（有机化学专业论文）高效液相色谱手性固定相分离α氨基膦酸酯.pdf

贵州人学2 0 0 7 届硕士研究生学位论文 缩写与符号 h p l c h i g h1 ) c f f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h 高效液相色谱 c s p c h i r a | s t a t i o n a r yp h a s e 手性固定相 a p s氨丙基硅胶 t f a e 2 , 2 ，2 三氟( 1 - 9 - 蒽) 乙醇 c d 环糊精 t f a e 2 , 2 ，2 三氟( 1 9 - 葸) 乙醇 3 贵州大学2 0 0 7 届硕士研究生学位论文 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行 研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个 人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究曾做出重要贡献的个人 和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律责任由本 人承担。 论文作者签名：圭整日期：缝z 盛旦 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解贵州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留 或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅；本人授权贵州大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：超导师签名弛日期：趔2 生( 旦 贵州人学2 0 0 7 届硕j 二研究生学位论文 高效液相色谱手性固定相分离露氨基膦酸酯 摘要 论文中应用了一种新型键合型3 ，5 二甲基苯基氨基甲酸酯淀粉类手性固定相 色谱柱( c h i r a l p a kt a ) ，在正相系统的高效液相色谱条件下首次直接拆分了系列烷氧 取代口氨基膦酸酯类化合物。在实验中，从保留因子( k ) 、分离因子( a ) 和分离度( 砸) 等方面考察了对映体保留和拆分的影响因素。通过改变流动相中醇类添加剂的种 类及浓度，考察了不同手性化合物在手性固定相上的分离情况，考察了流动相组 成对手性分离的影响，考察了醇类添加剂和溶质结构对手性分离的影响。研究结 果表明，在选定条件下4 氨基膦酸酯化合物均达到了基线分离，化合物结构和流 动相组成对外消旋体分离产生了重要影响，且分离时总是) 对映体先出峰，( s ) - 对映体后出峰。根据实验结果，对溶质在手性固定相上的分离机理作了初步探讨， 对分离效果比较理想的六个化合物还进行了手性制备，获得十二个单体，通过1 h n m r 、1 3 cn m r 进一步作了确认，并用色谱法检测了单一对映体的纯度，光学纯 度均大于9 0 。 关键词：口氨基麟酸酯；高效液相色谱法：手性分离；手性固定相； 直链淀粉手性固定相 图书分类号：0 6 2 1 贵州人学2 0 0 7 届硕上研究生学位论文 s e p a r a t i o no fe n a n t i o m e r so f a a m i n o p h o s p h o n a t e s o nc h i r a ls t a t i o n a r yp h a s e sb yh p l c a b s t r a c t t h et h e s i sd e s c r i b e sac h i r a lh p l cm e t h o df o rt h ee n t i o m e r i cs e p a r a t i o no ft h e s ea a m i n o p h o s p h o n a t ed e r i v a t i v e su s i n gi m m o b i l i z e da m y l o s e b a s e dc s p ( c h i r a l p a ki a ) t h ec h r o m a t o g r a p h i cp a r a m e t e r ss u c ha sr e t e n t i o nf a c t o r ) ，s e p a r a t i o nf a c t o r ( a ) ，a n d r e s o l u t i o n ( 出) o ft h es o l u t e sa r ei n v e s t i g a t e d e n a n t i o s e p a r a t i o no fd i f f e r e n ts o l u t e s w e r ec o m p a r e do nt h es a m ec h i r a ls t a t i o n a r yp h a s eb ya l t e r i n gt h ek i n da n dt h