（临床检验诊断学专业论文）vasp参与细胞周期调控及其机制的研究.pdf

独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立 进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容以外，本 论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对 本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标 明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：阁最 日期：z 。i 年，月 弓日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅。本人授权江苏大学可以将本学位论文 的全部内容或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密口， 在年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密i - - g i 。 学位论文作者签名： 司承、导师签名：。印弓夺曷 签字日期：，9f o 年6 月i 日签字日期： di 。年七月lj 日 江苏大学博士学位论文 摘要 血管扩张刺激磷蛋白( v a s o d i l a t o rs t i m u l a t e dp h o s p h o p r o t e i n ， v a s p ) 是一种细胞骨架相关蛋白，属e n a v a s p 蛋白家族，最初 从血小板中得到分离，是蛋白激酶a ( p l 认) 、蛋白激酶g ( p k g ) 和蛋白激酶c ( p k c ) 的作用底物。v a s p 整个蛋白序列由3 8 0 个 氨基酸组成，其中含有三个磷酸化位点，两个为丝氨酸位点( s e r l 5 7 、 s e r 2 3 9 ) ，一个为苏氨酸位点( t h r 2 7 8 ) ，这三个位点的磷酸化。赶 接受p k g 、p k a 的调控。v a s p 的磷酸化和它的功能有着密切的关 系，而且不同位点的磷酸化可使v a s p 呈现不同的作用。在细胞内， 它主要存在于应激纤维、粘附斑( f o c a la d h e n s i o n ) 处应激纤维的末 端、细胞问连接及细胞膜上具高动态性变化的区域。v a s p 在与细 胞骨架调节有关的各种细胞行为中起着重要作用，与癌细胞的侵袭 和转移也有着密切的关系。目前已知的v a s p 的功能都与它同细胞 微丝结构的结合有关。 本研究目的：一方面，明确v a s p 是否为一个新的微管相关蛋白， 探讨磷酸化对其与微管蛋白结合的影响；另一方面，观察磷酸化 v a s p 在h e l a 细胞内的定位，明确其在细胞周期中的作用，并且初 步探讨v a s p 参与细胞周期调控的机制。 研究方法如下： ( 1 ) 通过免疫荧光方法，观察磷酸化v a s p 在h e l a 细胞内的定位。 v a s p 参与细胞周期调控及其机制的研究 ( 2 ) 通过免疫共沉淀、微管沉淀和w e s t e r nb l o t 方法，观察v a s p 及其磷酸化与q 一微管蛋白的结合情况。 ( 3 ) 用w e s t e r nb l o t 方法观察c p t c a m p 、h 8 9 、c p t c g m p 和 k t 5 8 2 3 引起的p v a s p 在h e l a 细胞内分布的变化，以及h 8 9 对由 c p t c a m p 和k t 5 8 2 3 对由c p t c g m p 引起的p - v a s p 细胞分布变 化的影响。 ( 4 ) 通过胸侍( t d r ) 双阻断法诱导细胞周期同步化，释放后在不 同时间点收获蛋白样品，用w e s t e r nb l o t 方法观察v a s p 及其磷酸 化在细胞剧期进程中水平的变化。 ( 5 ) 通过胸苷( t d r ) 双阻断法诱导细胞同步化，分别用蛋白激酶 a 、g 和c 的抑制剂作用h e l a 细胞，在不同时间点收获蛋白样品， 用w e s t e r nb l o t 方法，通过检测p h 3s 1 0 高峰出现的时间，来观察 细胞周期进程的变化。 ( 6 ) 通过转染磷酸化位点突变的v a s p 质粒，改变细胞内v a s p 磷酸化水平，利用胸二旨( t d r ) 双阻断法诱导细胞同步化，不同时 间点收获蛋白样品，用w e s t e r nb l o t 方法，通过检测p h 3s 1 0 高峰 出现的时间，来观察细胞周期进程的变化。 ( 7 ) 利用r n a i 干扰技术，敲除细胞内v a s p 蛋白，继而降低其磷 酸化水平，利用免疫荧光方法，观察双核细胞计数的变化；利用流 式细胞术，检测四倍体细胞数的变化；利用w e s t e mb l o t 方法，通 过检测p h 3s 1 0 高峰出现的时间来观察细胞周期进程的变化。 江苏大学博士学位论文 ( 8 ) 构建靶向v a s p 基因的s h r n a 表达质粒，与g f p 质粒共转染 h e l a 细胞，通过免疫荧光方法观察纺锤体形态的变化。 ( 9 ) 利用非洲爪蟾卵提取物，通过抗体沉淀实验去除提耳义物中的 v a s p ，观察纺锤体形成的变化。 研究结果： ( 1 ) v a s p 与。【微管蛋白结合；p - v a s ps 1 5 7 分布于有丝分裂细胞 纺锤体，与仪一微管蛋白结合；p v a s ps 2 3 9 与肌动蛋白共定位，与 o 【一微管蛋白没有共定位关系。 ( 2 ) 蛋白激酶a 、g 和c 的抑制剂能够改变细胞内v a s p 磷酸化 水平，引起p h 3s 1 0 高峰出现延迟。 ( 3 ) v a s ps i r n a 引起其磷酸化水平下降的同时，导致双核细胞、 四倍体细胞数增加，p h 3s 1 0 高峰出现明缸延迟。 ( 4 ) v a s ps i r n a 引起h e l a 细胞增殖抑制。 ( 5 ) 靶向v a s p 基区i 的s h r n a 表达质粒敲除细胞内v a s p 后，观 察到形成的纺锤体形态正常。 ( 6 ) 在爪蟾卵提取物体系中，敲除v a s p 蛋白后，观察到新形成的 纺锤体形态异常。 由此得出以下结论： ( 1 ) p - v a s ps 1 5 7 定位于有丝分裂纺锤体，与o 【一微管蛋白共定位。 ( 2 ) v a s p 能够与c 【一微管蛋白结合，是一个新的微管相关蛋白。 ( 3 ) 改变v a s p 磷酸化水平能够引起细胞周期g 2 m 的延迟。 v a s p 参与细胞周期调控及其机- t , 4 的研究 ( 4 ) 干扰细胞内v a s p 蛋白表达，引起细胞周期g 2 m 进程延迟、 胞质分裂受阻和细胞生长抑制。 ( 5 ) v a s p 很町能在纺锤体组装过程中起着重要作用。 关键词：v a s p ，p - v a s p ，微管相关蛋白，g z v ，纺锤体 i v 江苏大学博士学位论文 a b s tr a c t v a s p ( v a s o d i l a t o rs t i m u l a t e dp h o s p h o p r o t e i n ) ，am e m b e ro ft h e e n a v a s pf a m i l y ，i sk n o w na sa na c t i n b i n d i n gp r o t e i n v a s pw a sf i r s t f o u n di np l a t e l e t sa n di sk n o w nt ob eas u b s t r a t ef o rp r o t e i nk i n a s ea ( p k a ) ，p r o t e i nk i n a s eg ( p k g ) a n dp r o t e i nk i n a s ec ( p k c ) v a s p h a s ap e p t i d ec h a i nc o n t a i n i n g38 0a m i n oa c i dr e s i d u e s t h e r ea r et h r e e p h o s p h o r y l a t i o ns i t e s ，t w os e r i n er e s i d u e ss e r 15 7a n ds e r 2 3 9 ，a n do n e t h r e o n i n er e s i d u et h r 2 7 8 p h o s p h o r y l a t i o no fv a s pa tt h e s es i t e si s d i r e c t l yr e g u l a t e db yp k aa n dp k g t h ea c t i v i t yo fv a s pi sr e g u l a t e d b yp h o s p h o r y l a t i o n p h o s p h o r y l a t i o na td i f f e r e n ts i t em a k e s v a s ph a v e d i f f e r e n tf u n c t i o n s i nv i v o ，v a s pi s h i g h l ye x p r e s s e d i nf o c a l a d h e s i o n sa l o n gs t r e s sf i b