（微生物学专业论文）喜树内生真菌的分离及其代谢产物10羟基喜树碱的研究.pdf

卜海师范大学硕士学位论文 中文摘要 论文题目：喜树内生真菌的分离及其代谢产物l o 一羟基喜树碱的研究 学科专业：微生物学 学位中请人：闵长莉 指导教师：袁萍 中文摘要 本文以我国特有药用植物喜树( c a m p t o t h e c aa c u m i n a t ed e c n e ) 为实验材料， 对喜树内生真菌的组织分布及分离方法进行研究。实验结果表明，材料的表面消 毒以7 5 乙醇和o 1 升汞结合的方法较好。对喜树的根部和茎部的升汞消毒时 间以4 - - - , 5 m i n 为宜，喜树叶子的升汞消毒时间应控制在2 m i n 左右。在所试条件 下共计分离得到3 8 株内生真菌，主要分布在树叶( 3 9 3 ) 和皮部( 3 7 1 ) ， 根部( 1 5 9 ) 和种子( 7 7 ) 中的内生真菌数目较少，在木质部未分离到内生 真菌。 本文对1 0 羟基喜树碱的薄层层析t l c 条件及高效液相色谱h p l c 检测条件 进行了探讨，确定了适合1 0 羟基喜树碱的展开剂为氯仿甲醇( 体积比9 1 ) ；测 定1o 羟基喜树碱的h p l c 条件为：色谱柱：p h e n o m e n e xcl8 柱( 2 5 0 m m x4 6 m m ， 5 1 a m ) ；流动相为乙腈水( 2 0 ：8 0 ) ；柱温：3 0 。c ；检测波长：2 6 6 n m ；流速：o 8 m l m i n 。 2 株内生真菌a 5 、a 9 的发酵产物中检出l o 羟基喜树碱。 利用传统分类学方法和i t s 序列的测定以及系统发育分析对a 5 、a 9 进行分 类鉴定，鉴定结果表明a 5 为b o t r y o s p h a e r i ab e r e n g e r i a n a ；a 9 为d i a p o r t h e p h a s e o l o r u m 。 对菌株a 9 的发酵条件和培养基组成进行了初步优化，优化培养基组成为： 2 葡萄糖、2 6 黄豆饼粉、o 3 磷酸二氢钾、0 3 的七水硫酸镁。最佳摇瓶培 养条件为：培养基起始p h 6 0 ，摇床转速2 2 0 r m i n ，培养温度2 8 c ，培养6 天。 在上述条件下，1 0 羟基喜树碱的产量为8 0 磺l ，与出发菌株相比产量约提高了 2 3 。 关键词：喜树；内生真菌；分离：鉴定；1 0 羟基喜树碱；发酵；培养基 论文类型：b 应用基础 a b s t r a c t i n t h i sp a p e qc a m p t o t h e c aa c u m i n a t ed e c n e ，ac h i n e s ee n d e m i cm e d i c i n a l p l a n t ，w a ss e l e c t e da sm a t e r i a l t h et i s s u e sd i s t r i b u t i o no fe n d o p h y t i c f u n g i i n c a c u m i n a t aa n di s o l a t i o nm e t h o dw e r ep r e l i m i n a r ys t u d i e d t h er e s u l ti n d i c a t e d t h a t t h es u p e r f i c i a ld i s i n f e c t i o nf o re n d o p h y t i cf u n g ii s o l a t i o ni sb e t t e rb y7 5 e t h a n o l c o m b i n e dw i t ho 1 h g c l 2m e t h o d a n dt h eh g c l 2d i s i n f e c t i o nt i m ei s4 - - - 5 m i nt o c a c u m i n a t sr o o ta n ds t e m f o rc a c u m i n a t al e a f sh g c l 2d i s i n f e c t i o nt i m es h o u l db e c o n t r o l l e da b o u t2 m i n u n d e rt h i s s u p e r f i c i a ld i s i n f e c t i o nc o n d i t i o n t o t a l l y3 8 e n d o p h y t i cf u n g ih a sb e e ni s o l a t e d m a i n l yd i s t r i b u t e si nt h el e a f ( 3 9 3 ) a n dt h eb a r k ( 3 7 1 ) ，t h en u m b e ro f e n d o p h y t i cf u n g if r o mr o o t ( 1 5 9 ) a n ds e e d ( 7 7 ) t