e c o n c e n t r a t i o no fa l c o h 0 1 t h ee f f e c t so fc o m p o s i t i o no fm o b i l ep h a s ea n dt h es t r u c t u r e o fs o l u t ea n da l c o h o lo nc h i r a ls e p a r a t i o nw e r ee x t e n s i v e l ys t u d i e d ( r ) e n a n t i o m e ri s e l u t e df i r s t l yi ns e p a r a t i o n t h u st h em e c h a n i s mo fc h i r a ls t a t i o n a r yp h a s er e c o g n i z e d w a sa c h i e v e d o na no p t i m u mc o n d i t i o no fs e p a r a t i n ga n dp r e p a r i n gt h es i xp a i r so f e n a n t i o m e r so f4 一a m i n o p h o s p h o n a t e a l ls i n g l e n e s se n a n t i o m e rw e r ec o n f i r m e db y1 h n m r ”cn m r t h ep u r i t yi so v e r9 0 k e y w o r d s ：口- a m i n o p h o s p h o n a t e ；h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h ； e n a n t i o s e p a r a t i o n ；c h i r a ls t a t i o n a r yp h a s e ；a m y l o s es t a t i o n a r yp h a s e 2 贵州大学2 0 0 7 届硕i ：研究生学位论文 ， 1 前言 口氨基膦酸酯作为天然氨基酸的含磷类似物，是有机磷化学中近几十年来发展 起来的重要组成部分，其结构类型多变，具有较好的抗植物病毒、抑制酶活性、 抗肿瘤、除草、杀菌等重要的生物活性，同时化合物的立体结构与其生物活性之 间也存在着密切的关系，这些都引起了农药、医药等领域工作者的广泛注意，从 而使这一领域的研究十分活跃。 如2 0 0 1 年廖本仁等( 廖本仁等，2 0 0 1 ) 对光学活性4 氨基膦酸及其酯的各种不 对称合成方法作了综述，主要介绍了化学计量不对称合成和催化不对称合成法； 2 0 0 2 年周爱玲等( 周爱玲等，2 0 0 2 ) 报道了手性有机磷化合物液相色谱拆分的研 究进展，对问接拆分和直接拆分法，尤其是各类手性固定相法在拆分有机磷化合 物中的应用作了简介。对拆分机理作了探讨。 2 0 0 3 年宋宝安等( 宋宝安等，2 0 0 3 ) 报道了新型光学活性口氨基膦酸及其酯的合 成进展。文中对光学活性的口氨基膦酸酯的主要制备方法手性试剂导向合成法、 不对称合成法、色谱分离方法进行了概述和总结。 本中心在口一氨基膦酸及其酯的合成及生物活性方面也做了很多工作，如杨松 等( 杨松等，2 0 0 4 ) 采用活性基团拼接法将氟原予引入口一氨基烷基膦酸酯中，设计合 成了新型含氟4 氨基烷基膦酸酯化合物。2 0 0 5 年宋宝安等利用席夫碱与亚膦酸酯 反应，合成了新型dd l 烷基哪( 6 甲氧苯并噻唑) 2 氨基4 氟苯基膦酸酯化合 物。徐应淑等( 徐应淑等，2 0 0 0 采用活性基团拼接法将烷氧基、氟原子、杂环基团 引入口氨基膦酸酯中，在微波辐射下采用无溶剂无催化剂一锅法合成了系列含烷 氧基含氟口氨基膦酸酯类化合物。 目前拆分对映体仍然是获得光学纯化合物的主要方法之一，特别是在开发新 药的初期阶段，当需将左、右二个对映体在相同条件下分别进行生物活性比较时， 就显得尤为必要。因此，为研究光学活性口氨基膦酸酯，需要获得其单一对映体 时，我们对其消旋体使用高效液相色谱手性固定相法进行了拆分，以便对单一对 映体的光学活性、生物活性等进行研究，对拆分机理进行探讨。 4 贵州大学2 0 0 7 届硕上研究生学位论文 2 文献综述 随着手性技术的不断发展，光活性4 氨基膦酸酯也越来越引起了人们的广泛 关注。当口氨基膦酸酯含有手性碳原子时，将表现出手性。本文从研发高效、低 毒、低成本和环境友好的新农药出发，对系列口氨基膦酸酯类化合物外消旋体进 行了拆分，便于研究其单一对映体的生物活性，同时对新农药创制及手性农药开 发具有重要的意义。 目前多在高效液相色谱手性固定相下对消旋口，氨基膦酯进行分离获得其单一 对映体，下面对高效液相色谱手性固定相法及国内外4 氨基膦酸酯类化合物手性 分离研究中代表性的工作综述如下。 2 1 高效液相色谱手性固定相 为深入探讨手性物质各对映异构体的生理活性，对映体的拆分和测定越来越 受到人们的关注，现代分离分析技术在此方面显示出了巨大的优越性。