（微生物学专业论文）红曲色素组分分离及其功能的初步研究.pdf

红f f n 色素组分分离及j e 功能的初步研究 摘要 红曲菌( m o n a s c u ss p p ) 是我国传统的食用和药用微生物，它能分泌产生色素、 莫呐可啉类( m o n a c o l i n s ) 物质、丫氨基丁酸( 丫一a m i n o b u t y r i ca c i d ，g a b a ) 等多 种有益代谢产物，被广泛用于食品发酵剂、食品着色剂和保健食品的生产。红曲色 素作为红曲菌的重要代谢产物，在我国有上千年的应用历史，主要用于肉制品和豆 腐乳等的着色。现代研究表明，红曲色素属于复合色素，包括红色、橙色和黄色三 大类，每一类色素中又包含多种组分。近年来，关于红曲色素组分的提取分离、结 构分析和稳定性研究已经有很多报道，对红曲色素的功能研究也有一定的进展，但 是对红曲色素各个组分功能的系统研究尚未见报道。 本实验通过t l c 方法成功分离得了7 种红色色素组分，4 种黄色色素组分，2 种橙色色素组分，然后对分离得到的红色组分1 、红色组分2 、橙色组分1 、橙色组 分2 等4 个组分以及红曲色素的初提物、总红色色素、总黄色色素和总橙色色素等4 种主要色素混合物进行了抗氧化、抑菌和抗肿瘤等功能的研究。主要研究结果如下： 1 建立了红曲色素各组分的薄层色谱( t l c ) 分离方法。红曲红色色素和黄色 色素以8 0 乙醇为提取剂，红色色素以甲苯：乙酸乙酯：甲酸= 7 ：3 ：1 ( v v ) 为展开 剂，黄色色素以正己烷：乙酸乙酯：石油醚= 3 0 ：1 7 ：5 ( v v ) 为展丌剂，可以对红色 和黄色色素组分进行有效的分离。橙色色素以乙酸乙酯为提取剂，以正己烷：乙酸 乙酯：石油醚= 3 0 ：1 7 ：5 ( v v ) 为展丌剂，展丌后将带有橙色色素的硅胶刮下，重新 用乙酸乙酯提取，离心取上清浓缩后，再以甲苯：乙酸乙酯：甲酸= 7 ：3 ：2 ( v v ) 为 展开剂，能够有效分离橙色色素各组分。 在上述条件下，成功得到了7 种红色色素组分r p l i 冲7 ，4 种黄色色素组分 y p l , - , y p 4 ，2 种橙色色素组分o p l , - 4 ：) p 2 。其中，r p l 和r p 2 的含量较多，黄色色 素各组分在总色素中含量较少，因此将提取纯化得到的主要红曲组分及其混合物作 为后续实验的研究材料，它们分别是红曲色素初提物( p t ) ，总红色色素( r p ) ， 总黄色色素( y p ) ，总橙色色素( o p ) ，红色组分1 ( i 冲1 ) ，红色组分2 ( r p 2 ) ， 橙色组分1 ( o p l ) ，橙色组分2 ( o p 2 ) 。 华中农业人学2 0 0 8 届硕i ：学位论义 同时，采用h p l c 方法对r p l 、r p 2 、y p l 、y p 2 、y p 3 、y p 4 、o p l 、o p 2 的 纯度进行了分析，结果表明，当色谱条件为色谱柱k r o m a s i lc 1 8 ( 5g m ；4 6 m m 2 5 0 m m ) 、流动相为乙腈：水= 7 5 ：2 5 ( v v ) 、紫外检测波长k = 2 5 4n l t l 、进样量3 0p l 、 流速lm l m i n 、柱温3 0 时，色素各组分的h p l c 图谱均只有一个峰，表明用t l c 方法提取分离的色素组分的纯度较好。 2 研究了红曲组分及其混合物的抗氧化功能。采用o h 体系、0 2 。一体系和d p p h 体系三种抗氧化模型，系统研究了p t 、r p 、y p 、o p 、r p l 、r p 2 、o p l 、o p 2 的 抗氧化功能。结果表明，红曲红色色素组分和橙色色素组分都有很强的清除自由基 能力，尤其是r p 2 ，在4 0g g m l 的浓度下，对o h 的清除率达到3 2 ，比同浓度 的v c 约高2 0 ；对d p p h 的清除率达到6 4 ，比同浓度的v c 约高4 1 。黄色色 素组分表现出微弱的抗氧化功能。 3 研究了红曲组分及其混合物的抑茵功能。以金黄色葡萄球菌、李斯特菌、大 肠杆菌、志贺菌和沙门菌等几种食品中常见的病原菌为研究对象，系统分析了p t 、 r p 、y p 、o p 、r p l 、r p 2 、o p l 、o p 2 对其的抑菌功能。结果表明，橙色色素各组 分对革兰氏阳性菌，如盒黄色葡萄球菌、李斯特菌具有很好的抑制效果，并且在2 0 g g m l _ 严1 0 0p g m l 的浓度范围内，随着浓度的增加抑制作用增强；对革兰氏阴性菌， 如大肠杆菌、志贺菌和沙门菌有一定的抑制作用。在6 0p g m l 的浓度下，o p 2 对 李斯特菌的抑制率为3 8 4 9 ，对志贺菌的抑制率为1 5 6 6 。红色色素组分对革兰 氏阳性菌也有一定的抑制作用，但是对革兰氏阴性菌的抑制效果不好。在6 0 肛g m l 的浓度下，r p 2 对李斯特菌的抑制率为3 4 3 7 ，对志贺菌的抑制率仅为9 2 。黄 色色素没有抑制作用。 4 研究了红曲组分及其混合物的体外抗肿瘤功能。