ob e f e w , h a sn o tb e e ni s o l a t e df r o mt h ex y l e m t l cc o n d i t i o n sa n dh p l cm e t h o d sw e r ed i s c u s s e di nt h i sp a p e r w ei d e n t i f i e d t h a ts t a r ta g e n ts y s t e mw a sc h l o r o f o r m m e t h a n o l ( v o l u m er a t i o9 ：1 ) ；w ea l s og o ta p e r f e c th p l cm e t h o d ：t h es a m p l ew a sa n a l y z e do nap h e n o m e n e xg e m i n ic18 c o l u m n ( 2 5 0 m m 7 6 0 m m ，5 介) ，w i t hm o b i l ep h a s eo fh 2 0a n dm e t h a n o l ( 8 0 ：2 0 ) a t f l o wr a t e0 8 m l 横i n a n dd e t e c t i o na t w a v e l e n g t h o f2 6 6 n m t h i nl a y e r c h r o m a t o g r a p h y ( t l c ) m e t h o da n dt h eh i g h l ye f f e c t i v el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) w e r ee m p l o y e dt od e t e c tm e t a b o l i t e so f a 5a n da 9 t h er e s u l t si n d i c a t e dt h em y c e l i u m o f t h i s2s t r a i n sm a yi n c l u d e10 - h y d r o x y c a m p t o t h e c i n eo rs i m i l a r c o m p o u n d s b yu s i n gt r a d i t i o n a lt a x o n o m i cm e t h o d s ，i t ss e q u e n c i n ga n dp h y i o g e n e t i c a n a l y s i s ，t h ee n d o p h y t i cf u n g u sa 5w a si d e n t i f i e da sb o t r y o s p h a e r i ab e r e n g e r i a n a a n dt h ee n d o p h y t i cf u n g u sa 9w a si d e n t i f i e da sd i a p o r t h e p h a s e o l o r u m t e s to nc u l t u r em e d i aa n dc u l t u r a lc o n d i t i o n sf o ra 9 ，s h o w e dt h a tc a r b o ns o u r c e a n dn i t r o g e ns o u r c ep r e s e n t e dt h em o s ts i g n i f i c a n te f f e c to nt h e p r o d u c t i o no f b i o a c t i v i t y t h eo p t i m i z e dm e d i u mw a sc o m p o s e do fg l u c o s e2 s o y a b e a nc a k e 2 6 ，p o t a s s i u md i h y d r o g e np h o s p h a t eo 3 ，e p s o ms a l t0 3 t h es u i t a b l es h a k i n g c u l t u r ec o n d i t i o n sa r ea sf o l l o w s ：i n i t i a l p ho fm e d i u m6 0 ，s h a k i n gf r e q u e n c y 2 2 0 r m i n ，i n c u b a t i o nt e m p e r a t u r e2 8 。