不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳.ppt

生化与分子生物学技术,中山医学院生物化学与分子生物学教研室,不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳,一、不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳实验操作及注意事项,实验分组（每人做一管，每组配一份胶）认清试剂（试剂和吸管对号、量器的使用）封管分离胶配制与灌胶（浓度为6%，化学聚合，每组总体积为10ml，灌胶高度为78cm）封正丁醇3mm（手法、高度、观察界面变化和判断凝固、时间掌握25min）,注意事项：1、封管要严，防止漏液。2、固定玻璃管要竖直，防止夹碎。3、每组配一份胶，试剂与移液管对号，准确加量。4、配胶后立即灌胶（用滴管灌胶，用后立即清洗）5、正丁醇沿管壁缓缓加入,浓缩胶配制（浓度为3%，光聚合，每组总体积为8ml，灌胶高度为1.5cm,留1cm空隙加样）倒掉正丁醇灌浓缩胶封正丁醇3mm（观察界面，判断凝固时间）安装电泳槽（结构、原理、电流及电极的方向、不漏水、除气泡）,注意事项：1、倒掉正丁醇，用滤纸吸干再灌浓缩胶。2、配胶后立即灌胶（用滴管）3、灌胶后立即清洗滴管，防止胶凝固于管中。4、撕掉封口膜，用胶塞将玻璃管固定于电泳槽上（竖直，防漏）5、加电极缓冲液（注意液面）,加buffer样品处理并加样（20ul）电泳（6mA/管，距底1cm时停止）剥胶,固定（时间5min）,染色（时间2min）,漂洗脱色至背景透亮,二、电泳基本原理及相关知识,电泳的概念,带电粒子（胶体颗粒、离子等）在电场的作用下在特定的介质中向与其电荷性质相反的电极方向定向泳动的现象。广泛应用于生物大分子的分离和鉴定,电泳的基本原理,利用物质的两个差异来分离物质,电荷差异电荷性质电荷数量,分子差异分子大小分子形状,电泳分离蛋白质的原理,蛋白质两性解离与等电点溶液pH与蛋白质PI决定蛋白质电荷性质与数量不同蛋白质分子大小和分子形状的差异,实验室中常用到的电泳方法（以介质分类）,纸电泳醋酸纤维膜电泳凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳,原理聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(N，Nmethylene-bisacylamide，简称Bis)在加速剂N，N，N，N四甲基乙二胺(N，N，N，Ntetramethylethylenediamine，简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(ammoniumpersulfate(NH4)2S2O8，简称AP)或核黄素(ribofavin即vitaminB2，C17H20O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis，简称PAGE)。,聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；(2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶；(3)对pH和温度变化较稳定；(4)几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好；(5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g(6)凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；(7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。,凝胶浓度(T)的选择与被分离物质分子量密切相关。分子量范围与凝胶浓度的关系分子量范围适用的凝胶浓度/(%)蛋白质10420-301-410415-201-5104-110510-1511055-1051052-5核酸(RNA)10415201041055-10105-21062-2.6,聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续系统与不连续系统两大类。目前常用的多为圆盘电泳(如图1)和板状电泳(如图2)，两者电泳原理完全相同。,蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果加入一种试剂使电荷因素消除，那电泳迁移率就取决于分子的大小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。1967年，Shapiro等发现阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）具有这种作用。当向蛋白质溶液中加入足够量SDS和巯基乙醇，巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键还原。由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白质SDS复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别，SDS与蛋白质结合后，还可引起构象改变，蛋白质SDS复合物形成近似“雪茄烟”形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都不一样，约为18A，这样的蛋白质SDS复合物，在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原来的电荷和形状的影响，而取决于分子量的大小，因而SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用于测定蛋白质的分子量。,SDS-PAGE,三、聚丙烯酰胺凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质的原理,不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳的三个不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳的三个效应,凝胶孔径缓冲液pH缓冲液离子成分,浓缩效应电荷效应分子筛效应,Gly-,Pro-,Cl-,Gly-,Pro-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Pro-,Pro-,Pro-,Gly-,Gly-,Gly-,pH为8.9的电泳缓冲液（Tris-Gly）,pH为6.7的浓缩胶,pH为8.3的分离胶,有效泳动率：MCl-MPro-MGly-,6%胶,3%胶,不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC1。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9Tris-HC1。电极缓冲液是pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。,样品浓缩效应(1)凝胶孔径不连续性：(2)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性；在pH6.7的凝胶缓冲体系中前导离子或快离子：HC1解离出的氯根(C1-)尾随离子(trailingion)或慢离子：甘氨酸根(甘氨酸等电点：5.97)mclclmppmGG(Cl代表氯根，P代表蛋白质，G代表甘氨酸根)有效迁移率=m，m为迁移率，为解离度)当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质；(3)电位梯度的不连续性：分子筛效应电荷效应,四、实验结果的分析,相关理论,表-1血清中各蛋白质的相关特性,种类,分子量(万）,