（微生物学专业论文）黑曲霉植酸酶微丸的制备和质量评价.pdf

：0 ：一 。 i 黑龙江大学硕士学位论文 i ii ab s t r a c t p h y t a s es e r v e sa sab i o l o g i c a lf e e da d d i t i v ef o re l e v a t i n gt h eu t i l i z a t i o nl e v e lo f p h o s p h o r u si nf e e d , i m p r o v i n gp e r f o r m a n c eo fa n i m a lp r o d u c t i o n , a n dr e d u c i n g e n v i r o n m e n t a lw a t e rp o l l u t i o nc a u s e db yt h eh i g h p h o s p h o r u sd e j e c t i o no fa n i m a l b u t t h ea p p l i c a t i o na n ds p r e a do fp h y t a s eh a v eb e e nl i m i t e di nc h i n ab e c a u s eo fi t sp o o r a n t i r e v e r s i o nf o r c e ，e s p e c i a l l yi t sp o o rt h e r m a ls t a b i l i t y i nt h i st h e s i s ，w ep r e p a r e da k i n do fp e l l e to fp h y t a s eo f a s p e r g i l l u sn i g e rw i t hg o o dt h e r m a ls t a b i l i t yu s i n ga d v a n c e d t e c h n o l o g yo fp h a r m a c e u t i c a lp r e p a r a t i o n s ，a n de v a l u a t e di t sq u a l i t y t h i ss t u d yw a s d e s i g n e dt op r e p a r eak i n do fp h y t a s ep e h e t so fa s p e r g i l l u sn i g e rw h i c hh a v eag o o d t h e r m a ls t a b i l i t yb y a p p l y i n go fa d v a n c e dt e c h n o l o g yo fp h a r m a c e u t i c a lp r e p a r a t i o n s t h ea c t i v i t yo fp h y t a s e p e l l e t s w e r e q u a n t i f i e db y v a n a d i u m a m m o n i u m m o l y b d a t em e t h o d t h er e s u l t so fi n t r a - d a ya n di n t e r - d a yp r e c i s i o n , r e c o v e r ya n d s a m p l ed e t e r m i n a t i o nw e r es a t i s f y i n g ，p r o v i n gt h a tt h i sm e t h o di sas c i e n t i f i c ，r e l i a b l e a n ds i m p l em e t h o df o rq u a n t i t a t i v ea n a l y s i so fp h y t a s e ，a n dc a nb eu s e df o ra c t i v i t y d e t e r m i n a t i o no ft h ep h y t a s ep e l l e t sd u r i n gi n s p e c t i o no f p r e p a r a t i o na n ds t a b i l i t y w ep r e p a r e dp h y t a s ep r i m ep e l