c ，i n c u b a t i o nt i m e6d a y s u n d e rt h i sc o n d i t i o n ， i t sc o n t e n ti s8 0 磺l c o m p a r e dw i t ht h eo r i g i n a ls t r a i n ，i t sp r o d u c t i o ni n c r e a s e d a b o u t2 3 1 i 卜海师范人学硕十学位论义英文摘要 k e yw o r d s ：c a m p t o t h e c aa c u m i n a t ed e c n e ；e n d o p h y t i cf u n g i ；i s o l a t i o n ； i d e n t i f i c a t i o n ；10 - h y d r o x y c a m p t o t h e c i n ；f e r m e n t a t i o n ；m e d i u m 1 1 1 论文独创性声明卜海帅范人学硕十学位论文 论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除 了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或机构已经发表或撰写过的研究 成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中做了明确的声明并表 示了谢意。 作者签纠习龋日期：2 。9 j 弘s 论文使用授权声明 本人完全了解上海师范入学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部 分内容，可以采用影印、缩印或其它手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此 规定。 作者签名：i 榭l 导师签名 吼二p 上海帅范人7 硕十。位论文 第。黾文献综述 第一章文献综述弟一早义陬练途 月l j吾 近年来，越来越多的人面临着由癌症、耐药菌、寄牛虫病以及真菌引起的各 种健康问题，寻找更新更有效的治疗药物来解决这些问题已迫在眉睫。植物药物 以其低毒性和高效性愈来愈引起人们的注意，据统计，约2 5 5 0 的现有药物 来源于植物川，植物成为我们寻找对付许多新兴疾病及难治之症的药物而不断进 行挖掘的宝库。但是植物的生长周期较长，培养条件受到地理环境和生态条件等 因素的影响。1 9 7 1 年美国蒙大拿州立大学的s t r o b e l d 、组在短叶红豆杉内生真菌 ( t a x o m y c e s a n d r e a n a e ) 中首次发现抗肿瘤药物紫杉醇并阐明其结构弘j ，植物来 源的内生菌药物重新被引起重视。 植物内生菌种类多，分布广，易变异以及微生物的次级代谢产物的多样性和 新颖性，作为一个多样性十分丰富的生物类群，内生菌产生的丰富多样的次级代 谢产物也具有多种生物活性。因此，在数目繁多的植物内生菌中发现新的有价值 的活性化合物的机率是很大的。随着研究领域的不断拓宽和研究方法的不断深 入，内生菌研究者们已不满足于最初的分离培养、生态分布等研究而转向与人类 生活息息相关的牛物活性成分的研究，期望能找到服务于人类健康的新药资源。 目前内生菌的研究主要集中在抗癌药物、抑菌剂、杀虫剂、植物激素、抗氧化剂 等有潜在应用价值的代谢产物。 1 植物内生真菌及其活性代谢产物的研究进展 早在1 0 0 多年前人们就己发现在健康植物组织的内部也有微生物存在，这类 微生物后来在文献中被称为植物内生菌，但关于植物内生菌的定义较为混乱，仍 有很多争论和分歧【j j 。1 8 3 3 年，人们发现在小麦叶片中可长出一种性质不明的锈 状物，将它形象地称为“o u t g r o w s ”。到了1 8 6 6 年，b a r y 首先提出了植物内生菌 ( e n d o p h y t e ) 一词”l ，将其定义为生活在植物组织内的微生物，用以区分那些生 活在植物表面的表生菌，按此定义植物的致病菌、菌根菌也归属于内生菌的概念 范畴。后来c l a y ( 1 9 8 8 ) 将内生菌定义为在植物内完成其生活史的部分或全部， 但又不引起任何病症的微生物，包括细菌和真菌，突出内生菌与植物的互惠夕芝生 关系p j ，冈此这个内生菌概念的范畴不包括植物致病菌和菌根菌。目前，较常用 的宽泛的内生荫概念是1 1 1 s t o n ej k 等提出的，是指那些在其生活史的一定阶段或 全部阶段生活于健康植物的各种纽织和器官内部的真菌或细菌，被感染的宿主植 物( 至少暂时) 不表现出外在病症，可通过组织学方法或从严格表面消毒的植物 第一争义献综述卜海师范人学硕十学位论文 组织中分离或从植物组织内直接扩增出微生物d n a 的方法来注明其内生i o j 。也就 是说我们可以把植物内生菌理解为生活于植物组织内的正常菌群，不仅包括互惠 共利的内共生微生物，也包括潜伏在宿主植物体内的病原菌。内生菌是一个生态 学概念，而非分类学单位，它泛指一切生活在植物体内的腐生、寄生和共生真菌 及细菌等微生物。植物内生菌的涵义已延伸至植物微生念学、植物病理学和生物 防治等领域。 1 8 9 8 年v o g l 从黑麦草l o i u mt e m u l e n t u m 的种子内分离出来第一株内生真 菌，至今已有一百多年的历史vj 。上个世纪八十年代初期，大多数研究内生真菌 的工作集中到有重要经济价值的植物。从八十年该后期开始，人们开始研究内生 真菌对植物影响的生理生化机制和内生真菌代谢活性物质的开发应用。