（临床医学专业论文）原发性胆汁性肝硬化患者外周血单个核细胞基因表达谱的相关研究.pdf

二、主要仪器和试剂6 三、实验方法8 四、统计分析1 4 结果1 4 一、样本临床基本情况1 4 二、提取p b m c 总r n a 结果15 三、全基因组表达谱芯片检测结果1 5 四、实时荧光定量p c r 结果2 0 五、e l i s a 结果3 6 讨论z i ( ) 第一部分全基因组表达谱芯片检测结果分析4 0 第二部分荧光定量p c r 及e l i s a 检测结果分析。4 1 1 c c l 2 0 在p b c 患者p b m c 中训 斟a 表达水平及血清中蛋白表达水平的研究一4 1 2 c c l 3 在p b c 患者p b m c 中m r n a 表达水平的研究4 2 3 p b e f l 在p b c 患者p b m c 中l i 斟a 表达水平的研究。4 2 4 s 1 0 0 a 1 2 在p b c 患者p b m c 中m r n a 表达水平及血清中蛋白表达水平的研究4 3 5 c d l 4 在p b c 患者p b m c 中m r n a 表达水平的研究4 4 第三部分研究的影响因素、不足之处和改进方法4 4 j ；吉论z i ! ； 参考文献4 6 综述一：原发性胆汁性肝硬化酬r n a 及蛋白差异表达研究进展4 9 综述二：t w e a k f n l 4 在自身免疫性疾病中的研究进展5 9 致谓 6 4 a s t a 忱 a m a m 2 a i h c d n a c 耶 c h c c v h p s s s l e r a s s c h c s p l o o g p 2 1 0 i g g m r n a p b m c p b s p c r q r t p c r g a p d h s 1 0 0 a 1 2 c c l 2 0 c c l 3 p b e f l c d l 4 c t f d r n d b m i u d c a a s d a r t a t ea m i n o t r a n s f e r a s e a n t i m i t o c h o n d r i a la n t i b o d i e s a n t i m i t o c h o n d r i a lm 2a n t i b o d i e s a u t o i 咖u n eh e p a t i t i s c o m p l e m e n t a r yd e o x y r i b o n u c l e i ca c i d c h r o n i ch e d a t i t i sb c h r o n i ch e d a t i t i sc c h r o n i cv i r a lh e d a t i t i s p r i m a r ys j 6 9 r e ns y n d r o m e s y s t e m i c1 u p u se r y t h e m a t o s u s r h e u m a t o i da r t h r i t i s s v s t e m i cs c l e r o s i s h e a lt h yc o n t r 0 1 n u c l e a ra u t o a n t i g e ns p l 0 0 g l y c o p r o t e i n2 1 0 i 咖u n o g l o b u l i ng m e s s e n g e rr n a p e r i d h e r a lb l o o dm o n o n u c l e a rc e l l p h o s d h a t eb u f f e r e ds o l u ti o n p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n q u a n tit a ti v er e a l ti m ep c r g l y c e r a l d e h y d e 一3 一p h o s p h a t ed e h y d r o g e a s e s 1 0 0c a l c i 姗b i n d i n gp r o t e i na 1 2 c h e m o k i n e( c cm o ti f )li g a n d2 0 c h e o k i n e ( c cm o t i f )l i g a n d3 p r e _ b c e l lc o l o n ye n h a n ci n gf a c t o rl c d l 4a n t i g e n t h r e s h 0 1 dc y cl e f a ls ed is c o v e r yr a t e n od a t a b o d vm a s si n d e x u r s o d e o x y c h o l i ca c i