（植物学专业论文）tdna标签在水稻基因组中的分布与特征.pdf

博士学位论文：t - d n a 标签在水稻基因组中的分布与特征 碱基对并没有明显的偏好。分析了2 3 3 令t - d n a 左边界和1 9 0 个t - d n a 右 边界与水稻基因组交接位点的序列，结果表明t - d n a 在整合过程中不仅伴 随着左右边界序列的缺失及“f i l l e rd n a ”的插入，而且还以单拷贝或多 拷贝的形式插入在基因组中的同一个位点。从缺刻位髯开始，大部分左边 界的缺失少于3 5 b p ，大多数的右边界序列缺失为2 1 b p 。“f i l l e rd n a ”的 长度从几个b p 到3 0 0 b p 左右，其来源是t - d n a 或基因组序列，在单拷贝的 t - d n a 左右边界或两个重复的t - d n a 中间都会有f i l l e rd n a ”的插入。t - d n a 整合的复杂结构用d s b r 模型比较容易解释。 关键词：水稻( o r y z a s a t i v al ) ，t - d n a ，旁邻序列，t - d n a 插入分布，饱和突 变，t - d n a 水稻交接点，t - d n a 缺失，f i l l e rd n a 博士学位论文：t - d n a 标签在水稻基因组中的分布与特征 a b s t r a c t i nt h ep r e s e n ts t u d y ，t r a n s g e n i cr i c ep l a n t sw e r eg e n e r a t e du s i n gt - d n at a g t h ef l a n k i n gs e q u e n c e so ft - d n ai n s e r t i o n si n r i c eg e n o m ew e r er e s c u e db y t a i l - p c r o n et h o u s a n da n dn i n ef l a n k i n gs e q u e n c e sw e r ep r e c i s e l ym a p p e do n 12r i c ec h r o m o s o m e sb yb i o i n f o r m a t i c sa n a l y s i s t h ed i s t r i b u t i o na n d c h a r a c t e r i z a t i o no fo n et h o u s a n da n dn i n et - d n at a g si n t e g r a t i o ni nr i c eg e n o m e w e r ea n a l y z e di nd e t a i l t h er e s u l t sw e r es u m m a r i z e da sf o l l o w s ： 1 t w ot h o u s a n dt r a n s g e n i cr i c ep l a n t so fn i p p o n b a r ea n dz h o n g h u an o 11w e r e o b t a i n e db yu s i n gt - d n at a g t a i l p e rw a sp e r f o r m e dw i t ht h r e ea r b i t r a r y d e g e n e r a t ep r i m e r st or e s c u et h ef l a n k i n gs e q u e n c e so ft - d n a i n s e r t i o n si nt h er i c e g e n o m e o n et h o u s a n da n ds i xh u n d r e dt h i r t y o n ef l a n k i n gs e q u e n c e sw e r e s u c c e s s f u l l yr e s c u e da n dt h er a t i ow a sa p p r o x i m a t e l yu pt o8 0 2 10 0 9f l a n k i n g s e q u e n c e sw e r em a p p e do n 12r i c ec h r o m o s o m e s o u rr e s u l t s s h o w e dt h a tt d n at a g sw e r eu n e v e n l ys p r e a do nr i c ec h r o m o s o m e sa n d p r e f e r e n t i a l l yi n s e r t e di ng e n e - r i c hr e g i o n s t h ed i s t a lr e g i o n so fm o s to ft h e c h r o m o s o m ea l m sh a dr