毕业设计（论文）-来源于巨大芽孢杆菌ALA2的细胞色素P450-BM-3的蛋白质工程研究.doc

本科毕业设计（论文）题目： 来源于巨大芽孢杆菌ALA2的 细胞色素P450 BM-3的蛋白质工程研究学院： 专业： 学号： 学生姓名： 指导教师： 职称： 年 月 日摘 要细胞色素P450酶系是广泛分布于动物、植物和微生物等不同生物体内的一类代谢酶系。来源于巨大芽孢杆菌（Bacillus. megaterium）的细胞色素P450 BM-3可以快速催化链长大约C12C18的饱和脂肪酸的单加氧酶活性，其中对C15和C16脂肪酸的活性最高。编码P450 BM-3的基因（CYP102）已被克隆并在大肠杆菌中得到表达，从大肠杆菌中表达的P450经纯化后与从巨大芽孢杆菌纯化的P450 BM-3有相同的功能、免疫化学和电泳特征，其N-末端序列也一致。本实验采用来源于巨大芽孢杆菌ALA2的细胞色素P450 BM-3基因进行蛋白质工程设计，按此依据进行定点突变和重组表达，并和原始基因在大肠杆菌中表达情况进行对比。相比于野生型细胞色素P450 BM-3，F87L对吲哚显示了较高的活性，酶活提高约6.98 %，由此证明Phe87对反应选择性控制起着关键的作用，是影响该酶表达量和表达活力的主要因素。并为进一步探索体外合成的细胞色素P450 BM-3进行生物催化应用打下较好的基础。关键词：巨大芽孢杆菌，P450 BM-3，F87L，吲哚The study on protein engineering of the cytochrome P450 BM-3 from B. megateriummALA2AbstractCytochrome P450 is a kind of metabolic enzymes which are widely distributed in animals, plants and microorganisms. Cytochrome P450 BM-3 from B. megateriumm shows high monooxygenase activity for long chain saturated fatty acid(12-18 carbons), especially fatty acid with 15 and 16 carbons are the highest.P450 BM-3 encoding gene (CYP102) has been cloned and expressed in E. coli, the purified P450 expressed from E. coli has the same function, immunochemistry and electrophoresis characteristic with the purified P450 BM-3 from B. megateriumm, and their N-terminal sequences are also consistent.The study usesd the cytochrome P450 BM-3 gene from B. megateriummALA2 for protein engineering design, according to which we conducted site-directed mutagenesis and recombination expression,and compared with the original gene expression in E. coli. F87L shows a litter higher activity towards indole than wild-type P450 BM-3, and the enzyme activity has increased by 6.98%, which proved that Phe87, playing a key role in the control of reaction selectivity, is the major factor influencing the enzyme expression and activity. The study also lay a good foundation to further exploration of cytochrome P450 BM-3 mutant for biocatalysis application.Keywords: Bacillus. Megaterium,P450 BM-3,F87L,indoleI 