以s p 2 0 、h e p g 2 和h e l a 等3 株肿瘤细胞为研究材料，系统分析了p t 、r p 、y p 、o p 、r p l 、r p 2 、o p l 、 o p 2 对其的抗肿瘤作用。结果表明，红曲橙色色素尤其是o p 2 具有较好的抑制 s p 2 0 、h e p g 2 和h e l a 细胞的功能，在7 2h 内，在o 0 5n e d m t , - l o op g m l 的浓度 范围内，随着时间的延长和色素浓度的增加，抑制效果增强。o p 2 在1 0 0 肛g m l 的 浓度下，作用4 8h ，对h e l a 细胞的抑制率为3 6 8 4 ，7 2h 抑制率为4 4 9 6 。红色 色素对肿瘤细胞有一定的抑制作用，但是抑制率稍差于橙色色素。在1 0 0g g m l 的 红曲色素纽分分离及】e 功能的初步研究 浓度下，作用7 2h ，r p 2 对h e l a 细胞的抑制率为3 2 8 3 ，o p 2 抑制率为4 4 9 6 。 黄色色素表现出微弱的抑制效果。 关键词：红曲菌；t l c ；抗氧化；抑菌；抗肿瘤 华中农业人学2 0 0 8 届硕i j 学位论义 a b s t r a c t m o n a s c u ss p p ，ak i n do ff o o da n dm e d i c i n a lm i c r o b e ，c a np r o d u c ev a r i o u s m e t a b o l i t e s ，s u c ha sh o n g q up i g m e n t ，m o n a c o l i n s ，7 - a m i n o b u t y r i ca c i d ( g a b a ) ，w h i c h h a v e b e e nw i d e l yu s e da sf o o df e r m e n t a t i o ns t a r t e r ，f o o dc o l o r a n t ，f u n c t i o nf o o d a sa n i m p o r t a n tm e t a b o l i t eo fm o n a s c u ss p p ，h o n g q up i g m e n th a sb e e nm a i n l yu s e da sa n a t u r a lc o l o r a n ti nm e a tp r o d u c t sa n df e r m e n ts o y b e a r lf o rc e n t u r i e si nc h i n a m o d e m r e s e a r c hs h o w e dt h a t ，h o n g q up i g m e n tw a sac o m p o u n dp i g m e n ti n c l u d i n gr e d ，y e l l o w a n do r a n g ep i g m e n t ，i nw h i c hav a r i e t yo fc o m p o n e n t sw e r ei n c l u d e d i nr e c e n ty e a r s ， m a n ya c h i e v e m e n t ss u c ha se x t r a c t i o na n ds e p a r a t i o n ，s t r u c t u r ei d e n t i f i c a t i o n , s t a b i l i t yo f h o n g q up i g m e n th a v eb e e na c q u i r e d ，b u ts y s t e mr e s e a r c ho nt h ef u n c t i o n so fe v e r y c o m p o n e n tf r o mh o n g q up i g m e n th a v en o tb e e nr e p o r t e db yn o w i nt h i sp a p e r , s e v e nk i n d so fr e dp i g m e n t ，f o u rk i n d so fy e l l o wp i g m e n ta n dt w o k i n d so fo r a n g ep i g m e n tw e r eo b t a i n e db yt l c ( t h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h y ) t h e n a n t i o x i d a n t a n t i b a c t e r i a la n da n t i t u m o rf u n c t i o n so fr p1 、r p 2 、y p1 、y p 2 、y p 3 、 y p 4 、o p1 、o p 2w e r es t u d i e d t h em a i nr e s e a r c hc o n t e n t sw