d 天门冬氨酸氨基转移酶 抗线粒体抗体 抗线粒体m 2 亚型抗体 自身免疫性肝炎 互补脱氧核糖核酸 慢性乙型肝炎 慢性丙型肝炎 慢性病毒性肝炎 原发性干燥综合征 系统性红斑狼疮 类风湿关节炎 系统性硬化症 健康对照 自身抗原核点蛋白s p l 0 0 核包膜蛋白g p 2 1 0 免疫球蛋白g 信使r n a 外周血单个核细胞 磷酸盐缓冲溶液 聚合酶链式反应 实时荧光定量p c r 3 一磷酸甘油醛脱氢酶 钙结合蛋白s 1 0 0 a 1 2 c c 亚族趋化因子配体2 0 c c 亚族趋化因子配体3 前b 细胞克隆增强因子l c d l 4 抗原 循环阈值 假发现率 资料缺失 体重指数 熊去氧胆酸 中英文摘要 第一部分全基因组表达谱芯片检测 目的利用基因芯片技术找出原发性胆汁性肝硬化( p r i m a r yb i l i a r yc i r r h o s i s ， p b c ) 患者中差异表达的基因。方法收集p b c 患者和健康对照各3 例，采集外周 静脉血，提取p b m c 总r n a ，进行人类全基因组表达谱芯片( 2 2 k ，约2 2 0 0 0 个基 因) 检测。结果基因芯片共筛选出3 5 6 个在p b c 中差异表达的基因，其中2 9 6 个表达上调，6 0 个表达下调。结论基因芯片为探索p b c 的发病机制提供了方向。 第二部分实时荧光定量p c r 及e l i s a 检测 目的扩大样本量验证芯片结果的准确性，进一步分析筛选基因m r n a 及蛋白水平 与疾病相关性。方法选取5 个基因c c l 2 0 、c c l 3 、p b e f l 、s 1 0 0 a 1 2 、c d l 4 ，扩 大样本量对p b c 患者、健康对照、慢性乙肝患者进行r t p c r 及e l i s a 验证。结 果p b c 患者p b m c 中c c l 2 0 、c c l 3 、p b e f l 、s 1 0 0 a 1 2 、c d l 4m r n a 表达均升高， 且与疾病活动性及进展相关；c d l 4m r n a 表达与细胞组分有关。p b c 患者血清c c l 2 0 与s 1 0 0 a 1 2 浓度与疾病进展相关。结论p b c 患者c c l 2 0 、c c l 3 、p b e f l 、s 1 0 0 a 1 2 的表达水平可以成为判断疾病活动性及进展情况的指标。 【关键词】原发性胆汁性肝硬化；人类全基因组表达谱芯片；实时荧光定量p c r ； 发病机制：生物标志物 0 b j e c t i v e st oe x p l o r et h ed i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e dg e n e si np b cc o m p a r e d w i t hh e a l t h yc o n t r 0 1 s m e t h o d sp e r i p h e r a lb l o o dm o n o n u c l e a rc e l l s ( p b m c s ) w e r ei s 0 1 a t e df r o m3p b cp a t i e n t sa n d3a g ea n ds e xm a t c h e dh e a l t h y c o n t r o l s t o t a lr n aw a se x t r a c t e df r o mp b m c s ， t h e na n a l y z e db yh u m a n g e n o m ee x p r e s s i o np r o f i l i n gm i c r o a r r a y s ( 2 2 k ) r e s u l t s3 5 6g e n e s d i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e di np b cw e r ei d e n t i f i e db ym i c r o a r r a ya n a l y s i s ，i n w h i c h2 9 6g e n e sw e r eu p r e g u l a t e da n d6 0g e n e sw e r ed o w n r e g u l a t e d c o n c l u s i o n sg e n em i c r o a r r a yp r o v i d e dar e s e a r c hd i r e c t i o nf o rt h e p a t h o g e n e siso fp b c p 8 r t 2a n a l y s isb yq 盯一p c r 锄de l i s a o b j e c t i v e s t oc o n f i r mt h em i c r o a r r a y sr e s u l t s ， a