e l a t i v e l yh i g hl e v e l so ft d n ai n t e g r a t i o n ，w h i l e t h e p e r i c e n t r o m e r i cr e g i o n sh a dl o w e rl e v e l s o nc h r o m o s o m e4 ，t h es h o r ta r ma n d t h ep e r i c e n t r o m e r i cr e g i o no ft h el o n ga r mh a dal o wd e n s i t yo ft - d n ai n s e r t i o n s c h r o m o s o m e s1 ，2 ，a n d3h a dr e l a t i v e l yh i g hl e v e l so ft d n ai n t e g r a t i o n ，o v e r t w i c et h o s eo fc h r o m o s o m e slla n d1 2 ，a n dc o n t a i n e d4 8 o ft h et o t a lm a p p e d t d n at a g s 3 t h et - d n ai n s e r t i o n sw e r ea n a l y s e di ng e n i e ，i n t e r g e n i ca n dr e p e a td n ar e g i o n s 。 o n l y2 。4 t - d n ai n s e r t i o n s w e r ei d e n t i f i e di nr e p e a td n ar e g i o n s t h e f r e q u e n c i e so f t d n ai n s e r t i o n si ng e n i ea n di n t e r g e n i cr e g i o n s ( 5 8 1 a n d4 1 ，9 ) s h o w e dag o o dc o r r e l a t i o nw i t ht h ep r e d i c t e ds i z ed i s t r i b u t i o no fg e n i ea n d i n t e r g e n i cr e g i o n si nt h er i c eg e n o m e ( 5 7 8 a n d4 2 2 ) t h ed e n s i t yo ft - d n a 博士学住论文：t - d n a 标签在水稻基因组中的分布与特征 i n s e r t i o n si n5 - a n d3 一r e g u l a t o r yr e g i o n so f5 0 0 b pa r o u n dt h ea t ga n ds t o p c o d o n s ，r e s p e c t i v e l y , w a sa p p r o x i m a t e l y2 - 3 5t i m e st h o s ei ng e n i ea n di n t e r g e n i c r e g i o n s ，s u g g e s t i n gt h a tt - d n ai sp r e f e r e n t i a l l y i n s e r t e di nt h e5 - a n d3 r e g u l a t o r yr e g i o n so ft h eg e n e s t h i si sc o n f i r m e db ya n a l y s i so fc h r o m o s o m e1 a n da l s of o u n dt h a tt - d n ai n s e r t i o n sh a da r e l a t i v e l yh i g hd e n s i t yi ni n t r o n s ，( m o r e t h a nt w i c et h a ti ne x o n s ) ，w h i c hi n d i c a t e st h a tt - d n aw a sp r e f e r e n t i a l l yi n s e r t e d i n t oi n t r o n sc o m p a r e dt oe x o n s t h er e s u l t sa l s os u g g e s t e dt h a tt - d n aw e r e e v e n l ys p r e a dw i t h i ng e n e s ，w i t h o u ta n yo b v i o u sb i a st o w a r dt h e5 o r3 7 e n d so f t h e g e n e s 4 a n a l y s i so fa t c o n t e n to ft h er i c eg e n o m es