（微生物学专业论文）少根根霉产gla的培养及检测条件的研究.pdf

南刀- 人学坝j 研究生学位论史 中立摘要 中文摘要 y 一亚麻酸( y l i n o l e i ca c i d ) 简称g l a ，是一种高级多不饱和脂肪酸，由 于其在人体内所具有的独特功效而引起人们的广泛重视。国内外有关专家及学者 从多方面对其进行了深入的研究和探讨，揭示了g l a 的重要作用机理。 少根根霉主要合成包括y 一亚麻酸在内的十八碳的多不饱和脂肪酸，不存在 更长链的脂肪酸。本研究以少根根霉为菌种，在不同的培养基、不同培养温度以 及添加不同诱导因素的条件下对其发酵产物中g l a 相对含量作以分析，并通过 不同的脂肪酸提取酯化方法对发酵产物中总脂肪酸进行提取，观察不同酯化条件 对g l a 相对含量及分离效果的影响，同时，也运用自制开口石英毛细管色谱柱 对不同分离条件下g l a 的分离效果进行了比较。 通过对不同培养条件下少根根霉发酵产物中g l a 相对含量的比较，发现碳 源和氮源对于g l a 及脂肪酸含量的积累有重要影响。单一碳源中糖的浓度对于 菌丝体重量和脂肪酸的含量呈正相关作用，却不利于g l a 的积累，而复合碳源 则可以获得较大的菌丝体重量以及脂肪酸和g l a 含量。此外，培养基中采用 ( n h 4 ) 2 s 0 4 和尿素作为氮源，则g l a 和亚油酸的相对含量提高，从而使p u f a s 的总量增加，而阻酵母粉为单一氮源，则油酸含量会相对提高，且油酸向亚油酸 转化较少。如果在复合碳源培养基中添加0 5 的柠檬酸会使菌丝体生物量，脂 肪酸含量和g l a 含量都有所提高，从而最终使g l a 的产量大幅度提高。 培养温度的不同也直接影响了菌丝体的生长和g l a 的积累。微生物生长有 其适宜的温度范围。温度过低或过高时菌丝体都无法生长。而在生长温度范围内， 温度较低时，不利于菌丝体生长，但有利于g l a 的积累，而随着温度的升高， g l a 含量呈下降趋势。选择合适的培养温度，可以很好地协调菌丝体重量、脂 肪酸含量及g l a 含量间的关系，并最终使g l a 的产量达到最大值。这一培养 温度通过实验定为2 5 较为合适。 不同的甲酯化条件对g l a 的提取和分离效果有很大影响。采用三氟化硼 甲醇酯化法可以较充分地提出g l a ，损失较少，且g l a 的分离效果最好，而甲 醇氢氧化钾室温酯化法和硫酸一甲醇酯化法提取时损失较多，g l a 相对含量较 低，且硫酸- 甲醇酯化法不能使g l a 与其相邻的亚油酸峰完全分开，对g l a 的 定量分析有一定影响。 南刀- 人学坝j 研究生学位论史中立摘要 虽佳的色谱条件以柱温1 8 0 1 c 、载气流速为2 0 m l m i n 时g l a 的分离效果较 好，系统的精密度较好，柱效较高，出峰时| 自j 较短，分离度较好，而恒温和程序 升温的比较结果未见明显差异，故认为采用简便可行的恒温分离即可。 自制丁f 口石英毛缅管色谱柱在分离毕赤酵母发酵产物上同样具有很好的功 效。完全可以将产物中各脂肪酸组分很好地分开，且各组分峰形较好。证明了自 制石英毛细管色谱柱是一种较实用的色谱柱，而且我们选择的分离条件在分离毕 赤酵母发酵产物时同样适用。 关键词：少根根霉y 一亚麻酸亚油酸开1 ：3 石英毛细管色谱柱 气相色谱分析 三氟化硼一甲醇酯化法 j i 南开人学砸1 叫开究生学位论文 a b s t r a c t g m n m a - l i n o l e i ca c i d ( g l a ) ，i soneo f t h ep o l y u n s a t u r a t e df a t t ya c i d st h a th a sg a i n e di t s p o p u l a r i t yd u e t ot h eu n i q u ef u n c t i o ni th a so nh u m a nb o d y m a n ye x p e r t sa n ds c h o l a r sh a v e m a d ei n d e p t hr e s e a r c hw o r ko ni t ，w h i c hh a sr e v e a l e ds e v e r a li m p o r t a n tm e c h a n i s m so fi t s f u n c t i o n 、 r h i z o p u sa r r h i z u si sak i n d o f b a c t e r i as p e c i e sp o s s e s s i n gt h ea b i l i t yt os y n t h e s i z e p o l y u n s a t u r a t e df a t t ya c i d sc o n t a i n i n ge i g h t e e nc a r b o na t o m si n c l u d i n gg a m m a l i n o l e i ca c i d o u rr e s e a r c ht a k e si ta st h et