1 9 9 3 年， 美国科学家a s t i e r l e 从短叶红豆杉的韧皮部分分离到。株产紫杉醇的内生真菌 安德氏紫杉霉t a x o m y c e sa n d r e a n a e t 5 l , 从此掀起了人们对植物内生真菌及其活性 物质开发的热潮。从植物内生真菌中筛选获得的各种生理活性物质产生菌陆续见 有报道。近年来，分子生物学和基因工程技术也心用剑内生真菌分类和进化的研 究中。 1 1 内生真菌及其代谢产物的生物多样性 1 9 9 1 年h a w k s w o r t h 估计真菌物种数目为l5 0 万。菌物学家在随后的十几年 时间，均提出充分的证据证明这个数字是十分保守的，按照最新版的真菌词典， 已被描述的真菌数目为7 4 万。这不足总数1 的真菌大多数是寄生或腐生于高 等植物上的。目前已研究过的数百种植物中( 包括苔藓蕨类) ，还未发现没有内 生真菌的植物，因此可以说内生真菌在植物体内是普遍存在的。保守估计每种植 物上将会发现6 个新的微生物种，现有植物种类2 7 万。则内生真菌的数目将会 是1 6 2 万p j 。可见内生真菌将是微生物物种的主要角色。 现今发现的内生真菌主要属于- 了囊菌( a s c o m y c e t e s ) 和半知菌 ( d e u t e r o m y c e t e s ) ，少数为担子菌( b a s i d i o m y c e t e s ) 。包括核菌纲( p y r e n o m y c e t e s ) ， 盘菌纲( d i s c o m y c e t e s ) 和腔菌纲( l o c u l o a s c o m y c e t e s ) 。最近报道从植物体内分 离到了接合菌( z y g o m y c e t e s 儿j 。 以目前广泛研究的紫杉醇产生菌及内生拟鼎多毛孢为例。产紫杉醇的内生菌 不仅仅局限二来自短叶红豆杉一种植物，也不单单是拟盛多毛孢一属的内生真菌 能够产生紫杉醇，从其它种植物分离的某些种属的内， i 真菌也能产生紫杉醇。表 1 一l 中列出现已发表的这些内牛真菌及其宿主植物。从表中可以看出产紫杉醇的 真菌种类比植物种类要多。内生拟盘多毛孢是植物( 尤其是木本植物) 内生真菌 2 上海! j i l j 范人。7 ：硕十。位沦史 第章文献综述 的主要类群，已鉴定的内生拟盘多毛孢有2 3 种【i 。该属真菌的定植植物差异很 大，在红树、椰子、西藏红豆杉、茶梅等木本植物中均有发现。一种拟盘多毛孢 可内生于多种植物体内，一种植物也可有多种拟盘多毛孢内生。拟盘多毛孢可产 生多种次生代谢产物，包括抗癌物质( 紫杉醇和粗榧酸) 和抗菌物质( 环己烷类 物质、粗榧酸和p e s t a l o s i d e ) 。 表1 1 现今发现的紫杉醇产生茵及其宿主植物 宿主植物h o s tp l a n t内生真菌t a x o l - p r o d u c i n g 短叶红豆杉t a x u sb r e v i f o l i a 短叶红豆杉 落羽杉7 搬d 旃“md i s t i c h u m 概树t o r r e y ag r a n d i f o l i a w o l e m i an o b i l i s 喜马拉雅红豆杉t a x u sw a l h c h i a n a 喜马托雅红豆杉 喜马拉雅红豆杉 喜马拉雅红豆杉 南方红亚杉t a x u sm a i r e i 南方红甚杉 云南红豆杉t a x u sy a n n a n e n s i s 中国红豆杉t a x u sc h i n e s i s 东北红豆杉t a x u sc u s p i d a r t a 安德氏紫杉霉t a x o m y c e sa n d r e a n a e 拟盘孢属p e s t a l o t i o p s i ss p p 拟盘多毛孢p e s t a l o t i o p s i sm i c r o s p o r a 黑葱花霉属p e r i c o n i as p p e s t a l o t i o p s i sg u e p i n i i 茎点霉属p h o m as p 拟盘多毛孢 小荚孢腔菌s p o r o r m i am i n i m a 聚端孢属t r i c h o t h e c i u ms p s e i m a t o a n t l e r i u mt e p u i e n s e 瘤座孢属t u b e r c u l a r i as p 头孢霉属c e p h a l o s p o r i u ms p 轮柄梳霉属m a r t e n i s o m y c e ss p 无胞菌群m y c e l i as t e r i l i a 安德氏紫杉霉t a x o m y c e s a n d r e a n a e 未分类 链格孢属a l t e r n a r i as p 1 2 内生真菌的活性代谢产物的开发利用 1 2 1 植物内生真菌在医药领域的开发和应用 在过去2 0 年，约有一半的药物来源于天然产物或天然的先导化合物，约5 的药物为天然化合物的直接应用。