e q u e n c e sn e a rt - d n ai n s e r t i o ns i t e s i n d i c a t e st h a tn oo b v i o u sb i a sw a ss e e ni nt h ea tn u c l e o t i d ec o m p o s i t i o nc l o s et o t - d n ai n s e r t i o ns i t e s t h ej u n c t i o ns e q u e n c e sb e t w e e nt - d n ab o r d e r sa n dt h e r i c eg e n o m ew e r ed e t e r m i n e df o rt h el e f tb o r d e r so f2 3 3t - d n ai n s e r t i o n sa n dt h e r i g h tb o r d e r so f1 9 0t o d n ai n s e r t i o n s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt r u n c a t i o n so f t - d n ab o r d e r s ，i n s e r t i o n so ff i l l e rd n aa n dt h ef o r m a t i o no fi n v e r t e da n dd i r e c t r e p e a to c c u r r e dd u r i n gt - d n ai n t e g r a t i o n f r o mt h ec l e a v a g es i t eo ft h et - d n a b o r d e r s ，n ot r u n c a t i o n so c c u r r e df o rn i n el e f tb o r d e r s ，m o s to ft h ei e f tb o r d e r s d e l e t e dl e s st h a n3 5 b pa n dm o s to f t h er i g h tb o r d e r st r u n c a t e dt o2 1 b p t h es i z eo f f i l l e rd n a r a n g e df r o ms e v e r a lb pt oa p p r o x i m a t e l y3 0 0 b pa n do r i g i n a t e df r o m t - d n ao rg e n o m es e q u e n c e s t h ei n s e r t i o n so ff i l l e rd n ao c c u r r e df o rb o t ht h e s i n g l ec o p yo f t - d n a b o r d e r sa n dt h et - d n a r e p e a t s t h ec o m p l e xc o n f i g u r a t i o n o f t - d n ai n t e g r a t i o n sc o u l db ee x p l a i n e db yd s b r e p a i rm o d e l k e y w o r d s ：r i c e ( o r y z as a t i v al ) ，t - d n a ，f l a n k i n gs e q u e n c e s ，t - d n ai n s e r t i o n d i s t r i b u t i o n ，s a t u r a t i o nm u t a g e n e s i s ，t - d n a r i c ej u n c t i o n s ，t - d n at r u n c a t i o n s ，f i l l e r d n a v 博士学位论文：t - d n a 标签在水稻基因组中的分布与特征 致谢 本论文是在导师吴平教授的悉心指导下完成的。感谢导师三年来在学习和 科研工作中给予我的指导、鼓励和帮助，使我得以顺利地完成学业。导师严谨 求是的科学态度、活跃的科研思维和忘我的敬业精神给我留下了深刻的印象， 并时刻激励着我，使我终生受益。 三年来在科研、学习和生活中得到了诸多老师和同学的帮助。感谢王明怡 博士、金维正博士和张帆硕士在科研过程中的合作与帮助。感谢吴运荣老师在 转基因材料的种植与管理、刘非燕老师在测序方面给予的帮助。感谢易可可老 师和李靖老师在科研过程中给予的许多建议和帮助。感谢农学系石春海老师及 冯英博士后平时给予的关心和鼓励。感谢农科院王林友同学给予的帮助。同时 感谢实验室的杨玲、姜华武、王首锋、王君晖、黄建中等老师，毛传澡、郑炳 松、吴忠长、侯兴亮、张麝龙、刘洪家、朱世华、佃蔚敏、杜黎明、王芳、齐 晓朋、焦芳蝉、党磊等博士研究生及黄帼、樊叶杨、周洁、贾巧君、汪少敏、 徐敏、韩秋敏、俞超、宋听蔚、沈翊、林涛、曹娇仙等硕士研究生平时给予的 帮助。 