（微生物学专业论文）普鲁兰酶产生菌的筛选及其酶学性质的研究.pdf

普鲁兰酶产生菌的筛选及e 酶学性质的研究 海南大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究：j ：作所取得的 成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品 或成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律 结果由本人承担。 论文作者签名： 日期：矽口年彳月8 日 学位论文版权使用授权说明 本人完全了解海南大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家 有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权海南人学可以将 本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段 保存和汇编本学位论文。本人在导师指导下完成的论文成果，知识产权归属海南大学。 保密论文在解密后遵守此规定。 论文作者签名：尜哆 日期：触o 年6 月孕日 本人已经认真阅读“c a l l s 高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人的学位论文提交 以护 月 棚叭酬 r 矿 鹳伊 师期导日 普鲁兰酶产生菌的筛选及其酶学性质的研究 摘要 本研究从海南海口、三亚、儋州等地采集的样品中分离得到- j 6 2 株产普鲁兰酶的 菌株，并通过筛选得到了一株产普鲁兰酶能力较强的菌株b c t - 1 ，该菌株的初始酶活 力为0 3 5 7 u m l 。 通过菌株形态特征、菌落特征、生理生化鉴定，并结合1 6 sr d n a 基因序列分析， 对菌株进行了初步分类鉴定。该菌株为革兰氏阴性杆菌，无芽孢，无鞭毛，没有运动 性，菌体呈短杆状。在分离平板培养基上菌落为白色或者微黄色、较粘稠，边缘不整、 表面凹凸不平且没有色素分泌：对该菌做的2 5 项生理生化鉴定的结果表明，各项指标 与不动杆菌相似；由1 6 sr d n a 基因序列分析可以知道该菌株的1 6 sr d n a 序列与不 动杆菌属中乙酸钙不动杆菌( a c i n e t o b a c t e rc a l c o a c e t i c u ) 的相似性达至1 j 9 7 8 ，综合以 上各项鉴定指标判定该菌为不动杆菌属，将该菌株命名a c i n e t o b a c t e rs p b c t - i 。 通过单因素实验和响应面( r e s p o n s es u r f a c ea n a l y s i s ，r s a ) 分析对a c i n e t o b a c t e r s p b c t - 1 产普鲁兰酶的发酵培养基和产酶条件进行了优化，优化后的培养基的配方和 产酶条件为：玉米淀粉19 9 7 9 l ；酵母膏10 4 5 9 l ；硫酸铵5 9 l ；m g s 0 4 7 h 2 00 5 9 l ； f e s 0 4 7 h 2 0o 0 1g l ，初始p h 值5 4 ；接种量8 ，装液量为15 0 m l 5 0 0 m l ，培养温 度3 0 培养，摇瓶转速2 0 0 r m i n 。优化后产酶水平为2 6 5 6 u m l ，与优化前的产酶水 平0 3 5 7u m l 相比提高了7 4 5 倍。 通过硫酸铵沉淀，s e p h a d a xg 7 5 凝胶过滤，d e a es e p h a r o s ef a s tf l o w 强阴离子 柱层析等方法对酶进行分离纯化后，纯化后的比活力是9 9 7 u m g ，与纯化前的1 5 7 u m g 相比，纯化倍数为6 3 5 ，回收率为6 2 。用s d s p a g e 检测出酶的分子量为 5 8 k d a 左右，该普鲁兰酶的最适作用温度为5 0 ，在5 5 之间时保温2 0 m i n 后，残 余酶活力达到5 5 以上；最适作用p h 为8 2 ，该酶在p h 6 o 9 0 范围内保持较稳定的 活性。c a 2 + ，m n 2 + ，m g + 对酶有较强的激活作用，b a 2 + ，f c 2 + ，c u 2 + ，c o ”，z n 2 + 和 n g + 对酶有一定的抑制作用。在底物特异性试验中，该酶对普鲁兰糖利用率最高，其 次为可溶性淀粉，糯米淀粉，玉米淀粉，支链淀粉，利用率最低的为马铃薯淀粉。 