（植物学专业论文）水稻rarf基因的克隆和鉴定水稻功能基因的电子克隆.pdf

第一部分：水稻r a r f 基因的克隆和鉴定 4 - f2 彳、 * ，l lh i 植塑生长塞应激因至a r f ( a u x i nr e s p o n s e 3f a c t o r ) 家族是植物中起源较早的 一类基因，1 9 9 7 年，第一个a r f 基因在拟南芥中被克隆，命名为a r f l ，此后t u l m a s o v 小组利用同源区段非严紧杂交相继在e d n a 文库中筛选到十几个拟南芥 a r k ：类基因并对其功能作了一定研究，除了已经发现并命名的4 0 多个a r f 类 基因外，在已完成全测序的拟南芥基因组中，通过计算机注释，还发现了数十个 候选a r f 基因，说明这是一个比较庞大的家族除了a r f 2 ( 原命名为a r f i 结合 蛋白，a r f l 一b p ) a r f 3 外，a r f 家族基因都包括2 个保守区段，即d n a 结合区 d b d 和蛋白相互作用区a u x i a a ，其中d b d 能够和生长素应答元件a u x r e “t g t c t c ”结合，从而启动受生长素调控的下游基因的表达，而a u x i a a 区 则能够和同源或异源的a u 1 a a 区结合，形成二聚体，研究表明a r f 类蛋白在 活体内通过二聚体或多聚体作用。而d b a 和a u x i a a 两个功能域由连接区( m r ) 相连，a r f 家族不同成员之间的差别主要来源于d b d 和a u x i a a 之间的联接 区，这一区段的不同氨基酸组成决定该基因上调或下调下游基因转录，其中富含 q 的连接区能够上调下游基因表达，而富含p 的连接区则下调下游基因表达。 1 _ _ 。1 。_ 。”“一 1 9 9 7 年至今，已经有不少报道将a r f 家族成员和已知的拟南芥突变型相联系。 m i e ns e s s i o n s 等( 1 9 9 7 ) 证明了造成e 卯w 突变型的基因为a r f 3 。r e n e m h a r p e r 等( 2 0 0 0 ) 通过实验证明了影响拟南芥培养组织分化生长的n p h 4 基因座 所编码的基因即为创玎7 了目前在水稻中尚未克隆一例全长a r f 家族基因，即 使在单子叶植物中，也仅有玉米v p l 等极少数a r f 家族成员被克隆，生长素作 为调控植物生长发育的主要激素之一( 另一个为乙烯) ，具有重要的生理功能， 研究与生长素应答相关的基因对于人工育种，作物改良有重要意义。 本实验中的水稻a r f 基因片段来自于水稻幼穗( 作为t e s t e r ) 对茎尖分生组 织( y 乍s bd r i v e t ) 进行差减杂交( s s h ) 所得到的e s t 库，在g e n b a n k 中进行同源比 较后，发现了2 个具有最高同源性的拟南芥基因，分别为a r f i 和一个功能不明的 类a r f 基因( a r f l i k eg e n e ) ，厨源区段位于近5 端的d n a 结合区，因此初 步判断为一个候选a r f 基因采用n o r t h e r n 杂交未检出任何阳性信号，筛选 c d n a 文库也未得到阳性克隆，说明该基因表达量非常低，常规方法不适合于该 基因的全长c d n a 克隆 实验方法和步骤 r n a 抽提及反转录： 水稻组织液氮研磨后，采用t r i z o i 试剂盒提取总r n a 用e l o n t e c hs m a r te d n ak i t 进行r n a 反转录，得到e d n a 群体。 3 ，端r a c b 在已知e s t 区段3 分别设计2 个正向引物a r f 5 和a r f 7 ，位置如图 a r f 5 a r f 7 7 6 6 b p 甜( a r f ( 2 ) f 2 1 一一1一 按以下条件进行2 轮p c r 第一轮： 引物：a r f 3 ，s m a r te d n ak i t3 引物，反应体系采用r o c h eh i g hf i d e l i t y e x p a n dp c rk i t ，每2 5 u l 反应体系加入0 5 u l 反转录e d n a 产物。 9 5 3 m i n + ( 9 4 x3 0 s + 6 0 x3 0 s + 7 2 x2 m i n ) 3 5 + 7 2 5 m i n p c r 得到一条约2 i k b 的条带，割取这一条带，华舜胶回收试剂盒回收后电泳 估算浓度。 第二轮： 引物：a r f 5 ，s m a r te d n ak i t3 引物，每2 5 u l 反应体系加入l n g 第轮 反应产物，其他条件同第一轮。 经第二轮p c r 后，得到长度约1 8 k b 的单一条带，以p r o m e g at - v e c t o rk i t 克隆该片段，经测序后和拟南芥中的同源基因比较发现该片段已经包含了完 整的3 端。 