e r ea sf o l l o w s ： 1 t l cw a se s t a b l i s h e dt os e p a r a t et h ec o m p o n e n t so fh o n g q up i g m e n t w i t h 8 0 e t h a n o la se x t r a c t i n gs o l v e n t s ，t o l u e n e ，e t h y la c e t a t ea n df o r m i ca c i d ( 7 ：3 ：lv v ) w a s u s e da sd e v e l o p i n gs o l v e n to fr e dp i g m e n t ；w i t h8 0 e t h a n o la se x t r a c t i n gs o l v e n t s ， y e l l o wp i g m e n tw a ss e p a r a t e db yu s i n gn - h e x a n e ，e t h y l a c e t a t ea n dp e t r o l e u m e t h e r ( 3 0 ：17 ：5v v ) a sd e v e l o p i n gs o l v e n t ；w i t he t h y la c e t a t ea se x t r a c t i n gs o l v e n t s ，o r a n g e p i g m e n tw e r es e p a r a t e db yu s i n gn - h e x a n e ，e t h y la c e t a t ea n dp e t r o l e u me t h e r ( 3 0 ：17 ：5v v ) a s d e v e l o p i n gs o l v e n t ，t h e ns c r a p e dt h es i l i c ag e la l o n ew i t ho r a n g ep i g m e n t s ， r e e x t r a c t e dw i t he t h y la c e t a t e ， c e n t r i f u g e d ， c o n c e n t r a t e df r o ms u p e r n a t a n t ，o r a n g e p i g m e n tw a ss e p a r a t e da g a i nu s i n gt o l u e n e ，e t h y la c e t a t ea n df o r m i ca c i d ( 7 ：3 ：2v n i nt h e s ec o n d i t i o n s ，c o m p o n e n t so fr e d ，y e l l o wa n do r a n g ep i g m e n tc a nb es e p a r a t e d e f f e c t i v e l y s e v e nk i n d so fr e dp i g m e n t ，f o u rk i n d so fy e l l o wp i g m e n ta n dt w ok i n d so f o r a n g ep i g m e n tw e r eo b t a i n e d p t , r p , y p , o p , r p1 ，r p 2 ，o p 1a n do p 2w e r ec h o o s e n a sr e s e a r c hm a t e r i a l sf o rf u r t h e re x p e r i m e n t t h ep u r i f i c a t i o no fr p 1 ，r p 2 ，y p1 ，y p 2 ，y p 3 ，y p 4 ，o p 1a n do p 2w a sc h e c k e db y h p l c t h ec h r o m a t o g r a p h i cc o n d i t i o n sw e r ea sf o l l o w s ：c o l u m n ( c h r o m a s i lc 18 ，5 岬， 2 5 0 m m 4 6 m m ) ；m o b i l ep h a s e ：a c e t o n i t r i l ea n dw a t e r ( 7 5 ：2 5v v ) ；u vd e t e c t i o n 九2 2 5 4 红熊色素组分分离及j 功巍的初步研究 n m ；f l o wr a t e ( 1 0m l m i n ) ；c o l u m nt e m p e r a t u r e ( 3 0 v ) ；i n j e c t i o nv o l u m e ( 3 0g l ) 。