e r s ，a n di nt h ea r e a sw i t hh i g h l yd y n a m i c m e m b r a n ea c t i v i t y v a s pp l a y sa n i m p o r t a n tr o l e i n i n m a n yc e l l b e h a v i o r sr e l a t e dw i t hc y t o s k e l e t o n ，a n dh a sac l o s er e l a t i o n s h i pt o i n v a s i o na n dm e t a s t a s i so fc a n c e rc e l l s a tp r e s e n t ，a g r e e m e n ti s o b t a i n e dt h a tt h er o l e so fv a s pa r ea s s o c i a t e dw i t ht h ec o m b i n a t i o n w i t hm i c r o f i l a m e n t o b j e c t i v e s ： i nt h i ss t u d y ，o n eo b j e c t i v ew a st o i n v e s t i g a t ew h e t h e rv a s pi san e w m i c r o t u b u l e a s s o c i a t e d p r o t e i n ，a n d t o a n a l y z e t h ee f f e c to fi t s p h o s p h o r y l a t i o no ni t sb i n d i n gw i t hm i c r o t u b u l e ；a n o t h e ro b j e c t i v ew a s t oi n v e s t i g a t et h el o c a l i z a t i o no fp - v a s pi nh e l ac e l l s ，t h er o l eo f p - v a s p i nr e g u l a t i o no fc e l lc y c l ea n dt h ep o s s i b l em e c h a n i s m s v v a s p 参与细胞周期调控及其机制的研究 m e t h o d s ： ( 1 ) i m m u n o f l u o r e s c e n c ea s s a y w a s a p p l i e d t o i n v e s t i g a t e t h e l o c a l i z a t i o no fp v a s pi nh e l ac e l l s ( 2 ) i m m u n o f l u o r e s c e n c e a s s a y ，c o i m m u n o p r e c i p i t a t i o na s s a y ， m i c r o t u b u l ep e l l e t i n ga s s a ya n dw e s t e mb l o ta s s a yw e r ea p p l i e dt o i n v e s t i g a t et h eb i n d i n go fv a s pa n dp - v a s pw i t h 仅一t u b u l i n ( 3 ) w e s t e r nb l o ta s s a yw a sa p p l i e dt oi n v e s t i g a t et h et r a n s l o c a t i o no f p - v a s pi nh e l ac e l l si n d u c e db yc p t - c a m p ，h 8 9 ，c p t c g m pa n d k t 58 2 3r e s p e c t i v e l y ，a n dt h ee f f e c to fh 8 9o nc p t - c a m p i n d u c e da n d k t 58 2 3o nc p t c g m p i n d u c e dp - v a s pt r a n s l o c a t i o n ( 4 ) h e l ac e l l sw e r es y n c h r o n i z e dw i t had o u b l et h y m i d i n eb l o c k ，c e l l e x t r a c t sw e r eh a r v e s t e da td if