最后，感谢我的父母和爱人王安良及我所有的朋友三年来对我的关心、理 解和支持! 陈双燕 2 0 0 3 年5 月于杭州华家浊 博士学位论文：t - d n a 标签在水稻基因组中的分布与特征 缩写 e s t b a c p a c y a c i r g s p b g i i r r i t - d n a a c d s i p c r t a i l p c r a d t i p n l s a s e m s p e g s s g r d s b r s s a s d s a 缩略词表 a b b r e v i a t i o n 英文 e x p r e s s e ds e q u e n c et a g b a c t e r i a la r t i f i c i a lc h r o m o s o m e s p 1 d e r i v e da r t i f i c i a lc i i r o m o s o m e s y e a s ta n i f i c i a lc h r o m o s o m e s t h ei n t e r n a t i o n a lr i c eg e n o m e s e q u e n c i n gp r o g r a m b e i j i n gg e n o m i c si n s t i t u t e t h ei n t e r n a t i o n a lr i c er e s e a r c hl n s t i t u t e t r a n s f e r r e dd n a a c t i v a t o r d i s s o c i a t i o n i n v e r s ep c r t h e r m a la s y m m e t r i ci n t e r l a c e dp c r a r b i t r a r yd e g e n e r a t ep r i m e r t u m o r - i n d u c i n gp r i n c i p l e n u c l e a rl o c a l i z i n gs i g n a l a c e t o s y r i n g o n e e t h y lm e t h a n e s u l f o n a t e p o l y e t b y l e n eg l y c o ! s i n g l e s t r a n d e dg a pr e p a i r d o u b l e - s t r a n d e db r e a k i n gr e p a i r s i n g l e - s t r a n d e da n n e a l i n g s y n t h e s i s d e p e n d e n ts t r a n d - a n n e a l i n g 中文 表达序列标签 细菌人工染色体 p 1 人工染色体 酵母人工染色体 国际水稻基因组测序计划 北京华大基因研究中心 国际水稻研究中心 转移d n a 反向p c r 热不对称交错p c r 随机筒并引物 肿瘤诱导因子 核定位信号 乙酰丁香酮 甲基磺酸乙酯 聚乙二醇 单链缺口修复 双链断裂修复 单链退火 依赖合成的链的退火 v 博士学位论文：t - d n a 标签在水稻基因纽中的分布与特征 1 水稻基因组测序计划 一、文献综述 1 1 “基因组”及“基因组学”概念的提出 “基因组”( g e n o m e ) 一词出现于约8 0 年前，指一种生物的全套基因和染 色体。“基因组学”( g e n o m i c s ) 是t h o m a s r o d e r i c k 在1 9 8 6 年提出的用于描 述基因组作图( m a p p i n g ) ，测序( s e q u e n c i n g ) 和基因组结构分析等领域的研 究工作，并由此诞生了以“g e n o m i c s ”为名的第本专业科学杂志。在过去的 十多年中，基因组学研究的内容也不断延伸和扩大，从单纯的基因作图，测序 和基因组结构分析发展到基因组功能的研究。这样，基因组学就分成了两个分 支( h i e t e r 。1 9 9 7 ) ，一个是结构基因组学( s t r u c t u r a lg e n o m i c s ) ，另一个是功 能基因组学( f u n c t i o n a lg e n o m i c s ) 。结构基因组学仍保留最初的基因组学的研 究内容，以构建生物的遗传图谱、物理图谱和e s t 图谱及基因组测序为主要 目标。功能基因组学则反映了基因组学研究的一个新的方面，即利用结构基因 组学研究获得的大量数据与信息评价基因的功能，包括生化功能、细胞功能、 发育功能、适应功能等，其主要手段结合了高通量的大规模的实验方法、统计 和计算机分析技术，不同于以往仅注重于单个基因或蛋白质功能的研究，而是 更注重于在同一系统的实验中研究所有的基因( h i e t e r ，i 9 9 7 ) 。 