1 第一轮3 r a c e 产物 2 第二轮3 r a c e 产物 3 d l 2 0 0 0m a r k e r 5 端r a c e 在已知e s t 区段内设计2 个反向引物a r f ( 一2 ) ，a r f ( 一4 ) ，位置见图。以a r f ( 一2 ) 和c l o n t e c h5 端引物进行第一轮p c r 扩增，反应条件同3 端r a c e 。第一 轮扩增得到一条约8 0 0 b p ，略为扩散的条带和4 5 0 b p 处由5 引物形成的单引 物扩增带( 根据经验这一条带在多数5 r a c e 反应中均出现) 。割取8 0 0 b p 的 条带作为第二轮扩增的模板，以5 端引物和a r f ( 一4 ) 进行第二轮扩增，条件 同3 r a c e 反应。得到约6 5 0 b p ，略为扩散的条带。割取这一条带，进行克隆 后，挑出其中插入片段最长的克隆进行测序。对序列进行翻译和同源分析后 发现该片段仍未包含5 起始密码在内。 4 1 第一轮5 r a c e 产物 2 第二轮5 r a c e 产物 3 d l 2 0 0 0m a r k c r 因此，希望通过得到染色体序列来推测5 端起始区域序列。用已知c d n a 序 列搜索数据库后未发现相应的基因组序列，所以决定通过b a c 克隆来获得其基 因组序列。 b a c 库筛选、亚克隆和测序 以所得到的a r f 片段为探针，在严紧条件下( 6 5 。c 杂交，洗膜) 和i r 6 4 的 b a c 库高密度膜杂交，出现两个明显的阳性信号，分别代表克隆2 4 l 0 5 和 4 1 0 0 5 h i n di i i 指纹分析表明这两个克隆是邻接克隆，代表了染色体上一段 连续的区段再以该a r f 片段为探针对不同酶切的2 4 l 0 5 进行s o u t h e r n 杂交， 得到几种阳性条带，见图2 ，分别克隆了其中1 1 k b 的h i n di i i 片段和 1 3 k b 、1 6 k b 的2 个e c o ri 片段，测序后根据已知e s t 序列的方向拼接成一 段3 k b 的连续片段，以其3 端片段( p c r 扩增产物) 为探针对不同酶切( 不包 含h i n di i i ) 的2 4 l 0 5 进行s o u t h e r n 杂交时，没有发现任何小于7 k b 的阳性 片段，进一步分析发现以2 4 l 0 5 为模板，以a r f 已知区的3 引物a r f7 和 s p 6 通用引物为两端引物可扩增出一约1 2 k b 片段，且其长度恰好等于a r f 基 因组序列己知3 区长度，由于该i r 6 4b a c 库是以h i n di i i 为酶切位点所构 建，因此推测该基因恰好在3 h i n di i i 位点处被打断，因而转向克隆4 1 0 0 5 进行3 端延伸，经检测，该克隆包含了目的基因的3 部分 左图：h i n d i i i 的杂交图谱 1 l a m d a ，h i n d1 1 1m a r k e r 22 札0 5 ，h i n di i l 右图：e e o ri 的杂交图谱 1 d l 2 0 0 0 m a r k e r 2 2 4 l 0 5 e c o ri q 上u u 3 h “m 1 仃 ， 2 4 l 0 5 一 b a c 克隆4 1 0 0 5 和2 4 l 0 5 在r a r f 区段的h i n di i i 酶切图谱 在此后的延伸过程中采用了特异引物在b a c 克隆上直接步移测序的方法。 取得了很好的结果，从而省略了片段亚克隆但是在步移至近5 端时遇到 段高g c 比区段而无法向前测序，因此只能再次通过亚克隆，以从另一端测 序通过s o u t h e r n 杂交，找到一个约3 k b 的x b a i x h o i 双酶切阳性片段，测 序后和原有序列拼接，得到总共8 k b 的片段，覆盖了目的基因区段。 x b ai d ( h oi 的杂交图谱 i l a m d a h i n di i im a r k e r 2 4 1 0 0 5 x b al 3 4 1 0 0 5 x b a i + x h o l 4 4 1 0 0 5 x h oi 序列分析和c d n a 克隆 对所得的8 k b 序列5 端用软件进行启动子分析后，选出了3 个最可能的 6 翻译起始位点m 1 ，m 2 和m 3 ，其中m 2 的分值最高。针对这3 个位点设计了3 个引物m 1 ，m 2 和m 3 ，分别和3 终止密码处的引物3 一e 进行p c r 扩增。结 果m 1 无扩增产物，而m 2 、m 3 都得到了约2 5 k b 的条带，其中m 2 的扩增条带 较m 3 弱得多，推测是m 2 和m 3 之间一段高g c 比区段( 3 5 4 3 ) 阻碍彻底变性 而影响了p c r 扩增效率。克隆全长片段，测序分析显示，根据读码框，m 2 处 的a t 6 应为真正的翻译起始点。由于m 2 上游到第一个同读框终止密码间没有 r n a 剪接位点，因此可以认定已经得到了最靠近5 端的外显子，即得到了全 长c d n a 。 