f e r e n tt i m ep o i n t s ，a n dw e s t e r nb l o ta s s a y w a sa p p l i e dt oi n v e s t i g a t et h el e v e lo fv a s pa n dp - v a s pd u r i n gc e l l c y c l ep r o g r e s s i o n ( 5 ) h e l ac e l l sw e r es y n c h r o n i z e dw i t had o u b l et h y m i d i n eb l o c ka n d t h e nr e l e a s e di n t of l e s hm e d i u m t h ec e l l sw e r et r e a t e dw i t ht h e a c t i v a t o r so ri n h i b i t o r so fp r o t e i nk i n a s ea ，ga n dc ，c e l le x t r a c t sw e r e h a r v e s t e da td i f f e r e n tt i m ep o i n t s ，a n dw e s t e r nb l o ta s s a yw a sa p p l i e dt o d e t e c tt h el e v e lo fp h 3s10 ，a n dt oi n v e s t i g a t et h ea l t e r a t i o no fc e l l c y c l ep r o g r e s s i o n ( 6 ) t h em u t a n tv a s pd n aa td i f f e r e n tp h o s p h o r y l a t i o ns i t e sw e r e t r a n s f e c t e di n t oh e l ac e l l st oa l t e rt h el e v e lo fp - v a s p c e l l sw e r e s y n c h r o n i z e dw i t h ad o u b l et h y m i d i n eb l o c ka n dc e l le x t r a c t sw e r e h a r v e s t e da td if f e r e n tt i m ep o i n t s w e s t e mb l o ta s s a yw a sa p p l i e dt o d e t e c tt h el e v e lo fp - h 3sio ，a n dt oi n v e s i t i g a t et h ea l t e r a t i o no fc e l l c y c l ep r o g r e s s i o n v 1 江苏大学博士学位论文 ( 7 ) r n ai n t e r f e r e n c ew a sa p p l i e dt os u p p r e s sv a s pg e n ee x p r e s s i o n ， a n dt od e c r e a s et h el e v e lo fp v a s p i m m u n o f l u o r e s c e n c ea s s a yw a s a p p l i e dt oi n v e s t i g a t et h eb i n u c l e a t e dc e l l s ；f a c sa s s a yw a sa p p l i e dt o i n v e s t i g a t et h ep e r c e n t a g eo f x 4 nc e ll s ；w e s t e r nb l o ta s s a yw a sa p p l i e d t od e t e c tt h el e v e lo fp h 3s10 ，a n dt oi n v e s i t i g a t et h ea l t e r a t i o no fc e l l c y c l ep r o g r e s s i o n ( 8 ) c o n s t r u c t e das h r n ae x p r e s s i n gv e c t o rd i r e c tt ov a s pg e n e ，a n d c o t r a n s f e c t e di tw i t hg f pv e c t o ri n t oh e l ac e ll s i m m u n o f l u o r e