l e t sp o s s e s s i n gs m o o t hs u r f a r ：e ，9 0 0 dr o u n d n e s s ， s m a l l - f r i a b i l i t y , u n i f o r mp a r t i c l es i z eb yu s i n ge x t r u s i o n - s p h e r o n i z a t i o nm e t h o dw i t h h i g hy i e l d t h eg o o dl i q u i d i t yo ft h eo b t a i n e dp e l l e t sw a si nf a v o ro fi t sm i x i n gi n t of e e d p e l l e t sa n da p p l y i n gi n t oa c t u a lp r o d u c t i o n l i q u i d i t yo fp e l l e t sw a sg o o d ，s oi t i s c o n d u c i v et om i x i n gi n t of e e dp e l l e t sa n da p p l y i n gi n t oa c t u a lp r o d u c t i o n p h y t a s ec o a t e dp e l l e t sw e r ep r e p a r e db yc o a t i n gp h y t a s ep r i m ep e l l e t su s i n g b o t t o m s p r a yt y p ef l u i d i z e db e d t h er e l a t i v er e s i d u a la c t i v i t yo fp h y t a s ec o a t e dp e l l e t s t r e a t e d 诚ms t e a mh e a t - m o i s t u r ea t10 0 f o r2 m i ns e r v e da st h em a i ni n s p e c t i o n i n d i c a t o r s w ed e t e r m i n e dt h ec o a t i n gp r e s c r i p t i o nb ys e l e c t i n gt h em a n n e ro fc o a t i n g ， c o a t i n gm a t e r i a lo fe v e r yl a y e ra n dt h et o t a lw e i g h ta sw e l la sw e i g h tr a t i oo fc o a t i n g l a y e ra c c o r d i n gt oa c t u a lp r o d u c t i o nr e q u i r e m e n t sa n ds t u d i e dt h ee f f e c to fp r o c e s s f a c t o r so nt h e r m a ls t a b i l i t yo fp h y t a s ec o a t e dp e l l e t s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tq u a l i t y a n dc h a r a c t e rs t u d yo f p h y t a s ec o a t e dp e l l e t sm e tt h er e q u i r e m e n t s ，t h ep h y t a s ec o a t e d n a b s t r a c t p e l l e t s h a du n i f o r ma c t i v i t y , s u i t a b l e p a r t i c l es i z e ，h i g hy i e l d a n dg o o dp r o c e s s r e p r o d u c i b i l i t y ，a n dp r e p a r a t i o np r o c e s so fp h y t a s ep e l l e t so fa s p e r g i l l u sn i g e rw a s s t a b l