关键词：普鲁兰酶；鉴定；不动杆菌；优化；酶学性质 普鲁兰酶产生菌的筛选及其酶学性质的研究 a b s t r a c t i nt h i sr e s e a r c h ，6 2p u l l u l a n a n s e - p r o d u c i n gs t r a i n sw e r ei s o l a t e df r o ms a m p l e st a k e n f r o mh a i k o u ，s a n y a ，d a n z h o ui nh a i n a np r o v i n c e a f t e rs c r e e n i n g ，o n e h i g h l y p u l l u l a n a n s e - p r o d u c i n gs t r a i nb c t - 1w a so b t a i n e d t h ei n i t i a le n z y m ea c t i v i t yo ft h i s s t r a i ni s0 35 7 u m 1 a c c o r d i n gt ot h ec h a r a c t e r i s t i c so fm o r p h o l o g ya n db a c t e r i ac o l o n y , p h y s i o l o g ya n d b i o c h e m i s t r yi d e n t i f i c a t i o n a n d16 sr d n ag e n e s e q u e n c ea n a l y s i s ，t h e s t r a i nw a s p r e l i m i n a r i l yi d e n t i f i e d i tw a so b s e r v e dt h a tt h ec e l l so ft h i ss t r a i nw e r es h o r tr o ds h a p e d ， g r a m ，n o n m o t i l e ，n os p o r e s ，n of l a g e l l a t h ei s o l a t e dc o l o n i e si nt h em e d i u mp l a t ei s w h i t eo rp a l ey e l l o w , v i s c o u s ，t h ee d g eo ft h ec e l li sn o ts h a r p ，t h es u r f a c eo ft h ec e l li s r a g g e d a n dn op i g m e n ts e c r e t i o n t h er e s u l t so f2 5 p h y s i o l o g i c a l a n db i o c h e m i c a l i d e n t i f i c a t i o ni n d i c a t e dt h a tt h i ss t r a i nw a sb a s i c a l l ys i m i l a rw i t ha c i n e t o b a c t e r 16 sr d n a g e n es e q u e n c ea n a l y s i si n d i c a t e dt h a tt h es i m i l a r i t yo ft h es t r a i nb c t - 1a n da c i n e t o b a c t e r c a l c o a c e t i c ur e a c h e d9 7 8 b a s e do nt h ea b o v er e s u l t s ，t h es t r a i nb c t - 1w a si d e n t i f i e d a sa c i n e t o b a c t e rs pa n dn a m e da sa c i n e t o b a c t e rs p b c t - 1 o n e - f a c t o re x p e r i m e n ta n dr e s p o n s es u r f a c ea n a l y s i s ( r s a ) w e r ec a r r i e do u tt o o p t i m i z et h em e d i u mc o m p o s i t i o na n