目 录摘 要IAbstractII前 言11 文献综述21.1 细胞色素P45021.1.1 细胞色素P450的酶系组成21.1.2 细胞色素P450的结构折叠21.1.3 细胞色素P450的底物结合与识别31.1.4 细胞色素P450的天然底物31.1.5 细胞色素P450的催化反应41.1.6 细胞色素P450基因的简化结构51.2 细胞色素P450 BM-361.2.1 细胞色素P450 BM-3的来源61.2.2 细胞色素P450 BM-3的结构61.2.3 细胞色素P450 BM-3的表达与诱导71.2.4 细胞色素P450 BM-3的催化反应71.2.5 细胞色素P450 BM-3的基因重组研究与应用72 细胞色素P450 BM-3基因克隆及其在大肠杆菌中的表达102.1 实验材料102.1.1 主要仪器102.1.2 菌株与质粒112.1.3 培养基与储液112.1.4 主要试剂132.2 实验方法142.2.1 突变位点的选择142.2.2 引物设计142.2.3 反向PCR反应152.2.4 PCR产物纯化162.2.5 琼脂糖凝胶电泳172.2.6 目的片段和载体割胶回收纯化172.2.7 DNA浓缩182.2.8 DNA磷酸化182.2.9 质粒的自身环化192.2.10 大肠杆菌感受态细胞的制备192.2.11 重组质粒电击转化202.2.12 质粒提取212.2.13 重组细胞色素P450 BM-3酶活检测212.2.14 细胞色素P450 BM-3酶活测定222.2.15 纯度鉴定方法223 实验结果与讨论253.1 定点突变重组子的构建253.2 突变基因测序结果与分析253.3 重组质粒验证263.4 粗酶液SDS-PAGE分析263.5 酶活的初步测定273.6 氨基酸突变结果讨论29结 论30展 望31致 谢32参考文献33i前 言20世纪70年代中期从巨大芽孢杆菌（B. megaterium）中发现了具有脂肪酸羟基化活性的P450，已从芽孢杆菌中将P450 BM-3纯化到同质，可作用于烷烃、脂肪酸、萜类、甾族化合物的惰性碳氢键，发生具有较高的区域选择性和立体选择性单加氧反应。因此，细胞色素P450被认为是精细化工合成的潜在催化剂。然而，它们本质上不是很活跃，表现出较差的稳定性，需要如铁氧化还原蛋白，黄素单核苷酸还原酶和NAD(P)H作为电子转移的相关因子。细菌细胞色素P450相对比较稳定，具有高活性，并且运用重组表达系统往往可以大量准备。来源于巨大芽孢杆菌的细胞色素P450 BM-3是一种经研究最好的细菌的P450，P450 BM-3分子质量很大，119 kDa，仅需底物和NADPH就有全活性。1 mol纯化的P450 BM-3包含1 mol FAD、FMN和血红素，可以催化细胞色素C以及其他人工电子受体。相比于其他P450s其性能更接近应用需求。但很多的研究表明，该酶有十分明确的底物特异性。为了获得对除了以长链不饱和脂肪酸为底物的反应活性，细胞色素P450 BM-3的蛋白质工程被广泛地研究。目前定向进化技术在改变酶功能特性和构建具有新的功能特性的酶中显示出巨大的潜力，比如P450 BM-3(A74G,F87V,L188Q)突变体能够催化吲哚生成靛蓝，这是野生型P450 BM-3所不具有的催化功能。大肠杆菌（E.coli）具有表达水平高，繁殖周期短，容易操作，有许多菌株突变体和含强启动子的载体可供使用等优点，因此常用于P450的表达。本研究运用定点突变手段对细胞色素P450 BM-3进行改造，并和原始基因在大肠杆菌中表达情况进行对比，找出影响该酶表达量和表达活力的主要因素，为进一步探索细胞色素P450 BM-3进行体外生物催化应用打下较好的基础。本研究在药物开发，生物降解和生物催化过程具有十分重要的意义，加氧酶的应用也具有广泛的市场前景。1 文献综述1.1 细胞色素P450细胞色素P450，是一类与重金属结合的配体，形成的酶在生物细胞通过可逆性的变化而进行电子传递。因它与一氧化碳结合后，在450 nm处有吸收峰，故有此名1。细胞色素P450广泛分布在脊椎动物或无脊椎动物（包括昆虫）、植物和微生物中。在生命过程中，内源物质的代谢与转化或外源化合物的活化与降解等都需要细胞色素P450酶系的催化与调控。由于该酶系的性质和功能及其在生命活动中它的作用，因此在药理学和毒理学的研究中它一直是引人关注的重要研究领域。 1.1.1 细胞色素P450的酶系组成细胞色素P450是广泛分布于动物、植物和微生物等不同生物体内的一类代谢酶系，作为功能单位，该酶系由多种组分组分组成。