研究者发现，特殊生态环境一卜的微生物与特殊 3 第。审文献综述卜海师范人学硕士学位论文 的次生代谢产物有紧密的关系。这使得狂植物内生菌在药物研发领域中成为热 点。 1 2 1 1 抗生素的开发 内生菌产生的抗生素类物质，不仪对病原体起作用，还对其它的细菌、真菌、 病毒和一些原生生物起抑制作用。大量内生真菌次生代谢产物体外抗菌试验表明： 约有3 0 的内生真菌能够产生具有抗菌活性的物质，表1 2 是近几年从植物内生 菌中发现的具有抗菌作用的活性成分。s t r o b e l 研究小组从卫矛科著名药用植物雷 公藤( t r i p t e r y g e u mw i t f o 砌d 中分离到的内生真菌c r y p t o s p o r i o p s i sc f q u e r c i n a 能 产生一种新型环肽抗生素c r y p t o c a n d i n ( 结构如图1 1 ) ，对癣菌及白色念珠菌等人 类病原真菌具有强烈抑杀作用，其m i c 与临床应用的抗真菌药a m p h o t e r i c i nb 相 当，具良好开发前景。 o 一 ) c h 2 ) ，t o h 图1 1c r y p t o c a n d i n 的化学结构式 邹文欣等从黄花蒿( a r t e m i s i aa n n u a ) 乖d 蒙i i 蒿( a r t e m i s i am o n g o l i c a ) 分离到1 0 余种内生真菌l l 川，其中一株内生真菌刺盘孢霉( c o l l e t o r i c h u ms p ) 能产生炭疽菌酸 ( c o i l e t o t r i c h u ma c i d ) ( 结构如图1 2 ) 等3 种新的抗菌活性物质，对枯草芽孢杆菌、 金黄色葡萄球菌和八叠球菌有很好的抑制作用。从一些兰科植物分离到的内牛真 菌可产生杀菌活性的物质，分别对奥里斯葡萄球菌、长球菌、大肠杆菌、隐球酵 母和假丝酵母具有广谱或专一抗性。l i 并l l h a r p e r 等从皿热带植物中分离到的一株 盘单毛孢内生菌能够产生一种新的抗真菌物质a m b u i ca c i d l i 州( 结构如图1 3 a ) ； 从一种橡树的内生真菌中分离到两种抗菌活性物质i e s t e r o n e ( 结构如图1 3 b ) 和 h y d r o x y j e s t e r o n e ；从薄荷中分离到的拟茎点霉属( p h o m o p s i sl o n g i c o l l a ) p q 生真菌能 产生一种具有临床应用前景的新抗生素d i c e r a n d r o l ( 结构如图卜3 c ) 。 卜渤口r l i 范人学硕 = 学位论义第章文献综述 o o h 图1 2 刺盘孢霉产的三种抗菌物质结构图 表1 2 近几年来从植物内生菌中发现的部分抗菌活性成分 h 3 c h 3 c c d i c e r a n d r o i o 图1 3 部分植物内生真菌产生的抗菌物质 c h 3 c h 3 第辛文献综述 卜淘帅范人：硕十学位论文 1 2 1 2 抗肿瘤活性物质的开发 1 9 9 3 年美国学者s t i e r l e 等首次从短叶紫杉( t a x u sb r e v i f o 胁) 的树皮中分离出 株内生真菌新种t a x o m y c e sa n d r e a n a e ，在培养液中能产生紫杉酵( t a x 0 1 ) ( 结构 见图1 - 5 a ) 和其他紫杉烷类化合物2 1 。至今已在短叶紫杉( t a x u s b r e v i f o l i a ) 、喜马 拉雅红豆杉( t w a l l i c h i a n a ) 、欧洲红豆杉( t b a c c a t a ) 、南方红豆杉( t m a i r e o 、 6 a - p h o m o p s i c h a l a s i n o h c - c o l l e t o t r i ca d d o ho e - g u a n a c a s t e p e n ea h o h o h o h m e h b c r 3 7 7 c h 2 o h h o h o d - a l t e r s e t i n 函 m e o f p h o m0 i 图1 - 4 部分植物内生真菌产生的抗菌化合物 m e 云南红豆杉( 7 撅“sy u n n a n e n s i s ) 、落羽杉( 掀加讲甜所d i s t i c h u m ) 、概树( 乃似弦 上海师范大学硕士学位论义 第，章文献综述 g r a n d i f o l i a ) 并dw o l l e m i a n o b i l i s 中分离到了许多种能产生紫杉醇的内生真菌与放线 菌。其中内生真菌微孢拟甜多毛孢( p e s t a l o t i o p s i sm i c r o s p o r a ) 的紫杉醇产量已初步 显示其商业潜力。 鬼臼毒素( p o d o p h y l l o t o x i n ) ( 结构见图卜5 b ) 是存在于鬼臼类植物中的一类 天然的木脂素( 1 i g n a n s ) ，对小细胞肺癌、淋巴癌等多种肿瘤疾病均有很好的疗效 而被美国f d a 批准上市。