其中高效 液相色谱法( h p l c ) 因具有操作快速、高效、简便、柱容量高和适用范围广等优 点，且在分离时不会破坏对映体的生物活性，已成为手性化合物分离分析和制备 的重要手段之一( 周爱玲等，2 0 0 2 ) 。 手性固定相( c h i r a ls t a t i o n a r yp h a s e ，简称c s p ) 作为整个h p l c 系统的关键 部件，它直接决定了拆分的效果。因此，具有良好手性识别能力的c s p 的研制， 是手性色谱发展的前沿领域，也是手性色谱发展的关键和核心。随着c s p 技术的 飞速发展使得采用c s p 分离对映体化合物的方法应用越来越广泛。目前，高效液 相色谱手性固定相法已成为药物手性分离最为重要也是最有效的方法，这也使得 近2 0 年来h p l c 手性固定相法在手性药物研发领域得以蓬勃发展( d a v i d ，1 9 9 2 ) ， 不仅可用于分析分离，还可用于对映体的半制备和制备分离( 王普善，x 9 9 s ) 。 一个有效的c s p 应当具有能够快速分离对映体，测定对映体的纯度，尽可能 适应多种类型的对映体的分离，对一系列结构类似的手性化合物，其d ，l 或r ， s 对映体洗脱顺序基本不变，可提供绝对构型信息；应当具有较高的对映体分离选 择性和柱容量；具有制备分离能力( w a i n e r , 1 9 8 7 ) 。市场上己有许多商品化的手性 固定相出售，也积累了许多手性分离的成功范例，随着各种新型手性固定相的不 断开发和出现，给手性分离带来了前所未有的活力。据c h m b a s r 巳( 手性色谱分离 数据库) 的统计，到2 0 0 0 年4 月为止全世界合成手性固定相的公司有4 4 ，4 7 9 家， 贵州大学2 0 0 7 届硕上研究生学位论文 c s p 的种类有1 1 5 7 种( p a t t i c l 【，2 0 0 1 ) 。在过去的- - 2 十年中，就己开发出多种类型 的高效液相色谱手性固定相( a u e n m a r k , 1 9 8 8 ；k r s m l o v i c , 1 9 8 9 ) ，新的手性固定相还 在不断地合成。但实际上，能同时满足这些要求的c s p 是不多的。 高效液相手性固定相一般可归纳为以下几大类( 邹汉法等，2 0 0 1 ) ：蛋白质手性 固定相、p i r k l e 型手性固定相、环糊精型手性固定相、多糖衍生物手性固定相等。 2 1 1 蛋白质手性固定相 蛋白质是手性大分子化合物，具有一级、二级及三级结构特征。是对映异构 体的天然识别体。多数蛋白质c s p 的分离机理目前尚不十分清楚，但是蛋白质c s p 的手性识别能力可以归结为它们独特的空间立体结构特征( 邹汉法等，2 0 0 1 ) ，尤其 是在对映体的手性识别过程中，三级结构所造成的疏水性口袋、沟槽或通道对手 性拆分具有十分重要的意义。 蛋白质分子本身具有较大的体积，所以载样量小，柱容量也低，一般只用于 分析目的。但蛋白质作为c s p 可拆分的化合物面较广，柱效高，色谱蜂形好，其 分离操作是在反相模式下进行，色谱操作参数的选择与优化十分灵巧，大量的参 数如缓冲液的组成、离子强度、p h 值、有机改性剂、柱温等因素均可被改变，这 使得一个给定的对映体可拆分的可能性大大增强。 目前，用于h p l c 手性拆分分析的蛋白质手性固定相主要包括人血清白蛋白、 牛血清白蛋白、卵类蛋白等。 2 1 2p i r k l e 型手性固定相 该类手性固定相( b e r g q v i s t ，1 9 9 3 ；侯经国等，1 9 9 7 ) 是2 0 世纪6 0 年代p i r k l e 等人 发明的，也称p i r l o e 型或p - p 作用型手性固定相，是将单分子层的手性有机分子通 过适宜的连接基团键合到硅胶载体上而制得，如1 9 8 1 年p i r i d e ( p i r l d e ，1 9 8 1 ) t 研究出 ( 1 l f n ( 3 ，5 二硝基) 苯基甘氨酸c s p 。 在手性液相色谱领域，p i r k l e 型c s p 是目前使用量大、适用面广、对手性识别 机理揭示较深的一类重要c s p ，多使用正相体系。该固定相通过含末端羧基或异 氰酸酯基手性前体与氨基键合硅胶进行缩合反应，分别形成含酰胺或脲型结构 c s p 。它们具有确定的化学结构，其化学结构特点是在手性中心附近含有下列功能 团：( 1 ) 带吸电子取代基或带推电子取代基的芳香基团，在手性识别过程中能发 生电荷转移相互作用：( 2 ) 能形成氢键的原子或基团；( 3 ) 能发生偶极偶极作用 6 贵州大学2 0 0 7 届硕l 研究生学位论文 的极性键或基团；( 4 ) 能提供立体排斥相互作用的较大的非极性基团。对映体和 c s p 之间的手性识别主要通过上述一种或几种相互作用来实现的。 