a r g e ts p e c i e s c u l t i v a t i n gi tu n d e rd i f f e r e n tm e d i ac o n d i t i o n st h a t v a r yi nm e d i ac o m p o s i t i o n ，t e m p e r a t u r ec o n d i t i o na n di n d u c i n gf a c t o r s w em a d ed i f f e r e n t e s t e r i f i c a t i o na p p r o a c h e st oe x t r a c tt h ef a t t ya c i d sw i t h i nt h ef e r m e n t a t i o np r o d u c t sa n d a n a l y z e dt h ei m p a c to f t h e s em e t h o d so l lt h ec h r o m a t o g r a p h i cs e p a r a t i o na n dr e l a t i v ec o n t e n t o fg l a a tt h es a i n et i m e t h ec o m p a r a t i v es t u d yo fs e p a r a t i o no ff a t t ya c i d su s i n gh o m e m a d e c a p i l l a r yc o l u m ng a sc h r o m a t o g r a p h yi sa l s op e r f o r m e d t h r o u g ht h ea n a l y s i sa n dc o m p a r i s o no f t h ed i f f e r e n tg l ac o n t e n tt h a th a sb e e no b s e r v e d w i t h i nd i f f e r e n tc u l t i v a t i n gc o n d i t i o n , w ef o u n dt h a tt h ec o n t e n to f c a r b o ns o l j r c ea n dn i t r o g e n s o u r c eb o t hp l a yi m p o r t a n tr o l e si nt h ea c c u m u l a t i o no f f a t t ya c i d sa sw e l la sg l a t h e g l u c o s ec o n t e n to f m o n o c a r b o ns o u r c ec o n t r i b u t e sp o s i t i v e l yt ot h ea c c u m u l a t i o no f f a t r y a c i d sa sw e l la sm y c e l i u mc o n t e n tw h i l eh a sn e g a t i v ei m p a c to nt h ed e p o s i t i o no fg l a ， w i t h i nw h i c hw ea t t a i n e dt h em a x i m u mp r o d u c t i o no fg l a f a t t ya c i d sa sw e l la sm y c e l i u m c o n t e n ta d o p t i n gc o m p o u n dc a r b o ns o u r c e o nt h eo t h e rh a n d ，n i t r o g e ns o a r c cw i t hu r e aa n d 附h 4 1 2 s 0 4m a k e sp o s i t i v ec o n t r i b u t i o nt ot h ea c c u m u l a t i o no fg l a a n dl i n o l e i ca c i d sa n d t h e r e f o r e ，h e l p si n c r e a s et h ec o n t e n to fp u f a s i n d u c i n gf a c t o r ss u c ha sc i t r i ca c i da l s o c o n t r i b u t e st ot h ei n c r e a s e da c c u m u l a t i o no fg l a ，f a t t ya c i d sa n dm y c e l i u mc o n t e n t m o r e o v e r t h et e m p e r a t u r ec o n d i t i o ni sa l s od i r e c t l