e ，r e l i a b l ea n dc o u l db ea p p l i e dt ot h ea c t u a lp r o d u c t i o n t h eq u a j i t yo fp h y t a s ec o a t e dp e l l e t sw a se v a l u a t e db yr e f e r r i n gt h em e t h o do f d r u gs t a b i l i t yi np h a r m a c e u t i c a lp r e p a r a t i o n s am o r ed e t a i l e di n s p e c t i o no ft h eh e a t r e s i s t a n c eo fp h y t a s ew a sc a r r i e do u ti n c l u d i n gt h er e s i s t a n c et od r yh e a t ，d a m ph e a ta n d s t a b i l i t yo ff e e dp r o c e s s i n gc o n d i t i o nt e s t h e a tr e s i s t a n c et e s t s s h o w e dt h a tt h e r e s i s t a n c eo fp h y t a s ec o a t e dp e l l e t sa g a i n s td r ya n dd a m p ，e s p e c i a l l ya n t i d a m p - h e a t a b i l i t yw a se x c e l l e n ta n dt h er e l a t i v ea c t i v i t yw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h a to f u n c o a t e dp e l l e t si nt h es t a b i l i t yo ff e e dp r o c e s s i n gc o n d i t i o nt e s t r e s u l t so ft h et e s t so f s t a b i l i t yi n c l u d i n gi n f l u e n c ef a c t o r si n d i c a t e dt h a tp h y t a s ec o a t e dp e l l e t ss h o u l db e s t o r e di nt h ea i r t i g h tc o n t a i n e ra n di nd a r ku n d e rl o w t e m p e r a t u r e k e yw o r d s ：p h y t a s e ；e x t r u s i o n - s p h e r o n i z a t i o n ；f l u i d i z e db e dc o a t i n g ；p e l l e t s 1 i i 黑龙江大学硕士学位论文 目录 中文摘要i a b s t r a c t i i 目录。 第1 章绪论1 1 1 植酸1 1 1 1 磷和植酸一1 1 1 2 植酸的抗营养作用1 1 2 植酸酶2 1 2 1 植酸酶的来源2 1 2 2 植酸酶的应用4 l - 2 3 影响植酸酶作用效果的因素一6 1 3 植酸酶在饲料方面的研究现状7 1 3 1 影响植酸酶热稳定性的因素一8 1 3 2 改善植酸酶热稳定性的方法9 1 3 3 药物制剂学技术改善植酸酶热稳定性的方法1 0 1 4 论文工作的提出1 4 第2 章植酸酶活性检测方法的建立1 6 2 1 前言。1 6 2 2 实验材料与仪器设备1 6 2 2 1 实验材料16 2 2 2 实验仪器及设备1 6 2 3 实验方法1 7 2 3 1 钒钼酸铵法测定植酸酶活性一1 7 2 3 2 重复性试验1 9 i v 目录 i 2 3 3 回收率试验1 9 2 3 4 三批样品测定1 9 2 4 实验结果与讨论2 0 2 4 1 标准曲线的绘制2 0 2 4 2 重复性试验结果2 0 2 4 - 3 回收率试验结果2 1 2 4 4 样品测定结果2 l 2 5 本章小结2 2 第3 章挤出滚圆法制备植酸酶素微丸2 3 3 1 前言 2 3 3 2 实验材料与仪器设备。