s c e n c e a s s a yw a sa p p l i e dt os h o wt h ef o r m a t i o no fs p i n d l e ( 9 ) i m m u n o d e p l e t i o nw a sa p p l i e dt od e p l e t ev a s pf r o mt h ex e n o p u s e g ge x t r a c t ，a n dt oi n v e s i g a t et h es p i n d l ea s s e m b l y r e s u l t s ： ( 1 ) v a s p b o u n dt o 仅一t u b u l i n ；p - v a s psi5 7c o l o c a l i z e dw i t h0 【- t u b u l i n o nt h em i t o t i cs p i n d l e ，w h i l ep v a s p $ 2 3 9c o l o c a l i z e dw i t ha c t i nb u t d i dn o tc o l o c a li z e dw i t h 仅一t u b u li n ( 2 ) t h ei n h i b i t o r so fp r o t e i nk i n a s ea ，ga n dc c o u l da l t e rt h el e v e lo f p - v a s p ，a n di n d u c et h ed e l a yo ft h ea c c u m u l a t i o no fp h 3s 10 ( 3 ) v a s ps i r n a n o to n l ys p e c i f i c a l l yd e p l e t e dt h ee x p r e s s i o no fv a s p ， b u ta l s od e c r e a s e dt h el e v e lo fp - v a s ps15 7 i tc a u s e da ni n c r e a s eo f b i n u c l e a t e dc e l l sa n dt h ep e r c e n t a g eo fx 4 nc e l l s ，a n dad e l a yo ft h e a c c u m u l a t i o no f p h 3s io ( 4 ) v a s ps i r n ai n d u c e dt h ei n h i b i t i o no ft h ep r o l i f e r a t i o no fh e l a c e l l s ( 5 ) v a s ps h r n a d i dn o tc h a n g et h ef o r m a t i o no fs p i n d l e ( 6 ) i nt h ex e n o p u se g ge x t r a c t ，w i t ht h ed e p l e t i o no fv a s p ，t h en e w f o r m e ds p i n d l eh a da na b n o r m a la s s e m b l y c o n c l u s i o n s ： v l i v a s p 参与细胞周期调控及其机制的研究 ( 1 ) p - v a s p s15 7c o l o c a l i z e dw i t hg c t u b u l i no nm i t o t i cs p i n d l e ( 2 ) v a s pc o u l db i n dt o 0 【一t u b u l i n ， a n dw a san e w m i c r o t u b u l e a s s o c i a t e dp r o t e i n ( 3 ) t h ea l t e r a t i o no ft h el e v e lo fp - v a s pc a u s e dt h ed e l a yo fg 2 m p r o g r e s s i o n ( 4 ) v a s ps i r n ac a u s e dt h ed e l a yo fg 2 mp r o g r e s s i o n ，t h ed e f e c to f c y t o k i n e s i sa n dt h ei n h i b i t i o no fp r o l i f e r a t i o n ( 5 ) v a s pm i g h tp l a y ar o l ei n r e g u l a t i n g t h ep r o c e s so fs p i n d l e a s s e m b l y k e y w o r d s ：v a s p ，p - v a s p ，m i c r o t u b u l e a s s o c i a t e dp r o t e i n ，g 2 m ， s p i n d l e v l l i 江苏大学博士学位论文 目录 摘 要一i a b slk a cl 。