y1 i n k e dt ot h eg r o w t ho fm y c e l i u ma n dt h e d e p o s i t i o no f g l a w i t l l i nac e r t a i nt e m p e r a t u r es c o p e ，t h ec o n t e n to f g l au n d e r g o e sa d e c r e a s e dv e n da st h et e m p e r a t u r eg o e su p t h r o u g ho u rr e s e a r c hw o r k ，w ef o u n dt h e o p t i m u mt e m p e r a t u r ec o n d i t i o ni s2 5 * c d i f f e r e n te s t e r i f i c a t i o nm e t h o d s ，c o l u r n nt e m p e r a t u r e sa n df l o wr a t e so fc a r r i e rg a sa l s oh a v e i m p o r t a n ti m p a c t so nt h es e p a r a t i o na n de x t r a c t i o no f f a t t ya c i d sa st h ef e r m e n t a t i o i lp r o d u c t s 。 w ei n v e s t i g a t e dt h ei m p a c t so ft h et h r e ef a c t o r so nt h es e p a r a t i o na n de x t r a c t i o no ff a t t ya c i d s w ef o u n dt h a tw h e na d o p t i n gb f 3 一c h 3 0 he s t e r i f i c a t i o nm e t h o d s ，w ec o u l dg e tm a x i m u m e x t r a c t i o na n dt h eb e s tr e s o l u t i o ne f f e c to fg l a w h i l et h eh 2 s 0 4 一c h 3 0 he s t e r i f i c a t i o n m e t h o di si n f e r i o rd u et ot h eo b s e r v e dp o o rr e s o l u t i o na n dt h ec o n s e q u e n tl e s sa c c u r a t e q u a n t i f i c a t i o no fg l a ， w ea l s of c ) u n dt h a tw h e nc o l u m nt e m p e r a t u r ew a ss e ta t1 8 0 g a m m a l i n o l e i ca c i dh a st h e s h o r t e s tr e t e n t i o nt i m ea n dt h eh i g h e s ts y s t e ma c c u r a c yc a nb ew o nw i t ht h el e a s tp e a ka r e a r s d t h r o u g ht h ea n a l y s i so f d i f b r e n tf l o wr a t eo f c a r r i e rg a sa n dt h e i ri m p a c t so nt h e s e p a r a t i o no f g l a w ef o u n dt h a tt h eb e s tr e s o l u t i o na n dh i g h e s ts y s t e ma c c u r a c yc a nb eg o t w h e nt h ef l o wr a t eo f c a r r i e rg a sw a ss e tb e l o w2 0m l m i n w ec h o s e2 0 m l m i nt a k i n gi n t o c o n s i d e r a t i o nb o t ho f t h eh i g h e s tr e s o l u t i o na n dt h es h o r t e s tr e t e n t i o nt i m e k e yw o r d s ：r h i z o p u sa r r h i z u s g a m m a - l i i l o l e i ca c i dl i n o l e i ca c i d s o t c g ( o p e nt u b u l a rc o l u n mg a sc h r o m a