第一代p i r l d e 是将2 , 2 ，2 - - - - - 氟( 1 - 9 蒽) 乙醇( t f a e ) 键合到硅胶上形成的固定相， 其后p i r h e 又制备了一系列3 ，5 二硝基苯甲酰( d n b ) 氨基酸、醇、胺衍生物c s p 构成第二代p i r k l e 型c p s ；第三代p i r k l e 型c s p 有富电子的萘基和较长的键合烷 基链，提高了立体识别能力和通用范围，此后，又合成了既含p 酸( c d b ) 又含p 碱( 萘基) ，含有碳、磷、联萘等不对称中心的c s p ( 罗维早等，2 0 0 0 ) 。近年又相继合 成了氨基磷酸酯及一系列含萘、杂环的氨基酸衍生物、二氨和由联萘、羧酸衍生 物的多种c s p ，已广泛用于氨基酸、乙内酰脲、内酰脲、胺类、醇类及硫醇类药 物对映体拆分。 2 1 3 环糊精型手性固定相 环糊精( 童林荟，2 0 0 1 ) 是一类由一定数量的d - ( + ) - b t t 喃葡萄糖单元提供加1 ，4 一糖苷键首尾相连成环的大环化合物。习惯上使用希腊字母表示其葡萄糖单元数 目，其中最常见的是a 、卢、7 - 环糊精，分别拥有6 、7 、8 个葡萄糖单元。由于环 糊精分子空腔内由氢原子和成桥氧原子形成，具有疏水性，而腔外则具有亲水性 的多个羟基，因此在分离过程中，手性化合物分子进入环糊精分子疏水性的空腔 内，对映体分子的疏水性部分被c d 的疏水空腔紧密包容，分子中的极性基团则可 以与c d 分子空腔边缘的仲醇羟基之间发生氢键等极性相互作用，从而出现保留和 对映体选择性上的差异，可实现手性分离。 因此，环糊精手性固定相的选择性与对映异构体分子的大小密切相关，对较 小或较大的对映体分子都不能有效的识别。 如辛梅华( 辛梅华，2 0 0 0 ) 等人将岁环糊精进行了乙酰化用于对肾上腺素类对映 体的测定，得到了不错的结果。 2 1 a 多糖衍生物手性固定相 该类手性固定相包括天然多糖以及衍生物，如纤维素、淀粉等以及合成的手 性聚合物如纤维素、淀粉等的衍生物。 纤维素是葡萄糖单元以p 1 ，4 - 糖苷键连接形成的线性聚合物，直链淀粉则是葡 萄糖单元以4 1 ，禾糖苷键结合而成的链状化合物。由于葡萄糖单元具有手性，因 此纤维素和直链淀粉作为天然的光学活性物质，同时分子为高度有序、呈螺旋型 7 贵州大学2 0 0 7 届硕j ：研究生学位论文 的空穴结构，本身就表现出一定的手性识别能力，不过作为液相色谱固定相，实 际应用的可能性不大。但它们葡萄糖单元中的羟基易被取代和官能团化，如将直 链淀粉或纤维素与相应的有机化合物苯甲酰氯、苯基异氰酸酯等反应制得的多糖 衍生物，就是有实际应用价值的固定相，且有广泛的手性识别能力，载样量大， 在大规模制各级色谱应用上也有很大潜力( 黄艳梅，1 9 9 9 ) 。 纤维素和直链淀粉的氨基甲酸苯酯衍生物表现出极强的手性拆分能力，大约 8 0 的外消旋手性化合物可以在这类固定相上得到拆分( y a s h i m a e ta i ，1 9 9 5 ) 2 1 4 1 多糖衍生物手性固定相的制备 目前多糖衍生物手性固定相有涂敷法、键合法、整体成球法、共聚一交联法等。 下面对涂敷法和键合法作简要介绍。 涂敷法是将多糖衍生物溶解于合适的有机溶剂( 称为涂敷溶剂) 中，再加入 载体如硅胶等，充分吸附多糖衍生物，然后蒸除涂敷溶剂，使多糖衍生物析出并 依靠其羰基与氨丙基硅胶表面氨基之间的氢键作用固定在硅胶表面。涂敷型固定 相的相互作用力相对较弱，一些能溶解多糖衍生物的溶剂，如氯仿、乙酸乙酯、 四氢呋喃、丙酮等就不能用作流动相，因为多糖衍生物会被溶胀或溶解而影响手 性柱的柱效和使用寿命，甚至可能失去手性识别能力。 与涂敷法相比，键合法则是通过各种化学键合方法将多糖衍生物键合到载体 上( 多使用氨丙基硅胶，a p s ) ，消除了流动相受限制的问题，扩大了流动相选择范 围，因而化学键合型多糖类手性固定相已受到愈来愈多的关注。 饿o 士+ o c 吣，忸羚士 + r ：一8 一q x = 一c n h _ ， 宁掣s 毗卜莨一 图2 - 1 氨基苯基甲酸酯类衍生物的制备及氨丙基硅胶( a p s ) 的合成 8 忠 贵州大学2 0 0 7 届硕十研究生学位论文 o k a m o t o 等人( o k a m o t oe ta 1 ，1 9 8 7 ) 1 1 9 8 7 年报道二异氰酸酯法制备键合型多 糖类手性固定相，后进行了改进。如图2 3 所示。因纤维素不溶于有机溶剂，故先 将纤维素与三苯基氯甲烷反应得到可溶于有机溶剂的三苯甲基纤维素，可被涂敷 到硅胶内表面，随后酸性条件下除去三苯甲基。由于纤维素糖单元上的一部分2 位、3 位或6 位羟基均可硅胶内表面的氨丙基相连，键合位置多样性将影响纤维素 衍生物的有序排列，降低了手性识别能力。 。善寺。 越 c 稍曲氇 图2 - 2 二异氰酸酯法制备键合型纤维素类手性固定相 由于化学键合作用强于氢键作用，使多糖衍生物在硅胶表面的排列有序度受 到影响，上面两种键合方式得到的固定相与用涂敷方法得到的固定相相比，手性 识别能力要低于涂敷型固定相。 后来o k a m o t o ( o k a m o t o e ta 1 ，1 9 8 6 ) 等开发了另外一种键合方法，将直链淀粉 衍生物的端基与氨丙基硅胶键合，合成得到端基为3 三乙氧基硅丙基的葡萄糖胺 后，再将其键合到硅胶表面，与异氰酸苯酯反应，葡萄糖音元上的羟基衍生为苯 基氨基甲酸酯基固定相。该法制备所得c s p 与涂敷型固定相的手性识别能力差别 不大。 