df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so fb c t - 1 t h eo p t i m u m m e d i u ma n df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw e r e c o ms t a r c h19 9 7 9 l ；y e a s te x t r a c t10 4 5 9 l ； s u l f a t ea m m o n i u m5 9 l ；m g s 0 4 7 h 2 00 5 9 l ；f e s 0 4 7 h 2 0o 0 1g l ，i n i t i a lp h 5 4 ； a m o u n to fi n o c u l a t i o ni s8 ，5 0 0m lf l a s kc o n t a i n i n gm e d i u m15 0m l , i n c u b a t i o n t e m p e r a t u r ei s3 0 a n ds h a k i n ga t2 0 0r m i n ，f e r m e n t a t i o nt i m ei s7 2h t h eo p t i m u m p u l l u l a n a s ea c t i v i t yw a s2 6 5 6u m l ，w h i c hw a s7 4 5t i m e so ft h ei n i t i a lp u l l u l a n a s e a c t i v i t y , 0 3 5 7u m 1 t h ep u l l u l a n a s ee n z y m ew a sp u r i f i e db ys u l p h a t ep r e c i p i t a t i o n ，s e p h a d a xg - 7 5g e l f i l t r a t i o n ，i o n e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h yo nd e a es e p h a r o s ef a s tf l o w t h em o l e c u l a r w e i g h to f t h ep u l l u l a n a s ew a se s t i m a t e dt ob e5 8k d a b ys d s p a g e t h es p e c i f i ca c t i v i t y i s 9 9 7 u m g ，c o m p a r i n gw i t ht h ei n i t i a la c t i v i t y1 5 7u m g ，p u r i f i e df o l di s6 3 5 ，a n d r e c o v e r yp e r c e n ti s6 2 t h ep u l l u l a n a s eo ft h eo p t i m u mt e m p e r a t u r ei s5 0 w h e nt h e e n z y m ew a si n c u b a t e da t5 5 f o r2 0 m i n ，t h e r ew a s5 5 r e s i d u a la c t i v i t y t h ee n z y m e w a sa c t i v ei nt h er a n g eo fp h 6 0 9 0 c a 2 + ，m n 2 + ，m g + a c t i v a t e dt h ep u l l u l a n a s e a c t i v i t y ，w h i l eb a 2 + ，f e 2 + ，c u 2 + ，c 0 2 + ，z n 2 + a n dn 9 2 + i n h i b i t e dt h ee n z y m ea c t i v i t y i n t h et e s to fs u b s t r a t es p e c i f i c i t y , t h ep u l l u l a nw a st h eo p t i m u ms u b s t r a t et ot h i se n z y m e ， f o l l o w e db ys o l u b l es t a r c h ，s t i c k yr i c es t a r c h ，t o ms t a r