高效毛细管电泳法

2019/11/20,一、高效毛细管电泳基本原理二、仪器装置三、影响柱效的因素及改进方法四、主要特点和应用,第五节高效毛细管电泳（high-performancecapillaryelectrophoresis,HPCE）,第七章液相色谱分析法,highperformanceliquidchromatograph,2019/11/20,一、高效毛细管电泳基本原理,HPCE是离子或荷电粒子以电场为驱动力，在毛细管中按其淌度或/和分配系数不同进行高效、快速分离的一种电泳新技术。由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同可实现分离。粒子在电场中的迁移速度，除与电场强度和介电性质有关外，与粒子的有效电荷及其大小形状也有关。这些因素构成了电泳分离的基础。,2019/11/20,1.经典电泳分离法的不足所用分离柱的柱径大，柱较短，分离效率不高（远低于HPLC），温度影响大。高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进。,2019/11/20,2.高效毛细管电泳技术上的重要突破,高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进：一是采用了0.05mm左右内径的毛细管,；二是采用了高达数千甚至上万伏的电压。毛细管的采用使产生的热量能够较快散发，大大减小了温度效应，使电场电压可以很高。电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱径变小，柱长增加。高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱，理论塔板数高达几十万块/米，特殊柱子可以达到数百万。,2019/11/20,3.电泳现象与电渗流现象,电泳现象：带电离子在电场作用下的泳动迁移现象，速度电泳,电渗流现象：玻璃表面存在硅羟基,pH3时,形成双电层，在高电场的作用下，以剪切面为分界面做相对运动，此时会携带柱中的溶液整体向负极移动，速度电渗流。,2019/11/20,4.分离过程,电场作用下，柱中出现：电泳现象和电渗流现象。,带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流两种速度的矢量和。正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出；中性粒子无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出；阴离子：两种效应的运动方向相反，电渗流电泳时,阴离子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,除中性粒子外,同种类离子由于受到的电场力大小不一样也同时被相互分离。,2019/11/20,5.分离类型,(1)毛细管区带电泳（CZE）最普遍、最基本的一种分离模式。其条件选择和控制也是其它分离模式的基础。,2019/11/20,(2)毛细管凝胶电泳（CGE）将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。可分离测定蛋白质、DNA等。“无胶筛分”技术,2019/11/20,(3)胶束电动力学毛细管色谱（MECC或MEKC）,胶束电动色谱是以胶束为假固定相的一种电动色谱，是电泳技术和色谱技术的结合。MECC是在电泳缓冲液中加入表面活性剂，当溶液中的表面活性剂浓度超过临界胶束浓度时，表面活性剂分子之间的疏水基团聚集在一起形成胶束（假固定相），溶质基于在水相和胶束相之间的分配系数不同而得到分离。最突出的优点是不仅能分离带电组分，还能分离中性物质。,2019/11/20,（4）毛细管等电聚焦（CIEF）若毛细管内充有两性电解质，在管两端施加直流电压，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的pH梯度。不同等电点的物质在电场作用下迁移至管内某些适当的pH位置处形成一窄聚焦区而得到分离。应用于蛋白质的分离。（5）毛细管等速电泳(CITP)采用两种不同的缓冲液体系，一种是前导电介质，充满整个毛细管，另一种称尾随电介质置于一端的储液槽种，前者的淌度高于任何试样组分，后者则低于任何试样组分，被分离的组分按其不同的淌度夹在中间以同一速度移动，实现分离。也可作为柱前浓缩手段用于试样的富集。,2019/11/20,（6）毛细管电色谱(CEC)在毛细管壁上键合涂渍或填充HPLC固定相微粒，以试样和固定相之间的相互作用为分离机制，以电渗流为流动相驱动力的色谱过程。兼具了HPLC和CE的优点。,2019/11/20,二、仪器装置,电压：030KV。紫外或激光诱导荧光检测器（可检测到：10-1910-21mol/L）,2019/11/20,高效毛细管电泳仪器（1）,2019/11/20,高效毛细管电泳仪器（2）,2019/11/20,高效毛细管电泳仪器（3）,2019/11/20,三、影响柱效的因素及改进方法,热效应：焦耳热仍是影响柱效的主要因素。采用外部冷却的方法散热，选择合适的电压和电解质也是提高柱效的有效途径。选择合适的电解质降低电阻，电流低于200微安，一般几十微安。,电渗流控制：电渗流的大小和方向依赖于毛细管壁与溶液间电势的极性和大小。,使用添加剂可以改变电渗流的大小和方向，如添加NaCl和甲醇可降低电渗流；加入乙腈则可以增大电渗流。加入反转剂。则可以改变电渗流的方向。,2019/11/20,四、主要特点和应用,高分辨率：理论塔板数高达数百万块，甚至数千万块。高灵敏度：可检测出低至10-21mol/L浓度的物质。高分