目前，国外已有商品化的多糖衍生物手性柱，一般是将多糖衍生物涂敷到大 孔硅胶载体上形成，该载体成本较高，在分离对映体时，其分离能力在很大程度 上依赖于制备条件及涂敷方法等。表2 - 1 列出了一些商品化的多聚糖衍生物手性 9 贵州人学2 0 0 7 届硕研究生学位论文 柱，除微晶纤维素三乙酸酯，c h i r a l p a ki a ，c h i r a l p a ki b 外，其余为涂敷在硅胶上 制备的手性柱。 表2 1 商品化多糖衍生物手性柱 多聚糖衍生物固定在硅胶载体 2 1 4 2 多糖衍生物手性固定相的拆分机理 在进行手性拆分时，不同的手性固定相具有不同的分离模式。其中的经典理 论“三点作用原理”是由d a i g i e i s h 首次提出，该认为不管选择何种固定相，分离 何种对映体，手性分离或手性识别都必须满足同时有三个相互作用点。“三点作用” 1 0 贵州人学2 0 0 7 届硕十研究生学位论文 的作用力可以是氢键，偶极偶极相互作用，范德华力，包合作用以及立体阻碍等。 后来p i r k l e 发展了d a i g l i e s h 的观点，再一次阐述了“三点作用”理论，认为 手性识别要求手性固定相和对映异构体( 至少一个对映体) 之间至少有三个同时存 在的作用力，并且这些作用力中至少有一个是与立体化学相关的。也就是说，用 另一个对映异构体来替代后，至少有一个作用力不存在或明显改变了性质，使得 对映体与手性固定相之间作用力有差别而达到对映体分离的目的。 但是对多糖类手性固定相而言，其手性拆分机理比较复杂，目前还没有比较满意 的解释，还不能预言手性拆分的情况，更不能从理论上确定对映体绝对构型的洗 脱顺序，只能凭借经验和实验来判断。 因此，手性识别实际上是对映体与手性固定相之间所有作用综合影响的结果， 有些时是不能完全用经典的“三点作用原理”来解释的。因此，简单的手性识别模型 不可能解释所有的实验现象，对映体拆分的手性识别机理还有待于进行更加深入 的研究。 目前尚不完全清楚在多糖衍生物c s p 上进行拆分的机理，对同一种多糖衍生 物固定相而言，因制备过程中的种种因素，如硅胶载体的孔性结构以及表面化学 性质、多糖分子量大小及分布、不同基团的引入、涂敷溶剂等的不同而呈现不同 的构象，从而表现出了不同的拆分能力。同时它们在固态或溶液中的结构也很难 准确测定，因此很难根据“三点作用”原理从分子水平来解释它们的手性识别能 力。一般认为多糖苯基氨基甲酸酯类固定相的主要手性吸附部位是氨基甲酸酯残 基( 如图2 - 6 ) ，多糖苯基甲酸酯类固定相的主要手性吸附位置则为甲酸酯残基， 在对映体与手性固定相之间可能存在p - p 相互作用、偶极偶极作用、氢键氢键作 用及非手性作用( 如空间效应) 等作用力，由于两个对映体与固定相之间作用能力有 差异，形成了非对映体络合物而得到分离。 因此，多糖衍生物的结构如苯基氨基甲酸酯残基和苯基甲酸酯残基中苯环上 的取代基类型及取代基的位置、芳环以及c s p 空间构型都将对手性识别能力产生 影响。 贵州人学2 0 0 7 届硕十研究生学位论文 引网。馏r r甘r r 0 0 0 n m 岱r 贵州大学2 0 0 7 届硕上研究生学位论文 基，光学拆分能力受控于n h c o 基团，n h 、羰基与样品问存在氢键作用，羰基 与样品间还存在偶极偶极作用，并且极性还受苯基上的取代基的影响。苯基上连 有给电子基如烷基、吸电子基如卤素的c s p 相比没有取代基的显出较高的手性拆 分能力若苯基上存在给电子基，使羰基的电子云密度增高；若存在吸电子基， 则会增强n i l 的酸性；苯基上引入甲氧基或硝基等极性较强的取代基时手性识别 能力则降低，可能是由于远离手性单元的极性较强取代基与样品的相互作用，削 弱了c s p 中手性单元与样品的作用，使手性识别能力下降。当甲氧基变成乙氧基 或丙氧基时，空间位阻较大，对映体与取代基上的醚氧间的相互作用降低，提高 了手性识别能力。 一般苯环单取代基在3 位、4 位比2 位的拆分能力强，可能由于2 啦上基团的 立体效应阻碍了高度有序的纤维素苯基氨基甲酸酯衍生物的形成。其中的3 ，5 一二 甲基苯基氨基甲酸酯c s p ( 即c h i r a c e l0 d ) 手性拆分能力特别高。 2 1 4 4 直链淀粉衍生物手性固定相 经x - 射线结构分析证实：纤维素- - ( 3 ，5 二甲基苯基氨基甲酸酯) 具有左旋三 重( 3 ，2 ) 螺旋构型，而直链淀粉却具有左旋四重( 4 1 ) 螺旋构型，致使其结构更为有序， 与纤维素相比葡萄糖单元构象、结构有序性存在差异，导致直链淀粉衍生物的手 性识别能力与纤维素衍生物存在很大的差别。 这两种衍生化的多糖类手性聚合物分子中，极性的氨基甲酸酯基团和3 ，5 二 甲苯基围绕着主链形成个螺旋槽，样品分子调整构象进入螺旋槽中，通过氢键 作用、偶极偶极作用以及p - p 相互作用与固定相形成缔合物，如果一对对映体与 固定相形成的缔合物稳定性不一样，便可实现手性拆分。 