c h ，a m y l o p e c t i n ，p o t a t os t a r c h k e y w o r d s ：p u l l u l a n a s e ；i d e n t i f i c a t i o n ；a c i n e t o b a c t e rs p ；o p t i m i z a t i o n ；e n z y m ep r o p e r t i e s 普鲁兰酶产生菌的筛选及其酶学性质的研究 目录 摘要i a b s t r a c t i i 第一章序言1 1 1 淀粉酶概述1 1 1 1 淀粉1 1 1 2 淀粉酶及其分类2 1 2 微生物脱支酶2 l - 3 普鲁兰酶j 4 1 3 1 普鲁兰酶的基本介绍：4 1 3 2 普鲁兰酶国内外研究概况和发展趋势6 1 4 普鲁兰酶的应用1 2 1 4 1 普鲁兰酶使支链淀粉变为直链淀粉12 1 4 2 普鲁兰酶与p 淀粉酶配合使用生产麦芽糖1 2 1 4 3 用于啤酒外加酶法糖化1 2 1 4 4 普鲁兰酶与其它淀粉酶配合使用1 3 1 4 5 普鲁兰酶在高葡萄糖浆生产中的应用1 3 1 4 6 普鲁兰酶在改性淀粉食品生产中的应用1 3 1 4 7 普鲁兰的其他用途1 4 1 5 研究目的及意义1 4 1 6 研究内容l5 第二章普鲁兰酶产生菌的筛选及产酶条件的优化16 2 1 材料与方法1 6 2 1 1 分离样品来源1 6 2 1 2 试剂与设备16 2 1 3 主要试剂的配制1 6 2 1 4 培养基配制1 7 2 1 5 分离方法1 7 2 1 6 普鲁兰酶活力的测定。1 7 2 1 7b c t 1 摇瓶产酶条件的优化1 9 2 1 8 响应面( r s a ) 优化实验。2 0 2 2 结果与分析2 l 2 2 1 平板筛选2l 2 2 2 葡萄糖标准曲线2 1 2 2 3 摇瓶产酶条件的优化2 2 2 2 4 响应面优化实验设计及结果2 9 2 ：；，j 、j ；吉：；：! 第三章普鲁兰酶的分离与纯化3 4 普鲁兰酶产生菌的筛选及其酶学性质的研究 3 1 材料与方法3 4 3 1 1 菌种来源3 4 3 1 2 试剂3 4 3 1 3 培养基3 4 3 1 4 实验仪器3 4 3 1 5 试剂配制3 4 3 1 6 实验方法3 5 3 2 结果与分析3 8 3 2 1 蛋白质标准曲线3 8 3 2 2 普鲁兰酶的硫酸铵沉淀3 8 3 2 3s e p h a d a xg 7 5 凝胶层析结果3 9 3 2 4d e a es e p h a r o s ef a s tf l o w 强阴离子柱层析结果4 0 3 2 5s d s p a g e 检测酶的分子量4 0 3 3 小结4 l 第四章菌株b e t - 1 产普鲁兰酶酶学性质分析4 3 4 1 材料与方法4 3 4 1 1 试剂4 3 4 1 2 实验仪器4 3 4 1 3 实验方法4 3 4 2 结果与分析4 4 4 2 1 最适作用温度和最适作用p h 值。4 4 4 2 2 酶的热稳定性以及p h 稳定性测定结果4 5 4 2 4 酶动力学k m 值测定4 7 4 2 5 酶的底物特异性4 7 4 2 6 金属离子对酶活力的影响结果4 8 4 3d 、结4 8 第五章菌株b o t - 1 的分类鉴定5 0 5 1 材料与方法5 0 5 1 1 菌株来源5 0 5 1 2 试剂5 0 5 。1 3 实验仪器一5 0 5 1 4 培养基5 0 5 1 5 实验方法5 0 5 2 结果与讨论5 4 5 2 1 培养性状及形态特征。5 4 5 2 2 生理生化特征5 4 5 2 3 菌株1 6 sr d n a 序列分析一5 5 5 3 小结5 7 第六章结论5 9 参考文献6 1 普鲁兰酶产生菌的筛选及其酶学性质的研究 第一章序言 1 1 淀粉酶概述 1 1 1 淀粉 淀粉是葡萄糖的高聚体，是植物体贮存的养分，广泛存在于种子，根和茎中，也 是制糖工业及发酵工业上最常用的原材料。淀粉可分为直链淀粉和支链淀粉，不同植 物合成直链淀粉和支链淀粉的比例与植物的种类，品种以及生长时期有关【l 】。工业上， 使用的谷类淀粉大多含有1 5 0 o - 2 0 的直链淀粉和7 5 - 8 0 的支链淀粉。直链淀粉( 结 构如图1 1 所示) 是葡萄糖仅以仅1 ，4 糖苷键连接而成的长链化合物。支链淀粉( 结 构如图1 2 所示) 除葡萄糖分子以0 【1 ，4 糖苷键连接成直链外，还有仅1 ，6 糖苷键 的存在，大约每2 0 2 5 个葡萄糖单位就有一个分支点。a 1 ，6 糖苷键分解程度直接 影响到淀粉的利用率【2 1 。 