t o g r a p h y ) g a s c h r o m a t o g r a p h i ca n a l y s i s b f 3 一c h 3 0 he s t e r i f i c a t i o nm e t h o d 第一章绪论 第一章绪论 第一节多不饱和脂肪酸及g l a 的研究进展 多1 ；饱和脂肪酸( p o l y u n s a t u r a t e df a t t ya c i d s ，p u f a s ) 是指含有两个或两个以上双键 且碳链长为1 6 2 2 个碳原子的直链脂肪酸【1 ，包括：y 一亚麻酸“一l i n o l e n i ca c i d ，g l a 1 8 ：3 a 6 ，9 ，1 2n 6 ) 、花生四烯酸( a r a c l f i d o n i ca c i d ，a r a 2 0 ：4 a 5 ，8 儿1 4n 6 ) 、二十碳五烯酸 ( e i c o s a p e n t a e n o i ca c i d ，e p a 2 0 ：5 a 5 ，8 ，1 1 ，1 4 ， n 3 ) * l - - 十二碳六烯酸( d o c o s a h e x a e n o i ca c i d ， d h a2 2 ：6 a 4 ，5 ，8 儿1 4 ，1 7n 一3 ) 等【2 】o 其中，亚油酸( l i n o l e i ca c i d ，l a 18 ：2 a 9 ，1 2n 6 ) 、g l a 和 a r a 被称为必需脂肪酸( e s s e n t i a lf a t t ya c i d ，e f a ) 口 ，在生物制药和营养保健品领域中得 到广泛关注和应用。临床上已将p u f a s 应用于心血管疾病、炎症、癌症及糖尿病等各种 疾病的治疗 4 】。近年来，由于它具有清除自由基、抗氧化及减肥的功能，在保健食品及 美容化妆品领域深受人们的青睐。但目前p u f a s 的商业来源主要是深海鱼油和某些动植 物，由于鱼油资源有限，易受气候、产地等条件的影响且纯化成本极高 5 1 ，产品不能满 足市场需求，而微生物发酵法生产p u f a s 却不受资源等条件的限制，因而成为世界各国 研究的热点。 一、多不饱和脂肪酸的合成途径及其功能 ( 一) p u f a s 的合成途径 p u f a s 广泛存在于生物体中，在微生物特别在一些藻类、真菌和细菌中的含量十分 丰富，多以贮存油和膜脂的形式存在6 1 。研究发现，真菌是p u f a s 稳定经济来源的首 选之一。它具有发酵周期快，繁殖力强，可以集约化大规模生产，不受气候和季节条件 限制等优点，故近年来成为人们研究的热点。 一般认为在高等微生物如酵母、真菌和藻类中，p u f a s 的生物合成是以饱和脂肪酸 一硬脂酸为底物，经碳链延长和去饱和两个主要反应而来 9 1 。硬脂酸( s t e a r i ca c i d ，c 1 8 ：0 ) 去饱和成为油酸( o l e i ca c i d ，o a 1 8 ：1 a 9 n 一9 ) ，然后转化成亚油酸。合成途径在油酸和亚油 酸处各有一个分支点，从而形成了( 0 3 ，一6 ，9 三个系列的p u f a s ( 见图l 一1 ) 。藻类、 真菌、细菌、昆虫和一些无脊椎动物具有从头开始合成各种p u f a s 所需的一系列延长酶 和去饱和酶，因此是p u f a s 在自然界的主要产生者。高等动物不能合成c 1 8 以上的 第一章绪论 p u f a s ，因为它们只有4 、5 、6 和9 去饱和酶，不能自身合成l a 、a l a 或从头合 成更长的p u f a s ，但能进一步转化l a 和a 亚麻酸( 旺l i n o l e n i ca c i d ，a l a ，18 ：3 a 9 ，1 2 ，1 5n 一3 ) ， 所以这些脂肪酸对包括哺乳动物在内的高等动物是必需的，必须从食物中摄取【m 1 。 j 91 2矗i 5 18 斗_ 生。! ! ! ! ! ：! _ 1 8 1 3 ) j 6j 6l 6 1 8 ：2 - 91 8 ：3 一6 ( g l a ) 1 8 ：4c ) - 3 ( 0 t a ) je lje l1 l e l 2 0 ：2 - 92 0 ：3 - 6 ( d e l a ) 2 0 ：4 一3 i 5j 5j 5 2 0 ：3 一92 0 ：4 一6 ( a r a )2 0 ：5 u 一3 ( e p a ) 一9 一6 1 i e l 2 2 ：5 t o - 3 【卫d ) 4 2 2 ：5 一3 ( d i d , ) l 一3 图卜1p 1 1 2 a s 的生物合成途径 ( 二) p u f a s 的生理功能 p u f a s 在人和哺乳动物的组织细胞中一系列酶的催化下，可转变为前列腺素 f p r o s t a g l a n d i n ，p o ) 、血栓素( t h r o m b o x a n ea 2 ，t x a 2 ) 及白三烯( l e u k o t r i e n e s ，l t s ) 等重要生 理活性物质，它们儿乎参与所有台匀细胞代谢活动，具有其他脂肪酸所无法取代的广泛的 生物学效应【l l 】和重要的生理功能 1 2 ： l 、p u f a s 是生物膜的重要组成成分，调节与膜有关的生理过程。