r a r e 全长c d n a l m 3 3 e 引物扩增产物 2 m i - 3 e 引物扩增产物 3 m 2 3 e 引物扩增产物 4 l a m d a i n di i im a r k e r 结构分析 这个水稻r a r f 基因在基因组中跨度为5 4 9 6 b p ( 起始密码a t g 到终止密码 t a a ) ，由1 4 个外显子组成，其中编码序列，即c d n a ，全长为2 5 7 4 b p ，翻译 产物为一个8 5 7 氨基酸的蛋白质。氨基酸序列同源比较显示，该蛋白质是一 典型的a r f 家族成员，5 端为特异的d n a 结合区d b d ，3 端为蛋白质互作域 a u x i a a ，这两个区域和标准结构相比均有很高的保守性。两个结构域中间为 连接区( m e d i a t er e g i o n ，m r ) ，这一区段在g e n b a n k 数据库中没有一致性非 常高的同源序列，在氨基酸组成上，脯氨酸p 略为偏高，但是不如a r f l 中有 那么明显的p 富含区 d b dm ra u x i a a r a r f 基因的表达图谱 由于该基因表达量很低，无法用n o h e m 检测到，因此采用r t - p c r 来检 测不同组织的表达图谱，使用的引物为a r f 5 和a r f 2 ，扩增的片段长度为6 0 0 b p 。 从检测结果来看该基因仅在幼穗和继代培养愈伤组织中表达，值得注意 的是，本实验选用的分化愈伤组织为初分化愈伤组织，材料为黄绿间杂的组 织块，也就是说，从形态上看，还包含了部分未分化愈伤组织，但是用灵敏 的r t - p c r 却检测不到表达，这一现象提示这个r a r f 基因的表达是激素水平 敏感的，因为两种培养基仅在2 , 4 一d 和n a a i a a 的浓度上有变化，其它成份 完全一致，这种表达的激素敏感性和已知的拟南芥a r f i 基因不同，a r f i 的 表达水平是和生长素( i a a ) 水平无关的。 r a r f 表达图谱： 1阳性对照： 2 d l 2 0 0 0 分子标记： 3短于5 m m 的幼穗： 4 叶，( 温室培养3 星期苗) ： 5根，( 组织来源同叶) ： 6 接入分化培养基2 周后的分化愈伤组织： 7继代培养愈伤组织 水稻r a r f 基因的定位 以测序获得的8 k b 序列在分子标记库中检索，很幸运的找到了一个已经定 位在水稻中的分子标记r z 7 9 7 。根据s u s a nm c c o u g h 于2 0 0 1 年修正的水稻分 子标记图谱( g e n o m e c o m e l l e d u ) ，这个分子标记被定位在“号染色体上端 3 0 1 c m 处。值得注意的是，l l 号染色体上端是已知的抗病基因密集区段，包 括x a 2 1 ，x a 4 等在内的许多重要抗病基因都被定位在这区段，而用这个 r a r f 基因检索e s t 库时，虽然没有检索到水稻来源的e s t ，但是检索到了一批 大麦，高梁，小麦等近缘物种来源的e s t ，其中有相当一部分来源于受病原诱 导组织的e s t 库，这些背景都提示这个r a r e 基因可能和抗病性有某些内在联 系，值得深入研究。 与其它同源基因的比较 迄今为止，这个r a r f 仍然是水稻中唯一一个得到全长序列的a r f 类基因。 2 0 0 2 年3 月，日本水稻基因组计划公布了一批水稻a r f 基因序列，均为不完 整的c d n a 序列，根据同源分析，都缺少5 端第一个外显子和部分第二个外 显子序列，这和本项研究中克隆5 端序列所遇到的困难是一致的，可能是水 稻中a r f 类基因在5 端有某种特殊的2 级结构或者高g c 比区段阻碍反转录 反应的完全进行，这些序列上的特殊结构究竟是什么，它们对水稻中a r f 类 基因调控表达是否有特殊作用是一个需要进一步研究的问题。 将已公布的所有水稻a r f 基因序列和相关的拟南芥a r f 基因( 对应的 o r t h o l o g s ) 以及本实验中克隆的a r f 基因的氨基酸序列进行对位比较后得到 了如下的系统树图，其中a 开头的为拟南芥来源的基因，r 开头的为水稻来源 的基因，其中r a r f l i k e 即为本实验中克隆的基因： 从这个系统树中可以看出a r f 类的基因起源很早，要远早于水稻和拟南 芥( 分别代表单双子叶植物) 的种分化年代，即起源于2 亿年前，而且a r f 类基因家族内的这些基因分化也在种分化前就已完成。从这张图中可以看出 本实验中克隆的r a r f 基因虽然和拟南芥中的a r f l 以及一个类a r f 基因 ( a r f l i k eg e n e ) 具有最高的同源性，但是这两个基因都不是它的直系同源 9 一一舢一础一础一一一一一一 戮嬲纛篇嚣鬈篓 形成的，因此还无法从拟南芥中的已知基因功8 e 术7 匡锻m 、旧i 4 。 “ 写 2 = 兰耍 三要 z 。 兰i 3 景 z 。 兰蠹 苫苗 主： 主羞 主置 i 募 三嘎 昱三 z 2 矗 j o 至萤 n z ： 三： 蛊 2 器 量j j 盏 誊； “芸 警芒 ：薹 e = ：主 ：2 i 口 呈三 三三 盏主 逆 兰苎 占兰 譬兰 看童 z ；z 她匝尉s岛鄙凶困醐皿配h涎* 酃越h gou叫名声葺_ 碰虹hhh召一z窖。