1 2 水稻基因组测序计划研究现状 水稻由于其基因组比较小，容易进行遗传转化以及与其它禾本科作物的 进化同源性，成为禾本科基因组研究的模式作物。国际水稻基因组测序计划 ( i r g s p ) 于1 9 9 7 年开始启动水稻粳褪品种只本精基因组的测序工作，至 2 0 0 2 年1 2 月i r g s p 已经公布了3 6 2 m b 的菲重叠的水稻基因组草图序列， 1 1 4 4 2 个测序的遗传标记已经被锚定到b a c p a c 克隆上 ( h t t w w w t ir o r z t d b e 2 k l l o s a l b a c m a o o i n r d e s c r i 划) ，目前，第1 和第4 染色体的测序、注释和分析工作已经结束并在n a t u r e 杂志上公稚( f e n g 等，2 0 0 2 ；s a s a k i 等，2 0 0 2 ) 。除了i r g s p 外，p h a r m a c i a ( p e a p a c k ，n j ) 和 博士学位论文：t - d n a 标签在水稻基因纽中的分布与特征 1 水稻基因组测序计划 一、文献综述 1 1 “基因组”及“基因组学”概念的提出 “基因组”( g e n o m e ) 一词出现于约8 0 年前，指一种生物的全套基因和染 色体。“基因组学”( g e n o m i c s ) 是t h o m a s r o d e r i c k 在1 9 8 6 年提出的用于描 述基因组作图( m a p p i n g ) ，测序( s e q u e n c i n g ) 和基因组结构分析等领域的研 究工作，并由此诞生了以“g e n o m i c s ”为名的第本专业科学杂志。在过去的 十多年中，基因组学研究的内容也不断延伸和扩大，从单纯的基因作图，测序 和基因组结构分析发展到基因组功能的研究。这样，基因组学就分成了两个分 支( h i e t e r 。1 9 9 7 ) ，一个是结构基因组学( s t r u c t u r a lg e n o m i c s ) ，另一个是功 能基因组学( f u n c t i o n a lg e n o m i c s ) 。结构基因组学仍保留最初的基因组学的研 究内容，以构建生物的遗传图谱、物理图谱和e s t 图谱及基因组测序为主要 目标。功能基因组学则反映了基因组学研究的一个新的方面，即利用结构基因 组学研究获得的大量数据与信息评价基因的功能，包括生化功能、细胞功能、 发育功能、适应功能等，其主要手段结合了高通量的大规模的实验方法、统计 和计算机分析技术，不同于以往仅注重于单个基因或蛋白质功能的研究，而是 更注重于在同一系统的实验中研究所有的基因( h i e t e r ，i 9 9 7 ) 。 1 2 水稻基因组测序计划研究现状 水稻由于其基因组比较小，容易进行遗传转化以及与其它禾本科作物的 进化同源性，成为禾本科基因组研究的模式作物。国际水稻基因组测序计划 ( i r g s p ) 于1 9 9 7 年开始启动水稻粳褪品种只本精基因组的测序工作，至 2 0 0 2 年1 2 月i r g s p 已经公布了3 6 2 m b 的菲重叠的水稻基因组草图序列， 1 1 4 4 2 个测序的遗传标记已经被锚定到b a c p a c 克隆上 ( h t t w w w t ir o r z t d b e 2 k l l o s a l b a c m a o o i n r d e s c r i 划) ，目前，第1 和第4 染色体的测序、注释和分析工作已经结束并在n a t u r e 杂志上公稚( f e n g 等，2 0 0 2 ；s a s a k i 等，2 0 0 2 ) 。除了i r g s p 外，p h a r m a c i a ( p e a p a c k ，n j ) 和 博士学位论文：t - d n a 标签在水稻基因纽中的分布与特征 s y n g e n t a ( s a nd i e g o ) 两家私立公司也在进行水稻日本瞎基因组的测序工作。 p h a r m a c i a 采用与i r g s p 同样的测序方法。已有2 5 9 m b 的基因组序列被测序， 其草图序列经过p h a r m a c i a 同意后可获得( h t t p ：w w w _ _ r i c e - r _ e s e a r c h o r g ) 。 s y n g e n t a 采用全基因组鸟枪法测序，已获得覆盖水稻基因组9 3 的草图序列， 基因注释估计水稻基因组编码3 2 0 0 0 5 0 0 0 0 个蛋白质( g o f f 等2 0 0 2 ) ，其草 图序列经s y n g e n t a 许可后也可获得( 鱼鲢q ；型型墼! 边区：q 篷) 。另一个水稻草图序 列是由北京华大基因研究中心( b e i j i n g g e n o m i c s n s t i t u t e ，b g i ) 提供，他们对 中国种植的水稻籼稻品种9 3 1 l 进行了全基因组鸟枪法测序，覆盖了3 6 0 m b 的基因组序列，这项工作不仅对于水稻亚种籼稻的基因发现而且对于水稻进行 比较基因组的研究提供了很好的资源( y u 等2 0 0 2 ) 。 