i n t h i sc o n d i t i o n , o n l yo n ep e a kw a so nt h eh p l cc h r o m a t o g r a mo fe v e r yp i g m e n t c o m p o n e n t i ts h o w e dt h a tt h es e p a r a t e dc o m p o n e n t so b t a i n e db yt l c w e r ep u r i t i e d 2 a n t i o x i d a n tf u n c t i o no fp i g m e n tm i x t u r e sa n dp i g m e n tc o m p o n e n t sw a s r e s e a r c h e d 。a n t i o x i d a n tf u n c t i o no fp t 、船、y p 、o p 、r p l 、对2 、o p l 、o p 2w a s r e s e a r c h e d b y t h r e ea n t i o x i d a t i v em o d e l s ，。o ha n t i o x i d a t i v et e s t s y s t e m ，0 2 一 a n t i o x i d a t i v et e s ts y s t e ma n dd p p ha n t i o x i d a t v et e s ts y s t e m 。t h er e s u l t sr e v e a l e dt h a t r e da n do r a n g ep i g m e n tc o m p o n e n t sh a dh i g ha n t i o x i d a t i v ea c t i v i t i e si nt h et e s tm o d e l s ， a m o n gw h i c hr e dp i g m e n tn o 2 ( r p 2 ) h a dt h eh i g h e s ta n t i o x i d a t i v ea c i t v i t y r p 2a t4 0 l x g m ls c a v e n g i n gr a t e so n o ha n dd p p hw e r e3 2 a n d6 4 ，r e s p e c t i v e l y , 2 0 a n d4 1 h i g h e rt h a nt h o s eo fv ca tt h es a m ec o n c e n t r a t i o n ，r e s p e c t i v e l y y e l l o wp i g m e n t s h o w e dw e a ka n t i o x i d a n tf u n c t i o n 3 a n t i b a c t e r i a lf u n c t i o no fp i g m e n tm i x t u r e sa n dp i g m e n tc o m p o n e n t sw a ss t u d i e d t h er e s u l t si n d i c t e dt h a to r a n g ec o m p o n e n t sh a df i n ei n h i b i t o r ye f f e c to ng r a m p o s i t i v e b a c t e r i as u c ha ss t a p h y l o c o c c u sa u r e u sa n dl i s t e r i am o n o c y t o g e n e s ；t h ei n h i b i t o r ye f f e c t w a ss t r o n g e rw i t ht h ei n c r e a s i n gc o n c e n t r a t i o nf r o m2 0l ，t g m lt o10 0l x g m l o r a n g e c o m p o n e n t sh a dc e r t a i ni n h i b i t i o ne f f e c to ng r a m n e g a t i v eb a c t e r i as u c ha se s c h e r i c h i a c o l i , s h i g e l l as p p a n ds a l m o n e l l as p p a t6 0r t g m l ，i n h i b i t i o nr a t eo fo p 2 o nl i s t e r i a m o n o c y t o g e n e sw a s3 8 4 9 ，o ns h i g e l l as p p w a s15 6 6 r e dp i g m e n tc o m p o n e n t s a l s oh a dc e r t a i ni n h i b i t o r ye f f e c to ng r a m p o s i t i v eb a c t e r i a ，b u tn oi n h i b i t o r ye f f e c to n g r a m - n e g a t i v eb a c t e r i a a t6 0g g m l ，i n h i b i t i o nr a t eo f r p 2o nl i s t e r i am o n o c y t o g e n e s w a s4 3 7 ，o ns k i g e l l as p p w a s9 。