直链淀粉苯甲酸酯手性识别能力低，而三( 3 ，5 - 二甲基苯氨基甲酸酯) 如 c h i r a l p a k a d 对绝大部分对映体显示最高的手性能力， y a s h i m a 等( y a s h i m a e t a l ，1 9 9 5 ) 把直链淀粉的3 ，5 二甲基苯基氨基甲酸酯衍生 物区域选择性键合到硅胶上作为h p l c 手性固定相，6 位键合到硅胶上比2 - ，3 - 位 键合具有较高的手性拆分能力，但键合型比涂敷型c s p 拆分能力低。 c h a n k v e l a d z e 等( c h a n k v e t a d z ee ta 1 ，1 9 9 5 ) 讨论了直链淀粉的二甲基一、二氯 和氯甲基苯基氨基甲酸酯c s p 的分离性能，表明直链淀粉的5 氯2 - 甲基苯基氨基 甲酸酯比相应的二甲基和二氯衍生物手性识别能力高；在苯基的2 位引入甲基， 贵州人学2 0 0 7 届硕j ：研究生学位论文 增加键合n i l 基的比例，通过分子内的氢键形成一个更有序的刚性结构的聚糖类 固定相，而在5 位引入氯增加自由n i - i 基的比例，意味着增加吸附点的数目，同 时降低了手性聚合物的规则性，但引入氯降低吸附点酸度，减弱对映体- n i l 基相 互作用力。苯基氨基甲酸酯的2 ，5 甲基氯基衍生物优于相应的二甲基、二氯基衍 生物，可能是上述作用平衡的结果。通过2 氯基与5 甲基比较表明n i t 基的酸度 对分子内的影响比作为吸着点与对映体相互作用更重要。 b o o t h 等( 蟹1 0 0 l l le ta 1 ，1 9 9 7 ) 以“定量结构手性选择保留关系”研究口烷基- 芳基羧酸手性化合物在直链淀粉三( 3 ，5 二甲基苯基氨基甲酸酯) c s p 上的分离，认 为对映体选择性是由于构象变化引起的，这一系列中手性识别不仅是由于“点” 作用而且是由于“分子”相互作用和构象变化的结果。对映体在c s p 上保留过程 分两步：第一是c s p 螺旋空穴的外边缘与对映体中心的官能团的氢键作用，然后 发生立体相互作用的构象调整，能不能分离决定于对映体是否存在第二个氢键基 团。 在众多的c s p 中又以c h i r a l c e lo d 和c h i r a l p a ka d 两种c s p 应用得较多。 c h i r a l c e lo d 和c h i r a l p a k a d 由日本d a i c e l 化学工业公司研发生产。c h i r a l c e lo d 属于纤维素氨基甲酸酯类c h i r a l p a ka d 属于直链淀粉氨基甲酸酯类，b 受体阻断 剂、巴比妥类、有机磷杀虫剂等药物均运用它们得到了分离。c h i r a l c e lo d 和 c h i r a l p a k a d 对药物结构有较强的选择性，且流动相条件，柱温对拆分影响较大。 a - - - c h i t a l c e lo d b - - - o f i r a l p a k - a d 图2 - 5 两种手性固定相结构 c h i r a l c e lo d 和c h i r a l p a ka d 两种c s p 具有高度有序的结构，能形成许多手 性空腔。被分离物能与c s p 形成具一定稳定性的复合物，也有可能是由于被分离 物的芳香基团插入c s p 的手性空腔。当氢键氢键，偶极偶极，p - p 作用占主导 1 4 贵州人学2 0 0 7 届硕i ：研究生学位论文 地位时，被分离物可以同时在两种c s p 上得到分离，而当空间位阻作用占主导地 位时则只有在一种上得到分离。 研究发现当用c s p 进行手性拆分时，手性固定相的种类和流动相组成不同， 可能会使对映体的洗脱顺序发生改变。t a o 等( t a o 户ta 1 ，2 0 0 0 ) 报道了在拆分 3 件f l u o r o ) o h e n y l - 4 - b e n z y l - 2 m o r p h o l i n o n e 及其类似物时，用c h i r a l c e lo d 时s - 对 映体先被洗脱，用c h i r a l c e l a d 则r 对映体先被洗脱。用c h i r a l p a ka d 拆分n 【2 - h y d r o x y 一2 一p y d d i n - 3 一y l - e t h y l - 2 - ( 4 一n i t r o - p h e n y l ) a c e t a m i d e 及其类似物时，流动相 为正己烷一异丙醇时，其r 对映体先被洗脱，当用正已烷乙醇为流动相时则 s 对映体先被洗脱。产生这种现象的原因并不清楚，一般认为是流动相成分的改 变导致了手性空腔的立体环境发生了变化。 2 24 氨基膦酸酯类化合物的手性分离研究 含磷手性化合物由于分子中含有手性磷原子，或是手性碳原子，可形成光学 异构体，在生物活性方面往往具有显著的立体差异。其中的4 氨基膦酸及其酯作 为天然氨基酸的类似物，自2 0 世纪5 0 年代末h o d g u c h i 从动物体内分离以来，其 合成方法和生物活性受到广泛的关注，也进行了很多相关方面的研究。 研究结果表明4 氨基膦酸及其酯类化合物具有抗肿瘤活性、抗植物病毒、植 物生长调节、除草、杀虫、杀菌、抑制酶活性、抗氧化及防辐射、破坏生物细胞 膜等重要的生物活性。