兰h 酃止h茸ou山s4o itlflil j l f ! 蕈丑 口_ 一 z o o 部扯io二，1日4譬o，in c l o n i n ga n dc h a r a c t e r i z a t i o no f ar i c ea r f f a m i l yg e n e f u l ll e n g t hc d n ao far i c ea r ff a m i l yw a sc l o n e da n dc h a r a c t e r i z e d t h i st 黼 g e n ec o n s i s t so fat y p i c a la u x i nr e s p o n s ee l e m e n tb i n d i n gd o m a i na n da na u x i a a p r o t e i ni n t e r a c t i o nd o m a i n ，w h i c ha r el i n k e db ya r lu n o b v i o u sp r i c hm e d i a t er e g i o n t h eg e n ei sp h y s i c a l l yl i n k e dt or f l pm a k e rr z 7 9 7 ，h e n c e ，w a sm a p p e do nr i c e c 1 r o m o s o m e1i t h ee x p r e s s i o np a t t e mi nd i f f e r e n tt i s s u es u g g e s t st h a tt h ee x p r e s s i o n o ft h er a r fg e n ei sr e g u l a t e db yp l a n th o r m o n ec o n c e n t r a t i o n p h y l o g e n i ct r e es h o w s t h i sr a r eg e n ei sn o tt h eo r t h o l o go f t h ea r f l i k eg e n ei na r a b i d o p s i st h o u g ht h e s e2 g e n e sw e r ea l i g n e dv e r yw e l la ta a s e q u e n c el e v e l k e y w o r d ：a u x i nr e s p o n s ef a c t o r , m a p p i n g ，p a t t e m ，o r t h o l o g 1 2 附：r a r f 全长c d n a 和氨基酸序列 mata evgg g ggegd a aaaav 1 0 2 03 0 4 05 0 6 0 a t g g c g a c g g c g g a g g t c g g c g g c g g c g g cg g t g a g g g g g a t g c t g c t g c c g c g g c g g t g t a c c g c t g c cg c c t c c a g c cg c c g c c g c c gc c a c t c c c c c t a c g a c g a c g g c g c c g c c a c ar ag 7 0 g c g c g a g c a g c g c g c t c g t c lwsa 1 3 0 c t g t g g a g c g g a c a c c t c g c yf po 1 9 0 t a c t t c c c g c a t g a a g g g c g rm0l 2 5 0 c g g a 丁g c g t g c c t a c g t c a ka ep 3 1 0 a a g g c c g a g c t t c c g g c t c g r oed 3 7 0 c g a c 从g a a g g c t g t t c t t c v rpr 4 3 0 g t t a g g c c a c c a a t c c g g t g ggg 8 0 g c g g c g g c g g c g c c g c c g c c cag 1 4 0 c g t g c g c g g g g c a c g c g c c c gh 2 a g g g g c a c a t t c c c c g t g t a ynl 2 6 0 t g t a c a a t c t a c a t g t t a g a d td 3 2 0 c a g a c a c c g a g t c t g t g g c t ng s 3 8 0 a t 从c g g c t c t a t t