2 y e l l o wp i g m e n ts h o w e dn oi n h i b i t o r ye f f e c t 。 4 a n t i t u m o rf u n c t i o no fp i g m e n tm i x t u r e sa n dp i g m e n tc o m p o n e n t sw a s r e s e a r c h e d 。t h er e s u l t sr e v e a l e dt h a tt h eo r a n g ec o m p o n e n t se s p e c i a l l yo p 2h a df i n e i n h i b i t o r ye f f e c to ns p 2 0 ，h e p g 2a n dh e l ac e l l ，t h ee f f e c tw a se n h a n c e dw i t ht h e i n c r e a s i n gc o n c e n t r a t i o na n dt i m ei n7 2h ，a n di nac o n c e n t r a t i o nr a n g eo fo 0 5 t g m l 一 10 0p g m l a t4 8h ，10 0i x g m l ，i n h i b i t i o nr a t eo fo p 2o nh e l ac e l lw a s3 6 8 4 ，a t7 2h w a s 甜9 6 。r e dp i g m e n tc o m p o n e n t sa l s oh a dc e r t a i ni n h i b i t o r ye f f e c to nt u m o rc e l l s ， b u ti n h i b i t i o nr a t ew a sl o w e rt h a no r a n g ec o m p o n e n t s a t10 0i t g m l ，7 2h ，i n h i b i t i o n v 华中农业人学2 0 0 8 届硕i ：学位论义 r a t eo fr p 2o nh e l ac e l lw a s3 2 8 3 ，i n h i b i t i o nr a t eo fo p 2w a s4 4 9 6 y e l l o w p i g m e n t s h o w e dw e a ki n h i b i t o r ye f f e c t k e yw o r d s ：m o n a s c u sr u b e r ；t l c ；a n t i o x i d a n t ；a n t i b a c t e r i a l ；a n t i t u m o r v i 红曲色素组分分离及j c 功能的初步研究 缩略语表 v l i 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 是否保密否 如需保密，解密时间年月日 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名：屈悯刁 时间：圳年月7 日 学位论文使用授权书 本人完全了解“华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定”，即学生必须按 照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电 子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇 编学位论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论 文的全部或部分内容。 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。 学位论文作者鲐屈煽锄始制 签名日期： 瑚年6 月i 日 签名日期：卫略年f 月 7 日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 红f h l 也索组分分离殿j e 功能的初步研究 1 食用色素概述 第一章文献综述 食用色素是主要用于食品着色及色彩改善的一类食品添加剂。它能使食品从白 色光中吸收一部分可见光，通过反射或透色丽呈现颜色，从磊促进入们的食欲，提 升食品的商用价值( 钟秋等，2 0 0 8 ) 。 