n dt of i n dt h e r e l a t i o n s h i pb e w e e nt h eg e n e sa n dt h ed i s e a s e m e t h o d sr e a l t i m e q u a n t i t a t i v ep o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o na n de l i s aw e r eu s e dt ov e r i f yt h e e x p r e s s i o no fc c l 2 0 、c c l 3 、p b e f l 、s 1 0 0 a 1 2 、c d l 4i n1 a r g e rp o p u l a t i o n s r e s u l t st h em r n ae x p r e s s i o nw e r ea l lu p r e g u l a t e di np b c ，a n dc c l 2 0 、 c c l 3 、p b e f l 、s 1 0 0 a 1 2w e r ef o u n dt ob ec o r r e l a t e dw i t ht h ed i s e a s ea c t i v i t v o rp r o g r e s s i o n ，b u tc d l 4m r n ae x p r e s s i o nw e r ef o u n dt ob ec o r r e l a t e dw i t h t h ep e r c e n t a g eo fm o n o c y t e s t h es e r u mc o n c e n t r a tio n so fc c l 2 0a n ds10 0 a 12 w e r ef o u n dt ob ec o r r e l a t e dw i t ht h ed i s e a s ep r o g r e s s i o n ( b n c l u s i o n s c c l 2 0 、c c l 3 、p b e f l 、s 1 0 0 a 1 2m a yb ea c t i v e l yi n v o l v e di nt h ep a t h o g e n e s i s o fp b ca n dm a yb ei n d e x e sf o rt h ed is e a s ea c t i v it yo rp r o g r e s s i o n 【k e y - o r d s 】 p b c ；h u m a ng e n o m ee x p r e s s i o np r o f i l i n gm i c r o a r r a y s ( 2 2 k ) ： q u a n t i t a t i v er e a l t i m ep c r ：p a t h o g e n e s i s ：b i o m a r k e r 3 前言 原发性胆汁性肝硬化( p b c ) 是一种原因不明的以血清中出现高滴度抗线粒 体抗体( a m a s ) 及自身免疫介导的肝内小胆管进行性破坏和炎细胞浸润为主要特 点的自身免疫病。其病因至今未明，可能是遗传、环境、性别、感染、免疫等多 个因素作用的结果。 目前疾病诊断主要依照美国肝脏病学会2 0 0 9 年制定的p b c 诊疗指南：胆 汁淤积的生化学证据：主要基于a l p 升高；a m a 阳性；非化脓性破坏性胆管 炎及小叶间胆管破坏的组织学证据( c l a s si ，l e v e lb ) 。如果符合上述三个标准 中的两项则p b c 的诊断可以成立。鉴别诊断包括药物引起的胆汁淤积反应、胆道 阻塞、结节病、a i h 及原发性硬化性胆管炎 1 。 在最终确诊的p b c 患者中，有5 1 0 a m a a m a m 2 检测阴性，可通过肝穿活 检进行病理诊断；而在临床实际工作中，肝脏病理不易获得。也有一部分患者 a m a a m a m 2 阳性，但a l p 、g g t 不高。因此过分依赖a m a 检测，容易造成漏诊或 误诊。 p b c 患者血清中也存在其他的特异性抗核抗体( a n a ) ，抗g p 2 1 0 抗体，抗s p l 0 0 抗体。用抗g p 2 1 0 抗体诊断p b c 的特异性可达9 9 ，但敏感性仅为1 0 4 1 ；抗 体阳性与阴性患者预后有显著差异，阳性患者死于肝衰竭者明显多于阴性者。用 抗s p l o o 抗体诊断p b c 的特异性约为9 7 ，敏感性为1 0 3 0 ；该抗体阳性p b c 患者出现肝硬化几率明显增加，血清中胆红素升高，患者病情进展速度快，预后 较差。但是有研究表明3 5 的p b c 患者h i v 一1 检测假阳性 2 ，因为s p l 0 0 蛋白 的一个结构域与眦v 的n e f 蛋白具有相似的序列 3 ，4 。 