g c c g a g vhs 4 4 0 g g g t g c a c t c c c c a c g t g a g gg g 9 0 c g g c g g a g g a g c c g c c t c c 丁 pl v 1 5 0 g c c g c t g g t g c g g c g a c c a c e 0v 2 1 0 c g a g c a g g t g g c t c g t c c a c p w k 2 7 0 c c c a t g g m g g g g t a c c t t c evy 3 3 0 c g a g g t t t a t g c t c c 从a t a tee 3 9 0 t a c t g a g g a g a t g a c t c c t c fck 4 5 0 a t t c t g c m g t 从g a c g t t c g gge 1 0 0 g g a g g a g g g g c c t c c l c c c e t vpr 16 0 a c g g t g c c g a t g c c a c g g c t east 2 2 0 g a g g c c t c g a c t c c g g a g c t lce 2 8 0 a t c c t g t g t g t a g b a c a c a c a0lt 3 4 0 g o t c a g c t c a c g a g t c g a g t evp s 4 0 0 g a g g t g c c t t c t c c a c g g 从 丁l丁a 4 6 0 a c a t t g a c c g t g t 从c t g g c 1 3 dal 1 1 0 a g g a c g c g c t t c c t g c g c g vge 17 0 g g g t t g g g g a c c c m c c c c t n0 v 2 3 0 c c 从c c a g g t g g t t g g t c c a vmn 2 9 0 a g g t t a t g 从 t c c m t a c t t llp 3 5 0 c t c t g c t t c c g g c g m g g apa 4 1 0 c t g c t c c a g c g a c g a g g t c g s dt 4 7 0 c c t c g g a c c g g a g c c t g t g f te 12 0 g t t c a c g g a g c a a g t g c c t c ke f 1 8 0 g a a g g a g t t c c t t c c t c a a g ge0 2 4 0 a g g c g a g c a g t c c g c t c g t c ve l 3 0 0 c g t t g a g c t g g c 从c t c g a c elk 3 6 0 t g 从t t g 从g a c t t a a c t t c agh 4 2 0 a g c t g g g c a t t c g a c c c g t a s丁h 4 8 0 g a g c a c a c a t c t c g t g t g t a ggf s 4 9 0 g g c g g c t t c t c c g c c g a a g a r opp 5 5 0 c g t c a g c c t c g c a g t c g g a g rhif 6 1 0 c g t c a c a t a t g c a g t g t a t a vs ak 6 7 0 g t t a g t g c c a c a a t c a c g g t elr v 7 3 0 g a a c t g c g t g c t 丁g c g c a c ssh 7 9 0 a t a t c a g c c t a t a g t t c g g gt mf 8 5 0 g g g a c c a t g t c t g g t c a y dry 9 1 0 t a c g a t c g c t a t g c t a g c g a rfes 9 7 0 a g g t t t g a a a t c c a m c t t t vlr 5 0 0 c g g t g c t g c g g c c a c g a c g c t0e 5 6 0 c 从c a c 从g a g t t g t g t t c t rg0 6 2 0 t c a g a g g t c a a g t c t c c a g t rlv 6 8 0 a a c g g c t t g t t t g c c g a a c a gvr 7 4 0 t t g g a g t c a g m c c t c g t c smh 8 0 0 a c a g c a t g c t g t t a c g t 丁vy 8 6 0 t c a c t g