食用色素按来源分为合成色素和天然色素。合成色素即人工合成的色素，主要 有胭脂红、日落黄、柠檬黄和靛蓝等( 锰静，2 0 0 4 ) 。合成色素一般色泽鲜艳，着 色力强，色调多样，性质较稳定，曾一度广泛应用。僵隧着合成色素安全性试验技 术的发展，发现有些合成色素有致癌、致畸变和致突变等弊端，因而许可使用的合 成色素品种有所减少( 张国文，2 0 0 4 ) 。 天然色素主要是从植物、动物和微生物中提取。从植物中提取的天然色素有甜 菜红、姜黄素、红花黄素、叶黄素、叶绿素铜钠、辣椒红色素、高粱红色素和玉米 黄色素等。由微生物产生的天然色素主要有红曲色素和类胡萝i - 素( 如番茄红素、 一胡萝 、素) 等，分别融红蓝菌( m o n a s c u ss p p ) 和红酵母( r h o d o t o r u l ag l u t i n i s ) 生产( 吕帮玉，2 0 0 7 ) 。常见天然色素来源及化学成分见表1 1 ( 钟秋，2 0 0 8 ) 。 天然色素与人工合成色素楣比有无毒、安全性高、色泽自然等优点，有些天然 色素还具有很高的营养价值和药理功能。例如，类胡萝卜素和多酚素类色素物质， 除了着色外，还具有抗氧化、抗突变、抑制肿瘤细胞生长、调节人体脂肪代谢和预 防心血管疾病等作用( 魏跃胜，2 0 0 7 ) 。因此，人们越来越倾向于食用天然色素， 以减少毒副作用或增加产品的天然特色。天然食用色素的研究和开发r 益受到重 视。 华中农业人学2 0 0 8 届硕i ：学位论文 表1 1 常见天然色素来源及化学成分 t a b l e1 1o r i g i na n dc h e m i c a lc o m p o s i t i o no fc o m m o nn a t u r a lp i g m e n t s 2 红f l 色素组分分离及其功能的初步珂究 2 红曲色素 红曲色素是由红曲菌( m o n a s c u ss p p ) 产生的一种色素，色泽自然，安全性高， 是一种具有悠久应用历史的天然色素( c h i ua n dp o o n ，1 9 9 3 ) ，主要应用于红酒、 肉类和豆腐乳等的着色( 章群义，2 0 0 3 ；t e n g ，2 0 0 1 ；傅金泉，2 0 0 1 ) 。近年来， 人们对红曲色素的性质、结构、分离提取方法、生产应用以及生理功能等方面的研 究同趋深入( 陈义光和彭德姣，2 0 0 0 ；b r o d e ra n ds h e p h e r d ，1 9 8 0 ) ，取得了一系 列的成绩。 2 1 红曲色素的理化性质 红曲色素包括水溶性色素和脂溶性色素。脂溶性色素可溶于乙醚、氯仿、乙醇、 醋酸和f 己烷等溶剂。水溶性色素的溶解度与水溶液的p h 有关，在中性或碱性条 件下极易溶解，而在p h 4 0 以下的酸性范围内或含5 以上盐溶液中，其溶解度呈 减弱倾向( 李严巍等，1 9 9 6 ) 。与其他天然色素相比，红曲色素对p h 较稳定，色 调不像其他天然色素那样易随p h 的改变而发生显著变化，它的乙醇溶液在p h 为 1 1 0 时仍保持稳定的红色( 张景强，2 0 0 1 ) 。 红曲色素的热稳定性很好，在1 2 0 加热1 5h ，色素的保存率在8 4 以上，在 1 0 0 加热3h 可达到同样的保存率。温度每降低2 0 ，耐热时问可延长一倍( 谢 珍珍和李建英，1 9 9 4 ) 。 红曲色素对r 光敏感性较差，易于褪色。光照时间越长，褪色程度越大。在室 内自然光照射下，样品放置8 0d ，色度损失3 0 左右，而在夏天白天直射光下放置 5h 就损失5 0 色度( 吕心泉等，1 9 9 5 ) 。 红曲色素几乎不受食品中常见金属离子的影响，在c a 2 + 、m 9 2 + 、c u 2 + 的存在 下，其色素的残存率均大于9 7 ( 张景强，2 0 0 1 ) 。 红曲色素几乎不受氧化剂和还原剂的影响。如在0 1 的过氧化氢、抗坏血酸 和亚硫酸钠等物质的存在下，色素的残存率均在9 5 以上( 颜延宁，2 0 0 7 ) 。 2 2 红曲色素的组分及其结构 红曲色素是一类聚酮类物质，属于复合色素，主要包括红橙黄三大类，各大类 又分为很多组分。自1 9 3 2 年n i s h i k a w a 首次从紫红曲菌培养物中分离出黄色和红 华中农业人学2 0 0 8 届硕i ：学位论文 色两种色素晶体以来( 雷帮星等，2 0 0 4 ) ，采用元素定性、熔点测定、光谱分析和 核磁共振谱等分析方法，目前已经确知结构的红曲色素组分主要有1 6 种( h a s s n a e t a 1 ，2 0 0 0 ；t e n ga n df e l d h e i m ，19 9 8 ；k y o k oe ta 1 ，19 9 7 ；j f i z l o v f ia n dm a r t i n k o v f i ， 1 9 9 6 ；b l a n ce ta 1 ，1 9 9 4 ；t u n r e r ，1 9 7 1 ) ，其分子结构及分子量如表1 2 所示。 