其中，a r a 是磷 脂结构功能的主要部分，对生物膜结构、机能、相转变、通透性的调节及膜相关过程的 控制有重要作用。 2 、p u f a s 可以转化成调节人体生理功能的生物活性物质。p u f a s 是前列腺素等具有 强烈活性的生理调节物质的前体。前列腺素是人体中分布最广、效应最大的生物活性物 质之一，它在机体内通过对某些激素的调节起作用。 3 、p u f a s 可以降低胆固醇和甘油三酯。p u f a s 可以抑制肝脏中脂肪酸和甘油三酯f t g ) 的合成：抑制肝脏极低密度脂蛋r ( v l d l ) 的合成和分泌；抑制v l d l 载脂蛋白脂肪酶活 性升高；使肝脏中脂肪酸的p 氧化作用增强，同时还可能增加脂肪组织中脂肪酸的动员 量。g l a 对血清甘油三酯的降脂作用，是目前报道中治疗高血脂疗效较佳和安全性最高 的。 4 、p u f a s 可防止，t 3 律失常。犬、大鼠、灵长类动物试验反复证明，3 脂肪酸可减 2 第一章绪论 少心脏对诱发心律失常的敏感性。t o r t e s 等对具有不同饮食习惯人群的比较也证实了0 ) 一3 p u f a s 有防止冠心病的作用。 5 、p u f a s 可保护大脑和神经系统。3 多不饱和脂肪酸在视网膜和大脑的结构膜中 起重要作用。最新研究结果表明，亚麻酸、花生四烯酸等多不饱和脂肪酸是潜在的神经 保护剂，因其能防止神经坏死，对脑部病变显示了潜在的治疗价值。 、g l a 的性质及生物学功能 ( 一) g l a 的结构及性质 g l a 为全顺式6 , 9 ，1 2 十八碳三烯酸【13 1 ，分子式为c 1 8 h 3 d 0 2 ，一般表示方式为 1 8 ：3 a 6 ，9 ，”，第一个数字表示碳原子数，冒号后边的数字表示双键的数目，a 表示双键在 碳链中的位置【1 4 。g l a 为无色或淡黄色油状液体，由于其高度的不饱和性使其在空气中 不稳定，尤其在高温条件下易发生氧化反应，在碱性条件下易发生双键位置及构型的异 构化反应，形成共轭多烯酸。g l a 是一种低熔点的脂肪酸，具有脂肪酸的一般特性，不 溶于水而易溶于乙醚、三氯甲烷、f 己烷、石油醚等非极性溶剂中。g l a 结构式为： 图1 2g i a 的结构式 ( 二) g l a 的生物学功能 g l a 由亚油酸转化而来，在人体内可以未酯化的形式存在或者以酯化的形式参与胆 固醇酯、甘油三酯和磷脂的组成成分，因此g l a 是生物细胞膜的重要组分，赋予细胞 膜以流动性、柔韧性和选择通透性，在膜的结构上和功能上具有特殊作用：另外，g l a 又是前列腺素、白三烯、血栓素等生物活性物质的前体物。正常人从食物中摄取的亚油 酸经6 一脱氢酶转化为g l a ，进而代谢为双高一g l a ，再转变成前列腺素e i ( p g e l ) ，或 经5 一脱氢酶转化为花生四烯酸后，生成其它前列腺素( p g s ) 。g l a 和由它进一步衍生 生成的其他6 系列的多不饱和脂肪酸都直接作为细胞膜的化学组成成份，对细胞的生 理起着重要的调节作用。高等动物脏器中，如担负贮藏和物质代谢中心的肝脏，产生能 量的肌肉和具排泄功能的肾脏的细胞膜中，( o 一6 不饱和脂肪酸占有一定的比例。人脑脑 重的2 0 是一6 不饱和脂肪酸。 1 、降血脂作用，研究结果表明g l a 具有明显的降低总胆固醇( t c ) 功效，活性是亚 第一章绪论 油酸的1 6 0 倍。其作用机理为： 作为p o e 的前体而发挥降低t c 作用； g l a 为多不饱和脂肪酸，增大了t c 的极性、水溶性，使之容易被酶分解； g l a 可从血液中清除甘油三酯，减少了内源性t c 的合成，从而减少了8 脂蛋白 的生成。 由于g l a 还具有明显的提高高密度脂蛋白( h d l ) 的作用，因而能抑制细胞摄取、分解和 蓄积低密度脂蛋白胆固醇，还能排除已蓄积在细胞内的胆固醇。临床结果表明对甘油三 酯、n _ n 醇，b 一脂蛋白下降的总有效率分别为8 1 5 ，6 8 2 ，6 4 8 【1 7 。 2 、抑制血小板聚集和血栓素a 2 合成，血栓素a 2 ( t x a 2 ) 是内源性最强烈的血小板聚 集剂和血管收缩剂，而前列腺环素( p g l 2 ) 则为最强烈的血管扩张剂。正常人体内两者保 持动态平衡，以维持血小板的生理作用。一旦两者失去平衡，将使t x a 2 合成增多，p g 2 的生成减少，而增加了血小板的聚集作用。g l a 作为p o e l 的前体，一方面通过其抑制 了血小板的聚集，同时它还通过双高o l a 抑制了血小板t x a 2 合成酶的活性，从而改变 t x a 2 p g 2 的比值i ”j 。 3 、抗脂质过氧化，对月见草研究表明，g l a 具有明显的抗脂质过氧化作用，说明 g l a 在体内首先被氧化而减轻了细胞脂质过氧化损害。c c 6 在体内能产生自由基损害肝 细胞膜，月见草油具有拮抗c c l 。致死作用1 9 1 ，其氧化作用可能是通过对抗或清除自由基 来完成的。 