李海燕等从桃儿七( s i n o p o d o p h y l l u me m o d i ) 茎中分到一 株能产生鬼臼毒素的内牛真菌。曾松荣等又分别从南方山荷叶( d i p h y t l e i a s i n e n s i s ) 和川八角莲( d y s o s m av e i t c h i o 中分离到了产生鬼臼毒素的内生真菌l i 引。 长春新碱( v i n c r i s t i n e ) ( 结构见图1 5 c ) 是有效的抗癌药物之一，一般用于治 疗白血病和恶性淋巴瘤等症。张玲琪等从长春花( c a t h a r a n t h u sl o s e u s ) 茎皮中分到 一种内生真菌( 9 7 c g 3 ) ，证明该菌能产生长春新碱。郭波等从云南巍山长春花茎 皮中分离到能产生长春碱的内生真菌菌株，属交联孢属凹l t e r n a r i as p ) 川。 球毛壳甲素a ( c h a e t o g l o b o s i na ) ( 结构见图1 5 d ) 是一种细胞分裂抑制剂， 通过影响细胞内的收缩蛋白而抑制细胞质的分裂。张玲琪等从生长于西双版纳的 美登木( m a y t e n us h o o k e r i ) 的老叶中分离、筛选出一株内生真菌球毛壳菌 ( c h a e t o m i u mg l o b o s u m ) 。从该内生菌的发酵产物中分离得到了球毛壳甲素a 。由 于美登木自身合成的抗癌活性成分是美登素( m a y t e n s i n e ) o ，这一研究表明，植 物内生真菌不仅能产生与宿主成分相同或相似的活性物质，有的还能产生与宿主 成分结构不同而作用相似的活性物质。同样的例子还见于红豆杉，从中分离到的 内生真菌除能合成紫杉醇外，还能产生其它一些抗癌活性物质，如十一元环松孢 菌素d ( c y t o c h a l a s i nb ) ( 结构见图1 5 e ) 、大环内酯类布雷菲德菌素a ( b r e f e l d i n a ，b f a ) ( 结构见图1 5 f 以及s e q u o i a t o n ea f f d b 。另外，从欧洲紫杉( t a x u sb a c c a t a ) 内生菌枝项孢似c r e m o n i u ms p ) 产生的白灰制菌素a ( 1 e u c i n o s t a t i na ) ( 结构见图 1 5 g ) 、从一种小蘖( b e r b e r i so r e g a n a ) 内生真菌得到的法尼基蛋白转移酶抑制剂 o r e g a n i ca c i d ( 结构见图1 5 h ) 等多种成分均表现出抗肿瘤活性l l 。表1 3 为近几 年来从内生菌中发现的郜分抗肿瘤活性成分。 表1 3 近几年来从内生菌中发现的部分抗肿瘤活性成分 活性成分内生菌来源植物结构 h o r m o n m a t eh o r m o n e m ad e m a t i o i d e sp h m ss p e c i e s s e q u o i a m o n a s c i n s a da s p e r g i l l u sp a r a s r i c u ss e q u o i as e m p e r v i r e u s 见图l 5 1 n o m o f u n g i n f i c u sm i c r o c a r p al 见图l 5 j s e q u o i a t o n e a fa s p e r g i l l u sp a r a s i t i c u ss e q u o i as e m p e r v i r e u s 一 7 第章义献综述卜海师范人。硕十学位论丈 d i c e r a n d r o l a c p h o m o p s i sl o n g i c o l l ad i c e r a n d r a f r u t e s c e n s t a n - 1 8 1 3p h o m as p f l 一4 1 5 1 0 l e u c i n o s t a t i naa c r e m o n i u ms p t a x u sb a c c a t a见图l 5 g a - t a x o l b - p o d o p h y ll o t o x i n d - c h a e t o g l o b o s i na t t 0 c 0 0 h h - o r e g a n i ca c i d 0 s 0 3 h h o l z f b r e f e l d i na h y “丫丫跳 o 0 a b砚 i s e q u o ia m o n a s c i na j - n o m o f u n g i n 图1 5 部分植物内牛真菌产生的抗肿瘤活性物质 1 2 1 3 抗糖尿病的活性物质 z h a n g 和s a l i t u r o 等【1 8j 从非洲刚果热带植物分离得到的内生( s p 甜如卅黜订，胁s p ) 产生的次生代谢产物中分离出一种类似胰岛素的小分了化合物( l 2 7 8 3 ，2 8 1 ) ，该 物质可使人的胰岛素受体酪氨酸b 亚基磷酸化，并使胰岛素受体的作用底物磷酸 化，激活a k t ，起到类似胰岛素中介作用的效果。