对光学活性4 氨基膦酸及酯而言，对映体立体结构上的差 异将导致在生物体类作用机理的不同，表现出不同的生物活性。随着人们对其生 物活性的重视，光学活性口氨基膦酸酯类化合物也成为了研究的热点，手性分离 也随之越来越受到人们的重视。 手性有机磷化合物的分离和一般光活性异构体一样，常用的是色谱法，包括 气相色谱、薄层色谱、超临界和亚临界流体色谱、毛细管电泳和液相色谱，其中 高效液相色谱法以其公认的直接、快速、高效、简便和适用范围广等优点而得到 迅速发展和广泛应用。 目前国内外关于4 氨基膦酸酯类化合物分离的相关文献中，一般都采用高效 液相色谱手性固定相法进行拆分，文献所涉及到的有p i r k l e 型手性固定相、环糊 精手性固定相、手性聚合物固定相等，下面对相关的研究状况进行了综述。 p i r h e 等在1 9 8 1 年合成了一种广泛通用的离子型( r ) n - o ，5 二硝基苯甲酰基) 贵州大学2 0 0 7 届颤l 研究生学位论文 苯甘氨酸硅胶键合手性固定相，并用它对磷酸酯类衍生物进行了拆分，其后在1 9 8 5 年又用口萘基禾戊烯基酮合成了乙酰内脲型手性固定相，并用它有效地分离了氨 基磷酸酯对映体。后来他们又制备了一系列p 酸性( 3 ，5 - 二硝基苯甲酰基) 氨基酸衍 生物和p 碱性( 萘基) c s p ，拆分了一些口氨基烃基膦酸酯的3 ，5 二硝基苯甲酰胺 衍生物和二乙基n ( 芳基) 1 氨基1 芳甲烷膦酸酯外消旋对映体。 1 9 9 4 年s e l i m ( s d i m ，1 9 9 4 ) 采用手性氟代醇固定相分离了3 ，5 - 二硝基苯基口氨 基瞵酸酯。采用的三种手性固定相手性分离系数依次为c s p 4 c s p 3 c s p 2 ( 化学结 构式如图2 。 西鼬而 o 、佩d 厂s v 、牟o 一、s 、舞、4 、一、卉 一 嘞k嘞 喁 图2 - 6 手性固定相结构示意 c a c c a m e s e 等( c a c c a m c s ee ta 1 。1 9 9 4 ) 用c h i r a l c e lo j 柱分离了一系列氟化 n ( 芳5 ) - 1 氨基1 芳甲烷膦酸酯化合物。 1 9 9 8 年杨国生等人( 杨国生，1 9 9 8 ) 利用用已合成的n - 3 ，5 二硝基苯甲酰l 亮 氨酸手性固定相( p i r l d e 型手性固定相，结构见图2 1 0 ) ，在正己烷异丙醇体系下系 统地研究了1 1 种有机膦酸酯的手性分离情况( 结构见图2 - 1 1 ) ，考察流动相中强组 分异丙醇浓度和柱温对手性分离的影响。结果表明在选定的分离条件下，1 1 种有 机膦酸酯均可达到基线分离，手性分离系数随温度的升高和流动相中强组分浓度 的增加而降低，同时对映体中取代基位置的不同会直接影响手性分离结果，空间 位阻过大同样会使手性分离系数降低。 巴灿舢_ ! 一卜nh - ! 阳：l ) 夕卜酬3 n h 1 ：一f 卜脯叫n e h 2 揩0 2 1 6 贵州大学2 0 0 7 届硕i 二研究生学位论文 。啡。一趾一f i 卜k r 1 图2 - 8 有机膦酸酯结构 2 0 0 0 年起陈慧、黄君珉等人( 陈慧等，2 0 0 0 ；黄君珉等，2 0 0 1 ) 对口一氨基膦酸酯类 化合物的分离进行了一系列的研究和报道，合成了苯基氨基甲酸酯衍生化，一环糊 精键合相，首次在该固定相上和商品化的( s ) ( + ) - 萘乙基氨基甲酸酯衍生化卢环糊 稽固定相对n 对甲苯磺酰基哪一氨基膦酸酯系列化合物( 化学结构式如图2 - 1 2 ) 进行 了有效的拆分；结果表明，手性分离系数随温度的升高和流动相中强组分浓度的 增加而降低。讨论了有机膦酸酯不同取代基对手性分离的影响，指出手性化合物 中取代基位置的不同会直接影响手性分离结果，空间位阻过大同样会使手性分离 系数降低，在选定的分离条件下，该种氨基膦酸酯均可达到基线分离；探索运用 定量结构对映异构体选择性保留关系的方法，将对映异构体的色谱保留和溶质分 子描述参数进行相关性联系建立定量方程，对比研究了可能的液相色谱保留和手 性识别机理；该c d 键合相对手性有机磷化合物具有广谱性和高的对映体选择 性，对许多化合物可以发展成制各型液相色谱。 图2 - 9n - 对甲苯磺酰基m 氨基膦酸酯结构式 2 0 0 0 年j o h n s o n 采用采用c h i r a l p a ka d 固定相制备出了二异丙基屯一( 4 - 羟基3 甲氧基- 5 甲基苯基) n - 【3 ( 2 ，6 二甲基毗啶) 】氨基甲基膦酸酯的手性异构体，化学 结构式如图2 1 3 。 图2 - 1 0 有机媵酸酯结构式 1 7 k 日0 q i 卜 p r 一砥 oi卜io 贵州大学2 0 0 7 届硕七研究生学位论文 2 0 0 1 年n g u y e n 等采用c h i r a l p a ka d 固定相分离得到了上述外消旋化合物的 两个对映体。 周岚等( 周岚等，2 0 0 1 ) 以纤维素三( 3 ，5 ) - z 甲基苯基氨基甲酸酯为手性固定 相，正相条件下分离了6 种有机膦酸酯对映体，考察了流动相各组分配比、柱 温、样品分子结构对对映体分离的影响。 