目前已知的细胞色素P450酶系的主要组分包括两种细胞色素（细胞色素P450和细胞色素b5）、两种黄素蛋白（即NADPH-细胞色素P450还原酶和NADH-细胞色素b5还原酶）以及磷脂等，其中细胞色素P450和细胞色素P450还原酶最为重要。1.1.2 细胞色素P450的结构折叠通常P450有4个-折叠，大约是13个-螺旋，其中5是可变的。P450保守的结构核心由螺旋束D、E、I、L及螺旋J、K组成。螺旋I包含高度保守的苏氨酸。N-端有酸性残基，位于活性中心吡咯环B的上方。螺旋K含完全保守的E-X-X-R，可能参与稳定核心结构，位于血红素近侧（即假定的氧化还原个搭档结合侧）。螺旋L构成血红素结合区的一个部分。有两套结构保守的-折叠，一为-折叠1，包含5个股（strands）；另一为-折叠2，包括两个股；这些折叠有助于形成疏水性的底物进入通道1。所有P450具有结构保守的共有序列（consensus sequence），位于血红素的近表面包含完全保守的半胱氨酸（Cys），它是血红素铁的第五个配体，也是CO-结合蛋白在450 nm有特征Soret吸收的原因。在蛋白质的近表面还有一卷曲成为曲（meander），其结构高度保守，以前称为芳香区（aromatic region）。因此，变异较大的结构元件是螺旋A、B、B、F、G、H、K、-折叠3和4以及环（loop）。这些可变区包含与底物特异性有关的部分。图1.1 细胞色素P450的结构图Figure1.1 The structure of P4501.1.3 细胞色素P450的底物结合与识别以上提到的非保守区或可变区通常与底物结合部位和氧化还原搭配（Peterson）结合部位相连。比较CYP2家族和P450 cam的序列，Gohoh(1992)鉴定出参与底物识别的区域，以底物识别部位（substrate recognition sites，SRS）加数字命名。与底物结合相连的可变区是螺旋A、B、B、F和G以及他们毗邻的环。环B-B和B-C形成活性中心1（SRS-1），螺旋F和G及它们的环形成活性中心的“进入通道”和顶（ceiling）（SRS-2和SRS-3）。-折叠4末端的转角（-turn）深入活性中心（SRS-6），-股（1-4）的N-末端区（SRS-5）也伸入活性中心。另一个与底物结合相连、在反应机制中重要区域是保守的、螺旋I的中心部分（SRS-4）。以上区域的大多数实际在P450酶的血红素/活性中心，参与底物在囊中的定向。螺旋A、F-G环和-股1-1和1-2似乎参与底物识别1。1.1.4 细胞色素P450的天然底物细胞色素P450具有很广的底物谱（表1.1）既包括许多外源物质如抗体、植物次生性物质及合成有机化合物，也包括多种甾醇和其他生理过程产生的脂类。人类制造的环境化合物大多数是P450的可能底物，还有许多可作为P450 同工酶的诱导剂和抑制剂3。 表1.1 细胞色素P450的底物Table1.1 The substrates of cytochrome P450 BM-3 外来物 生理过程相关 药物（含抗生素） 甾醇 致癌物 类花生四烯酸 抗氧化剂 脂肪酸添味剂 丙酮，丙酮醇溶剂脂过氧化氢农药类视黄酸染料麻醉剂石油产品醇类1.1.5 细胞色素P450的催化反应细胞色素P450与底物的总反应可以用下式表示：RH代表底物，在催化反应过程中分子氧（O2）裂解形成水和羟基化的代谢产物（ROH）。反应中需要两个电子和两个质子。在线粒体和许多细菌中，电子是从NADH或NADPH通过依赖FAD的还原酶来传递到铁-硫铁氧还蛋白。然而，在微粒体内质网系统中，NADPH传递电子是通过含黄素蛋白的FAD和FMN，即细胞色素P450氧化还原酶，无需Fe2S2氧还蛋白的中介作用，而b5也可能是提供第二个电子的来源。有关各种P450系统的电子传递途径（Takemori et al.,1993）（图1.3），（1）中还原的吡啶核苷酸首先还原含FAD的铁氧还蛋白还原酶，再将电子传递到铁氧还蛋白。铁氧还蛋白为还原酶和P450之间的电子穿梭（shuttle）转移。（2）中NADPH-P450还原酶含FAD和FMN作为辅基，其中FAD为从NADPH来源的电子受体，FMN为还原的FAD和P450电子转移的中间体1。图1.2 （1）为线粒体的电子转移系统。（2）为微粒体的电子转移系统。Figure1.2 （1）The electron transfer system of mitochondria.（2）The electron transfer system of microsome.细胞色素P450酶（CYPs）是一类含血红素的单加氧酶，它几乎存在于所有的生命有机体中。在NADPH或NADH 的辅助下，细胞色素P450酶可以催化一些疏水化合物的单氧化甚至还可以在非活性的C-H键引入氧原子，如作用于烷烃、脂肪酸、萜类、甾族化合物的惰性碳氢键产生具有较高区域选择性和立体选择性的单加氧反应。