4 、抑制溃疡及胃出血作用，许多实验已证实前列腺素可以缓解胃出血或胃溃疡，在 对由阿司匹林引起胃出血的大鼠进行喂养g l a 的实验表明，o l a 可有效地防止阿司匹 林引起6 去饱和抑制作用，保护胃粘膜免受损害，而且促进了花生四烯酸和前列腺素前 体物质的合成。另有研究表明，月见草油中的g l a 可明显抑制大鼠幽门结扎性溃疡的 形成，湿著抑制大鼠庞激性溃疡，对组织胺所致的大鼠胃溃疡有明显的抑制作用，并明 显抑制慢性醋酸型胃溃疡，抑制胃液分泌，降低胃酸酸度俐。 5 、增强胰岛素作用。a w a x d 认为，由g l a 组成的磷脂可以增强细胞膜上磷脂流动 性，增强细胞膜受体对激素敏感。由g l a 而来的前列腺素等活性物质，也可以增强腺 苷酸化酶的活性，提高胰岛p - 细胞分泌胰岛素的功能。此外g l a 作为多不饱和脂肪酸， 还可以恢复糖尿病人细胞的脂肪酸去饱和酶的活性( 2 ”。临床观察也同时表明了对高血糖 者的降血糖作用，说明其对糖尿病及其综合症有较全面的防治作用。 6 、减肥作用，由于g l a 对棕色脂肪组织有刺激作用，能促进棕色脂肪酸线粒体活 4 第一章绪论 性，以消耗体内过多热量，而具有治疗肥胖症作用。临床应用在征常饮食下可降低体重 2 8 娃的患者达7 5 1 2 “。近几年来国内外临床研究还表明g l a 对精神分裂症【2 3 】、特应性 湿疹或普通鳞癣病、妇女月经期综合征【2 5 1 、周期性乳腺疼痛口6 1 以及多种炎症口7 1 均有疗 效和改菩作剧。预示着g l a 具有更广泛的药用前景。 ( 三) g l a 的临床应用 在正常情况下，l a 来自人摄取的食物，而g l a 来源于亚油酸的肝生物转化，这中 间的关键反应是6 一脱氢酶的去饱和催化过程【巧j 。健康的成年人能进行正常的由l a 向 g l a 及其衍生物的转化，很少表现体内必需脂肪酸缺乏的临床症状，但由于一些人为的 原因f 如吸烟，酗酒) 或生理的因素，体内酶系统活性受损，g l a 合成减少，因而前列腺 素的合成也不能顺利进行。由此引起一系循环障碍，如动脉硬化，血栓，风湿，高血压， 糖尿病，生理不调，皮肤粗糙等。此时，如及时地补充g l a ，便可以保证体内前列腺素 的f 常代谢，从而消减疾病。所以，往膳食中添加g l a 或摄耿富含g l a 的功能性食品， 可明显改善机体的生理机能。七十年代初，发达国家就已经把g l a 列为营养保健品， 月见草油在英国，澳大利亚，加拿大等十几个国家得到政府注册。此后，一些公司大力 升发一系列含g l a 的营养品和特种食品，如瑞典、瑞士推销婴儿用的营养品，法国在 国际上销售的适合老年人和恢复期病人的营养品，主要成分均为月见草油，其中的g l a 可被人体直接摄取，以调节代谢及保证前列腺素p g 的生物合成。另外，由于近年来用 母乳喂养的婴儿不断减小，用乳粉或鲜乳喂养的婴儿正在增多，而乳粉或鲜乳最大的缺 陷就是不含g l a ，为了解决这一问题，有些公司从被孢霉属真菌油脂中提取g l a ，添 加到乳粉或鲜乳中，使之接近母乳，以满足婴儿对营养的需要。他们使用环糊精作载体 解决了直接添加g l a 难于与乳混合均匀这个问题【2 9 1 。g l a 由于其重要的生理生化功能， 在人体皮肤的营养、健美，保护及疗效方面，有一定的作用。作为化妆品添加剂，有抗 炎，抗皮肤衰老的作用，对治疗一些痤疮及皮肤病有较好的疗效。1 9 8 8 年，英国国家卫 生部批准使用主要成分为月见草油的“e p o g m n ”的药品治疗湿疹。 三、g l a 的来源 ( 一) g l a 的动植物资源 第一章绪论 g l a 首先是从月见草种子油中发现。月见草( o e n o t h e r a b i e n n i ) 又称夜来香，山芝麻， 是柳玎1 菜科多年生草本植物3 0 1 ，原产于北美洲。最初为印第安人采集药用。1 7 世纪，月 见草移植至欧洲，后逐渐传至世界各地。本世纪2 0 年代证实了月见草油的药效成分就是 g l a ，并通过化学方法确定了分子结构。月见草种子含油脂2 0 2 5 ，油脂中含有 7 0 8 0 能jl a ，7 1 0 的g l a 3 1 ，3 2 矧。除月见草外，在黑加仑 3 4 、玻璃苣 3 5 等植物种 予中均发现有较大量的g l a 。1 9 6 2 年e y w i n 和b l o c h 3 6 1 用人工方法培养某些纤毛纲原生 动物，测定了其组织中脂肪酸组成，发现所培养的5 个种有4 个含有g l a ，其含量占脂 肪酸的3 0 。 ( 二) g l a 的藻类和微生物资源 螺旋藻( s p i r u l i n a ) y 、名蓝藻，属蓝藻门，是一种多细胞、微型、不分枝、无异形细胞 的螺旋状体，生长于热带的高温碱性湖水中，在地球上已有3 5 亿年的历史，是现存最古 老的生命之一，螺旋藻含有2 0 左右的g l a ”】。在自然界中，除了一些植物、动物、藻 类能产生g l a 外，一些微生物也具有产生g l a 的能力。在有利于油脂积累的培养条件 下，一些微生物( 如霉菌、酵母菌) 还具有超常的油脂合成能力，在这些油脂产生菌中， 低等丝状真菌不但可以产生大量的油脂，而且油脂中还富含大量的g l a ，这就为发酵法 生产g l a 展示了一个广阔的前景。