黄君珉等( 黄君珉等，2 0 0 1 ) 利用s u m i c h i r a lo a - 4 7 0 0 色谱柱在正相条件下对硫 代磷酰胺酯类手性磷有机化合物进行了拆分，探索了运用定量结构对映异构体选 择性保留关系的方法。将对映异构体的色谱保留和溶质分子描述参数相关性联系 建立定量方程，研究了色谱保留和手性识别机理。 周爱玲等( 周爱玲等，2 0 0 3 ) 合成了苯基氨基甲酸酯全衍生化卢环糊精键合硅胶 手性固定相，在正相色谱条件下，对系列2 - ( 噻唑基扣一氨基膦酸酯化合物进行了 有效的手性拆分研究，所有化合物都得到基线分离。 1 8 贵州人学2 0 0 7 届硕上研究生学位论文 3 论文设计思想 通过查阅文献得知口氨基膦酸酯类化合物结构类型多变，具有较好的抗植物 病毒、抑制酶活性、抗肿瘤、除草、杀菌等多种重要的生物活性，当n 氨基膦酸 酯分子中含有手性碳原子时，形成的不同光学异构体在生物活性方面往往也表现 出显著的差异，为了更深入地研究该类化合物的生物活性，需要获得各类光学活 性4 氨基膦酸酯单体。 从目前的研究现状来看，a 氨基膦酸酯手性拆分的相关研究和报道不多，在拆 分消旋体时主要采用高效液相色谱手性固定相法，多在纤维素类手性固定相及环 糊精类手性固定相上进行手性分离，未见在直链淀粉手性固定相上的报道，而且 对直链淀粉手性固定相的拆分机理认识还比较肤浅，还没有比较满意的理论解释， 进行系列化合物的对映体拆分，必将对认识固定相的手性识别机理将提供必要的 数据和信息。 因此论文拟使用高效液相色谱法，采用一种新型直链淀粉键合手性固定相 a l i r a l p a l 【队手性固定相【直链淀粉- 三0 ，5 - 二甲基苯基氨基甲酸酯) 手性固定 相】对本中心合成的口氨基膦酸酯系列化合物进行分离和制备，从保留因子( k ) 、分 离因子0 ) 和分离度( 融) 等方面考察对映体保留和拆分的影响因素，着重考察流动相 组成、流动相结构、待分离样品结构等对手性分离产生的影响；根据实验结果对 拆分机理进行初步探讨；对样品量较多，分离效果理想的化合物则利用半制备色 谱柱进行手性制备，以获得单一对映体并对左旋体和右旋体进行确证，对其光学 活性等进行测定和研究。 论文中采用的c h i r a l p a ki a 手性柱是日本d a i c e l 公司推出的新型手性固定 相，与常用的涂敷型手性固定相不同之处是采用直链淀粉三o ，5 二甲苯基氨基 甲酸酯) 衍生物固定在硅胶载体上，属键合型手性固定相。c h i r a l p a ki a 手性固定 相与使用较广泛的c h i r a l p a ka d 手性固定相相比，两者结构是相同的，只是制备 方法上不同，其结构式如图3 - 1 。 实验方法： ( 1 ) 在一定的h p l c 条件下检测，通过三维谱图确定最大吸收波长( 1 瑚) ； ( 2 ) 主要以正已烷为流动相的基础溶剂，极性调节剂为甲醇、乙醇、异丙醇 1 9 贵州人学2 0 0 7 届硕上研究生学位论文 等，通过改变极性调节剂的种类，改变极性调节剂与正已烷的相对含量等，达到 理想的分离效果： ( 3 ) 根据优化的色谱条件结合样品在制备柱上的出峰情况，确定手性制备条 件，进行手性制备； ( 4 ) 对制备所得左旋体和右旋体进行结构表征和测定。测”cn m r 、1 hn m r 、 3 1 pn m r ；计算e e ；测定旋光度值，计算出比旋光度值等。 ( 5 ) 根据实验结果，对手性识别机理进行初步探讨。 图3 - 1 c h i r a l p a ki a 手性固定相结构示意图 贵州大学2 0 0 7 届硕 研究生学位论文 4 实验部分 4 1h p i 上基本概念 化合物的色谱保留性质可以用容量因子( c a p a c i t yf a c t o r ) k 来度量，根据容 量因子的定义，k 。可表示为： k = ( t r t o ) t o 式中，t r 为溶质的保留时间，t o 为色谱柱的死时间。在一定温度下，容量因 子k 与色谱柱长和流动相的流速无关。 分离因子a 也称选择性因子( s e p a r a t i o nf a c t o ro rs e l e c t i v i t yf a c t o r ) ，是两种 溶质热力学平衡分配差别的度量，可表示为两溶质容量因子之比，即： u = k 2 ，k l 色谱分离度( ( r e s o l u t i o n ) r s 是描述两溶质在色谱柱中分离程度的指标，可 用两溶质保留时间之差与其平均峰宽之比来表示，即： r s = 2 ( t 舵- t 砒) ( w l + w 2 ) 式中t r l 和t r 2 分别为两溶质的保留时间，w l 和w 2 分别为两溶质的峰底宽。 当r s 等于1 时，两峰基本分离；当r s 等于1 5 时，两峰完全分离。 4 2 实验条件 4 2 1 实验仪器 高效液相色谱系统：美国a g i l e n t1 1 0 0 型高效液相色谱仪，配置四元泵、真空 脱气机、柱温箱、二极管阵列检测器及色谱工作站。 日本电子j e o l - e c x s 0 0 型5 0 0m h z 核磁共振仪；w z 乙2 a 自动旋光仪；x - 5 型数字显示