鉴于以上自身抗体在特异性及敏感性上的不足，我们研究p b c 发病机制，研 究其基因表达谱，寻找新的生物标志物，为疾病早期诊断、疾病活动性评估、预 后评估及治疗提供帮助是非常必要的。 多种因素导致的基因差异性表达与疾病的发生发展密切相关，分析差异表达 的基因，对于研究疾病的发病机制、寻找新的标志物非常重要。随着分子生物学 的进展，基因芯片技术的成熟为研究疾病的发病机制提供了新的平台，鉴于其快 速、高通量、样品用量少等优点，现正广泛运用于生物学研究。该研究获得原发 性胆汁性肝硬化外周血单个核细胞的基因表达谱，从一个较宽的层面上认识原发 性胆汁性肝硬化的基因表达情况。有望为p b c 的临床诊断、评估疾病活动度、预 4 后及治疗提供新的途径。 实验目的 利用人类全基因组表达谱芯片技术找出p b c 患者外周血单个核细胞中差异表 达的基因，并对其转录水平及翻译水平进行验证，从而为疾病诊断、评估、治疗 及预后提供帮助。 材料与方法 一、研究对象及项目 1 样本来源： 全部6 6 例p b c 患者来自2 0 0 9 年1 1 月至2 0 1 0 年5 月就诊于北京协和医院和 北京佑安医院的门诊或住院病例，全部7 3 例正常健康对照来自北京协和医院健 康医学部体检者，全部5 5 例慢性乙型肝炎患者来自于北京协和医院肝炎门诊及 北京佑安医院，患者、健康志愿者参加研究前均签署知情同意书。 2 入组标准及分组情况： ( 1 ) p b c 入组标准及分组标准： 根据美国肝病研究学会( 从s l d ) 2 0 0 9 年制定的原发性胆汁性肝硬化指南：a 胆汁淤积的生化学证据：主要基于a l p 升高；b a m a 阳性；c 非化脓性破坏性胆管 炎及小叶间胆管破坏的组织学证据( c l a s si ，l e v e lb ) 。如果符合上述三个标准中的 两项则p b c 的诊断可以建立。鉴别诊断包括药物引起的胆汁淤积反应、胆道梗 阻、结节病、自身免疫性肝炎及原发性硬化性胆管炎 1 】。 p b c 患者分组：一部分患者对u d c a 治疗反应好，治疗后肝功完全正常；另一部 分患者经u d c a 治疗后a l p 和g g t 仍然高于正常上限；另外t b i l 在很多晚期，存在肝 硬化的患者中升高，在m a y o 分期中占有较大比重，是一个非常好生存预后指标 5 ，但是t b i l 水平容易受感染、药物等因素的影响。故在本研究中将p b c 患者分 为三组：稳定期( 定义为：用u d c a 治疗后，a l t 、a s t 、g g t 、a l p 、t b il 完全正常) ； 活动期( 定义为g g t 、a l p 超出正常上限，t b 订在正常范围内，且b 超未提示肝硬 化) ；肝硬化期( 定义为：除外感染、药物因素，胆红素升高，或b 超证实有肝 硬化，门脉高压的患者) 。 根据公式计算m a y o 危险评分( m a y or i s hs c o r e ，m r s ) ：m r s = o 8 7 1 1 0 9 。 总 胆红素( m g d 1 ) 卜2 5 3 l o g 。 白蛋白( g d 1 ) + 0 0 3 9 ( 年龄) + 2 3 8 1 0 9 。 凝血 酶原时间( s ) + 0 8 5 9 ( 水肿积分) ，其中水肿积分：o 分为无水肿；o 5 分为可 控制的水肿；1 分为难控制的水肿。 病理分期：根据l u d w i g 分期标准分为4 期：i 期为汇管区炎症；i i 期为弥漫 性汇管区和汇管区周围炎症和或纤维化；i i i 期为出现纤维间隔或桥接坏死； i v 期为肝硬化。若同时出现不同期别的病理表现，则归入高级别组，例如i i i i i 期归入i i i 期。 由病理科医生进行p b c 肝脏病理分期。i i i 期为早期，i i i 期为晚期。 ( 2 ) 健康对照入组标准： 全部健康对照来自北京协和医院体检中心的健康志愿者。入选条件：无既 往肝病史、自身免疫性疾病史、肿瘤病史及相应家族史；无烟酒嗜好；体检 当日血常规、尿常规、大便常规、肝功能( a l t 、a s t 、a l p 、g g t 、t b i l 、d b i l 、 t p 、a l b ) 均正常；h b s a g 阴性。 ( 3 ) 慢性乙型肝炎入组标准： 根据中华医学会肝病学分会中华医学会感染病学分会于2 0 0 5 年制定的慢 性乙型肝炎防治指南： h b e a g阳性慢性乙型肝炎血清h b s a g 、h b vd n a 和h b e a g阳性，抗 一h b e阴性，血清a l t 持续或反复升高，或肝组织学检查有肝炎病变。 h b e a g阴性慢性乙型肝炎血清h b s a g 和h b vd n a 阳性，h b e a g 持续阴 性，抗一h b e 阳性或阴性，血清a l t 持续或反复异常，或肝组织学检查有肝炎 病变。 