进一步研究表明，此小分子化 合物制成片剂在给糖尿病大鼠模型口服后，能明显降低血糖浓度【1 9 j 【2 0 1 。 8 卜淘! f l i 范人学硕十学位论文第璋文献综述 1 2 1 4 抗疟原虫，结核类的活性物质 疟疾和结核病在当今普遍存在，现也有多种药物可以治疗，在植物内生菌中 也分离到多种抗疟疾和结核类新物质，o s t e r h o g ec ( 2 0 0 0 ) 等i j 从绿藻类石莼植物 内生真菌a s c o c h y t as a l i c o r n i a e 中分离m 一。种新的结构异常的四聚体酸 a s c o s a l i p y r r o l i d i n o n e sa ( 结构见图1 - 6 a ) 对疟原虫f a l e i p a r u ms t r a i nk 1 和n f 5 4 有 抗性。从内生真菌g e o t r i c h u ms p 的发酵液巾分离m 三种新的二氢异香豆素衍生 物( k o n g s a er e e p ，e ta 1 2 0 0 3 ) 和从内生真菌p h o m o p s i ss p b c c 13 2 3 中分离出的两种 新的二聚体p h o m o x a n t h o n e s a 署d b ( 结构见图1 6 b ) ，都具有抗结核菌和抗疟疾作 用。 1 2 1 5 免疫抑制剂 分离白药用植物雷公藤的镰孢菌属内牛真菌( f u s a r i u ms u b g l u t m a n s ) 眨一产生 一种非细胞毒的二萜吡酮类化合物s u b g l u t i o n o la 和b ( 结构见图1 - 6 c ) 。实验证 明，两者都具有免疫抑制活性。两者在m l r ( m i x e dl y m p h o c y t er e a c t i o n ) 和 t p ( t h y m o c y t ep r o l i f e r a t i o n ) 评价系统的i c s o 都为o 1 u m o l l 。与环孢菌素 a ( c y c l o s p o r i n a ) 相比较，m l r 系统分析发现两者的活性与其相当，而t p 实验结 果则显示环孢菌素a 的活性比两者高1 0 4 倍。但因为s u b g l u t i o n o la 和b 缺乏细胞 毒性，所以二者仍将具有诱人的应用前景。 1 2 1 6 抗氧化剂 h a r p e r 等人从t e r m i n a l i am o r o b e n s i s 的内生真菌( p m i c r o s p o r a ) d 尸分离到了两 种化合物p e s t a c i n 和i s o p e s t a c i n ( 结构见图卜6 d ) 2 2 】。实验证实，两者既具有抗 菌活性，又有抗氧化活性。p e s t a c i n 是一种消旋体，实验发现其抗氧化活性至少 比t r o l o x ( 维生素e 的衍生物) 大一个数量级1 2 3 1 。l s o p e s t a c i n 的结构与f l a v a n o i d s 相 似，在缓冲液中，它可以消除超氧自由基和羟基自由基。 1 2 1 7 抗病毒类活性化合物 从内生真菌中发现抗病毒活性化合物的研究还处于起步阶段。目前这方面的 报道4 i 多，但通过建立适当的抗病毒活性筛选体系，从中找到一些新型结构的抗 病毒活性物质还是充满希望的。c y t o n i ca c i da s l l b ( 结构见1 6 e ) 是分离自内生 真菌c y t o n a e m as p 的三缩酚酸类异构体，实验证明是一种新的人巨细胞病毒 ( h c m v ) 蛋白酶抑制剂引。 9 第章义献综述卜海师范人学硕十学位论义 2 g s 曲g i 谢o n 0 ia d - r ：s l a ( 抽( 1 ) 和l s o p e s c a c i n ( 2 ) 1 2 e - c y t o n i ca c i da ( 1 ) 和| b ( 2 ) 图1 6 部分来源于内生菌的化合物结构式 1 2 2 植物内生菌在涉农领域的开发和应用 在植物内生菌中转入抗病抗虫荩冈，是现在植物病虫害生物防治又一新思 路。植物在其整个生活史中，总会受到病虫害的侵害，特别是一些经济植物，一 旦遭受病虫，就会造成经济损失，如用化学药剂，既影响产品质量，又会给环境 造成污染。 1 2 2 1 杀虫类活性物质 在植物内牛菌中转入抗病虫基因较在植物中直接转入抗病虫基因简单容易。 被转入抗病虫基凶的内生菌在宿主中表达，抗病虫物质直接分泌在植物体内，更 l o 蕊h 卜海师范入学硕士学位论义第+ 章文献综述 易被转运。