1 9 4 8 年b e r n h a r d 和a l b e r c h t 3 8 , 3 9 1 首先从布拉克须霉 ( p h y c o m y c e s b l a k e s l e e a n u s ) 的菌丝体脂肪中鉴定出真菌的g l a ，其含量为菌体脂肪酸的 1 6 。以后的研究发现，低等丝状真菌，如被孢霉属、小克银汉霉属、毛霉属、根霉属、 等属的一些菌株均有产生g l a 的能力。 四、微生物发酵法生产g l a 的优点及现状 ( 一) 微生物发酵法生产g l a 的优点 4 1 】 月见草为1 一年生草，产量少，受地域、气候等因素影响大，因此从月见草等天然植 物中提取的g l a 价格昂贵( 日本市场售价每公斤5 万日元，约折合人民币3 4 0 0 元) ，大 大地限制了g l a 在诸多方面的应用。我国从月见草油种子提取的油脂，每年1 0 0 _ 2 0 0 吨，而实际需要3 0 0 0 4 0 0 0 吨。因此自八十年代开始国际上利用生物技术生产g l a 的 研究发展十分迅速。与从月见草等天然植物中提取g l a 的传统方法相比，采用微生物 发酵法生产一g l a 具有如下优点： a 微生物繁殖能力强、生长快，菌丝体易于收集和提取。 6 第一章绪论 b 生产不受原料和产地限制，不受季节和气候的影响，不占用大量土地，可长年工业 化生产，生产周期短，生产过程可人为控制。 c 低等丝状真菌产生的油脂及g l a 的相对含量相对较高，而且其油脂成分与人乳的 油脂成分接近，营养学上独具特点。 d 可以通过先进的生物技术手段大幅度提高g l a 的产量和降低生产成本。 ( 二) 微生物发酵法生产g l a 的现状 以丝状真菌发酵法生产g l a ，所选的菌株需要综合考虑菌体油脂含量及脂肪酸中 g l a 的相对含量两个因素，并且从单位培养基的生产量着眼，既要保证菌体的增殖量， 又要有较高的碳源转化率。通常在油脂含量高的培养条件下( 高碳浓度、低氮浓度) 菌体 的增殖量及碳源转化率都很低，因此所选择的菌株如能把多种矛盾统一起来，确定其培 养条件，就有可能发酵生产g l a 。 在这方面日本已走在前面。19 8 5 年o s a m as u z u k i 等【4 2 , 4 3 】对深黄被抱霉( 胁e r e l l a i s a b e h & a ) 、葡酒色被抱霉( 1 1 1 1 v i n a c e a ) 、拉曼被抱霉( m r a m a n n i a n a ) 和矮被抱霉f 膨n a n a ) 进行了葡萄糖浓度为6 0 4 0 0 9 l 的高浓度碳源发酵培养，结果菌体系数为2 0 4 0 9 ，油脂 含量3 5 一7 0 ，脂肪酸中g l a 相对含量为3 - 1 1 。1 9 8 7 年蓑岛良一等【4 4 】用雅致小克银 汉霉( c u n n i n g h a m e l l ae l e g a n s ) 发酵生产g l a ，其含量可达1 8 左右。a k i r a s e t o 4 5 】贝0 利用 枝霉( t h a m n i d i u me l e g a n s ) 进行发酵，g l a 相对含量高达2 0 。自1 9 8 6 年以来，日本出 光化学公司等己将发酵生产的g l a 产品投放市场，主要用于医药、保健食品、功能性 饮料和高级化妆品 4 。 我国对微生物发酵法生产g l a 的研究起步较晚，目前仅有上海工业微生物研究所、 南开大学微生物系等几家单位在近年来开展了研究工作。我国上海工业微生物研究所从 1 9 8 7 年起率先进行发酵法生产g l a 研究。张峻等f 4 7 】从毛霉目2 2 种中筛选出一株深黄被 孢霉，经诱变育种，菌体得率2 9 3 ，油脂含量4 4 2 ，g l a 相对含量9 4 4 0 ；赵振英 等从毛霉目6 个属菌株中筛选c 6 7 6 l 和t 8 7 6 5 ，前者脂肪含量为2 5 3 5 ，g l a 相对含 量达1 2 一1 4 ，后者脂肪含量为1 5 - 2 0 ，g l a 相对含量达2 2 一2 4 。1 9 9 5 年赵仁俊 等1 49 j 研究了影响被孢霉产g l a 油脂的因素，其中包括氮源种类、c n 比率、p h 、种龄 和接种嚣。关洁雯等1 5 0 还对被孢霉产g l a 的补料工艺进行了研究。李植峰等进行了拉 曼被孢酶研究，发现从目前的发酵结果看，拉曼被孢酶f 5 已达到工业生产菌株要求【5 1 】。 第一章绪论 目前国内水平同同本、英国相比有较大差距，主要表现在菌株产生g l a 的水平较低， 还不能商品化生产。 微生物发酵法生产g l a 的研究成功，为g l a 的应用开辟了一个新的资源。以微生 物为资源发酵生产g l a ，经过碳链延长和生化酶的作用最终生成f i h - y o 腺素，已经成为前 列腺素生产最有希望的途径之一。并且，随着现代分子生物学技术的发展，人们对不饱 和脂肪酸生物合成过程中各种关键酶在分子水平上的作用与调节机制有了进一步的了 解，这就使人们有希望用基因工程手段制备g l a 工程菌，得到高g l a 合成能力的菌种。 