图1 1 直链淀粉结构示意图 f i 9 1 1t h e s t r u c t u r eo f s t a r c h 图1 2 支链淀粉结构示意图 f i g 1 2t h es t r u c t u r eo fa m y l o p e c t i o n 普鲁兰酶产生菌的筛选及j e 酶学性质的研究 1 1 2 淀粉酶及其分类 淀粉酶是能够将淀粉或糖原水解为糊精和更小的分子( 包括葡萄糖单位在内) 的 一大类酶的统称，广泛存在于动物、植物和微生物中p j 。淀粉酶是一类非常重要的酶， 产量占酶制剂市场份额的2 5 t 钔。淀粉酶在食品工业、纺织工业、造纸工业、洗涤剂 工业、医药、分析化学等众多领域有着非常重要的用途【5 】。尽管可以通过植物、动物 和微生物等多种途径得到淀粉酶，但是目前能够在工业上得到应用的淀粉酶绝大多数 都是来自于微生物【6 j 。 淀粉酶根据其水解产物和作用底物专一性的不同可以分为四类：q 淀粉酶、b 淀 粉酶，葡萄糖淀粉酶( y 淀粉酶) 和脱支酶。其中葡萄糖淀粉酶是外切酶，其余三种均 为内切酶，其介绍见表1 1 。在大规模应用q 淀粉酶、p 淀粉酶、葡萄糖淀粉酶的淀 粉工业中，由于直链淀粉和支链淀粉结构上的差异造成了其被淀粉酶水解产物的不 同。在淀粉加工过程中，淀粉通过液化( 9 5 10 5 c ，p h 5 5 6 2 ) 和糖化( 5 7 6 3 c ，p h 4 0 - 4 5 ) 这两个步骤后，直链淀粉可被0 【淀粉酶、p 淀粉酶水解为麦芽糖；而支链淀粉由于含 有5 - - , 6 的a 1 ，6 糖苷键，只有当加入脱支酶后，才能使支链淀粉彻底水解。由于 支链淀粉的存在阻碍淀粉的分解，影响到淀粉的利用率和产品的质量【卜9 1 ，并且在大 多发酵工业中，原料在总生产成本中都占据着较大的比重【l0 1 。因为脱支酶的对支链 淀粉的分解利用有着重大的作用，所以，世界各国为了改善淀粉酶对淀粉的作用效果， 提高支链淀粉的利用率，减少成本，纷纷投入大量人力物力用于研究开发脱支酶，以 此来提高经济效益。 1 2 微生物脱支酶 脱支酶系统名为支链淀粉1 ，6 葡聚糖水解酶( e c 3 2 1 9 1 ，能催化水解支链淀粉、 糖原以及相关的大分子化合物中的a 1 ，6 糖苷键。 1 9 3 1 年，日本的n i s h i n u r a 首次在酵母中提出了淀粉脱支酶( d b e ) 这个概念，同 时对支链淀粉进行染色时也检测到了该酶的活性，从而将其命名为“支链淀粉合成酶” 【l 。随后，人们在马铃薯块茎和水稻胚乳中发现了同样的酶，并发现该酶不能合成淀 粉，而是能够水解支链淀粉分枝上的a 1 ，6 糖苷键，从而生成直链淀粉，由此这种 酶被命名为淀粉脱支酶，在其后的研究中各国科学家发现，微生物中的细菌，真菌和 放线菌均能产生淀粉脱支酶。据不完全统计，在国内外已报道的菌株中，细菌有十余 种，其中多数为杆菌，如b a c i l l u sf l a 脚姚一d 1 2 1 ，a e r o b a c t e ra e r o g e n e 【1 3 1 ， a n a e r o b r a n e a g o t t s c h a l k i i 1 4 1，d e s u l f u r o e o e c u s m “c 螂1 1 川 ，p s e u d o m o n a s a m y l o d e r a m o s a 【16 1 ，c y t o p h a g a 1 7 等；酵母仅有s a c c h a r o m y c e s 韶，卵括肠和l i p o m y c e s 勋玎刀绷幻口1 9 】两种。目前我国尚无具备大规模工业化生产淀粉脱支酶能力的企业。我 国所需要的淀粉脱支酶全部进口自丹麦n o v oe n z y m e 公司( 由酸性普鲁兰芽孢杆菌丑 a c i d o p u l l u l y t h ：u s 生产) 和美国的g e n e n c o r 公司，且价格高昂。近年来，国内不少学者 2 普鲁兰酶产生菌的筛选及其酶学性质的研究 致力于筛选和培养新的产酶菌株，期望筛选出能产生适应不同目标的淀粉脱支酶的野 生菌株，并运用基因工程技术加以改造，使其能够增加与底物的亲和性，并通过优化 产酶条件，以得到产酶量大、酶活力高、稳定性好的产淀粉脱支酶菌株，从而实现该 酶低成本，国产化生产的目标。 