2 3 3 2 1 实验材料2 3 3 2 2 实验仪器及设备2 3 3 3 实验方法2 4 3 3 1 植酸酶发酵液的制备。2 4 3 3 2 植酸酶微丸的制备方法2 5 3 3 3 处方影响因素考察2 6 3 3 4 工艺影响因素考察2 8 3 3 5 工艺稳定性考察2 9 3 4 实验结果与讨论2 9 3 4 1 处方因素实验结果2 9 3 4 2 工艺因素实验结果3 2 3 4 3 工艺稳定性考察3 4 3 5 本章小结。3 5 第4 章流化床法制备耐高温植酸酶包衣微丸3 6 3 6 材料与仪器设备3 6 v 黑龙江大学硕士学位论文 i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i a i i i i i i i i i i i i i i i i i 4 2 1 实验材料3 6 4 2 2 实验仪器及设备3 7 4 3 实验方法3 7 4 3 1 植酸酶包衣液的配制：。3 7 4 3 2 处方因素的影响3 9 4 3 3 工艺因素的影响4 l 4 3 4 工艺稳定性考察4 1 4 4 实验结果与讨论4 2 4 4 1 处方因素考察结果4 2 4 4 2 工艺因素的考察结果4 5 4 4 3 工艺稳定性考察结果4 8 4 5 本章小结与讨论4 9 第5 章植酸酶包衣微丸的质量评价5 l 5 1 前言5 1 5 2 实验材料与仪器设备5l 5 2 1 实验材料5 l 5 2 2 实验仪器及设备5l 5 3 实验方法5 2 5 3 1 热稳定性考察5 2 5 3 2 稳定性试验5 3 5 4 实验结果与讨论5 4 5 4 1 热稳定性考察结果5 4 5 4 2 稳定性考察结果5 6 5 5 小结5 7 结论。5 9 参考文献6 0 蜀l j 射。6 6 v i 目录 攻读学位期间发表的学术论文6 7 独创性声明6 8 v i i 第1 章绪论 1 1 植酸 1 1 1 磷和植酸 第1 章绪论 磷是动物机体内不可缺少的一种矿物质元素，具有多重的生理生化方面的作 用，是畜禽及水产养殖饲料中不可缺少的营养要素。 植酸( p h y t i ea c i d ，p a ) ，又名肌醇六磷酸酯，具有很强的螯合力( 结构如图1 1 ) 。 植酸广泛存在于植物组织和相应的粮食作物中，是植物性饲料中磷的重要存在形 式，其中植酸磷含量占植物总磷量的8 0 以上i l 】。然而以这种形式存在的磷很难 被单胃动物吸收。 h - j i 图1 - 1 植酸的结构图 f i g 1 - 1t h e s t r u c t u r ef i g u r eo f p a 1 1 2 植酸的抗营养作用 图1 - 2 植酸与金属离子螯合图 f i g 1 2t h es t r u c t u r ef i g u r eo fp aw i t hm e t a l i o n 植酸分子中的肌醇环上有6 个磷酸基团，均带有负电，对其他多价阳离子有 极强的络合性( 如图1 2 ) ，这是其具有抗营养作用的主要原因。主要表现在：植 酸可以与多种阳离子如z n 2 + 、m n 2 + 、c a 2 + 、m 9 2 + 、f e 3 + 等结合成被称为菲丁( p h y t i n ) 的难溶性络合物，降低了矿物元素的利用率，尤其是磷；可以与蛋白质及其水解 中间产物进行络合，影响蛋白质的利用率和消化酶的活性；通过对c e + 的络合作 用，影响淀粉、脂肪的消化率。 黑龙江大学硕士学位论文 1 2 植酸酶 植酸酶( p h y t a s e ) ，其系统名称为肌醇六磷酸酶( m y o i n o s i t o lh e x a p h o s p h a t e p h o s p h o h y d r o l a s e ) ，属于磷酸单酯水解酶，是催化植酸及其盐水解成肌醇与磷酸( 或 磷酸盐) 的酶类总称【2 - 5 1 。 植酸酶是一种重要的工业产品酶，多被用作畜禽饲料添加剂，水产品养殖也经 常会用到嘲，是一种新型绿色生物添加剂。作为单胃动物饲料添加剂，可以提高有 机磷的利用率，减少饲料中无机磷的添加量，降低饲料成本；减少动物粪便中无 机磷的排出量，降低对环境的污染，具有较好的综合效益嘿植酸酶还可以解除植 酸对其他金属离子和蛋白质的鳌合作用，提高机体对蛋白质和多种微量元素的利 用率，促进动物生长发育，提高畜禽市场效益。 1 2 1 植酸酶的来源 1 9 0 7 年，s u z u k i 等人第一次在米糠中发现了植酸酶，第一个纯化的植酸酶来 源于麸皮i s 。之后陆续发现植物、动物组织以及微生物都可以产生植酸酶。