心和一个 4 f e - 4 s 束，而n a p b 基元有两个血红素辅基。f r a n g i o n i 等已 经报告了r s p h a e r o i d e s 【7 4 】中n a p a b 型蛋白质膜的直接循环伏安。虽然活性位 置结构和辅基有相当大的差异，但是在相当大的硝酸盐浓度范围内，可观察到理 想的s 型催化圆盘伏安峰【7 4 】。 1 5 3 过氧化物酶 该族酶是与血红素相关的，它能催化不同底物的氧化反应，同时还原h 2 0 2 或有机过氧化物生成水。不同过氧化物酶的来源不同，许多已用于电化学特别是 i - 1 2 0 2 的生物传感器中进行研究。这种过氧化物酶的催化循环是：三价血红素与 h 2 0 2 迅速发生还原反应产生2 - e 氧化离子( ) 和水( 式1 1 ( a ) ) 不同酶的活性中 心也不同：在细胞色素c 过氧化物酶( c c p ) 中，活性中心是色氨酸残基链，在 辣根过氧化物酶( h r p ) 中活性中心则是以f c 原子为中心的卟啉环不同过氧 化物酶的电子接受体也不同，但是每种过氧化物酶都符合式1 l ( a ) - ( c ) 提出的基本 机理。三价铁血红素活性中心可以发生单电子还原反应( 式( 1 l d ) ) ，催化循环 中不包括该反应。一些实验组已报道了f e ”叭氧化还原对( 一9 0 m v 坩n h e ，p h7 ) 在不同修饰工作电极上随p h 变化的直接循环伏安图 4 0 ，4 1 ，7 5 7 7 1 。 第一章绪论 f e 。h l + h 2 0 2 f e 。v o ( l + h 2 0 f e w o ( l + ) e 。_ f e o ( l ) f e v o ( l ) + e - + 2 h + 哼f c l l + h 2 0 f c m l + e _ f e h l ( 1 1 a ) ( 1 l b ) ( 1 i t ) ( 1 l d ) 酶电化学研究中，过氧化物酶引起重视的另一个原因是它们的底物( h 2 0 2 ) 是许多氧化酶的产物。对酶的反应产物h 2 0 2 进行分析测定，从而建立生物酶传 感器【7 8 s o 。这种传感器避免了由于存在干涉剂( 如抗坏血酸盐、尿素) 而产生 的电流。 、 囊耐岫妇唾捌矗如蝴哪獭e 龋靠 釉州蝻- _ 警a 睁蚋毕- _ 锵 。j； li 删黼嘲t j： ； 靠曲增 删 釉吲钠娩建嗨l 翻毫咧翳b 蛾b 吒棚随弱l i 嘲 m e t a l ；t r a mi ip r 戳t i m l l t , g o x 饼“融船铡咖嘲 f i g u r e1 6p r i n c i p l eo f c o u p l e do x i d a s e - p e r o x i d a s eb i e n z y m es e n s o r s t h es e n s i n ge = f l z y m ei nt h i s c a s ei s 舀u c o s eo x i d a s ea n dt h et r a n s d u c e ri ss o y a b e a np e r o x i d a s el i n k e dt ot h ee l e c t r o d eb y a o sc o m p l e xm e d i a t o r h e l l e r 组报道了包含葡萄糖氧化酶( g o ) 或乳酸氧化酶( l o ) 混合物的体系 【7 8 】。他们设计了一个多层电极( 如图1 6 ) ，由特殊设计的膜分开，允许底物 自由扩散到外层酶层，但是阻止g o l o 扩散。底物翻转产生的h 2 0 2 可以通过 内层膜扩散，并被s b p 还原( s b p 比其他过氧化酶具有更好的热稳定性) 。在 其他电子媒介体过氧化物酶体系中，s b p 通过o s 一修饰膜与电极相结合。 1 4 第一章绪论 1 6 应用 目前已出版了一些关于各种类型的生物传感器应用方面的 8 1 8 3 ，下面重点 讨论其中最主要的三种应用。 1 6 1 分析物检测 传统安培计检测中，酶电极主要是对生物体中小分子分析物( 底物) 进行测 定。安培计生物传感器的发展可从三代仪器的演变中看出，第一代是基于对辅助 底物( 如0 2 ) 的安培计检测。辅助底物的消耗量和与酶反应的分析物的量成正 比。含g o x 的c l a r k 氧电极通过在银阴极上发生还原反应来检测0 2 的浓度，加 入含葡萄糖的样品后，电流的变化值与葡萄糖的浓度成正比。不过，分析结果会 受到分析过程中溶解的0 2 量影响。产物h 2 0 2 作为底物的指示剂也可由安培计来 检测。第二代安培计生物传感器是引入合成的电子媒介体作为电子接受体，通过 它们再氧化反应产生的电流来检测底物的浓度。最近，出现了第三代安培计生 物传感器【8 4 1 。它不需要加入电子媒介体或辅助底物，电极和酶之间就能发生直 接电子转移。这种“无试剂”检测器制成可植入酶电极应用于活有机体中，有很 大的前景。下面介绍葡萄糖氧化酶生物传感器。 c k ) x 电极已成为世界上最常用的分析仪器，它可以对血液中的葡萄糖浓度 进行迅速测定。糖尿病患者( 特别是那些依靠胰岛素注射的) 为了避免过高或过 低的葡萄糖浓度必须不停地平衡血糖浓度，这需要随时进行快速准确的血糖分 析。酶电化学虽然不是检测溶液中葡萄糖的唯一的方法，不过却是目前最灵敏、 有效可行的方法。 现在市场上有很多葡萄糖传感器，它们采用相似的机理，都是以葡萄糖( c o x ) 或者葡萄糖脱氢酶( g d h ) 作为生物传感器的催化单元。早期( 1 9 7 0 s ，第一代) 葡萄糖传感器都是利用p t 作为阴极检测氧化产物h 2 0 2 ，但是p t 的费用很高。 1 9 8 0 年中期，出现了以二茂铁为电子媒介体的葡萄糖氧化酶催化的第一篇报道。 随后e x a x t e c h 投放市场，它是在可弃微电极里固定葡萄糖氧化酶和二茂铁。而 同期出现的其它仪器是以铁氰化物作为电子媒介体，运用的原理不同( 酶和介质 的浓度都很高) 绝大多数是在高