二、主要仪器和试剂 1 人类全基因组表达谱芯片( 2 2 k ) ： 由博奥生物有限公司提供技术平台，是其研发的基因芯片产品之一，编号 2 2 0 0 1 0 ，产品名称晶芯 人类全基因组寡核苷酸微阵列芯片服务v 1 o ，包含2 1 5 2 2 条7 0m e r 长度的寡核苷酸，每条寡核苷酸代表了人的一个基因转录本：其中2 1 3 2 9 条来自于o p e r o n 公司的h u m a ng e n o m eo l i g os e tv e r s i o n2 1 ，其余1 9 3 条0 l i g o d n a 为博奥公司合成。芯片上寡核苷酸代表的近2 2 0 0 0 个基因中包含少部分功能 6 g e n ea m p 2 4 0 0 型p c r 扩增仪 c h 一2 型显微镜 4 8 0 3 一0 2 加热磁力搅拌器 e c p 3 0 0 0 型三恒电泳仪 f l u o r c h e mi s 一8 8 0 0 凝胶成像系统 h 一8 4 微型混合器 x k 9 6 一b 快速混匀器 w d 9 0 0 a s l 2 3 2 格兰仕微波炉 n a n o d r o pn d 一10 0 0 分光光度仪 实时荧光定量p c r 仪i q 5 4 及一2 0 低温冰箱 一8 0 低温冰箱 3 主要试剂 ( 1 ) 主要的生物化学试剂 氯仿 异丙醇 无水酒精 琼脂糖 淋巴细胞分离液 去离子水 d n am a r k e r 2 t a qm a s t e r m i x t r i z o l 试剂 p r i m e s c r i p t t mr t p c rk itd r r 0 3 7 a s y b r p r e m i xe xt a qt m ( p e r f e c tr e a lt i m e ) d r r 0 4 】a 美国p e r k i ne l m e r 公司 日本0 l y m p u s 公司 c o l e p a r m e r 公司 北京六一仪器厂 美国a l p h ai n n o t e c h 公司 江苏水泗实验设备厂 姜堰市新康医疗器械有限公司 广州格兰仕电器实业有限公司 美国t h e r m o 公司 美国b i or a d 公司 中国海尔集团有限公司 日本s a n y 0 公司 北京化学试剂厂 北京化学试剂厂 国药集团化学试剂有限公司 北京赛百盛生物技术有限公司 国药集团化学试剂有限公司 北京天根生物有限公司 北京天根生物有限公司 北京康为试剂生物科技有限公司 美国i n v i t r o g e n 公司 宝生物工程( 大连) 有限公司 宝生物工程( 大连) 有限公司 h u m a nc c l 2 0 m i p 一3 aq u a n t i k i n ee l i s ak i t 美国r d 公司 s 1 0 0 a 1 2 e n r a g ee l i s ak i t日本c i r c u l e x 公司 ( 2 ) 主要试剂的配备 1 p b s ( p h 7 2 0 ) t a eb u f f e r ( 5 0 t a e ) 琼脂糖凝胶制备( 1 5 ) n a c l8 0 9 ，k h 2 p 0 4o 2 9 ，n a 2 h p 4 1 2 h 2 02 9 9 ，k c l 0 2 9 ，加蒸馏水至l 0 0 0 m l 1 l 中含t r i s c l2 4 2 9 ，冰乙酸5 7 1 m l ，0 5 姗o l l e d t a ( p h 8 0 ) 1 0 0 m l 。按1 ：5 0 稀释配制使用。 o 3 9 加入2 0 m 11 t a e 电泳缓冲液中，微波炉加热 3 0 秒后至沸腾，加入e b2 “1 ，充分混匀，将温热的 凝胶倒入己放置好梳子的制胶盘中，待凝胶凝固后 待用， 三、实验方法 1 实验标本采集： p b c 患者、健康对照组及疾病对照组受试者，均采集静脉血7 m l ，( 肝素或 e d t a 抗凝5 m 1 ，血清管2 m 1 ) 取血后立即进行血浆和细胞的分离，1 5 0 0 r p m ，常 温，离心5 分钟，血浆一8 0 冻存备用，细胞留作下一步分离。 2 提取外周血单个核细胞( p b m c ) ： ( 1 ) 分离血浆后剩余的细胞层中加入2 倍体积p b s 缓冲液，充分混匀。 ( 2 ) 取2 支试管，每支试管均加入3m l 左右淋巴细胞分离液。 ( 3 ) 将稀释后的血细胞均匀加入两支试管中，注意小心缓慢操作，保持淋巴细胞 分离液层面不被破坏，使稀释后的抗凝血置于淋巴细胞分离液层上。 ( 4 ) 2 5 0 0 r p m ，常温，离心2 0 分钟。 ( 5 ) 离心结束后立即小心吸取两支试管中的p b m c 至另一试管，并加入3 4 m 1p b s 洗涤。 ( 6 ) 1 5 0 0 r p m ，4 ，离心5 分钟。 ( 7 ) 离心结束后弃去上清，将剩余细胞团块敲打散开，加入p b s 定容至2m 1 ，混 匀。 ( 8 ) 取9 ul 加入计数板，计数细胞数目。 ( 9 ) 重复洗涤离心一次。 洗涤结束后，弃上清，将剩余细胞团块敲打散开，加入适量p b s ，将细胞加 入一个r n a s ef r e e 的1 5 m le p 管中。 