其催化反应的范围很广，因此CYPs是一类具有很强应用前景的生物催化剂。细胞色素P450酶系的循环催化反应（图1.4）（Porter et al.,1991）。其中Fe表示活性部位中血红素的铁原子，RH代表底物，RH(H)2代表还原产物，ROH为单氧化作用产物，XOOH代表过氧化物作为交替的氧供体1。图1.3 P450作用机制Figure1.3 The mechanism of P4501.1.6 细胞色素P450基因的简化结构 细胞色素P450基因的简化结构（图1.4）： 图1.4 P450基因的简化结构Figure1.4 The simple structure of P450 gene1.2 细胞色素P450 BM-320世纪70年代中期从巨大芽孢杆菌（B. megaterium）中发现了具有脂肪酸羟基化活性的P450，已从芽孢杆菌中将P450 BM-3纯化到同质，它能对链长大约C12C18饱和脂肪酸及相似链长的单不饱和脂肪酸、脂肪族醇和脂肪酰胺发生羟基化或环氧化反应。1.2.1 细胞色素P450 BM-3的来源目前已从巨大芽孢杆菌（B. megaterium）ATCC14581中检测出2个P450活性。P450 BM-1和P450 BM-2可被巴比妥（barbiturate）诱导，P450 BM-1的Barbie盒位于5侧翼区。P450 BM-1是含410氨基酸，分子质量为48 kDa的蛋白，与P450cam最相似。P450 BM-2是48 kDa脂肪酸羟化酶。P450 BM-1，BM-2，BM-3在B. megaterium 12个ATCC株的11个都存在，但在ATCC13368中未检测出，该菌株包括一个类型1的P450（P450meg），它可以在15位置羟基化不同的甾醇1。1.2.2 细胞色素P450 BM-3的结构P450 BM-3分子质量很大，119 kDa，仅需底物和NADPH就有全活性。1 mol纯化的P450 BM-3包含1 mol FAD、FMN和血红素，可以催化细胞色素C以及其他人工电子受体1。水解酶部分水解P450 BM-3得到两个结构域，其中66 kDa多肽包含两分子黄素，保持还原酶活性；另一结构域为55 kDa的血红素结构域，可与底物结合，也可与CO结合，在450 nm有吸收峰。P450 BM-3被认为是两个结构域的融合蛋白，这两个结构域分别对应于真核生物微粒体P450酶系的组成成分即P450和NADPH P450还原酶。图1.5 细胞色素P450 BM-3的催化域入口Figure1.5 The catalytic domain entrance of cytochrome P450 BM-31.2.3 细胞色素P450 BM-3的表达与诱导编码P450 BM-3的基因CYP102已被克隆并在大肠杆菌中得到表达4，从大肠杆菌中表达的P450经纯化后与从巨大芽孢杆菌（B. megaterium）纯化的P450 BM-3有相同的功能、免疫化学和电泳特征，其N-末端序列也一致。P450 BM-3可被IPTG诱导，在培养基中加入0.51.0 mM的IPTG便可以诱导P450 BM-3的表达。巴比妥、芳基脲和酰胺也是P450 BM-3的诱导剂。1.2.4 细胞色素P450 BM-3的催化反应 细胞色素P450 BM-3有十分明确的底物特异性，它快速催化链长大约C12C18的饱和脂肪酸的单加氧酶活性其中对C15和C16脂肪酸的活性最高5,6。其他底物包括相似链长的单不饱和脂肪酸、脂肪族醇和脂肪酰胺，脂肪酸酯不是P450 BM-3的底物。脂肪酸底物的羟基化作用一般在-2位置，也可发生在-1和-3。棕榈酸羟基化产物可以进一步作氧化作用的底物而进一步羟基化。不饱和脂肪酸的双键也可被环氧化4,15。1.2.5 细胞色素P450 BM-3的基因重组研究与应用应用有关P450活性位点的研究成就，有可能重新设计P450的活性部位以结合和催化P450的非天然底物。P450底物结合囊的细微改变，可以改变P450的底物特异性和催化效率，通过修饰P450酶可以用于选择性氧化非活性碳氢化合物。1.2.5.1 改变底物特异性和催化效率目前已有研究表明，通过蛋白质设计或定向进化技术，可以将P450 BM-3酶转变成另一种酶，这种酶可以催化一类在结构上与它的天然底物基本无相似的化合物。不仅可以提高其对于酚类化合物的催化活性（如2,6-二氯酚），而且还可以提高其区域选择性，从而催化只产生一种产物10。综合利用蛋白质设计和定向进化技术得到的另一种三重突变体，其催化-紫罗酮的活性大约是野生型酶的80倍，该酶的转换数可达到260 min-1，而且主要是产生（R）-4羟基-紫罗酮（其对映体过量率为40%），这种产物可以作为一种食用香料。