表1 1 几种常见淀粉酶的作用特点 t a b 1 1s e v e r a ln o r m a lk i n d so fa m y l o l y t i ce n z y m e 名称 系统名称作用特点 分布 作用方式和专性 产物及表观现象 普鲁兰酶产生菌的筛选及其酶学性质的研究 1 3 普鲁兰酶 1 3 1 普鲁兰酶的基本介绍 普鲁兰酶( p u l l u l a n a s e ，e c 3 2 1 4 1 ) 【2 0 】是一种能够专一性切开支链淀粉分支点中 的0 【1 ，6 糖苷键，从而剪下整个侧枝，形成直链淀粉的一类脱支酶【2 l 】。该酶能将最 小单位的支链分解，最大限度地利用淀粉原料，因此在工业上有着重要应用价值，是 一种需求量较大的酶类。最初，研究者发现这种酶能够水解普鲁兰糖的u 1 ，6 糖苷 键，故称其为普鲁兰酶1 7 】。 普鲁兰糖( p u l u l l a n ) 中文亦译为茁霉多糖、出芽短梗孢糖、普聚多糖，该糖是出芽 孢梗霉产生的胞外多糖，以a 1 ，6 糖苷键结合麦芽糖构成同型多糖为主，即葡萄糖 按洳1 ，4 糖苷键结合成麦芽三糖，两端再以0 【1 ，6 糖苷键同另外的麦芽三糖相结合， 如此反复连接而成高分子多槲2 2 】。 普鲁兰酶作用于普鲁兰糖的机制如图1 3 所示。然而并非所有淀粉、糖原和糊精 中的a 1 ，6 糖苷键都能在热力促进作用下被该酶水解，水解发生的基本条件是，在 0 【1 ，6 糖苷键的两端至少有2 个a 1 ，4 糖苷键相连的d 葡萄糖【2 3 1 。 国外学者经过深入的研究，根据普鲁兰酶水解产物的不同和底物专一性将其分为 四种类型，详细介绍见表1 2 【2 4 1 。 表1 2 普鲁兰酶种类 1 a b l e1 2p u l l u l a n a s ec l a s s p u l l u l a n a s ec l a s s作用位点水解产物 p u l l u l a n a s ei 还原性末端泓l ，4 糖苷键葡萄糖 p u l l u l a n a s ei i普鲁兰糖和支链寡聚麦芽三糖和直链寡 糖0 【1 ，6 糖苷键聚糖 p u l l u l a n a s ei i io 【一l ，6 糖苷键 仅麦芽糖基( 1 ，6 ) d 葡糖 n e o p u l l u l a n a s e c c 1 ，6 糖苷键潘糖 普鲁兰酶能专一性地切断支链淀粉中的0 【1 ，6 糖苷键，这一性质决定了它在改 善淀粉酶对淀粉的作用效果、提高淀粉利用率、降低原料消耗、提高产品质量及开发 新的产品方面有着相当巨大的价值，在淀粉加工工业中有着重要的用途和良好的市场 前景。 4 普鲁兰酶产生菌的筛选及其酶学性质的研究 釜气 o 呐 m t 耐r i 、 ， k 。乙落 _ 、_ _ 、_ ，_ _ ， m e a s u r i r 嚼 摹o l 时i o n 0d - g l u c o s e ：il ，6 吨- l i n k a g e ：i l ，4 - 吨l i n k a g e 图1 3 普鲁兰酶作用于普鲁兰糖机制【2 5 】 f i g 1 3a c t i o np a t t e r no fp u l l u l a n a s eo np u l l u a n 普鲁兰酶的单独使用可以将支链淀粉转变为直链淀粉，这种转化率可以达到 1 0 0 2 6 。在淀粉的加工过程中，普鲁兰酶与糖化酶协同作用，能够加速糖化的过程， 提高糖的利用率。另外普鲁兰酶还能与p 淀粉酶协同作用来可以提高麦芽糖的产量 2 7 1 。同时普鲁兰酶可应用于饴糖生产，啤酒酿造，酒精生产制造，洗涤剂等工业 2 5 】。 普鲁兰酶也可以用来研究碳水化合物的结构。由于普鲁兰酶这种新型的淀粉酶的广泛 用途，该酶的研究和生产也日益受到世界各国的重视【2 9 1 。 目前，许多普鲁兰酶的基因已经被克隆，但对普鲁兰酶的晶体结构( 见图1 4 ) 报 道并不多。根据序列相似性对糖苷酶水解键水解酶的分类，可以判断普鲁兰酶属于a 淀粉酶第1 3 家族。这个家族中包含了3 0 多种酶，大致可分三大类：水解酶、转移酶、 异构酶。这些酶能够水解和合成a 1 ，l 、0 【1 ，2 、a 1 ，3 、a 1 ，4 、仅1 ，5 、仅1 ，6 糖苷键， 该家族的很多酶结构已经被报道，他们都为( p 愚) 8 的结构【2 1 1 。通过生物信息学的 研究表明，这个家族的蛋白质的酶活性中心都是( b 旭) 8 折叠筒这一共同结构( 见图 1 6 ) ，命名为结构域a 。第1 3 家族中的大多数酶也具有结构域b ，它是位于( 阶) 3 折叠筒中第三个p 片层与第三个a 螺旋之间的一段序列。结构域b 的结构和长度差 异较大，推测其功能是与底物的结合有关。紧接着( d 旭) 8 折叠筒后，还有结构域c ， 紧接着结构域c 是部分家族成员还有的结构域d 。 