表1 2 已知红曲色素组分的结构式及分子量 t a b l e1 2s t r u c t u r a lf o r m u l aa n dm o l e c u l a rw e i g h t o fk n o w nc o m p o n e n t sf r o mh o n g q up i g m e n t 4 红曲色索纰分分离及j e 功能的初步研究 o n 戊二酰皋红f f l l 红胺 红 c 2 8 h a 3 0 8 n 5l l n g l u t a r y l m o n a s c o r u b r a m i n e n 虢糖幕红斑黻 n - g l u c o s y i l l j b r o p u n c t a 红 c 2 7 h 3 3 0 9 n 515 m i n e n - 麓糖装红稳红黻 勉 c 勰h 3 7 q n 5 4 3 n - g l u c o s y i m o n a s c o r u b r a m i n e c h 3 来禽名缝分i 经 c 2 6 h 3 1 n0 6 4 5 3 朱命名组分i i红 c 2 4 h 2 7 n0 6 4 2 5 5 华中农业人学2 0 0 8 屙硕i ：学位论文 o o h n 办n h 2 h n a n h 2 未命名组分i i i红 c 2 7 h 3 4 n 4 0 6 510 朱命名纽分 红 c 2 0 h 3 8 n 4 0 6 5 3 8 红曲警 黄 c 2 l h 2 6 0 5 3 5 8 m o n a s c l n 红f f h 黄素 黄 c 2 3 h 3 0 0 s 3 8 6贝j 5 0 a n k a f l a v i n y e l l o wl i 黄 c 2 3 h 3 0 0 5 3 8 6 6 红i f f l 色素纽分分离及j e 功能的初步研究 2 3 红曲色素组分的分离纯化 红曲色素组分分离纯化方法主要有薄层层析法、柱层析法和高效液相色谱法等。 2 3 1 薄层层析法 薄层层析法( t l c ) 是目前红曲色素组分分离的一种常用方法。李严巍等( 1 9 9 6 ) 用薄层层析的方法检测食品中的红曲色素，以正己烷：乙酸乙酯：甲醇= 5 ：3 ：2 ( v v ) 为展丌剂，展开后在荧光灯下观察有4 个斑点，r f 值分别为0 8 6 、0 7 1 、o 5 4 和0 3 8 ； 以氯仿：甲醇= 8 ：3 ( v v ) 为展丌剂，展丌后在荧光灯下观察有3 个斑点，r f 值分别 为o 8 6 、0 6 9 和o 5 7 。 甘纯玑等( 1 9 8 9 ) 用丙酮提取色曲，采用硅胶g f 2 5 4 为固定相，以乙醚：苯： 乙醇：水= 2 0 ：2 2 ：4 0 ：1 5 ( v v ) 为展开剂，可以从红曲色素中分离出7 个斑点，其r f 7 华中农业人学2 0 0 8 俑硕i ：学位论文 值分别为0 8 6 4 、o 。8 3 6 、0 7 3 6 、0 6 5 4 、0 6 0 0 、0 5 0 0 和0 4 0 0 。其中1 个为黄色斑 点，1 个为具有荧光性质的无色斑点和5 个红色斑点。 薄层层析法不需要特殊设备，操作比较简单，分离效栗较好，展开速率较快。 不过薄层层析法对制板的要求很高，所制备的薄层板若不够均匀或有气孔，将会影 响展开效果，从而影响最终结果。 2 3 2 柱层析法 柱层析法可用于红曲色素的初步分离。郭东川等( 1 9 9 3 ) 以红色红曲菌a s 3 4 6 1 7 为菌种进行液体培养，采用氯仿甲醇萃取蓊丝体，对萃取液减压浓缩，经过两次硅 胶柱层析。第一次采用硅胶h f 2 5 4 ，用氯仿甲醇液进行梯度沈脱，收集到三条主要 色素带。洗脱先后顺序为，第一条带为黄色带，第二、第三条带为红色带。将第三 条红色区带色素溶液合并，减压浓缩，进行第二次柱层析，采用硅胶h 装柱，样品 上柱后用苯异丙醇溶液加压沈脱，分离得到两种红色色素。用h p l c 检测色素纯度， 检测结果显示两种色素均只有一个峰，表明均为纯的色素样品。经元素组成分析、 核磁共振谱、快离子轰击、质谱和高分辨质谱分析确定，分离出来的两个红色色素 为新发现的红曲菌色素，它们可能的分子式为c 2 5 h 3 1 0 5 n 和c 2 3 h 2 7 0 5 n 。 连喜军等( 2 0 0 3 ) 根据红曲色素中各成分分子大小的不同，选用大孔吸附树脂 法分离红曲色素各组分。根据其所带电荷的不同，用离子交换树脂进行分离，从而 除去蛋白质、氨基酸等大分子物质，并使红曲色素中红色色素和黄色色素分开。分 别用阳离子、阴离子交换树脂和大孔吸附树脂吸附红曲菌发酵液，然后用9 5 乙醇 沈脱。结果表明，弱碱性阴离子交换树脂d 3 8 0 对红曲菌发酵液中红曲红色色素的 吸附能力最强，但难以用乙醇沈脱；大孔吸附树脂的平均吸附量为3 5u 据，但不能 将色素液中的红色色素和黄色色素分开；弱碱性阴离子交换树脂d 3 0 1 r ，可用于分 离红曲黄色色素；弱酸憔阳离子交换树脂1 1 0h ，对发酵液中红曲红色色素的吸附 量为2 1 6u g ，洗脱量为1 3 0u g ，沈脱率为6 5 ，是供试树脂中分离红曲红色色 素效果最佳的树脂。 2 3 3 高效液相色谱法 高效液相色谱法( h p l c ) 可分离得到较纯的红曲色素组分。