1.2.5.2 改变反应产物形成在P450 BM-3位于“进入通道”入口处的-股1-1和1-2的-转角上的精氨酸47（R47）突变研究发现，该位点如为酸性残基则完全抑制与花生四烯酸的结合，而如突变为丙氨酸，则降低底物结合达五倍1。R47突变可使产物的形成也发生变化，野生型P450 BM-3产生80%的18-羟基二十碳三烯酸（18-HETE），R47A突变体只有66%HETE，而14,15-环氧二十碳三烯酸（14,15-EET）则由野生的20%变为R47A突变体的30%。但如在活性中心发生F87V突变（B-C环），14,15-EET的产量由野生型的20%变为突变体的100%。Oliver等发现精氨酸47突变为谷氨酸可以产生烷基三甲基铵（alkyltrimethylammonium）羟化活性。1.2.5.3 增强区域选择性和催化活性Arnold和他的同事综合利用定向进化、蛋白质模型和定点突变的方法来改变P450 BM-3酶的特性，得到一系列的突变体，分别用于催化十二烷烃、辛烷、己烷、丙烷和乙烷的羟基化。P450 BM-3酶其中的一种突变体具有一个最佳的还原酶区域，它可以直接将乙烷氧化成乙醇，但催化效率比较低，耦合效率也小于1%。鉴于P450 BM-3酶和其突变体的广泛用途，许多研究者尝试着将其催化的反应放大。比如用P450 BM-3酶催化亚麻酸来工业化生产15(R),16(S),9,12-环氧十八二烯酸（对映体过量率60%）11，在优化的反应条件下，这种酶表现出很高的区域选择性和催化活性。图1.6 细胞色素P450 BM-3选择性环氧化亚麻酸Figure1.6 Cytochrome P450 BM-3 shows selective epoxidation towards linolenic acid 1.2.5.4 增强酶的稳定性和催化效率以及耦合效率通过研究P450 BM-3酶在水-环己烷双相系统中的作用效应，该系统是利用NADP+依赖型甲酸脱氢酶来提供回收辅因子。结果发现，假如加入稳定因子，如牛血清白蛋白和过氧化氢酶，P450 BM-3酶可保持活性长达100 h，而且催化产物只有环己醇13。在该双相系统中，P450 BM-3酶突变体则表现出更高的稳定性和催化效率，在依赖NADPH的环己烷羟基化反应中，该突变体酶有很高的催化活性。利用定点突变的方法使得P450 BM-3的还原酶区接受NADPH，这样的突变体也有上述的特性。研究证明，NADPH依赖型的单加氧酶突变体在合适的条件下可以表现出很高的稳定性和催化效率以及高耦合效率（有的高达60%）。2 细胞色素P450 BM-3基因克隆及其在大肠杆菌中的表达2.1 实验材料2.1.1 主要仪器表2.1 主要仪器及来源 Table2.1 Main instruments and manufacturer 仪 器 名 称 型 号生 产 厂 家梯度PCR仪 MasterCycler Gradient 5331德国Eppendorf Bio-photometer 6131德国Eppendorf 核酸电泳仪 DYY2-C 北京六一 蛋白电泳仪 VE-180上海天能凝胶成像系统 Quantity One 170-8171美国Bio-Rad-86 超低温冰箱 U410-86英国New Brunswick Scientific旋涡振荡器 Vortex Genie 2美国Scientific Industries电子天平 AY120日本岛津自动蒸汽灭菌锅 D-1 AUTO CLAVE北京发思科贸超净工作台 VS-1300L-U苏州安泰生化培养箱 SP-300B南京恒裕恒温培养振荡器 ZHWY-2102C上海智城高速冷冻离心机 X-22R美国BECKMAN水浴振荡器 THZ-82 常州国华企业 电热鼓风干燥箱 PHG-9123A上海精宏冰箱BCD-518WS海尔集团2.1.2 菌株与质粒宿主菌为E. coli TOP10。质粒载体为pTrc99A，原始重组质粒由本实验室构建。2.1.3 培养基与储液（1）LB 培养基（1000 mL）： 液体培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g。 固体培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，琼脂粉15 g。 搅拌使之完全溶解，用NaOH 调pH 至7.0，高压灭菌20 min（121 0.1 Mpa) （2）SOB 培养基（1000 mL）：20 g胰蛋白胨，5 g酵母提取物，0.5 g NaCl，加入约800 mL的去离子水，溶解后加入10 mL 250 mmol/L KCl溶液（将1.86 g KCl 用100 mL 去离子水溶解即配成250 mmol/L KCl 溶液），用5 mol/L NaOH调节pH值至7.0（约0.2 mL），定容至1 L。