a d3 0 0 0 r p m ，4 ，离心1 0 分钟。 离心结束后尽量弃净上清，加入l m lt r i z 0 1 反复吹打至细胞团块完全溶解 ( 具体加入t r i z o l 量由细胞数目决定，原则上每5 1 0 1 0 6 个细胞加入l m l t r i z 0 1 ) 。 一8 0 冻存用于r n a 的制备。 3 提取p b m c 总r n a ： ( 1 ) 取出冻存的t r i z o l 细胞溶解液，彻底混匀，室温静置5 分钟。 ( 2 ) 加入0 2 m l 氯仿( 每l m lt r i z 0 1 加入0 2 m l 氯仿) ，用力振荡混匀( 1 5 秒) ， 室温放置1 0 分钟。 ( 3 ) 1 2 0 0 0 r p m ，4 ，离心1 5 分钟。 ( 4 ) 转移水相( 约3 0 0 一4 0 0 i j1 ) 入另一e p 管( r n a s ef r e e ) ，加入( 5 0 0 i jl l m l t r i z 0 1 ) 异丙醇，颠倒混匀，一2 0 放置1 小时。 ( 5 ) 1 2 0 0 0 r p m ，4 ，离心1 5 分钟。 ( 6 ) 弃去上清，加入1 m l7 5 乙醇( 冰预冷) 洗涤。 ( 7 ) 7 5 0 0 r p m ，4 ，离心1 0 分钟( 重复洗2 遍) 。 ( 8 ) 弃上清，吸干乙醇，超净台内干燥( 不能完全干燥) 。 ( 9 ) 加入3 0 i jld e p c 处理水溶解r n a ，5 5 水浴5 1 0 分钟。 用凝胶电泳和分光光度计检测提取r n a 纯度和浓度。 q dr n a 一8 0 立即冻存备用。 4 凝胶电泳鉴定r n a 质量： ( 1 ) 琼脂糖凝胶的制备： 称取琼脂糖0 3 克，加t a e 缓冲液2 0 毫升，微波炉加热，直至琼脂糖完全 溶解，加入朗替代染料1 微升，摇匀，将胶倒入胶槽中，室温放置3 0 分钟， 至其凝固。 ( 2 ) 上样电泳： 吸取r n a5 微升，与1 微升6 l o a d i n gb u f f e r 上样缓冲液混合后，加样 至己放置在t a e 电泳缓冲液中的1 5 琼脂糖凝胶，1 2 0 伏恒压电泳约l o 一1 5 分钟，利用紫外透射仪及凝胶图像成像分析仪照相留图分析。 5 全基因组表达谱芯片检测： ( 1 ) 本次实验共使用6 张全基因组表达谱芯片检测，p b c 患者、健康对照各3 张， 保证年龄、性别匹配。 9 ( 2 ) 纯化总r n a ： 进行基因芯片检测的r n a 需进一步纯化，采用n u c l e o s p i 旧r n ac l e a n u p 试 剂盒( m a c h e r e y n a g e l ，g e r m a n y ) 对总r n a 进行过柱纯化。 ( 3 ) 对样品i n a 进行荧光标记： 、 采用c y 5 一d c t p 、c y 3 一d c t p ( g eh e a l t h c a r ec a t n o p a5 5 0 2 1 p a5 3 0 2 1 ) 。 ( 4 ) 杂交与清洗： 标记的d n a 溶于8 0 u1 杂交液中，于4 2 杂交过夜。杂交结束后，先在4 2 左 右含o 2 s d s 、2 s s c 的液体中洗5 分钟，而后在0 2 s s c 中室温洗5 分钟。 玻片甩干。 ( 5 ) 芯片扫描： 用l u x s c a n1 0 k a 双通道激光扫描仪( c a p i t a l b i o 公司) 进行扫描。 ( 6 ) 芯片图像的采集与数据分析： 采用l u x s c a n3 0 图像分析软件( c a p i t a l b i o 公司) 对芯片图像进行分析， 把图像信号转化为数字信号； 片间校正：根据c y 5 和c y 3 总体信号的g l o b a lm e a n 对各芯片进行片间线性校 正，使得各张芯片的g l o b a lm e a n 相同； 片内归一化：l o w e s s 方法或线性归一化： 根据信号强度和图像质量对基因进行标记； 筛选表达基因： 删除了荧光信号弱的基因以及芯片上的阴性对照、内标、外标等冗余的数据； 筛选差异表达基因： 单张芯片筛选标准为比值( p b c 健康对照) 2 0 或o 5 ，包括了表达 上调和下调的基因； 多张芯片每个基因有9 个重复比值，用s a m 软件进行分析，f d r 控制在5 以内，再以2 倍及o 5 倍标准筛选差异表达基因。 6 r n a 逆转录成c d n a ： ( 1 ) 采用t a k a r a 公司p r i m e s c r i p t 反转录试剂盒d r r 0 3 7 a 。 ( 2 ) 按照试剂盒要求严格操作，冰上进行。 ( 3 ) 采用1 0ul 反转录体系，组成如下： 5 p r i m e s c r i p t wb u f f e r6u1 ： p r i m e s c r i p t 憎e n z y m em i xi1 5ul ； o l i g od tp r i m e r1 5u1 ； r a n d o m6m e r s1 5ul ； l o r n a ( 具体加入体积由其浓度决定，每一反转录体系加入1 ugr n a ) ； d e p c 处理水( 加入体积由r n a 加入量决定) 。 ( 3 ) 反应条件：3 7 1 5m i n ，8 5 5 s 。 ( 4 ) c d n a 冻存于一2 0 备用。 7 实时定量p c r 验证： ( 1 ) 引物设计、合成：应用p r i m e rp r e m i e r 5 o 和d n a m a n 软件设计实时定量p c r 所需引物，i n v i t r o g e n 公司完成引物合成。设计引物时尽量满足如下条件： p c r 扩增产物长度：8 0 2 0 0 b p 最为合适； 引物长度：1 8 2 5 核苷酸； g c 含量：4 0 6 0 ； 引物序列：a 、g 、c 、t 整体分布尽量均匀，不要有部分的g cr i c h 或a tr i c h ； 3 末端序列：最好为g 或c ，尽量避免为t ； 互补序列：尽量避开引物内部或两条引物之间有过多碱基互补的序列，两条引 物间的3 末端避开有2 个碱基以上的互补序列； 特异性：使用b l a s t 检索确认引物的特异性。 引物序列( 5 一3 ) 如下： g a p d h f ： t c g g a g t c a a c g g a t t t g g t c g a p d h r ：g c c a t g g g t g g a a t c a t a t t g g c c l 2 0 f ：g a a g g c t g t g a c a t c a a t g c t a t c c c l 2 0 r ：g a c t t t t t t a c t g a g g a g a c g c a c c c l 3 一f ：t c t c t g c a t c a c t t g c t g c t g c c l 3 一r ：t t a g g 从g a t g a c a c c g g g c p b e f1 一f ：c c g a c t c c t a c a a g g t t a c t c a c p b e f l 一r ：t c t g t c t t c t t t t c a c g g c a t t c s10 0 a12 一f ：a t t g a g g g g t t 从c a t t a g g c t g s10 0 a12 一r ： g a t a t t c t t g a t g g t g t t t g c a a g c c d14 一f 1 ： a g a c t t a t c g a c c a t g g a g c g c d 】4 一r1 ：t c a t c g t c c a g c t c a c a a g g ( 2 ) 引物稀释、保 稀释前，将引 确定引物量； 配置储存液： 配置工作液： 存： 物管离心数秒使d n a 聚集至管底： 储存液浓度配置为1 0 0u m o l l ： 根据储存液浓度稀释配置到所需浓度，一般为1 0u m o l l ： 采用反应条件： 9 4 3 m i n 9 4 3 0 s e c + 5 5 7 2 5 m i n 3 0 s e c + 7 2 1 m i n x 制备琼脂糖凝胶，取反应后产物5 u 1 ， 成像分析仪照相留图分析。 上样电泳， 采用2 5 i jl 反应体系， 1 c y c l e ； 3 0 c y c l e s ； 1 c y c l e 利用紫外透射仪及凝胶图像 ( 4 ) r t p c r 验证： 采用t a k a r a 公司s y b rp r i m e s c r i p tr t p c r 试剂盒d r r 0 4 1 a 。按照试剂盒要 求严格操作，冰上进行。采用2 5ul 反应体系，组成如下： 2 p r e m i xe xt a q 删1 2 5ul ； 上游引物o 5 i jl ： 下游引物o 5 i jl ； c d n a2i jl ( 稀释至5 n g u 1 ) ； d d h 。09 5 ul 。 反应条件： 9 5 3 0 s e c1 c y c l e ； 9 5 5 s e c + 6 0 3 0 s e c4 0 c y c l e s ； 融解曲线分析9 5 6 0 s e c + 5 5 1 0 s e c + 5 5 1 0 s e c 。 每份标本以目标基因和内参基因各重复3 孔，求出目标基因3 个复孔循环阈值 ( c y c l et h r e s h o l d ，c t ) 的平均值和内参基因3 个复孔c t 值的平均值，c t 值= c t ( 目的基因) 一c t ( 内参基因) 。 