v 第一章绪论1 le n a v a s p 蛋白研究现状1 1 1v a s p 的分布1 1 2v a s p 的结构特点1 1 3v a s p 对细胞骨架的调节作用2 1 4 含有e n a v a s p 蛋白的蛋白复合物4 1 5e n a v a s p 蛋白受到磷酸化调控6 1 6e n a v a s p 蛋白的病理生理相关性8 1 7 e n a v a s p 蛋白和药物的发现一l o 2 细胞骨架1 0 2 1 微管1 1 2 2 微丝1 l 2 3 微管和肌动蛋白细胞骨架之间的“c r o s s t a l k ”一1 2 3 纺锤体研究现状1 7 4 、本研究的目的和立项依据1 9 5 、研究内容和技术路线1 9 参考文献2 0 第二章v a s p ，一个新的微管相关蛋白? 3 7 1 材料与方法3 8 1 1 材料3 8 1 2 方法4 0 2 实验结果4 2 2 1p - v a s p $ 2 3 9 在细胞周期各个时期的分布4 2 2 2p - v a s ps15 7 在细胞周期各个时期的分布4 4 2 3v a s p 蛋白及其磷酸化与o 【微管蛋白的结合情况4 4 v a s p 参与细胞周期调控及其机制的研究 2 4 分析不同细胞组分中v a s p 磷酸化调控的差异4 6 3 讨论4 9 参考文献。5 2 第三章v a s p 参与细胞周期进程的调控5 6 l 材料与方法5 7 1 1 材料5 7 1 2 方法6 0 2 实验结果6 3 2 1 磷酸化v a s p 在细胞周期中水平的变化6 3 2 2 磷酸化v a s p 水平对细胞周期进程的影响6 4 3j 时论7 3 参考文献7 5 第四章初步探讨v a s p 在纺锤体组装中的作用一7 8 1 材料与方法8 l 1 1 材料8l 1 2 方法8 5 2 结果9 4 2 1s h r n a 表达载体的构建、鉴定和效率检测9 4 2 2v a s ps h r n a 对纺锤体形成的影响9 6 2 3 抗体敲除v a s p 对纺锤体形成的影响9 7 3 讨论9 8 参考文献10 0 第五章主要结论和展望1 0 7 1 主要结论1 0 7 2 展望10 7 至l 【谢10 9 在读期问已发表和待发表的论文11o x 江苏大学博士学位论文 第一章绪论 1e n a v a s p 蛋白研究现状 脊椎动物e n a v a s p 家族，由三类成员组成，包括哺乳动物e n a ( m e n a ) ， v a s p 和e n a v a s p 样蛋白( e v l ) 。v a s p 于上世纪8 0 年代从血小板中得到 分离。 1 1v a s p 的分布 v a s p 是e n a v a s p 蛋白家族的主要成员，其在体内分布广泛：在肺脏、 胃、大肠及平滑肌中含量丰富，也存在于脑、心脏、肾脏及小肠中，而在肝脏 及骨骼肌中检测不到它的存在。在这些组织、器官中，v a s p 的表达可以见于 浦肯野细胞、巨核细胞、心肌细胞、肾小球系膜细胞、淋巴细胞、内皮细胞、 血管平滑肌细胞以及成纤维细胞等，其中以血小板、成纤维细胞、血管内皮细 胞以及平滑肌细胞中含量更为丰富【1 】。在细胞内，它主要存在于应激纤维、粘 附斑( f o c a la d h e n s i o n ) 处应激纤维的末端、细胞间连接及细胞膜上具高动态性变 化的区域，与细胞骨架的变化联系紧密。 1 2v a s p 的结构特点 e n a v a s p 家族足一组和肌动蛋白调节相关的多功能蛋白。v a s p 最仞在血 小板中发现。v a s p 在与细胞骨架调节相关的各种细胞行为中起着重要作用， 与细胞活动中的肌动蛋白解聚聚合密切相关，如神经细胞轴索的延伸、t 细胞 的移动、成纤维细胞的迁移等 2 - 4 】。 e n a v a s p 蛋白家族的成员具有6 0 - - - 7 0 的同源性结构，v a s p 整个蛋 白序列由3 8 0 个氨基酸组成，所有的e n a v a s p 家族成员含有同样的结构域， 包括位于氨基末端的e v h l 结构域，中间的脯氨酸富集区域p r r 和羧基末端的 e v h 2 结构域 5 7 】。e v h l 区：含1 1 2 个氨基酸。e v h l 不能结合磷脂类，它能 够通过与富含脯氨酸的片段结合来调控蛋白蛋白之问的相互作用。