目前各国学者已经对不饱和脂肪酸代谢途径中的去饱和酶有了相当深的r 解，在此 基础上，可以通过抑制或提高某些去饱和酶的活性来积累g l a ，从而达到高产的目的。 但g l a 是胞内产物，发酵过程受到菌体收率、产油率和油脂中g l a 相对含量3 个因素 的制约，这也是当前发酵水平偏低的原因，因此，菌种的选育和发酵工艺的改革是关键。 随着g l a 代谢途径的进一步阐明，研究工作己向代谢控制育种方面发展，以期通过改 变发酵条件来调节生产菌株的代谢调控，使生产菌株更高效地积累g l a 。通过对温度、 碳源、氮源、c 烈、无机盐组成及脱氢酶活性的诱导条件等方面的研究，使生产菌株产 g l a 的能力得到提高。 我们相信，随着生化技术和分子技术的不断进步和完善，真菌发酵生产g l a 技术也 将不断地完善起来，在今后由g l a 开始的一系列相关不饱和脂肪酸的研究将会在医药 学、营养学、生物学等方面展开一个新的、更广阔的研究领域。 第二节多不饱和脂肪酸检测条件研究 在筛选蔺种及发酵过程中，都需要对脂肪酸进行检测，工作量大，而且多不饱和脂 肪酸易氧化，在空气中稳定性差，存放不当极易变质。因此寻找一种简便快速的分析方 法分析其含量十分重要 5 2 。目前，分析油脂的脂肪酸组成的方法主要有以下几种5 3 】： 1 、用醇一铅法分离出长链饱和脂肪酸，甲酯化真空分馏达到定性定量的目的，这种 方法费时费力。 2 、应用滴定测酸值、碘值、皂化值，利用三者数据的差异，计算出最常见的脂肪酸 的组成。它的缺点在于仅获得油酸、亚油酸、亚麻酸含量。 3 、用碱异构化1 ，4 一二烯酸成共轭酸，用紫外光谱法测定，但对1 , 4 孤立双键的多烯 酸的无法检测。 第一章绪论 4 、反向纸色谱法比较成功地应用于脂肪酸定性，但定量困难。 5 、脂肪酸甲酯化后用气相色谱分析。此方法方便、简捷，可用于反应监控以达到定 性定量的目的。 正是由于气相色谱高效、快捷的优点，目前分析油脂的脂肪酸组成成分时，大多采 用气相色谱法进行定性和定量【5 4 】。气相色谱分析的关键技术之一为色谱柱。色谱柱分为 填充柱和毛细管柱两种。自从毛细管色谱柱问世以后，由于其相比于填充柱有许多显著 的优势，因而受到广大分析工作者的青睐。以毛细管柱代替填充柱成为必然趋势。 一、毛细管柱色谱的分离原理 毛细管柱，又称空心管色谱柱，由m j e g o l a y1 9 5 6 年在研究填充柱性能过程中 发展提出【5 ”。色谱法的特点是在分离中引入一个固定相和一个流动相，利用不同的物质 在两相间有不同的分配系数，对物质进行分离。当两相作相对运动时，这些物质在两相 间的分配多次反复地进行，这样就对那些分配系数只有微小差异的组分产生很大的分离 效果，从而能够分离不同组分【5 6 。也就是说，色谱过程是物质在相对运动着的两相间分 配平衡的过程。由于混合物中若干个组分的分配系数不等，则被流动相携带移动的速度 不等，产生差速迁移而被分离。气相色谱的流动相为气体，称为载气；所用的仪器为气 相色谱仪。注入进样口的供试品被加热汽化，并被载气带入色谱柱，在柱内各组分被分 离后，随载气依次进入检测器，检测器将组分及其浓度随时问的变化量转变为易检测的 电信号，即色谱信号，用记录仪或数据处理器记录 5 7 】。 二、毛细管色谱柱的优点【5 5 】 表1 - 1毛细管柱利填充桴的物理性能参数比较 尺寸性能填充柱毛细管柱 梓长f m ) 拄内径( m m ) 载气流速( m l m i n ) 压力降( p s i l 每米有效板数 总有效板数 5 1 0 0 o 2 _ 0 7 o 5 1 5 3 - 4 0 3 0 0 0 1 5 0 ，0 0 0 ( 5 0 m ) o o m “ 姗 嘞 ， l 如 第一章绪论 容量 液膜厚度( i x m ) o u 峰 1 1 0 5 0 n g 蝮 0 0 5 一l0 毛细管柱是空心柱，阻力小，渗透性好，允许毛细管做的很长，因而具有填充柱无法 比拟的高柱效，高分离效率，分离效能高、检测灵敏度高、分析速度快等优点，毛细管 柱固定液膜的厚度仅为填充柱的1 1 0 ，大大降低了样品的传质阻力。这些都有利于柱效 的提高和峰形的对称。表1 i 列出了毛细管柱和填充柱的物理性能参数。 三、利用气相色谱对g l a 检测的研究现状 ( 一) g l a 的定性分析 利用气相色谱对g l a 定性的方法很多，用已知物直接对照法定性，这是实际工作 中常用的简便可靠的定性方法【5 8 l 。由于色谱过程的本身是物质在相对运动着的两相间分 配平衡的过程，混合物中若干个组分的分配系数不等。所以被分离的混合物中各组分的 保留时间不尽相同。因此可以利用被测组分的保留时间或保留体积定性。在实验条件一 定的条件下，分别测出已知物和未知样品的保留时间，在未知样品色谱图中对应已知物 保留时间的位置上若有峰出现，则判定样品中可能含有此已知物组分。 ( 二) g l a 的定量分析 1 、检测器：氢火焰离子化检测器，是1 9 5 8 年发展起来的高灵敏度检测器，它对含 碳有机物的检测敏感度可达l o 1 2 克，秒58 1 。由于它灵敏度高，死体积小，响应时间快， 线性范围广，故成为常用的检测器，作痕量分析和快速分析；另外他还有结构简单，稳 定性好，很少受操作条件的影响等优点，多用它做常规分析。