根据其 来源植酸酶主要分为三类：植物植酸酶、动物植酸酶和微生物植酸酶。 1 2 1 1 植物植酸酶 植物植酸酶分为6 植酸酶( 6 一p h y t a s e ) 和3 一植酸酶( 3 - p h y t a s e ) ，大部分属于6 一植 酸酶。植物性植酸酶含量较低；最适p h 在4 0 7 5 范围内，大多数在5 0 6 0 之间， 范围窄，不适宜在单胃动物的酸性环境中发挥作用；4 5 6 0 的范围内较稳定，而 在饲料加工温度7 0 8 0 c 下，酶活部分或全部失活【9 ，l o 】，热稳定性差。因此，植物 植酸酶基本不具有实际应用价值。 1 2 1 2 动物植酸酶 动物植酸酶的含量少且活性低、提取困难，不具有实际应用价值。多胃动物 2 第1 章绪论 i i i i i i i ii i- - l i eii ii i i i 宣i 宣i j i i i i i 宣i 宣i 有瘤胃微生物来源的植酸酶可以帮助其分解饲料中的植酸盐，而单胃动物则难以 有效利用植酸盐。因此在单胃动物饲料中添加植酸酶制剂显得尤为重要。 1 2 1 3 微生物植酸酶 自然界中很多种微生物都产植酸酶，如真菌、细菌、酵母、瘤胃和土壤微生 物等。研究较早且较为深入的产植酸酶真菌是黑曲霉，它是最活跃的产酶菌株， 它产生的植酸酶活性较高，耐热性强【1 1 , 1 2 】。 在实际生产中微生物发酵产植酸酶是最主要的来源，以曲霉属的两个菌株 a n i g e r 和a f i c u u m 最为常见。与其他来源植酸酶相比，微生物植酸酶具有植物植 酸酶及动物植酸酶无法比拟的优点，包括【1 3 。6 】：( 1 ) 生产周期短、产酶多、较容 易分离提纯；( 2 ) 来源广泛；( 3 ) 近年来发酵工程、生物技术和d n a 重组技术的 迅猛发展，使其活性大幅度提高，降低了生产成本；( 4 ) p h 值范围广( 2 5 一- 7 o ) ， p h 值为2 5 时和5 5 时与动物胃中和小肠酸度相适应，适合在畜禽肠道内发挥作 用；( 5 ) 无毒副作用，不影响消化系统的正常机能，外源性植酸酶在体内不存在 同类酶的负反馈作用；( 6 ) 热稳定性强，大多数微生物植酸酶的最适温度在4 5 - - 5 5 ，个别可达8 0 以上。从而使微生物植酸酶得到了广泛应用。 部分微生物产生的植酸酶及其基本理化性质见表1 1 。其中，真菌植酸酶具有 更突出的性能，特点突出。表现为：( 1 ) 丝状真菌植酸酶多为胞外酶，容易分离 纯化，而细菌植酸酶则往往是胞内酶( b s u b t i l i s 和e n t e r o b a c t e 除外) ，其活性相对 较低也不易分离纯化；( 2 ) 目前大多数已知微生物产生的植酸酶大多是3 植酸酶， 属于组氨酸酸性磷酸酶家族，少量细菌( 如e c o l i ) 产生的植酸酶是6 植酸酶；( 3 ) 真菌植酸酶的分子量普遍比细菌和酵母菌高；( 4 ) 来源于细菌、真菌及酵母菌的 植酸酶的最适温度相差较大；( 5 ) 不同来源植酸酶水解植酸的最适p h 不尽相同， 其中真菌植酸酶的最适p h 集中在2 5 和5 0 左右，这与畜禽的胃和小肠中的p h 正好相吻合，因此更适合在畜禽消化道催化植酸盐的水解。 来源于黑曲霉的3 植酸酶基因分子量为2 0 0 0 k d ，最适反应温度为5 5 。在 3 7 、p h 2 5 的条件下，以植酸为底物的k m 值为5 0 m m o l 。黑曲霉能同时产生植 3 黑龙江大学硕士学位论文 酸酶p h y a 、p 郴和磷酸酶a p h 。 c l a s s i f i c a t i o n 表1 1 来源于不同微生物的植酸酶酶学性质 t a b l e l - 1c h a r a c t e r so f p h y t a s ef r o md i f f e r e n tm i c r o o r g a n i s m s m o l to p tk m s 。u r c e ( k n a ) ( ) p h0 p t ( 1 l l m ) r e f e 啪c e s ( ) 1 ( i l l i 哪 b a c t e r i u mb a c i l l u ss u b t i l i s 3 6 5 4 4 7 4 4 a n i g e rn r r l 3 13 5 a n i g e r a t c c 9 1 4 2 a n i g e ry a ? lt e i g h e m a n i g e rs k - 5 7 p e n c i l l i u m b a s i d i o m y c e t e f u n g