这一与蛋白 之间的相互作用，对于e v h l 结构域锚定蛋白在细胞内精确定位来形成细胞膜 受体复合物是很重要的。富含脯氨酸区域的蛋白质即在此结合形成p p i i 型构象 v a s p 参与细胞周期调控及其机制的研究 体( p o l y p r o l i n e i ic o n f o r m a t io n ) 。可与e v h l 区域结合的富含脯氨酸结构的蛋 白质有几种，其中主要的包括：在李斯特菌( l i s t e r i a ) 表面蛋白a c ta 中的f p 4 元件；位于粘附斑复合体中的斑联蛋白( z y x i n ) 和粘着斑蛋白( v i n c u l i n ) ；t 细胞受体信号通路的成分f y b s l a p ( f y b b i n d i n gp r o t e i n s l p 7 6 一a s s o c i a t e d p r o t e i n ) 、神经轴突的引导蛋白r o b o s e m a p h o r i n 6 a 1 及s a x 3 r o b o ( r o u n d a b o u t ) 等【8 ，9 】。p r r 区：在e n a v a s p 蛋白中，位于中问的脯氨酸富 集区是保守性最少的。然而，在所有的e n a v a s p 蛋白都有脯氨酸结合位点， 能够与g 肌动蛋白结合蛋白的中问区域结合【7 ，1 0 ，1 1 】。该区含有( g p 5 ) 3 多肽 链。由于该区域在李斯特菌等细菌的基于肌动蛋白的移动中起着重要作用，因 此也被称为a b m 2 ( a c t i n b a s e dm o t i l i t y ) 序列，其序列可用x p p p p p 表示，x 可 为g 、a 、l 、s 、p 1 2 ，1 3 。此区域可与s h 3 片段、w w 片段及另一种重要的 肌动蛋白调节蛋白p r o f i l i n 结合。v a s p 的三个磷酸化位点之一的丝氨酸1 5 7 ( s e r i n e1 5 7 ) 位点位于此区域内。e v h 2 区：位于v a s p 的羧基术端，由1 6 0 - 1 9 0 个氨基酸构成。e v h 2 区域从氨基末端到羧基术端可进一步划分为a ( 2 2 5 - 2 4 5 ) 、b ( 2 5 9 - - 2 7 8 ) 、c ( 3 4 3 , - - 3 7 7 ) 三个部分。a 区域中有磷酸化位点丝氨酸 2 3 9 ( s e r i n e2 3 9 ) ；b 区域是v a s p 与肌动蛋白丝结合的区域，肌动蛋白丝也可 伎v a s p 形成二聚体，此区域含磷酸化位点苏氨酸2 7 8 ( t h r e o n i n e2 7 8 ) ；c 区域 为形成v a s p 四聚体所必需。e n a v a s p 蛋白的主要分子功能是通过其对阻止 盖帽蛋白对肌动蛋白的盖帽作用进而允许肌动蛋白丝的延长。e n a v a s p 蛋白 的这个功能需要肌球蛋白、肌动蛋白的结合位点和卷曲螺旋基序【4 ，1 4 】。总之， e v h 2 的功能主要是与肌动蛋白丝结合以及自身形成四聚体，以利于肌动蛋白 形成束状结构和调节v a s p 与粘附斑的结合。 1 3v a s p 对细胞骨架的调节作用 细胞骨架不仅可以维持细胞形态，在细胞与细胞之间、细胞与基质之间的 连接中同样发挥作用，v a s p 直接与肌动蛋白的结合也说明v a s p 参与细胞骨 架的重构。这方面的研究主要体现在细胞与基质的粘附及细胞的运动两个方面。 1 3 1v a s p 与细胞和基质的粘附 在细胞与基质接触面，粘附斑是胞内肌动蛋白锚定的位置，也是细胞与细 胞外弹力纤维附着的位置，它构成收缩弹力单位，从而传递胞外的张力。目前 2 江苏大学博士学位论文 大多数学者认为粘附斑是整合素聚集区，跨膜的整合素将胞内的细胞骨架和胞 外的基质连接起来。粘附斑是研究最多的细胞骨架连接力的转导位点。通过整 合素进行的跨膜力转导还包括粘附斑复合体蛋白( f o c a la d h e s i o nc o m p l e x p r o t e i n ) 、t a l i n 、v i n c u l i n 、0 c a c t i n i n 以及v a s p 等，它们将整合素与细胞骨架 的肌动蛋白相连。研究发现，磷酸化的v a s p 可使粘附斑结构变得不稳定，并 且p k gl 的激活能够抑制细胞的迁移速度，而细胞的迁移和细胞的粘附功能调 节足紧密相关的【l 】。在流动剪切力诱导细胞变形的过程中，实验同样证明粘附 斑的结构受到v a s p 磷酸化与去磷酸化的动态调节，这也提示v a s p 的反复磷 酸化可能介导细胞的逐步变形【1 5 】。另外，在嗜中性粒细胞中，p k g 介导v a s p 的磷酸化参与了细胞与胞外基质的局部粘附【3 】。 