8 e l i s a ( 1 ) 检测血清c c l 2 0 浓度 1 2 采用美国r d 公司h u m a nc c l 2 0 m i p 一3 aq u a n t i k i n ee l i s a 试剂盒。 按试剂盒说明书严格操作。 标准品梯度稀释：用蒸馏水溶解标准品干粉，室温混合 5 分钟；梯度稀释至 5 0 0 、2 5 0 、1 2 5 、6 2 5 、3 1 2 、1 5 6 、7 8 p g m 1 ，以c a l i b r a t o rd i l u e n t 作为 o p g m 1 ，用于标准曲线的制作。 e l i s a 检测血清c c l 2 0 浓度 加a s s a yd il u e n t1 0 0 i j1 孔 l 加梯度标准品、标本各l o o i jl 孔 l 室温孵育2 小时 洗涤4 遍 l 力口c o n j u g a t e2 0 0 ul 孑l j室温孵育2 小时 洗涤4 遍 l 力口显色齐02 0 0 u1 孑l i室温避光孵育3 0 分钟 加终止液5 0 l j1 孔 j 酶标仪检测 根据标准曲线将测得的标本o d 值换算为浓度( p g m 1 ) 。 ( 2 ) 检测血清s 1 0 0 a 1 2 浓度 采用日本c i r c u l e x 公司s 1 0 0 a 1 2 e n r a g ee l i s a 试剂盒 按试剂盒说明书严格操作。 标准品梯度稀释：用去离子水溶解标准品干粉，室温混合 5 分钟：梯度稀释 至5 0 0 0 、2 5 0 0 、1 2 5 0 、6 2 5 、3 1 3 、1 5 6 、7 8 p g m l ，以c a l i b r a t o rd i l u e n t 作为 o p g m l ，用于标准曲线的制作。 e l i s a 检测血清s 1 0 0 a 1 2 浓度 稀释样本( 1 5 u1 血清+ 3 0 0 l jld i l u t i o nb u f f e r ) l 加梯度标准品、活化标本各5 0 l j1 孔 l 室温孵育l 小时 洗涤4 遍 l 力口c o n j u g a t e1 0 0 1 孑l l室温孵育1 小时 洗涤4 遍 l 加显色齐01 0 0 i j1 孔 l室温避光孵育2 0 分钟 加终止液l o o i j1 孔 l 酶标仪检测 根据标准曲线将测得的标本o d 值换算为浓度( p g m 1 ) ，再乘以稀释倍数 ( 2 0 1 ) 。 四、统计分析 数据的统计学分析采用s p s s1 3 o 软件，对实时荧光定量p c r 结果2 n 进行 统计；组间比较符合正态分布采用两样本均数t 检验，相关性分析采用p e a r s o n 相关检验，以p 1 7 0 ，r n a 质量符合实验要求。 图1r n a 电泳图 三、全基因组表达谱芯片检测结果 1 芯片杂交体系质控情况： h e x 、外标、内标等阳性对照信号正常，阴性对照检测为阴性；看家基因重 复性好，比值c v 不超过0 3 ；无影响数据的污染，漏点率不超过3 。 2 差异表达基因筛选情况： 6 张芯片共筛选出3 5 6 个基因差异表达( 图2 ) ，其中2 9 6 个基因表达上调， 6 0 个基因表达下调。信号通路如( 表3 ) f 、| i 备 c 2 c 图2 芯片示意图( 红点代表p b c 中高表达基因， 绿点代表低表达基因，黄点代表基因表达基本无差异) l o g - l o gs c a 仕e rp l o t 3 0 01 0 0 03 0 0 0 1 0 0 0 03 0 0 0 0 i m e n s i t y - h u m a nr e f e r e n c er n a 图3 比较分析散点图( 红点代表p b c 中高表达基因， 绿点代表低表达基因，黑点代表基因表达基本无差异) 1 6 o o o o 寸 o o o o f o o o n o o o o o n 图4 芯片非监督聚类分析图( b 1 1 2 b 1 1 4 代表p b c 患者，n 1 1 3 n 1 1 5 代表健康对照， 可见芯片结果基本能将p b c 患者和健康对照区分开) 1 7 表3 主要信号通路基因 p a t h - a y n 锄e g e 聃 q 1 陋1 l 埒 f o l dc h 觚聃( 阳c ( )健康对照) c d 2 24 0 3 5 7 5o 1 8 6 9 2 c d h lo3 2 2 6 3 8 c l d n 4 03 1 1 1 4 1 h l a d o b1 6 8 7 0 40 3 0 5 3 c e l la d h e s i o nm o l e c u l e s ( c a m s ) i c a m l0 5 0 6 7 6 2 p e c a m l00 2 9 1 3 9 s e l p2 2 9 8 2 80 1 9 8 6 3 f 1 1 r3 2 1 1 1 50 4 6 6 6 c d 2 7 61 5 1 5 1 l2 2 3 9 1 4 c o l l a 22 2 9 8 2 82 2 6