2 水稻功能基因组的研究 2 1 水稻突变体库的构建 进行功能基因组学研究，离不丌突变体。拟南芥功能基因组学的研究是建 立在首先获得大量突变体的基础之上( a a r t s 等，1 9 9 3 ；l o n g 等，1 9 9 3 ) 。出 此可见，突变体在功能基因组研究方面具有非常重要的作用。 饱和诱交和饱和插入是植物基因组学研究中的两种策略，前者基于正向遗 传学的思路，后者基于反向遗传学的思路，目前均用于水稻突变体库的构建和 功能基因组学的研究。 1 ) 理化诱变，利用射线或化学诱变剂处理水稻种子或幼苗。i r r i 目前收集了 大量出快速中子、y 射线和化学诱变剂诱变产生的突变体( f i s h e r 等，2 0 0 0 ； l e u n g 等，2 0 0 0 ) ，并开始用生物胁迫或非生物胁迫的方法来筛选形念缺失突 变体。理化诱变不需要进行转基因，缺点是由于没有标签很难确定突变体的表 现型是由哪个基因引起。 2 ) t - d n a 插入，利用农杆菌介导的转化系统，把t - d n a 引入水稻。j e o n 等 ( 2 0 0 0 ) 利用t - d n a 插入已经构建了一个有2 2 0 9 0 独立转化植株的水稻突变 体库。该t - d n a 标签具有基因捕获的作用，他们对根、叶、花和种子等器官 进行g u s 染色分析发现有1 6 2 1 测试器官表现g u s 阳性，既有组织器官特 2 博士学位论文：t - d n a 标签在水稻基因纽中的分布与特征 s y n g e n t a ( s a nd i e g o ) 两家私立公司也在进行水稻日本瞎基因组的测序工作。 p h a r m a c i a 采用与i r g s p 同样的测序方法。已有2 5 9 m b 的基因组序列被测序， 其草图序列经过p h a r m a c i a 同意后可获得( h t t p ：w w w _ _ r i c e - r _ e s e a r c h o r g ) 。 s y n g e n t a 采用全基因组鸟枪法测序，已获得覆盖水稻基因组9 3 的草图序列， 基因注释估计水稻基因组编码3 2 0 0 0 5 0 0 0 0 个蛋白质( g o f f 等2 0 0 2 ) ，其草 图序列经s y n g e n t a 许可后也可获得( 鱼鲢q ；型型墼! 边区：q 篷) 。另一个水稻草图序 列是由北京华大基因研究中心( b e i j i n g g e n o m i c s n s t i t u t e ，b g i ) 提供，他们对 中国种植的水稻籼稻品种9 3 1 l 进行了全基因组鸟枪法测序，覆盖了3 6 0 m b 的基因组序列，这项工作不仅对于水稻亚种籼稻的基因发现而且对于水稻进行 比较基因组的研究提供了很好的资源( y u 等2 0 0 2 ) 。 2 水稻功能基因组的研究 2 1 水稻突变体库的构建 进行功能基因组学研究，离不丌突变体。拟南芥功能基因组学的研究是建 立在首先获得大量突变体的基础之上( a a r t s 等，1 9 9 3 ；l o n g 等，1 9 9 3 ) 。出 此可见，突变体在功能基因组研究方面具有非常重要的作用。 饱和诱交和饱和插入是植物基因组学研究中的两种策略，前者基于正向遗 传学的思路，后者基于反向遗传学的思路，目前均用于水稻突变体库的构建和 功能基因组学的研究。 1 ) 理化诱变，利用射线或化学诱变剂处理水稻种子或幼苗。i r r i 目前收集了 大量出快速中子、y 射线和化学诱变剂诱变产生的突变体( f i s h e r 等，2 0 0 0 ； l e u n g 等，2 0 0 0 ) ，并开始用生物胁迫或非生物胁迫的方法来筛选形念缺失突 变体。理化诱变不需要进行转基因，缺点是由于没有标签很难确定突变体的表 现型是由哪个基因引起。 2 ) t - d n a 插入，利用农杆菌介导的转化系统，把t - d n a 引入水稻。j e o n 等 ( 2 0 0 0 ) 利用t - d n a 插入已经构建了一个有2 2 0 9 0 独立转化植株的水稻突变 体库。该t - d n a 标签具有基因捕获的作用，他们对根、叶、花和种子等器官 进行g u s 染色分析发现有1 6 2 1 测试器官表现g u s 阳性，既有组织器官特 2 博士学位论文：t - d n a 标签在水稻基因纽中的分布与特征 s y n g e n t a ( s a nd i e g o ) 两家私立公司也在进行水稻日本瞎基因组的测序工作。 p h a r m a c i a 采用与i r g s p 同样的测序方法。已有2 5 9 m b 的基因组序列被测序， 其草图序列经过p h a r m a c i a 同意后可获得( h t t p ：w w w _ _ r i c e - r _ e s e a r c h o r g ) 。 s y n g e n t a 采用全基因组鸟枪法测序，已获得覆盖水稻基因组9 3 的草图序列， 基因注释估计水稻基因组编码3 2 0 0 0 5 0 0 0 0 个蛋白质( g o f f 等2 0 0 2 ) ，其草 图序列经s y n g e n t a 许可后也可获得( 鱼鲢q ；型型墼! 