s 普鲁兰酶产生菌的筛选及j c 酶学性质的研究 f i g 1 图1 4 普鲁兰酶的晶体结构3 0 】 图1 5 ( f j l a ) 8 折叠筒2 1 】 f i g1 5t i m b a r r e lo f2 t a a ( t a k a a m y l a s e ) 1 3 2 普鲁兰酶国内外研究概况和发展趋势 1 3 2 1 普鲁兰酶的主要产生菌株 1 3 2 1 1 酸性普鲁兰酶的产生菌株 在1 9 6 1 年，b e n d e r 和w a l l e n f e l s 最先通过产气气杆菌a e r o b a c t e ra e r o g e n e s ( 典型 菌为肺炎克雷伯氏杆菌) 发酵获得了普鲁兰酶，该酶具有良好的酶学性能( 酶作用最适 p h5 5 - 6 0 ，最适温度为5 0 。c ) 3 l 】。之后，经过世界各国的科研人员广泛深入的研究， 在不同地区发现许多不同的微生物都能产该酶，并筛选出了一些适用于工业化生产的 优良菌株。 1 9 6 9 年，b r o c k 等【3 2 】从美国黄石公园分离并报道了水生栖热菌za q u a t i c u s 产普 鲁兰酶后，栖热菌抗高温的特点引起广大的研究者的关注。 6 普鲁兰酶产生菌的筛选及其酶学性质的研究 1 9 7 5 年日本的y o s h i y u k it a k a s a k i 3 3 】发现蜡状芽孢杆菌覃状变种b c e r e u s v a r m y c o i d e s 能同时产普鲁兰酶和b 淀粉酶。最佳产酶条件为p h 6 0 6 5 ，温度5 0 ，最 大转化率( 淀粉水解产生麦芽糖) 大约为9 5 。酶学性质研究中发现，此酶在p h 5 0 ， 温度6 0 依然保持大部分活性。 八十年代初，丹麦n o v o 公司0 5 】获得嗜酸性的高产普鲁兰酶芽孢杆菌b a c i d o p u l l u l y t i c u s 并投入巨资开发研究，并于1 9 8 3 年在日本和欧洲市场同时进行商品名 p r o m o z y m e 的产品销售。该普鲁兰酶产品有p r o m o z y m e 2 0 0 l ( 2 0 0 p u n g ) ，p r o m o z y m e 6 0 0 l ( 6 0 0 p u n g ) 两种类型。温度对酶活的影响在p h 5 0 、6 0 时酶活最大，4 5 和 6 8 时活力仍为6 0 的二分之一，2 0 时相对酶活小于2 0 ；在温度为6 0 时，p h 5 0 左右酶活最大，p h 4 0 和p h 6 0 时酶活降至5 0 以下，p h 3 3 时酶活接近o ；在6 0 ， p h 4 5 5 5 时，7 2 h 后仍可以保留5 0 6 5 的酶活。目前，p r o m o z y m e 这类产品已占 领了世界的大部分市场份额，是应用最广、产量最大的普鲁兰酶。 在1 9 8 5 年，美国威斯康星大学的h h h y u n 和密歇根州立大学的j g z e i k u s 对耐 热产硫梭菌( c l o s t r i d i u mt h e r m o s u l f u r o g e n e s ) 的报道，他们深入研究了通过此菌和高温 产硫化氢梭状芽孢杆菌( c l o s t r i d i u mt h e r m o h y d r o s u l f u r i c u m ) 共同培养以提高酶产量的 机理【3 6 1 。 1 9 8 6 年，p l a n t 等【3 7 】从水生栖热菌t s p y t - 1 中检测到i 型普鲁兰酶，该酶最适温 度7 5 、p h 5 5 ，分子量为6 5 k d a 。k i m 等【弱】从zc a l d o p h i l u sg k - 2 4 中分离出了相 同分子量的i 型普鲁兰酶。p h 5 5 时，7 5 c 活性最大，可彻底水解普鲁兰糖为麦芽三 糖，并能切割极限糊精、可溶性淀粉、支链淀粉和糖原的a 1 ，6 糖苷键。 到1 9 8 7 年，德国的e m a d i 和g a n t r a n i k i a n 等也报道了一株能同时产a 淀粉酶、 普鲁兰酶和葡萄糖淀粉酶的菌种：耐热产硫梭菌( c l o s t r i d i u mt h e r m o s u l f u r o g e n e s ) 。该 菌种产普鲁兰酶最适反应温度为7 0 。c - 7 5 c ，最适作用p h 为4 9 5 2 t 3 9 1 。 1 9 8 8 年，k u r i k i 等人【4 0 j 从b s t e a r o t h e r m o p h i l u s 中分离到新的普鲁兰酶。