t c t a a g t g c a g a t mes 9 2 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c g t t t c c t g g ele 1 3 5 0 c g a g t t a g a a g c t c m t c t t ntp 1 4 1 0 t m c a c t c c c a t t g t g a g g g sys 1 4 7 0 g a g t t a c a g t c t c 从t b t c a fcs 1 5 3 0 t t t c t g t t c t a a a g a c a a g a kwrs 1 0 6 0 a a a t g g c g c t t t t a c c g c g a vspw 1 1 2 0 g t t t c t c c c t c a a a g a g g g a prtk 1 1 8 0 c c a a g a a c c a g g t t c t t g g t akea 12 4 0 g c a j u a g a a g c g t l t t c t l c f0丁0 1 3 0 0 t t c c a g a c a c m g g t c t g t g saok 1 3 6 0 a g t g c t c a g a t c a c g a g t c t q wk 1 4 2 0 a t a c a g t g g a t a t g t o a c c t e ml s 1 4 8 0 g a g a t g c t a t c t c t c g a t a lpe 0 1 5 4 0 t t a c c t g a g c a a t g g a g t c g 1 5 lk v 1 0 7 0 c c c t t m g g t g g g a a t 丁c g a 0e 1 13 0 g g c a a a t a g a c c g t t t a t c t r lr 1 1 9 0 a g a g g c t t c g t c t c c g m g c a tk 12 5 0 c t g c 丁a c g a g a c g a t g c t t e na 13 1 0 从g a g t g c t t c t c t t a c g sm 1 3 7 0 a a t c m t c a t t t a g t t a g t a lgs 1 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c c c t g c g ek0s 2 0 5 0 g a g a m t g t t c t c t t t a g m tvn 1 5 8 0 a c a c a g t a 从 t g t g t c a t t t sfm 16 4 0 g g t c c 丁t c a t c c a g g a a g t a eag 1 7 0 0 a g g m g c t g g t c c t t c g a c c al p 17 6 0 c t g c a c t g c c g a c g t g a c g g nsh 1 8 2 0 c a 从t t c c c a g t t t 从g g g t hgd 1 8 8 0 c c c a t g g t g a g g g t c c a c t sp a 1 9 4 0 a c a g c c c a g c t g t g g t otp 2 0 0 0 c a c a a a c a c c g t g t t t g t g g d o s 2 0 6 0 c t g t c c t t c g a c t a g g m g aqy 15 9 0 t g c t c a g t a t a c g a g t c a t a p pn 16 5 0 g c c t c c a m t c g g a g g t t t a vls 1 7 1 0 t g t g t t g t c t a c a c a a c a g a grg 17 7 0 a g g c c g a g g t t c c g g c t c c a m dd 1 8 3 0 c a t g g a t g a t g t a c c t a c t a vqk 1 8 9 0 t g t t c a c a a a a c m g t c t t t kse 1 9 5 0 g a ，蚺t c t g m c t t t a g a c t t g at 2 0 t 0 a g g t b c t c t t c c a c g a t g a kam 2 0 7 0 t 从g g c c a t g a t t c c g g t a c odo q 1 6 0 0 c m g a t c m c g 丁t c 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