边区：q 篷) 。另一个水稻草图序 列是由北京华大基因研究中心( b e i j i n g g e n o m i c s n s t i t u t e ，b g i ) 提供，他们对 中国种植的水稻籼稻品种9 3 1 l 进行了全基因组鸟枪法测序，覆盖了3 6 0 m b 的基因组序列，这项工作不仅对于水稻亚种籼稻的基因发现而且对于水稻进行 比较基因组的研究提供了很好的资源( y u 等2 0 0 2 ) 。 2 水稻功能基因组的研究 2 1 水稻突变体库的构建 进行功能基因组学研究，离不丌突变体。拟南芥功能基因组学的研究是建 立在首先获得大量突变体的基础之上( a a r t s 等，1 9 9 3 ；l o n g 等，1 9 9 3 ) 。出 此可见，突变体在功能基因组研究方面具有非常重要的作用。 饱和诱交和饱和插入是植物基因组学研究中的两种策略，前者基于正向遗 传学的思路，后者基于反向遗传学的思路，目前均用于水稻突变体库的构建和 功能基因组学的研究。 1 ) 理化诱变，利用射线或化学诱变剂处理水稻种子或幼苗。i r r i 目前收集了 大量出快速中子、y 射线和化学诱变剂诱变产生的突变体( f i s h e r 等，2 0 0 0 ； l e u n g 等，2 0 0 0 ) ，并开始用生物胁迫或非生物胁迫的方法来筛选形念缺失突 变体。理化诱变不需要进行转基因，缺点是由于没有标签很难确定突变体的表 现型是由哪个基因引起。 2 ) t - d n a 插入，利用农杆菌介导的转化系统，把t - d n a 引入水稻。j e o n 等 ( 2 0 0 0 ) 利用t - d n a 插入已经构建了一个有2 2 0 9 0 独立转化植株的水稻突变 体库。该t - d n a 标签具有基因捕获的作用，他们对根、叶、花和种子等器官 进行g u s 染色分析发现有1 6 2 1 测试器官表现g u s 阳性，既有组织器官特 2 博士学位论文：t o d n a 标签在水稻基因组中的分布与特征 异表达也有组成型的表达。r o i s 等人( 2 0 0 2 ) 提出了一种简单快速鉴定t - d n a 插入基因的方法，他们将所有拟南芥转基因植株的d n a 建成混合池，利用 t - d n a 特异引物和基因特异引物进行p c r 扩增即可快速获得t - d n a 插入突变 体。t - d n a 作为插入标签的优点是产生的突变体稳定、拷贝数低以及便于进 行遗传和分子分析。缺点是需要大量的转基因工作以及复杂的t - d n a 插入增 加了对突变体分析的难度。 3 ) a c d s 转座子标签法，分别获得有a c 转座酶基因和d s 转座子的转基因植 株，通过杂交可产生大量的d s 插入突变体。目前已有许多报道利用玉米中的 a c d s 转座子标签构建水稻突变体库的工作( c h i n 等，1 9 9 9 ；c r e c o 等，2 0 0 1 ： e n o k i 等，1 9 9 9 ) 。a c d s 转座子标签的优点是只需要构建少量的转化植株通过 杂交便可产生大量的突交体以及可以产生回复突变。缺点是很难产生稳定的插 入突变体以及对突变体的遗传分析比较困难。 4 ) t o s l 7 插入，t o s l 7 是粳稻品种中活跃的逆转座子之一，在细胞培养过程中 表现出活跃的转座能力。h i r o c h i k a 研究小组构建了一个含有2 5 0 0 0 0 个t o s l 7 插入的水稻突变体库( h i r o c h i k a 等，1 9 9 6 ：h i r o c h i k a ，1 9 9 7 ) 。利用t a i l p c r 方法已经获得了6 7 7 0 个t o s l 7 插入位点的旁邻序列。这种插入标签的优点是 不需要转基因，主要缺点是插入拷贝数多以及突变体由t o s l 7 插入引起的频率 很低( 1 0 ) 。 2 2 获得t - d n a 或转座子插入旁邻序列的方法 如果植物基因被t d n a 或转座子敲除后产生表型变化，根据与t - d n a 或 转座予相邻的植物d n a 序列，通过生物信息学分析，就能获得哪个基因控制 这种表型的信息。目前，获得t - d n a 或转座子插入旁邻序列的方法有：i p c r ( i n v e r s ep c r ) ( o c h m a n 等，19 8 8 ) ，t a i l p c r ( t h e r m a l a s y m m e t r i ci n t e r l a c e d p c r ) ( l i u 等，1 9 9 5 ) 、p c r 步行( p c r w a l k i n g ) ( b a l z e r g u e 等，2 0 0 1 ；c o t t a g e 等，2 0 0 1 ；s i e b e r t 等，1 9 9 5 ；) 及质粒营救法( p l a s m i dr e s c u e ) 。 