1 3 2v a s p 与细胞的伸展、迁移及运动 在细胞的伸展、迁移及运动中不仅要调节其细胞骨架，也要调节膜脂质与 基质问的联系。在这些过程中信号分子及其调节是关键的，近来的研究发现 v a s p 是一个重要的调节开关。在细胞伸展的早期，整合素及胞外基质侧接触 的建立可使p i p 2 的合成增多，v a s p 及v i n c u l i n 也聚集起来，在形成 v a s p v i n c u l i n 复合体后，v a s p 的磷酸化水平也下降。这种复合体在安静状态、 伸展状态的细胞及成纤维细胞中均可见到。到目前为止，v a s p 在真核细胞的 运动中究竟是一种正性的还是种负性的调节因素尚不清楚。一部分的实验结 果支持v a s p 对于真核细胞的运动是一种正性的调节因素：在b 1 6 2f 1 鼠黑色 素瘤细胞中，v a s p 的表达水平直接和细胞伪足的形成速度成正比例关系；在 鼠v a s p 突变缺失成纤维细胞的运动过程中，细胞回缩能力和细胞膜上引导区 域方向重排能力的降低，进而表现为细胞在损伤修复实验( aw o u n dh e a l i n g a s s a y ) d ? 的运动能力降低【1 6 】；v a s p 缺失的巨噬细胞其依赖肌动蛋白骨架重排 的噬菌能力降低【1 7 】。与此相反，另一部分的实验结果支持v a s p 是一种负性 的调节因素：在成纤维细胞中过度表达v a s p 会导致细胞运动能力降低；在 v a s p 缺乏的血小板中p k a 和p k g 介导的血小板聚集抑制明显降低，并且血 小板聚集前的变形非常迅速，提示此时v a s p 的作用是抑制肌动蛋白的重组， 抑制细胞变性和聚集。2 0 0 2 年b e a r 等对于v a s p 的负性调节作用提出了一种 假说【4 】4 ，认为v a s p 能促进肌动蛋白丝组装，在细胞内起“抗盖帽蛋 v a s p 参与细胞周期调控及其机制的研究 白”( a n t i - c a p p i n g ) 作用，v a s p 能减少肌动蛋白丝的分支，有利于肌动蛋白的 不断延长。v a s p 在细胞伪足部位的过度表达拮抗了盖帽蛋白的活性，形成分 叉少的细长肌动蛋白丝，导致细胞片状伪足的突出速度提高。但这种细长的丝 抵抗膜张力的能力较弱，使细胞移动减慢。相反，v a s p 表达缺失则形成高度 分叉的短肌动蛋白丝的网络结构，抗张力能力强，导致细胞迁移速度加快。研 究还发现，v a s p 可以通过一种肌动蛋白单体蛋白m y o s i nx ( m i o ) 转移到丝状 伪足顶端，从而发挥抑制肌动蛋白丝延长的作用 1 8 1 。v a s p 发挥其负性调节作 用受到各种信号分子如c d c 4 2 、r a s 等的调节。此外，v a s p 、v i n c u l i n 和p r o f i l i n 在上皮细胞中共同调节肌动蛋白的重组，这三种蛋白表达水平的高低反映了上 皮细胞粘附能力的强弱，同时也是上皮细胞不同转化状态的标志【1 9 】。 1 4 含有e n a v a s p 蛋白的蛋白复合物 1 4 1 李斯特菌属 李斯特菌的细胞内移动需要a c t a 蛋白表面的f p 4 基序募集e n a v a s p 蛋 白。这首次提示了e n a v a s p 蛋白对于调控肌动蛋白的聚合是必需的 2 0 ，2 1 。 另外，a c t a 也能结合并且激活a r p 2 3 复合物。这个含有七个蛋白的复合物激 活导致新生肌动蛋白丝的成核。a r p 2 3 和e n a v a s p 蛋白功能的结合导致肌球 蛋白尾部形成，驱使李斯特菌通过细胞浆 2 2 ，2 3 】。 1 4 2 局部粘附班和应激纤维 在成纤维细胞和血小板中，e n a v a s p 蛋白在肌动蛋白丝( 应激纤维) 的 反向平行的肌束上面的一个大的蛋白复合物中，被募集到被称为是局部粘着斑 的细胞基质粘附位点上。许多含有f p 4 基序的蛋白，例如，斑联蛋白，粘着斑 蛋白，鬼笔肽( p h a l l a d i n ) ，m i g f i l l i n 和r i a m 分布在局部粘附班上面，起做 募集e n a v a s p 蛋白到该部位的作用【2 4 ，3 0 。有趣的是，粘着斑蛋白能够募集 e n a v a s p 和a r p 2 3 到局部粘着斑上面，此处能够发现生长具倒刺毛的末端 3 1 ，3 2 。斑联蛋白和鬼笔肽也能够阶段性的募集e n a v a s p 蛋白到肌动蛋白丝 上。研究显示，内皮细胞上v a s p 过度表达能够增进应激纤维的形成【3 3 】。然 而，e n a v a s p 并不是应激纤维形成所必需的，在应激纤维形成过程中，该蛋 白的具体作用仍然是不清楚的 3 4 】。 1 4 3 层形足板和伪足 4 江苏大学博士学位论文 通过e v h l 结构域结合到含有f p 4 基序的蛋白对于募集e n a v a s