i l s a n f r a n c i s c e n s i s c b l 1 2 2 植酸酶的应用 8 5 1 0 0 8 4 6 6 6 0 6 5 5 4 7 2 5 5 6 0 7 0 4 0 7 o 2 o 1 0 7 o 6 5 8 5 5 8 5 0 5 8 2 5 ，5 5 6 55 0 5 2 5 52 5 5 0 2 5 ，5 5 5 54 0 4 0 - 6 05 0 6 0 4 54 0 0 0 4 o 1 3 0 5 5 o 0 5 o 3 0 0 4 o 1 o 6 1 o 0 2 【1 7 【1 8 】 【1 9 【2 0 】 【2 1 【2 2 】 【1 1 【2 3 】 【2 4 【2 5 】 【2 6 】 【2 7 】 微生物植酸酶可以水解饲料中的植酸，提高动物对磷、矿物质元素及蛋白质 和氨基酸的利用，减少排泄物中磷的污染，这一观点已被人们普遍证实和接受； 并已广泛应用于饲料工业、食品工业、医学工业和环保事业。 1 2 2 1 在饲料工业中的应用 ( 1 ) 提高矿物元素的生物利用率 植酸酶水解植酸，破坏了植酸对矿物元素的络合能力，释放出被络合的矿物 元素，从而提高了磷、钙、锌、镁、锰、铜和铁的生物利用率，促进了动物矿物 4 i 第1 章绪论 质营养的平衡。其中，植酸对锌的影响最大。 ( 2 ) 提高蛋白质、氨基酸的利用率 蛋白质可以与植酸形成不溶性复合物，还可以与植酸、多价阳离子形成三元 复合物，这些复合物的形成会改变蛋白质的结构，降低其溶解性。植酸酶可以通 过破坏植酸蛋白质键，释放出蛋白质以及与植酸结合的内源性蛋白酶、淀粉酶、 脂肪酶等，从而提高日粮的蛋白能量比，改善蛋白质的利用率。 ( 3 ) 提高动物的生产性能 目前，植酸酶作为单胃动物饲料添加剂，其喂养效果已在世界范围内得到广 泛确证【2 引。在日粮中添加植酸酶可以提高肉鸡的生产性能，增加体重、提高采食 量、蛋鸡的产蛋率【2 9 】及蛋壳的质量1 3 0 l ；在猪饲料中添加植酸酶明显提高了猪增重， 提高了矿物元素、蛋白质和一些氨基酸的表观消化率，降低了粪中磷的排放量1 3 l j ； 在水产动物饲料中添加适宜的植酸酶，可明显促进鱼类生长，提高饲料中磷、蛋 白质的利用率，降低磷排泄【3 2 。3 4 】。 1 2 2 2 在食品工业中的应用 许多主要的食品原料如豆类、谷物和油料作物中的植酸含量很高。而分解植 酸的植酸酶在人的小肠中的活性极低，难以利用植酸盐。用食品级的植酸酶处理 食品，可以减少植酸对微量元素如铁、锌的螯合，提高食品的营养价值。植酸对 锌的利用率影响最大，普遍认为以大豆为基础的含植酸盐的婴儿配方食品是锌吸 收率低的原因之一，所以食品级纯化的植酸酶可用于生产高档婴儿食品。h a r o s p ”6 j 等研究表明，在面包发酵期添加植酸酶可以显著改善面包的品质，缩短发酵时间。 植酸酶还可用于谷物沉淀加工、废弃物的处理和玉米的湿磨加工中。 1 2 2 。3 在医学中的应用 植酸酶可分解植酸，植酸的降解产物肌醇能降低血糖、胆固醇和甘油三酯， 还可用于治疗肝硬化、肝炎、脂肪肝、血管硬化、糖尿病、四氯化碳中毒等病症。 黑龙江大学硕士学位论文 植酸的降解产物之一三磷酸肌醇( i p 3 ) 具有去除镉、铝等在体内的副作用、消除 体内自由基、消炎、治疗糖尿病等作用。而肌醇五磷酸( i p 5 ) 和肌醇四磷酸( i p 4 ) 在鸟类红细胞中对血红蛋白具有别构调节作用【3 7 1 。 1 2 2 4 在环保中的作用 单胃动物和人因缺少分解植酸的植酸酶而不能充分利用植酸盐中的磷，大量 的磷随粪便排出体外后可以与土壤中的钙、铝等矿物元素结合成不溶性复合物而 保留在土壤中，同时从畜禽粪便中排出的磷是水体富集营养化的重要原因之一， 危及鱼虾及其他野生动物的生存。大量试验表明，畜禽日粮中添加植酸酶替代一 部分或全部无机磷可有效降低磷的排泄量，具有很好的环境效益。 1 2 3 影晌植酸酶作用效果的因素 作为饲料添加剂中重要的酶制剂，植酸酶被广泛应用于生产中，而在实际生 产中存在着一些因素影响着植酸酶作用效果的发挥，如制备方法、p 讯温度及湿 度、饲料中钙磷水平及钙磷比、v d 3 、有机酸以及其他酶类。 1 2 3 1 制备方法 植物产植酸酶活性较低，极易因添加到饲料中加工、贮存等因素遭到破坏。 而微生物来源的植酸酶在饲料制粒后仍能促进肉鸡的生产性能和钙磷的消化吸收 植 号子o 1 2 3 2p h 、温度及湿度 植酸酶是酶的一种，在相应的p h 、温度和湿度条件下才能表现出高活性。植 物植酸酶的最适p h 值范围较窄，微生物植酸酶的最适p h 值范围较宽，与动物胃 肠道酸度相近，更适于生产和应用。