d o w n i n gk s ( 2 0 0 0 ) 等就在从苹果茁中分离出的内生菌p s e u d o m o n e a s f l u o r e s c e n sr f l 转入抗病c h i a 基因，再把这种携带有c h i a 基因的内生菌接种到豆苗 中，可以防治豆苗病原真菌r h i z o c t o m i as o l a n i ，他们又存h 。蔗内生菌中转入抗虫 基因c 巧i a c 7 基因，回接甘蔗，可以防治甘蔗钻心虫e l d a n as a c c h a r i n a k 川。清华 大学的j u 等从内生菌感染的一种草熟禾( p o a m p l a ) 中分离到数个对蚊子幼虫有 毒性的黄酮类化合物。n o d u l i s p o r i ca c i d s 是一种吲哚二萜类化合物，是从植物 b o n t i a d a p h n o i d e s 的内生真菌( n o d u l i s p o r i u ms p ) 中发现的。其杀灭大苍蝇幼虫 的活性，主要是通过激活昆虫的谷氨酸门控的氯离子通道而起作用的弘0 。f i n d l a y 箸f 1 2 7 , 2 5 , 2 9 】从云杉等针叶树的内生真菌的代谢产物中发现了一系列具有抗虫活性 的物质：如从胶冷杉( a b i e sb a l s a m e a ) 中分离到一株内生真菌，在其发酵产物 中分离出2 个二萜类化合物：9 a h y d r o x y l ，8 ( 1 4 ) ，1 5 i s o p i m a r a t r i e n 3 ，7 ，1 i - t r i o n e ) 和9 0 r h y d r o x y 1 ，8 ( 1 4 ) ，1 5 i s o p i m a r a t r i e n 3 ，1 1 一d i o n e ( 结构见图1 - 7 a ) ，它们 对枞色卷蛾的胃毒致死率分别为2 8 和3 2 ；从黑云杉( p i c e am a r i a n a ) 的一株 内- 牛真菌( c a n o p l e ae l e g a n a ) 的液体发酵物中分离到的2 个异香豆素类化合物 ( 结构见图1 7 b 和图1 7 c ) ，它们对云杉蚜虫均有明显的毒性。n a p h t h a l e n e 是一 种广泛使用的驱虫剂讳脑球的有效成分，由藤蔓植物( p a u l l i n a p a u l l i n i o i d e s ) 的内生真菌m u s c o d e rv i t i g e n u s 产生，该物质可以有效地驱赶一些昆虫，如叶蜂 ( c e p h u sc i n c t u s ) _ 等1 3 0 】。 o 图1 7 部分涉农领域的内生菌代谢产物 1 2 2 2 植物生长调节物质 内牛真菌长期和宿主植物生活在一起，对植物的牛长发育具有很重要的作 用。已有多篇文章报道内生真菌可产生植物生长激素样物质，如吲哚乙酸( i a a ) 、 吲哚乙腈、脱落睃( a b s c i s i ca c i d ，a b a ，图l - 7 d ) 等。从柑橘属果树中分离出 来的p e n i c i l l i u mt t a h c u m h e 。) 托赤霉素( g a ) p i lo 眦舾i c a r p u sv a g i n a l i sd c 的根部 分离到的植物内生菌，在加有色氨酸的酵母浸出粉甘露糖醇培养基中能产大量的 o 且 v 加刈 ( o 旷 h q 1 h ， 咄r 黼举。 h 笫亭_ ! ：【= 献综述卜海帅范人学硕十学位论文 i a a ，并且发现在细胞生长静止期，i a a 产量达到最高p 引。r y u 等在对5 种从药 用植物中分离到的内生菌进行研究时发现，它们各自的发酵液中都含有至少一种 植物激素：g a ，i a a ，a b a ，z ( z e a t i n ) ，z r ( z e a t i nr i b o s i d e ) ，这些由内生真 菌产生的植物激素是揭示内生真菌促进药用植物生长机制的重要物质。一些植物 内，j ：真菌会释放出挥发性混合物作为信号分子调节植物微生物问的关系，促 进植物的生长p 川。邹文欣等从黄花蒿中分离得到一株刺盘孢内生真菌 ( c o l l e t o t r i c h u ms p ) ，通过对其发酵产物的深入研究，发现该菌也能产生植物生 长激素i a a ，对宿主植物的生长起促进作用p 引。 1 2 3 内生真菌在分类学上的意义 内牛真菌与其宿主( 如植物、昆虫等) 长期共处，共同进化，在进化过程 中二者必然相互影响，形成一些新的真菌种类。因此研究内生真菌能发现一些新 的真菌类群。如从短叶红豆杉中分离得到安德氏紫杉菌陋j ，从雷公藤中分离得到 c r y p t o s p o r i o p s i sc f q u e r c i n 口【1 3 1 。 另外，内生真菌研究过程中会出现些新问题，某些内生真菌在人工培养 基上不产生有性或无性孢子【3 5 1 ，而且这类菌株占总菌株数的比例高达4 1 3 3 6 】， 无法用经典形态学方法进行鉴定。为克服这一困难，g u oe ta l 用分子生物学技术 进行签定【3 7 】3 8 】。 综上所述对内生真菌的研究仅有一百多年的历史，仍有广阔的研究空间， 本文的研究对象是从喜树中分离得