钟立人等( 2 0 0 0 ) 用不同溶剂提取红越米，耀h p l c 检测所提取的组分，采用g - b o n d p a r kp h e n y l 和 红曲色素纽分分离及】e 功能的初步研究 p b o n d p a r kc 1 8 柱( 1 0 岬，3 0 0m m x 3 9i l n l ) ；流动相：a 液：5 0 甲醇水溶液， b 液：8 0 甲醇水溶液；梯度沈脱程序：a 液5m i n ，从5m i n 至3 0m i n 由1 0 0 a 线性变至1 0 0 b ；检测波长3 6 0n n l 。结果显示，p h e m y l 柱对共轭双键有差别的物 质分离效果较好，但仅r 取代基不同时，分离效果不是很好。c 1 8 柱对r 基不同的 异构体分离度较好。由图谱还可以看出，水溶性红曲组分在1 0m i n 之前出峰，非水 溶性红曲组分均在1 0m i n 之后出峰。乙醇提取液含有已知的6 种色素，正庚烷萃取 液，石油醚萃取液，苯萃取液只含红曲素，黄红曲素，红斑红曲素和红曲玉红素。 张慧娟等( 2 0 0 6 ) 利用薄层层析的方法从红曲色素中分离精制出了多种色素组 分，并重点对红斑红曲素的h p l c 定性定量检测方法进行了研究。分别从色谱柱、 沈脱方式、梯度沈脱时流动相中甲醇比例和流速等四个方面研究了h p l c 的条件。 结果表明，采用高效液相色谱法，在红斑红曲素最大吸收波长( 4 6 5n m ) 处可以灵 敏快速的对红斑红曲素进行定性定量检测。其最佳h p l c 条件是：色谱柱z o r b a x e c l i p s ex d b c 1 8 ( 5l x m ，2 5 0m m 4 6i t i n i ) ，洗脱条件为以7 0 甲醇平衡5m i n ， 3 0m i n 梯度变化至9 0 甲醇，流速为1m l m i n ，检测波长为4 6 5n l t l 。 2 4 红曲色素的生产及应用 红曲色素主要通过固态发酵和液态发酵两种方式进行生产。在固体发酵中，首 先生产红曲米，然后再从红曲米中提取色素，有时红曲米也可以作为色素直接使用。 红曲米、红曲米中色素的提取和液态发酵生产红曲色素的工艺流程见图1 1 图1 3 ( 连喜军，2 0 0 4 ；宫慧慧等，2 0 0 2 ) 。 保藏种斜面活化一级曲种浸泡_ 磨浆二级曲种 上 人米浸泡_ 沥干_ 蒸熟_ 凉饭_ 接种 上 成品+ 一包装+ 一分级+ 一烘干+ 一发酵 图1 1 红曲米的生产工艺流程 f i g 1 1t e c h n o l o g i c a lp r o c e s so fr e dr i c e 9 华中农业人学2 0 0 8 屈硕i ：学位论文 红曲米浸泡( 加热至u l o o 。c )过滤滤液1 l 混合分离 滤渣滤液2 一i 粉状红曲色素卜干燥卜浓缩红曲色素 一 图1 2 红曲米中红曲色素的提取工艺( 固态发酵法) f i g 1 2t e c h n o l o g i c a lp r o c e s s o fh o n g q up i g m e n tf r o mr e dr i c e ( s o l i d - s t a t ef e r m e n t a t i o n ) 保藏种子 斜面活化 摇瓶种子 入术辅科 人米辅料 上上 配料 配料 上上 种子罐 发酵罐 上上 接种_种子培养_ 发酵_ 发酵液 l 无菌空气 副产品 耷 粉碎 干燥 十 滤渣 压滤 成品卜包装卜干燥卜分离卜沉淀卜滤液 图1 3 液态发酵法生产红曲色素工艺流程 f i g 1 3t e c h n o l o g i c a lp r o c e s so fh o n g q up i g m e n tb ys u b m e r g e d s t a t ef e r m e n t a t i o n 自古以来，我国就用红曲色素着色各种食品。我国食品添加剂食用卫生标准规 定，红曲色素可在各种肉制品、水产品、配制酒、冰棍、饼干、果冻、膨化食品、 调味类罐头和奶制品等食品中，按生产需要适量使用( 温辉梁等，2 0 0 2 ) 。 红曲色素具有良好的着色性能和较强的抑菌作用，现已广泛的应用于各种肉制 品中。王柏琴等( 1 9 9 5 ) 研究了红曲色素在发酵香肠中的应用。结果显示，以红曲 色素为着色剂制作的发酵香肠，色泽红润均匀，口感细腻，风味独特，耐同光性高 于亚硝酸盐。 豆腐乳是我国的传统发酵食品，被欧美各国称为“中国乳酪”。在腐乳中添加 红曲或红曲色素，不仅提供了色素和各种酶类，使产品表面形成诱人食欲的红色， i o 红i n 也索组分分离殿j 功能的衲步研究 内部形成多种香气和香味成分( 沈士秀，2 0 0 1 ) ，而且具有群血压、降胆圈醇和降 血糖的功能( 付秀荣等，1 9 9 8 ) 。 福建红曲老醋是我困四大名醋之一，选用濡米、芝麻和红蓝为原料，将濡米蒸 熟，拌入米量2 5 的古用红曲，经液体发酵酿制而成。产品色泽棕黑、酸而不涩、 香中带甜、风味独特，畅销3 0 多个国家( 沈士秀，2 0 0 1 ) 。 2 。5 红曲色素的生物合成途径 红蓝色素生物合成途径为1 分子乙酰c o a 和3 分子丙二酰c o a 在聚酮体合酶 ( p o