多数植酸酶的最适温度为4 0 6 0 c ，与正常畜 禽消化道的温度( 4 0 c 2 1 e 右) 相适应，能够在畜禽体内发挥较好的作用3 8 1 。此外， 6 第1 章绪论 i i i i - , , , i-aia n- - d ii i - i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i 添加植酸酶的饲料应保持适宜的水分。据b a s f 公司报道，在体外实验中，介质 含水量至少达到2 5 左右时，反应才能进行【3 9 1 。 1 2 3 3 饲料中钙磷水平及钙磷比 饲料中钙、磷水平和钙磷比是影响植酸酶水解植酸的重要因素。日粮高钙水 平对微生物植酸酶应用效果有负作用，因为钙与植酸会形成植酸钙或钙植酸蛋白 质复合物m ，低钙有利于磷的吸收。日粮中无机磷水平不仅影响植酸磷的释放和 磷在小肠的吸收，还会影响植酸酶的活性。一般认为，日粮钙磷比在1 1 1 4 时， 添加植酸酶的效果最好，随着钙磷比的增大，植酸酶的作用效果反而降低。 1 2 3 4v d 。 v d 3 能促进钙的吸收，降低了钙对植酸酶活性的抑制，问接提高了植酸酶的 活性【4 。 i 1 2 3 5 有机酸 有机酸可以提供有利于植酸酶水解的胃肠p h ，减少胃排空时间而延长植酸酶 对底物的作用时间。同时添加植酸酶和乳酸可大幅度提高猪的磷消化率。在鸡饲 料中，植酸酶与柠檬酸有良好的累加效果【4 2 1 。 1 2 3 6 其他酶类 王丽娟等4 3 】研究表明，同时添加植酸酶和纤维素酶对产蛋鸡植酸磷利用率的 改善具有加性效应( p b c ，即 包衣增重 内层中间层+ 外层 中间层外层。结果得出的最佳搭配为a 3 8 2 c 3 。但 是根据实际生产中的酶活需要( 最低酶活在5 0 0 0 u g 以上) 及成本费用的因素，包 衣增重不宜过大，因此选择总包衣增重为6 0 ，三层包衣增重比为6 ：1 ：3 。 通过以上处方工艺的筛选，确定包衣处方：选用三层包衣；m g s 0 4 作为内层、 阿拉伯胶为中间层、乙基纤维素为外层包衣材料，总包衣增重为6 0 ，三层包衣 增重比为6 ：1 ：3 。 第4 章流化床法制备耐高温植酸酶包衣微丸 4 4 1 4 溶解试验结果 表4 - 3 溶解试验结果表 t a b 4 3r e s u l t so fs o l u t i o nt e s t 样品 外观形状 植酸酶素丸 底层植酸酶包衣微丸 中间层植酸酶包衣微丸 三层植酸酶包衣微丸 较快溶解 逐渐溶解 逐渐溶解 仍成基本丸状，表面有细小孔洞 植酸酶素丸具有很好的溶解性，有助于植酸酶的释放。由于使用了水溶性包 衣材料，底层和中间层包衣微丸也能够很好的溶解，释放效果良好。三层包衣微 丸虽然不能很快溶解，但是可观察到在丸体表面有许多细小孔洞，由于底层和中 间层植酸酶微丸具有很好的释放效果，因此植酸酶可从这些小孔洞中释放，达到 生物效能。 4 4 2 工艺因素的考察结果 4 4 2 1 流化床制备工艺参数 根据各层实际包衣情况，以微丸在整个包衣过程中不粘结、保持良好的流化 状态为前提，确定流化床各个工艺参数，见表4 4 。 表4 4 流化床工艺参数 t a b 4 - 4t e c h n o l o g i c a lp a r a m e t e ro ff l u i d i z e db e d 投料量：投料量过少，则包衣液会喷涂在流化床内壁上，损失较多，包衣重 现性不佳；而投料量过多时，随着包衣层的不断增重，微丸过重不能处于良好的 4 5 黑龙江大学硕士学位论文 流化状态，使包衣膜不均匀。 包衣液流速：包衣液流速由恒流泵控制。在雾化压力一定的条件下，恒流泵 流速低，则包衣液雾化效果好，微丸不易粘结，但微丸制备时间延长；提高喷液 速率可以缩短操作时间，但流速过大则微丸不能及时干燥，从而导致微丸间的粘 连。因此，应在微丸不粘结，保持较好的流化状态的前提下，尽量地增大包衣液 流速。 包衣温度：温度主要影响溶剂的蒸发速度及成膜质量。包衣温度过低，喷涂 在微丸表面上的包衣液可能会由于干燥过程变慢而引起微丸间的粘连，同时包衣 时问会有所延长；温度过高，则会使雾滴在附着在微丸表面之前干燥，致使包衣 材料损失较大，包衣效率降低。因此，包衣必须在适宜的温度下，通过控制包衣 温度，使溶剂以一定速率蒸发。 雾化压力：在一定范围内，雾化压力越大，包衣雾滴越小，包衣材料在微丸 表面形成的衣膜较为致密。雾化压力过小，雾滴则较大，微丸表面过湿，干燥不 及时而易导致微丸粘结；雾化压力过大，雾滴则较小，干燥过程太快致使包衣材 料未附着于微丸表面前就已经干燥成粉末，材料损失，包衣效率低下。