在15 psi（1.05 kg/cm2）高温高压灭菌20 min，4 保存。使用前加入5 mL灭菌的2 mol/L MgCl2溶液（用90 mL 去离子水溶解19 g MgCl2，用去离子水溶解19 gMgCl2，用去离子水调整体积为100 mL，在15 psi（1.05 kg/cm2）高压下蒸汽灭菌20 min）。 （3）SOC培养基 向100 mL SOB培养基中加入2 mL过滤除菌的1 mol/L 葡萄糖溶液混合均匀，4保存。 （4）氨苄青霉素储存液 用无菌双蒸水配成100 mg/mL，过滤除菌，分装于-20保存。 （5）10TBE琼脂糖凝胶电泳缓冲液 称取Tris 108 g，Na2EDTA2H2O 7.44 g，硼酸55 g，加蒸馏水定至1 L，室温保存，使用时稀释10倍。 （6）碱裂解质粒小提试剂 （a）Solution 分别取25 mL 1 mol/L TrisHCl（pH 8.0），20 mL 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0），45 mL 20% glucose（W/V），加ddH2O定容至1 L。121 灭菌20 min，4保存。使用前每50 mL的Solution中加入2 mL的RNase A（20 mg/mL）。 （b）Solution 分别取50 mL 2 mol/L NaOH，50 mL 10% SDS（W/V），加灭菌水定容至500 mL。室温保存。此溶液保存时间不要超过一个月。同时，SDS易产生气泡，不要剧烈搅拌。 （c）Solution 称取147 g KOAc，加入300 mL去离子水后搅拌溶解，加入57.5 mL CH3COOH，用去离子水定容至500 mL。121灭菌20 min，4 保存。 （7）SDS-PAGE蛋白电泳试剂 （a）30%丙烯酰胺凝胶贮备液 称取29.2 g丙烯酰胺，0.8 g甲叉双丙烯酰胺，加水至100 mL，通风橱操作，过滤后棕色瓶避光保存。 （b）1.5 mol/L TrisHCl分离胶缓冲液（pH 8.8） 称取18.15 g Tris，用l mol/L HCl调pH值至8.8，加水至100 mL，4保存。 （c）0.5 mol/L TrisHCl浓缩胶缓冲液（pH6.8） 称取6 g Tris，用l mol/L HCl调pH值至6.8，加水至100 mL，4保存。 （d）10% SDS溶液 称取10 g SDS，加水至100 mL，完全溶解后室温保存。 （e）50%GY 量取50 mL甘油，加水定至100 mL，室温保存。 （f）1%溴酚蓝 称取100 mg溴酚蓝，加水定至10 mL，过滤后4保存。 （g）10%过硫酸铵 称取1 g过硫酸铵，溶于10 mL水中，贮于4，使用不可超过2周。 （h）5Loading Buffer 取1.2 mL 0.5 mol/L Tris-HCl（pH 6.8），2.5 mL甘油，1 g SDS，50 mg溴酚蓝，加去离子水定至10 mL，分装成小份（500 L/管），贮于室温。用前每小份中加入25 L的-巯基乙醇，加入-巯基乙醇之后可在室温保存1个月。 （i）电泳缓冲液（pH8.3） 称取3 g Tris，18.8 g甘氨酸，1 g SDS，定容至1 L，室温保存。 （j）染色液 称取1 g考马斯亮蓝R-250于1 L烧杯中，加入250 mL异丙醇搅拌溶解，再加入100 mL冰乙酸和650 mL水，混匀，过滤后室温贮存。 （k）脱色液 量取100 mL冰乙酸，50 mL乙醇，850 mL水，混匀后室温贮存。2.1.4 主要试剂表2.2 主要试剂及来源Table2.2 Main reagents and manufacturer 试剂 生产厂家 DNA 聚合酶 TAKARA T4 DNA 连接酶 TAKARA电泳级琼脂糖 OXOID 琼脂糖凝胶/PCR产物纯化试剂盒 BIOMIGA质粒小提试剂盒 BIOMIGA氨苄青霉素 南京天为时代过硫酸铵SCIGENE酵母提取物 OXOID胰蛋白胨 OXOID葡萄糖 国药集团上海化学试剂公司琼脂粉南京基天生物技术有限公司三羟甲基胺基甲烷（Tris）ANGUSEDTA 国药集团上海化学试剂公司NaCl 南京化学试剂有限公司NaOH南京化学试剂有限公司MgCl2南京化学试剂有限公司HCl 南京化学试剂有限公司2.2 实验方法2.2.1 突变位点的选择爱丁堡大学化学系，细胞及分子生物学研究所和斯特拉斯克莱德大学理论及应用化学系的Tobias等14探索了对P450的底物结合部位进行理性设计的可能性。