该酶能 有效的水解普鲁兰糖成潘糖，并能水解少量淀粉。 1 9 9 0 年，s a h a 掣4 l j 从火山温泉中分离到胞内、胞外均产耐热、耐酸普鲁兰酶i i 型的嗜热厌氧菌t h e r m o a o a e r o b a c t e rs p b 6 a ，其最适作用温度7 5 、p h 5 0 。1 9 9 1 年， s u z u k y 等人【4 2 】分离高温芽孢杆菌且f l a v o c a l d a r i u sk p 12 2 8 。 1 9 9 3 年，b r o w n 等1 4 习从两株嗜热厌氧古细菌激烈火球菌p y r o c o c c u s f u r i o s u s 和栖 热球菌t h e r m o c o c c u sl i t o r a l i s 中分离到i i 型普鲁兰酶。19 9 5 年，r u d i g e r 等【4 4 】人分离 到一株产耐热普鲁兰酶的伍氏火球菌pw o e s e i ，该酶的分子量为9 0 k d a ，最适酶活温 度l o o c 、p h 6 0 。 1 9 9 5 年k i m 等m 】分离到产i i 型普鲁兰酶丑c i r c u l a n sf 2 ，用淀粉酶抑制h 孑+ 和 普鲁兰酶抑制剂c 0 2 + 对其酶活抑制结果发现其两种活性在同一肽链的不同位点，因 7 普鲁兰酶产生菌的筛选及其酶学性质的研究 此将其命名为淀粉酶一普鲁兰酶( a m y l a s e p u l l u l a n a s ee n z y m e ，a p e ) ，有别于同一活 性位点的淀粉普鲁兰酶( a m y l o p u l l u l a n a s e ) 。 2 0 0 0 年，d u f f n e r 等人【4 6 】报道了一株能产耐热普鲁兰酶i i 的极端嗜热厌氧古细菌 黏质脱硫球菌d e s u l f u f o c o c c u sm u c o s u s ，该菌所产普鲁兰酶除能分解普鲁兰糖的a 1 ， 6 糖苷键外，还能切割淀粉、多糖、支链淀粉和环糊精内0 【1 ，4 糖苷键，产生麦芽三 糖和麦芽糖，因此这是一种新型的能分解环糊精的普鲁兰酶。 2 0 0 1 年，唐宝英等人【4 7 】筛选得到一株产耐热耐酸普鲁兰酶的芽孢杆菌 b a c i l l u s s p e m 2 4 1 9 ，其普鲁兰酶最适作用温度7 5 。c 、最适p h 为4 6 ，该酶学性质接 近n o v o 公司的普鲁兰酶，适用于淀粉糖化的工业生产。 1 3 2 1 2 碱性普鲁兰酶的主要产生菌株 碱性普鲁兰酶在p h 6 啦1 1 0 有较稳定的酶活，且具有较高的热稳定性。在碱性 条件下能专一性水解茁霉多糖、淀粉、糖原、支链淀粉和相应低聚糖中的a 1 ，6 糖 苷键。与酸性普鲁兰酶不同的是，碱性普鲁兰酶是洗涤剂的一种有效添加剂，从而拓 宽了该酶在工业生产中的应用。 a a r 和i g a r a s h i 4 8 】在1 9 9 2 年也发现了产碱性普鲁兰酶的栖热菌菌株t h e r m u s 。 1 9 9 4 年，l e e 等人【4 9 】从土壤中分离得到一株产耐热、耐碱i i 型普鲁兰酶的芽孢 杆菌b a c i l l u ss p x a l 6 1 。该普鲁兰酶同一活性位点同时具有a 一淀粉酶和普鲁兰酶活 性，产物为麦芽糖和麦芽三糖。 2 0 0 2 年，马晓军等【5 0 1 选育到一株高产稳定耐热的碱性普鲁兰酶生产菌株芽孢杆 菌b a c i l l u ss p s x 1 2 。对该菌的原生质体经紫外诱变处理后，酶活提高2 8 倍。该普 鲁兰酶最适作用温度5 5 、最适p i l l 0 0 1 0 5 ，可应用于洗涤业作为添加剂。 2 0 0 2 年，b e r t o l d o 等f 5 l 】对哥氏厌氧分支杆菌a n a e r o b r a n c ag o t t s c h a l k i i 基因测序 发现该菌携带普鲁兰酶基因。对该基因进行重组克隆得出酶分子量9 6 k d a ，最适作 用温度7 0 、p h 8 0 。此外，闪烁杆菌f e r v i d o b a c t e r i u mp e n n i v o r a n s 和栖热孢菌 t h e r m o t o g am a r i t l i m a 也含有相似的普鲁兰酶基因。 1 3 2 2 普鲁兰酶主要产生菌株的酶学特性 见表1 3 所示。 1 3 2 3 普鲁兰酶产生菌的同源性比较 用m e g av e r