1 ) i p c r ：i p c r 的原理是首先用限制性的酶消化带有t - d n a 或转座子插入的 基因组d n a ，所选用的限制性酶在t - d n a 或转座子中没有酶切位点或只有单 博士学位论文：t o d n a 标签在水稻基因组中的分布与特征 异表达也有组成型的表达。r o i s 等人( 2 0 0 2 ) 提出了一种简单快速鉴定t - d n a 插入基因的方法，他们将所有拟南芥转基因植株的d n a 建成混合池，利用 t - d n a 特异引物和基因特异引物进行p c r 扩增即可快速获得t - d n a 插入突变 体。t - d n a 作为插入标签的优点是产生的突变体稳定、拷贝数低以及便于进 行遗传和分子分析。缺点是需要大量的转基因工作以及复杂的t - d n a 插入增 加了对突变体分析的难度。 3 ) a c d s 转座子标签法，分别获得有a c 转座酶基因和d s 转座子的转基因植 株，通过杂交可产生大量的d s 插入突变体。目前已有许多报道利用玉米中的 a c d s 转座子标签构建水稻突变体库的工作( c h i n 等，1 9 9 9 ；c r e c o 等，2 0 0 1 ： e n o k i 等，1 9 9 9 ) 。a c d s 转座子标签的优点是只需要构建少量的转化植株通过 杂交便可产生大量的突交体以及可以产生回复突变。缺点是很难产生稳定的插 入突变体以及对突变体的遗传分析比较困难。 4 ) t o s l 7 插入，t o s l 7 是粳稻品种中活跃的逆转座子之一，在细胞培养过程中 表现出活跃的转座能力。h i r o c h i k a 研究小组构建了一个含有2 5 0 0 0 0 个t o s l 7 插入的水稻突变体库( h i r o c h i k a 等，1 9 9 6 ：h i r o c h i k a ，1 9 9 7 ) 。利用t a i l p c r 方法已经获得了6 7 7 0 个t o s l 7 插入位点的旁邻序列。这种插入标签的优点是 不需要转基因，主要缺点是插入拷贝数多以及突变体由t o s l 7 插入引起的频率 很低( 1 0 ) 。 2 2 获得t - d n a 或转座子插入旁邻序列的方法 如果植物基因被t d n a 或转座子敲除后产生表型变化，根据与t - d n a 或 转座予相邻的植物d n a 序列，通过生物信息学分析，就能获得哪个基因控制 这种表型的信息。目前，获得t - d n a 或转座子插入旁邻序列的方法有：i p c r ( i n v e r s ep c r ) ( o c h m a n 等，19 8 8 ) ，t a i l p c r ( t h e r m a la s y m m e t r i ci n t e r l a c e d p c r ) ( l i u 等，1 9 9 5 ) 、p c r 步行( p c rw a l k i n g ) ( b a l z e r g u e 等，2 0 0 1 ；c o t t a g e 等，2 0 0 1 ；s i e b e r t 等，1 9 9 5 ；) 及质粒营救法( p l a s m i dr e s c u e ) 。 1 ) i p c r ：i p c r 的原理是首先用限制性的酶消化带有t - d n a 或转座子插入的 基因组d n a ，所选用的限制性酶在t - d n a 或转座子中没有酶切位点或只有单 博士学位论文：t d n a 标签在水稻基因纽中的分布与特征 个酶切位点；将酶切后的d n a 片段连接，使其环化；然后用t - d n a 或转座子 边界序列设计的一对反向引物进行p c r 扩增，即可获得插入位点两侧的基因 组序列，如果限制性酶在t - d n a 或转座子中有一个酶切位点，通过p c r 扩增 可得到插入位点一侧的基因组序列。 2 ) t a i l p c r ：刘耀光等设计的热不对称交错p c r 方法最初用于y a c 和p 1 载体克隆基因的分离，后又广泛用于t - d n a 或转座子标签的分离。其基本原 理是一端用嵌套的t - d n a ( 转座子) 特异引物，另一端用短的随机简并引物 ( a r b i t r a r yd e g e n e r a t ep r i m e r , a d ) ，连续进行三轮p c r 反应。高温退火( t m 值一般在5 7 - 6 2 间) 适合于特异引物的扩增，低温( t 。值在4 4 。c 一4 6 。c 范 围) 适合a d 引物的退火，通过高温退火和低温退火交替进行，使特异引物和 简并引物都得以扩增，从而使靶向序列以双链形式指数增长。同时，由于a d 引物在旁邻序列处有一个或多个退火位点，从而在简并引物之间形成非特异的 扩增。第一轮反应产生的非特异扩增产物在第二轮和第三轮反应中逐渐减少， 最后得到特异性扩增产物( 图1 ) 。t a i l p c r 与其它方法相比具有简便、特异、 高效、快速和灵敏等特点，适合于商通量地获得t - d n a 或转座子插入旁邻序 列，已在模式植物如拟南芥和水稻中广泛应用。 3 ) p c r 步行法：主要包括三个步骤( 图2 ) ：首先，用平末端限制性酶消化基 因组d n a ，产生平术端的d n a 片段：其次，加入不对