他们所使用的模型为结合了棕榈酸的P450 BM-3酶。为我进行定点突变提供了结构指导。如图2.1所示，P450 BM-3肽链中第87位的苯丙氨酸残基，位于活性中心且高度保守，侧链上的苯环可以改变活性区域（疏水通道）的构象，并且指导脂肪酸的取向。突变此点可以改变P450 BM-3的底物选择性和立体区域选择性。图2.1 细胞色素P450 BM-3和底物棕榈酸对接Figure2.1 The modeling of cytochrome P450 BM-3 and substrate docking2.2.2 引物设计本实验通过DNA序列测定确定了突变位点碱基序列的变化，以及碱基对应氨基酸的变化。由于易错PCR方法的不可预见性，决定采用定点突变的方法，通过反向PCR对细胞色素P450 BM-3进行定向改造。通过在设计引物时人为改变碱基序列实现细胞色素P450 BM-3的定向进化，本实验因时间有限，只将细胞色素P450 BM-3活性中心87位残基上的苯丙氨酸进行定向改造。图2.2 一步反向PCR法致点突变原理示意图Figure2.2 Schematic diagram of one-step opposite direction PCR method 引物设计如下： F87突变的引物序列： 上游引物5-GTCCAGCTTGTNNNTAAACCGTCTCC-3 下游引物5-GCCGAAAAAAAACTGGAAAAAAGCGC-3加粗体下划线的碱基表示人为引入突变位点。设计好的引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。2.2.3 反向PCR反应以设计的质粒为模板，PCR反应体系的组成：表2.3 PCR反应体系Table2.3 PCR reaction system成分 加量（L）ddH2O 32.5 5PrimeSTARTMBuffer 10.0dNTP 10 mmol/L4.0P1 10 mol/L 1.0P2 10 mol/L1.0Templates 1.0PrimeSTARTM HS DNA Polymerase（2.5 U/L）0.5Total50.0按下列程序进行PCR循环扩增：表2.4 PCR反应程序Table2.4 PCR reaction program步骤温度（）时间（min）Stage1955Stage2（32cycles）95152.61727.5Stage37215直接进行下一步实验或将PCR扩增产物置4保存。2.2.4 PCR产物纯化 为降低产物浓度，采用BIOMIGA的PCR产物纯化试剂盒进行纯化。具体步骤为：（1）收集4保存的PCR反应液。（2）加入2倍体积的Buffer GC（如50 L的PCR反应液，加入100 L Buffer GC），混合均匀。 （3）将上述混合液（每次不超过700 L）移至一个带有收集管的吸附柱中，室温下13,000 rpm室温离心1 min，取出吸附柱，并倒掉收集管中废液，将吸附柱放回到收集管中。重复步骤（3），直到剩余的混合液全部通过吸附柱。（4）加入650 L DNA Wash Buffer至吸附柱中，室温下，13,000 rpm离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回到收集管中，重复步骤（4）一次。（5）室温下，13,000 rpm，将吸附柱开盖离心2 min，去除残留的乙醇。（6）将吸附柱放入干净的1.5 mL离心管中，在吸附柱膜中央加入3050 L Elution Buffer或ddH2O，室温放置1 min。13,000 rpm离心1 min，离心管中的液体即为包含目的DNA片段的溶液，取25 L进行电泳检测浓度，纯化好的DNA可立即用于后续实验或于-20冻存。2.2.5 琼脂糖凝胶电泳 （l）琼脂糖凝胶的制备 称取0.2 g琼脂糖，置于三角瓶中，加入20 mL 1TBE缓冲液（胶浓度1 %），电炉加热至琼脂糖完全溶解，冷至60左右时，加入核酸染料至终浓度为0.5 g/mL，摇匀后倒入事先插好梳子的制胶槽中，轻微晃动使胶液面平整，室温放置约40 min使胶完全凝固，然后小心拔去梳子，将胶放入盛有1TBE缓冲液的电泳槽中。缓冲液应没过胶面约5 mm，且加样孔靠近电泳槽负极。 （2）加样 将5 L DNA样品与1 L 6Loading Buffer混匀，小心加入加样孔中，同时加入DL 10，000或1kb ladder Marker。 （3）电泳 接对电泳槽正负电源线，打开电泳仪电源，设定100120 V恒压电泳，待溴酚蓝前沿跑至距凝胶正极端约1 cm左右时停止电泳。 （4）成像将胶置于凝胶成像系统（BIO-RAD）中，紫外光下拍摄图像，并进行条带分析。2.2.6 目的片段和载体割胶回收纯化 用1%琼脂糖凝胶电泳，在紫外照射下，切下目标DNA。从琼脂糖凝胶中回收DNA采用BIOMIGA的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（离心柱型）回收DNA。（1）在紫外灯下用干净锋利的手术刀片切下含有目的条带的凝胶块，放入1.5 mL离心管中，计算凝胶块的重量。（2）每100 mg琼脂糖凝胶加入不少于100 L Buffer GC，于5060温浴10 min，每23 min间断混合，直至凝胶完全融化。 （3）将上述混合液移至一个带有收集管的吸附柱中，室温下13,000 rpm室温离心1 min，取出吸附柱，并倒掉收集管中废液，将吸附柱放回到收集管中。重复步骤（3），直到剩余的混合液全部通过吸附柱。（4）加入650 L DNA Wash Buffer至吸附柱中，室温下，13,000 rpm离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回到收集管中，重复步骤（4）一次。（5）室温下，13,000 rpm，将吸附柱开盖离心2 min，去除残余的乙醇。（6）将吸附柱放入干净的1.5 mL离心管中，在吸附柱膜中央加入3050 L Elution Buffer或ddH2O，室温放置1 min。13,000 rpm离心1 min，离心管中的液体即为包含目的DNA片段的溶液，取25 L进行电泳检测浓度，纯化好的DNA可立即用于后续实验或于-20冻存。2.2.7 DNA浓缩将纯化过后的PCR中加入0.1倍体积的3 mol/L 的乙酸钠（pH 5.2），再加入总体积3倍量的无水乙醇，混匀，-80放置1 h后，4，13,000 rpm 离心40 min，轻柔弃上清。再加入600 L 75%乙醇（现配），轻柔混匀，室温10 min，4，13,000 rpm 离心15 min，彻底弃上清，超净工作台小风风干。然后加入8 L ddH2O反复轻柔吹打重悬。2.2.8 DNA磷酸化DNA浓缩后按表2.5进行磷酸化反应：表2.5 DNA磷酸化反应体系Table2.5 DNA phosphorylation reaction system成分 加量（L）浓缩过后的 PCR 纯化产物 8.0T4Ligase 10 buffer 1.0T4 Polynucleotide Kinase（10 U/L）1.0Total10.0 37水浴3 h后，加热至70，5 min使T4磷酸化激酶失活。2.2.9 质粒的自身环化磷酸化后的DNA按表2.6进行质粒的自身环化反应：表2.6 质粒的自身环化反应体系Table2.6 Plasmid cyclization reaction system成分 加量（L）磷酸化质粒 8.0T4 Ligase 10 buffer 1.0T4 DNA Ligase（5 U/L）1.0Total10.0 将上述体系置 16下水浴过夜。之后取1.0 2.0 L用于电转化。2.2.10 大肠杆菌感受态细胞的制备 （1）-80冰箱中取出保存的大肠杆菌E. coli Top 10。在LB平板上划线，37过夜培养至长出单菌落。 （2）长出单菌落后，马上挑取一个接种到5 mL LB液体培养基，37温和震荡培养5过夜。 （3）将2 mL培养物加入到盛有200 mL LB液体培养基的1000 mL烧瓶中，37，180 rpm，摇床培养至OD600为0.30.4为宜。 （4）菌液冰浴冷却1015 min，在超净工作台中，将OD值适宜的培养液分装到6支已预冷的50 mL离心管中，对称放入离心机中，4，5000 g离心15 min。（5）动作温柔、弃去上清，用已预冷的去离子水（盖满离心管底部为宜），混匀，手工震荡重悬。（6）重悬完成后，用预冷的去离子水定容至离心管体积的2/3左右，4，5000 g离心10min，弃上清液。（7）重复步骤（5），（6）。（8）加入盖满离心管底部的10%（v/v）甘油，重悬，用预冷的10%（v/v）甘油定容至离心管体积的2/3左右，4，5000 g离心10 min，弃上清液。（9）重复步骤（8）。（10）加入盖满离心管底部1/2体积10%（v/v）甘油，重悬，合管后用预冷10%（v/v）甘油定容至离心管体积的2/3。再用另一个同样大小的离心管加入同等体积水作为平衡管，4，5000 g离心10 min。 （11）制备30管，每管55 L，加入1.7 mL已预冷的10%（v/v）甘油，重悬菌体，分装于预冷的离心管中，贮存于-80冰箱