所以，应 根据实际需要调节雾化压力。 流化风量：流化风量影响着微丸表面包衣层的干燥速度和产品的收率。适合 的流化风量可以使微丸保持较高的流化高度而使微丸处于较好的流化状态，使包 衣膜均匀，保证包衣质量。在实际操作过程中可根据流化状态调节流化风量，保 证良好的干燥、流化状态和较高的收率。 4 4 2 2 包衣温度和热处理温度对植酸酶活性影响的考察结果 按照上述处方和工艺制备植酸酶包衣微丸三批，考察包衣温度3 5 3 8 。c 为和热 处理温度为4 0 。c 对植酸酶活性的影响。 第4 章流化床法制备耐高温植酸酶包衣微丸 i ii l lu 表4 5 包衣温度和热处理温度对植酸酶活性影响 t a b 4 - 5e f f e c to f c o a t i n ga n dh e a tt r e a t m e n tt e m p e r a t u r eo nt h ep h y t a s ea c t i v i t y 批号编号 相对酶活( ) r s d ( ) 0 0 1 0 0 2 0 0 3 9 8 2 9 6 90 9 1 9 8 6 植酸酶微丸最外层选用乙基纤维素水分散体。通常水分散体在包衣过程中胶 粒软化不彻底，衣膜融合不完全，需要经过充分热处理，胶粒才能进一步聚结， 最终获得致密、均匀的衣膜【7 1 】。因此，在整个包衣结束后，可让植酸酶包衣微丸 继续在流化床内流化半小时后，再放置电热烘箱中使膜进一步愈合。由表4 5 结果 可知，不高于4 0 的温度对于植酸酶活性的影响极小，植酸酶微丸在包衣结束后 相对剩余酶活均在9 8 左右，最大程度地保留了植酸酶活性。 4 4 2 3 烘干时间对植酸酶质量的影响 ：l 掴一 ；：j n h 0 口哪n t 呐 图4 - 4 烘干时间对植酸酶包衣微丸耐湿热性的影响 f i g 4 - 4e f f e c to fh e a tt t e a t m e n tt i m eo nt h ed a m ph e a tr e s i s t a n c eo fp h y t a s ec o a t i n gp e l l e t s 包衣制备出的植酸酶微丸需经过干燥方能制备完成。以湿热处理后的酶活力 为指标观测4 0 c 烘箱不同干燥时间对植酸酶微丸质量的影响。结果( 图4 4 ) 表 明随着干燥时间的延长植酸酶微丸抗湿热能力不断增强，说明包衣工艺完成后加 4 0 ( 2 干燥有助于提高包衣膜阻隔外界湿热对酶活力的影响。综合考虑到生产效率 和成本，将植酸酶微丸包衣后4 0 c 通风干燥的时间定为1 2 h 。 4 7 黑龙江大学硕士学位论文 4 4 3 工艺稳定性考察结果 表4 - 6 植酸酶包衣微丸性状考察结果，n = 3 t a b 4 - 6r e s u l t so fp h y t a s ec o a t e dp e l l e t sq u a l i t ya n dc h a r a c t e r , n = 3 表4 7 植酸酶包衣微丸收率 t a b 4 7y i e l do f p h y t a s ec o a t e dp e l l e t s 批号编号 收率( ) 平均值( )r s d ( 徇 由表4 7 可知，通过2 0 2 4 目的样品约占9 0 左右，说明粒径适宜，有助于植 酸酶包衣微丸与饲料的混合。 表4 - 8 植酸酶包衣微丸活性均匀度 t a b 4 8u n i f o r m i t yo fp h y t a s ec o a t e dp e l l e t sa c t i v i t y 样品号活力值g )r s d ( 呦 研究结果( 表4 8 ) 表明，植酸酶包衣微丸酶活力均匀，工艺稳定。 表4 9 工艺稳定性考察结果 t a b 4 - 9r e s u l t so f t e c h n o l o g yv a l i d a t i o n 4 8 第4 章流化床法制备耐高温植酸酶包衣微丸 经包衣工艺各因素的综合考察确定的最适宜的包衣处方和工艺设备参数( 包 衣温度3 5 3 8 。c 。风量1 7 2 2 h z ，干燥时间1 2 h ) ，制备三批，性状质量( 4 3 4 ) 综合 结果考察表明各批表观指标和植酸酶相对酶活具有良好的稳定性( r s d = i 1 0 ) 。 考虑到生产过程中的不确定因素比较复杂，为保证包衣的综合质量，经上述实验 研究验证制备过程中流化床包衣机可按表4 _ 4 所示的控制范围进行及时调整。 4 5 本章小结与讨论 在固体制剂中，有很多药品通过包衣改变药物释放特性，如缓控释、肠